Αφηρημένο

Ιστορικό

σύντηξης καρκινικών κυττάρων με κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών κινητικό (BMDCs) έχει από καιρό έθεσε ευθέως ως μηχανισμός για την μετάσταση του καρκίνου. Ενώ υπάρχει μεγάλη υποστήριξη για το σκοπό αυτό από τις μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας και των ζώων, έχει ακόμη επιβεβαιωθεί στον καρκίνο του ανθρώπου, όπως όγκου και τα κύτταρα που προέρχονται από μυελό από τον ίδιο ασθενή δεν μπορεί να διακριθεί εύκολα γενετικά.

Μέθοδοι

Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμό του γονότυπου ενός μεταστατικού μελανώματος στον εγκέφαλο που προέκυψε μετά από αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών (ΒΜΤ), χρησιμοποιώντας την εγκληματολογική μικρή διαδοχική επανάληψη (STR) μήκους-πολυμορφισμών να διακρίνει δότη και γονιδιωμάτων του ασθενούς. Τα καρκινικά κύτταρα απομονώθηκαν δωρεάν λευκοκυττάρων μέσω μικροδιατομής λέιζερ, και ο όγκος και προ-μεταμόσχευσης DNAs λεμφοκυττάρων αίματος αναλύθηκαν για δότη και αλληλόμορφα των ασθενών σε 14 αυτοσωματικό STR θέσεις και τα φυλετικά χρωμοσώματα.

Αποτελέσματα

Όλα τα αλληλόμορφα στον δότη και τον ασθενή προ-ΒΜΤ λεμφοκύτταρα βρέθηκαν σε κύτταρα όγκου. Τα αλληλόμορφα έδειξε δυσανάλογη σε σχέση με αφθονία σε παρόμοια πρότυπα σε όλο τον όγκο, υποδεικνύοντας ο όγκος ξεκίνησε από μια κλωνική εκδήλωση σύντηξης.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν σθεναρά σύντηξης μεταξύ ενός BMDC και ενός καρκινικού κυττάρου παίζοντας ένα ρόλο στην προέλευση αυτής της μετάστασης. Ανάλογα με τη συχνότητα τέτοιων γεγονότων, τα ευρήματα θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για την κατανόηση της δημιουργίας των μεταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων των προέλευση των καρκινικών κυττάρων για την έναρξη και την επιγονιδιώματος καρκίνου

Παράθεση:. Lazova R, LaBerge GS, Ντιβάλ Ε, Spoelstra Ν, Klump V, Sznol Μ, et al. (2013) Ένα μελάνωμα μετάσταση εγκεφάλου με έναν δότη-ασθενούς Hybrid Γονιδιώματος παρακάτω Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών: πρώτα στοιχεία για το Fusion σε ανθρώπινα καρκινικά. PLoS ONE 8 (6): e66731. doi: 10.1371 /journal.pone.0066731

Επιμέλεια: Eva Mezey, National Institutes of Health, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 9, Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιούνη του 2013

Copyright: © 2013 Lazova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν παρέχονται εν μέρει από μια απεριόριστη δώρο από την Amway Corporation και από το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Cancer Center NCI Grant υποστήριξης (P30CA046934). Πρόσθετες δαπάνες καλύφθηκαν εσωτερικά από τους εμπλεκόμενους φορείς: Πανεπιστήμιο Yale, το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, και η Αστυνομία Έγκλημα Εργαστήριο Ντένβερ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η χρηματοδότηση για την μελέτη αυτή προβλέπεται εν μέρει από μια απεριόριστη δώρο από την Amway Corporation. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

σύντηξη κυττάρων όγκου με κινητικά λευκοκύτταρα, όπως κύτταρα μυελοειδούς προέλευσης ή βλαστικών κυττάρων έχει τεθεί προς τα εμπρός ως ενοποιητική εξήγηση για μετάσταση [1] – [4]. Περισσότερο από έναν αιώνα πριν Aichel προτείνει ότι ο καρκίνος θα μπορούσε να προκύψει από συγχώνευση μεταξύ κινητικά λευκοκυττάρων και άλλα σωματικά κύτταρα, με τις ποιοτικές διαφορές μεταξύ των χρωμοσωμάτων που προκαλεί την υβριδική να «ρίχνονται από την πορεία των μητρικών κυττάρων για να σχηματίσουν αυτό που έχει γίνει γνωστό ως ένα κακόηθες κύτταρο «[5]. κυτταρική σύντηξη Καρκίνος ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά όταν τα ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος εμφυτεύτηκαν σε χάμστερ και των μεταστάσεων που αναπτύσσονται με καρυότυπο ανθρώπου-χάμστερ [6]. Αυτό ακολουθήθηκε από αναφορές από πολλά εργαστήρια της σύντηξης των καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργεια και ποντικούς [1] – [3]. Πιο πρόσφατα, όταν κακώς μεταστατικά κύτταρα μελανώματος ποντικού Cloudman S91 συντήχθηκαν με φυσιολογικό ποντίκι ή ανθρώπινα μακροφάγα σε καλλιέργεια, τα υβρίδια εμφυτεύονται σε ποντικούς έδειξε υψηλά ποσοστά μετάστασης με μειωμένη χρόνους επιβίωσης από τους οικοδεσπότες σε σύγκριση με εκείνα των κυττάρων μελανώματος ελέγχου που χρησιμοποιούνται ως εταίροι σύντηξης [7]. Μεταστατικό υβρίδια ήταν έντονο χρώμα, χαρακτηριστικό της γενεαλογίας των μελανοκυττάρων, και εξέφρασε επίσης πολλές μυελοειδούς γνωρίσματα σειράς, όπως ενισχυμένη χημειοτακτική κινητικότητα, αυτοφαγία και τα πρότυπα γλυκοζυλίωσης μακροφάγων-όπως [8] – [10]. Όταν τα ανθρώπινα μακροφάγα χρησιμοποιήθηκαν ως εταίροι σύντηξης με κύτταρα μελανώματος ποντικού, τα υβρίδια που εκφράζεται τόσο ανθρώπου και ποντικού τα γονίδια SPARC, υποδεικνύοντας ότι οι epigenomes και των δύο εταίρων σύντηξης ενεργοποιήθηκαν [11]. Ομοίως, όταν τα κύτταρα που προέρχονται από μυελό φθορίζουσα σήμανση των οστών ποντικού εισήχθηκαν μέσω parabiosis σε ποντίκια με εντερικά όγκους, υβρίδια μακροφάγων καρκινικό κύτταρο που σχηματίζεται που εκφράζονται transcriptomes χαρακτηριστικό και των δύο γονικών συνεργάτες σύντηξης [12]. Ομοίως, η εμφύτευση του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος ή κύτταρα λεμφώματος Hodgkins σε μάγουλα χάμστερ οδήγησε σε μεταστατικό υβρίδια ανθρώπου-χάμστερ με συν-έκφραση των γονιδίων του ανθρώπου και των χάμστερ [13] – [14]. Έτσι, ποντικού-ποντικού, ανθρώπου-ποντικού, και την ανθρώπινη-χάμστερ υβρίδια όλα συν-εκφράζονται φυσιολογικά γονίδια του καρκίνου του κυττάρου των κυττάρων και και έδειξαν αυξημένη μεταστατική δυνατότητες. Σε άλλες μελέτες, η σύντηξη των καρκινικών κυττάρων με BMDC στην επαγόμενη καλλιέργεια ανευπλοειδίας, αντοχή φαρμάκου, αυξημένη διεισδυτικότητα και όγκου ανομοιογένεια [15] – [20]. Σε ανθρώπινα μελανώματα, «stealth» κύτταρα μελανώματος ανιχνεύθηκαν σε μεταστάσεις λεμφαδένα που έδειξε ιδιότητες συνεπή με το να είναι υβρίδια σύντηξης [21]. Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα σταματούν από το αίμα των ασθενών με μελάνωμα, παγκρεατικό και του παχέος εντέρου συν-εκφράζεται καρκίνωμα και λευκοκυτταρικών δείκτες υποδηλώνουν κυτταρικής σύντηξης BMDC όγκου [22].

Ωστόσο, σύντηξης και γονιδιωματικό υβριδισμό πρέπει ακόμη να αποδειχθεί σε γενετική βάση στον καρκίνο του ανθρώπου, δεδομένου ότι δεν μπορεί να διακριθεί εύκολα γονιδιωματική διαφορές μεταξύ των κυττάρων από τον ίδιο ασθενή. Για να παρακάμψουν αυτό το πρόβλημα έχουμε αναλύσει δευτερογενείς κακοήθειες που προκύπτουν μετά την μεταμόσχευση αλλογενών μυελού των οστών (ΒΜΤ). Σε δύο προηγούμενες εκθέσεις δείξαμε αλληλόμορφα δότη στον ασθενή καρκινικά κύτταρα, αλλά δεν υπήρχε καμία πρόβλεψη για τον εντοπισμό αλληλόμορφα και σύντηξη των ασθενών ως εκ τούτου δεν θα μπορούσε να αποδειχθεί [23] – [24]. Εδώ χρησιμοποιήσαμε STR μήκους-πολυμορφισμών και ιατροδικαστική γενετικές τεχνικές για την ανάλυση γονιδιακού DNA σε μια εγκεφαλική μετάσταση μελανώματος από έναν ασθενή που είχε λάβει κατά το παρελθόν ΒΜΤ από τον αδελφό του. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την παρουσία του δότη και του ασθενούς αλληλόμορφα σε καρκινικά κύτταρα σε όλο τον όγκο, υποδεικνύοντας ότι ένα συμβάν κυτταρική σύντηξη BMDC-καρκίνος έχει ξεκινήσει την παραγωγή αυτού του όγκου. Παθολογία αναλύσεις και μαθηματική μοντελοποίηση των αλληλομόρφων μοτίβα υποστήριξαν αυτό το συμπέρασμα.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν προϋπάρχοντα και αποχαρακτηριστούν πριν παραληφθεί από το ερευνητική ομάδα Yale. Απαλλαγή χορηγήθηκε βάσει του Yale IRB πρωτόκολλο # 070900309 (JP και RL) από το Πανεπιστήμιο Yale Πρόγραμμα Ανθρώπινου Προστασίας Έρευνας, θεσμικές Συμβούλιο Εξέτασης.

Πηγή των ιστών

Ο ασθενής ήταν 68-χρόνο- γέρος που υποβλήθηκαν σε αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών από τον αδελφό του για τη θεραπεία του λεμφώματος Β-κυττάρου. προφίλ τελευταία εμφύτευση /χίμαιρας του ήταν Παραλήπτη 3%? Δότη 97%. Έξι χρόνια αργότερα ο ασθενής είχε διαγνωστεί με μεταστατικό μελάνωμα που περιλαμβάνει λεμφαδένες, το ήπαρ και τον εγκέφαλο, που προέρχεται από έναν άγνωστο πρωτογενούς όγκου. Αναλύσαμε μια μετάσταση εγκεφάλου (ορίζεται ως «MH3») που αποτελείται από ένα σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστός 0,5 × 0,2 × 0,3 εκ. Ο όγκος αφαιρέθηκε χειρουργικά, σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη, και ενσωματωμένα σε παραφίνη με πρότυπες ιστολογικές διαδικασίες. Προ-μεταμόσχευση δότη και ασθενή λεμφοκύτταρα αποθηκεύτηκαν στους -90 ° C στη Stem Cell Yale-New Haven Νοσοκομείο Τράπεζα και να ανακτηθεί μετά ολοκληρώθηκαν οι αναλύσεις του όγκου.

Laser μικροανατομίας

Χειρισμός και επεξεργασία δειγμάτων ιστού διεξήχθη χρησιμοποιώντας εξαιρετικά καθαρές, ελεύθερο DNA εξοπλισμό. Πέντε μ πάχους ιστολογικές τομές κόπηκαν και ανοσοβαφή για την ΑΚΖ /CD45 (κλώνος 2B11 + PD7 /26, Dako, κατάλογος N1514) χρησιμοποιώντας ένα Autostainer (DAKO, Carpinteria, CA) στο Yale Dermatopathology Laboratories. Το αντίσωμα ελέγχθηκε ως προς τη χρώση αποδοτικότητας όπως περιγράφεται στην S1 αρχείου. Τα καρκινικά κύτταρα μικροτομή χωρίς LCA /CD45-θετικά κύτταρα από 9 περιοχές του όγκου χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μικροσκοπίου ανατομή λέιζερ Αρκτούρος XT. Κάθε δείγμα αποτελείτο ανατεμνόμενων καρκινικά κύτταρα συγκεντρώνονται από μία ή περισσότερες περιοχές του ίδιου τμήματος.

DNA εξόρυξη

εξαγωγή DNA και αναλύσεις STR ήταν από το Αστυνομικό Τμήμα του Ντένβερ Εγκλήματος Εργαστηριακής Μονάδας DNA χρησιμοποιώντας τυπικές ιατροδικαστική λειτουργίας και valided διαδικασίες [25]. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε λεπτού τοιχώματος σωλήνων αντίδραση GeneAmp (0.5 ml? Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Λεμφοκυττάρων DNA εκχυλίζεται στην πλατφόρμα BioRobot EZ1 με το πρωτόκολλο του κιτ ίχνος DNA EZ1 DNA Ερευνητής (Qiagen στις ΗΠΑ). Σύνολο του ανθρώπου και των αρσενικών DNA αξιολογήθηκαν με την Quantifiler Duo DNA Ποσοτικοποίηση Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαδικασίες εκχύλισης DNA. Για δείγματα όγκων 1-4, το DNA εκχυλίζεται με τη χρήση του 5% Chelex με πρωτεϊνάση Κ διαδικασία [26]. Για τα δείγματα 5-9, DNA εκχυλίζεται με τη χρήση της RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid Kit Μόνωση για FFPE ιστούς (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), η οποία βελτίωσε την απόδοση DNA περίπου 5 φορές (δεν φαίνεται). Ο αριθμός των κυττάρων του όγκου σε μικροδιατομή ανά δείγμα καταγράφηκε αυτόματα από το σύστημα Αρκτούρος XT.

PCR ενίσχυση

PCR πραγματοποιήθηκε με τη AmpFlSTR Identifiler Ενίσχυση PCR Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA ). Γενικά, 1 ng του συνολικού DNA έγινε στόχος σε κάθε ενίσχυση PCR. Σε δείγματα με λιγότερα DNA (& lt? 0,1 ng /μl), τα δείγματα συμπυκνώθηκαν 5-20 φορές χρησιμοποιώντας ένα Microcon φυγοκεντρικού φίλτρου (Ultracel ΥΜ-100, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA)

Ιατροδικαστική γενετικές αναλύσεις. των θέσεων STR

Κάθε τόπος STR επιλέχθηκε να είναι ουδέτερη σε σχέση με άλλες γενετική σύνδεση ή ενώσεις είτε με Μέντελ ή μη Μέντελ διαταραχές. Το τόποι ήταν πολυμορφικές και επέδειξαν αποδεκτά επίπεδα ετεροζυγωτίας, τυπικά 70% ή υψηλότερη. Θα μπορούσαν να προσδιοριστούν από κοινού ως PCR multiplex και ήταν ισχυρή για την υποβαθμισμένη DNA [25]. Γονοτυπικός των προϊόντων PCR και την ερμηνεία του Short Tandem Repeat-STR αλληλόμορφα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε ΑΒΙ Prism 3130 Genetic Analyzer με GeneMapper ID Software έκδοση 3.2 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Χ και Υ χρωμοσώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας την ταυτόχρονη δοκιμασία αμελογενίνης με τον αυτοσωματικό αναλύσεις STR [25]. Ποιοτική και ποσοτική σήματος προς θόρυβο όρια προσδιορίστηκαν με την ABI Identifiler Kit. Όλες οι κορυφές & gt? 50 σχετικές μονάδες φθορισμού βαθμολογήθηκαν ως αληθινή αλληλόμορφα με βάση α) το ύψος και β) αιχμή της μορφολογίας [25]

Τα αλληλόμορφα τραύλισμα

κορυφές σήματος αλληλόμορφων μπορεί να επικαλύπτονται τεχνική «κολλάει». θέσεις από άλλες αλληλόμορφα. μελέτες επικύρωσης έχουν θεσπίσει κατευθυντήριες γραμμές για την ερμηνεία για την εγκληματολογική δείκτες να διακρίνει αλήθεια σήματα αλληλόμορφο από τραύλισμα για οποιοδήποτε δεδομένο αλληλόμορφο σε κάθε τόπο [27] – [28]. Όλα αλληλόμορφο κλήσεις θεωρείται σημαντική σε αυτή τη μελέτη ήταν σύμφωνα με αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές και δεν κολλάει επικαλύψεις.

Στατιστική Μοντελοποίηση και Ανάλυση

Bayesian στατιστικών μοντέλων της σύντηξης και κυττάρων δότη μόλυνσης είχαν τοποθετηθεί και σε σύγκριση με τη χρήση αλυσίδων Markov μέθοδοι Monte Carlo [29] υλοποιηθεί με τη χρήση Jags [30] και R [31] λογισμικού, όπως περιγράφεται στο S2 αρχείου.

Αποτελέσματα

παθολογία αναλύει

Πραγματοποιήσαμε εκτεταμένες αναλύσεις παθολογία για να εξασφαλίσει ότι οι laser τεμαχίζεται δείγματα όγκων δεν είχαν μολυνθεί από διηθητικά λευκοκύτταρα δότη. Για την ανίχνευση των λευκοκυττάρων χρησιμοποιήσαμε ένα αντίσωμα προς λευκοκυττάρων κοινό αντιγόνο (LCA /CD45), που εκφράζεται στην επιφάνεια των ώριμων λευκοκυττάρων και αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Σε πειράματα θετικού ελέγχου το αντίσωμα έδειξε & gt?. 99% απόδοση χρώση κατά περιπτώσεις ελέγχου της δερματίτιδας και του λεμφώματος (. Σχ S1 και S2, S1 πίνακα στο S1 αρχείου)

Η χρώση του μελανώματος MH3 για LCA /CD45 αποκάλυψε ότι ορισμένες περιφέρειες που περιέχονται LCA /CD45-θετικά λευκοκύτταρα αναμειγμένα με LCA /CD45-αρνητικά κύτταρα μελανώματος (Εικ. 1Α). Αυτά κρίθηκαν ακατάλληλα για μικροδιατομής λέιζερ. Ωστόσο, άλλες περιοχές περιείχαν καθαρούς πληθυσμούς των LCA /CD45-αρνητικά κύτταρα μελανώματος σε ομάδες από δεκάδες έως εκατοντάδες που ήταν κατάλληλα για μικροδιατομής (Σχ. 1 Β-D). Παρομοίως, όταν ο όγκος χρωματίστηκε για S100 για να ανιχνεύσει κύτταρα μελανώματος [32], μερικές περιοχές του όγκου διεισδύσει με S100-αρνητικά λευκοκύτταρα, ενώ άλλοι περιείχαν μόνο S100-θετικά κύτταρα μελανώματος (σχ. 2Α και Β). Έτσι, δύο διαφορετικές αναλύσεις ανοσοχημεία έδειξε ότι ο όγκος MH3 περιείχε περιοχές της ουσιαστικά καθαρής κακοήθων κυττάρων μελανώματος που θα μπορούσαν να είναι καθαρά μικροδιατομή με & lt? 1% μολυσματικών λευκοκυττάρων. Μια πιο λεπτομερής ανάλυση της χρώσης S100 παρουσιάζεται στα Σχ. S3 και S4 στο S1 αρχείου.

Α. Μια περιοχή με καφέ LCA /CD45-θετικών λευκοκυττάρων (βέλος) σε επιμειξία με μπλε LCA /CD45-αρνητικά καρκινικά κύτταρα. B-D. Γειτονικές περιοχές από το ίδιο τμήμα που περιέχει μόνο μπλε LCA /CD45-αρνητικά καρκινικά κύτταρα.

Η

Α. Μια περιοχή του S100-θετικά καρκινικά κύτταρα αναμιγνύονται με διηθητικά S100-αρνητικά λευκοκύτταρα (βέλη). B. Μια περιοχή που περιέχει μόνο S100-θετικά καρκινικά κύτταρα. Οι πιο λεπτομερείς αναλύσεις παθολογία που παρουσιάζονται στα σχήματα S3 και S4 στο S1 αρχείου.

Η

Laser μικροδιατομής και αναλύει STR

τομές όγκων βάφτηκαν με LCA /CD45 πριν από την εκτομή με λέιζερ και τα καρκινικά κύτταρα αποκόπηκαν χωρίς LCA /CD45-θετικά λευκοκύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα απομονώθηκαν από 9 περιοχές σε όλο τον όγκο (δείγματα 1-9) και το DNA εκχυλίστηκε και ενισχύθηκε για αλληλόμορφα σε 14 STR θέσεις. Όλα τα αλληλόμορφα βρίσκονται στο δότη προ-μεταμόσχευσης και λεμφοκύτταρα αίματος ασθενών ανιχνεύθηκαν επίσης σε κύτταρα όγκου. Για κάθε τόπο υπήρχε τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο κοινές τόσο του δότη και του ασθενούς, σύμφωνα με την αδελφική σχέση. Οκτώ τόποι εμφάνισαν donor- συγκεκριμένα αλληλόμορφα και έξι από αυτές εκτίθενται τόσο του δότη όσο και τον ασθενή συγκεκριμένες-αλληλόμορφα. Αυτό έδειξε ότι τα κύτταρα του όγκου ήταν δότη-ασθενή υβρίδια (Εικ. 3, Πίνακας 1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι αναλογίες όγκου αλληλική διέφερε μεταξύ loci, αλλά για οποιαδήποτε δεδομένη θέση οι αλληλικές αναλογίες ήταν παρόμοιες σε όλες τις 9 περιοχές του όγκου. Αυτό πρότεινε μια σχετικά σταθερή γονότυπο και την πιθανή κλωνική προέλευση της μετάστασης. Οι υπόλοιπες θέσεις ήταν κατατοπιστική σχετικά με τη σύντηξη μόνο με κοινές ή ασθενή συγκεκριμένα αλληλόμορφα και δεν αλληλόμορφα δότη (Πίνακας 2? Εικ. S5 στο αρχείο S1).

Ορατή είναι «ενημερωτικό» θέσεις που παρουσιάζουν δότη και ασθενή συγκεκριμένα αλληλόμορφα σε προ -BMT λεμφοκύτταρα. Οι τόποι όγκου παρατίθενται κατά σειρά σχετική αφθονία των αλληλόμορφα δότη-ειδική (κόκκινο αστερίσκο) σε σύγκριση με τον ασθενή συγκεκριμένες (μπλε αστερίσκο) και την κοινή αλληλόμορφα (μαύρο αστερίσκο). Αλληλόμορφο κορυφές & lt? 50 σχετικές μονάδες φθορισμού λογοκρισία ως «μη πρόσκληση» (ανοιχτοί κύκλοι). Τόπους χωρίς ανιχνεύσιμα αλληλόμορφα μετά την ενίσχυση με PCR (-).

Απλή αναζήτηση

Τέλος, ταιριάζει στατιστικά μοντέλα για να συγκρίνουν την πιθανότητα σύντηξης κυττάρων δότη BMDC-όγκου σε σχέση με τη μόλυνση των λευκοκυττάρων του δότη (Εικ . 4), που περιγράφεται λεπτομερώς στα Σχ. S6, S7, S8, S9, Πίνακας S2 στο αρχείο S2. Το μοντέλο Fusion ταιριάζει καλύτερα τα δεδομένα, όπως φαίνεται από τις μικρότερες deviances του (Εικ. 4Α και Β) και τα υψηλότερα log ψευδο-οριακή πιθανότητα της (LPML), η οποία υπερέβη το LPML για το μοντέλο μόλυνσης από τη διαφορά των 71,4 (Εικ. 4C και D, κόκκινη γραμμή). . Μια διαδικασία βαθμονόμησης [33] – [34] για να εκτιμήσει τη σημασία αυτής της διαφοράς απέδωσε πιθανότητες

P

& lt? 0,005 για τη μόλυνση και

P

& gt? 0.3 για τη σύντηξη (Εικόνες 4C και D ), δείχνει ότι η παρατηρούμενη LPML διαφορά είναι πολύ σπάνιο σύμφωνα με το μοντέλο της μόλυνσης, αλλά όχι σπάνια κάτω από το μοντέλο σύντηξης. Έτσι, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν σθεναρά τη σύντηξη πάνω από τη μόλυνση των κυττάρων δότη ως εξήγηση για τις παρατηρούμενες αλληλομόρφων δόσεις

Πάνελ Α και Β:. Deviances κάτω από τη μόλυνση και σύντηξη μοντέλα? μικρότερες deviances δείχνουν καλύτερη εφαρμογή. Πίνακες Γ και Δ: Μια διαδικασία βαθμονόμησης δείχνει την παρατηρούμενη διαφορά LPML (κόκκινες γραμμές) είναι σπάνια κάτω από το μοντέλο μόλυνσης αλλά τυπικά κάτω από το μοντέλο σύντηξης. Οι πιο λεπτομερείς στατιστικές αναλύσεις που παρουσιάζονται σε S2 αρχείου.

Η

Συζήτηση και Συμπεράσματα

STR αναλύσεις του όγκου DNA αποκάλυψε ότι δότη και ασθενή αλληλόμορφα ήταν παρόντες μαζί με πολλούς τόπους και ότι υπήρχαν διαδεδομένη αλληλομόρφων ανισορροπίες και ανευπλοειδία. Ένα μειονέκτημα ήταν η αδυναμία να εκτελέσει STR αναλύσεις σε μεμονωμένα κύτταρα του όγκου, αλλά για αυτό τον όγκο το κατώτερο όριο για την ανάκτηση του DNA για STR αναλύσεις ήταν περίπου 500 κύτταρα, ακόμη και με τη χρήση της διαδικασίας εκχύλισης DNA για τα κύτταρα που FFPE βελτιωμένη ανάκτηση του DNA. Έτσι, δεν θα μπορούσε οριστικά να αποκλείσει ότι τα σχέδια θα μπορούσε να οφείλεται σε ένα χιμαιρικό μείγμα κυττάρων ασθενούς όγκου και BMDCs δότη. Ωστόσο, αυτό είναι απίθανο για τους ακόλουθους λόγους: 1) Για ένα δεδομένο τόπο οι αλληλικές αναλογίες ήταν παρόμοια σε όλο τον όγκο. Είναι δύσκολο να εξηγήσουμε αυτά τα επαναλαμβανόμενα μοτίβα, καθώς εξαιτίας της χιμαιρικά μείγματα, καθώς αυτό θα απαιτούσε ότι οι διάφοροι τύποι κυττάρων υπήρχαν μαζί στις ίδιες αναλογίες σε όλο τον όγκο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ενώ το μεγαλύτερο μέρος του ενημερωτικού τόπους όγκου έπρεπε ασθενούς και την κοινή αλληλόμορφα σε μεγαλύτερη σχετική αφθονία στο δότη συγκεκριμένα αλληλόμορφα, θέση του όγκου D13S317 ανατράπηκε, με το αλληλόμορφο ασθενή συγκεκριμένες απουσιάζει και το αλληλόμορφο δότη ειδικά στο προσκήνιο. Από την αρχική δόση του γενωμικού DNA για κάθε δείγμα ήταν καθοριστική όσον αφορά την ένταση του προϊόντος PCR και διέφεραν σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων, δεδομένης της συνέπειας στην αλληλόμορφη αναλογίες από δείγμα σε δείγμα την αναστροφή της δοσολογίας DNA στο γενετικό τόπο D13S317 δεν μπορεί να εξηγηθεί από προτιμησιακό PCR ή μολύνσεως από λευκοκύτταρα. 2) Τα κύτταρα όγκου αποκόπηκαν από περιοχές απαλλαγμένες από LCA-θετικών κυττάρων (Εικ. 1). 3) Είναι απίθανο ότι τα αποτελέσματα οφείλονται σε μολυσματικό DNA από εξωγενείς πηγές. Κάθε μολυσματικό DNA θα έπρεπε να έρθει από το δότη ή τον ασθενή αφού όλα τα αλληλόμορφα ανιχνεύονται στα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να εξηγηθεί σε λεμφοκύτταρα προ-μεταμόσχευση από ένα ή το άλλο από αυτά τα άτομα. Μία πηγή τέτοιας μόλυνσης θα μπορούσε να είναι οι ίδιοι τα λεμφοκύτταρα που περιείχαν τεράστιες ποσότητες DNA σε σύγκριση με εκείνα στα δείγματα του όγκου. Ωστόσο, αυτό αποκλείστηκε επειδή τα λεμφοκύτταρα που ανακτώνται από μακροχρόνια αποθήκευση σε υγρή Ν

2 μόνο αφού είχαν ολοκληρωθεί οι αναλύσεις του όγκου. Επίσης, υπήρξε διάχυτη πηγή μολυσματικών DNA στον όγκο, θα έπρεπε να ήταν παρούσα σε επίπεδα παρόμοια στις νεκρωτικές περιοχές και αυτό δεν ήταν η περίπτωση, όπως συζητήθηκε παραπάνω. 4) στατιστικές αναλύσεις μας από τα αλληλόμορφα πρότυπα υποστήριξε σθεναρά την κυτταρική σύντηξη BMDC-μελανώματος πάνω από μοντέλα μόλυνσης των λευκοκυττάρων.

Στη βιολογία των βλαστικών κυττάρων, τόσο δια-και σύντηξης φαίνεται να είναι λειτουργική στη μετατροπή των βλαστικών κυττάρων σε διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα [ ,,,0],35] – [38]. Ωστόσο, η προέλευση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων /καρκινικά κύτταρα έναρξης είναι αμφιλεγόμενη. Σε δύο προηγούμενες εκθέσεις της δευτεροβάθμιας malignances προκύπτουν σε ασθενείς μετά από αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών, τα γονίδια δότης βρέθηκαν στα καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας έντονα σύντηξης [23] – [24]. Αλλά σε καμία περίπτωση ήταν ασθενή ειδικά γονίδια εντοπίστηκαν και στα καρκινικά κύτταρα και εναλλακτικούς μηχανισμούς για σύντηξη δεν μπορεί να αποκλειστεί, όπως δια-βλαστικών κυττάρων δότη σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο στον όγκο που περιγράφεται στο παρόν, ιατροδικαστική STR αναλύσεις αποκάλυψαν ότι και οι δύο δότη και αλληλόμορφα ασθενής ήταν παρόντες στα κύτταρα όγκου όλη και ο όγκος εμφανίστηκε να αποτελείται σε μεγάλο βαθμό, αν όχι αποκλειστικά υβριδίων κυττάρων BMDC-όγκου. Επιπλέον, οι επαναληπτικοί αλληλική πρότυπα για κάθε γενετικό τόπο σε όλο τον όγκο έδειξε μία κλωνική προέλευση της μετάστασης και πρότεινε ότι ο όγκος που δημιουργείται από μια προηγούμενη περίπτωση σύντηξης μεταξύ ενός δότη BMDC και ενός καρκινικού κυττάρου ασθενή. Έτσι, τουλάχιστον σε αυτήν την περίπτωση, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το κύτταρο ογκογενή ήταν ένα υβριδικό κύτταρο BMDC-όγκου. Ο βαθμός στον οποίο ο μηχανισμός αυτός λειτουργεί σε άλλα όγκους μένει να καθοριστεί.

Σε παλαιότερες μελέτες, τα υβρίδια πειραματικών όγκων που δημιουργούνται

in vitro

μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ή ινοβλάστες γενικά κατασταλεί ογκογονικότητα και την έκφραση των διαφοροποιημένων λειτουργιών, που οδηγεί στην ανακάλυψη των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [39] – [40]. Αλλά αργότερα, χρησιμοποιώντας μακροφάγα ως εταίροι σύντηξης με κύτταρα μελανώματος, του επακόλουθου υβρίδια εκφραζόμενων γονιδίων και διαφοροποιημένων γνωρίσματα από τους δύο γονείς και η μετάσταση ήταν σημαντικά ενισχυμένη [7] – [11]. Αυτό έδειξε συν-έκφραση epigenomes από δύο γονικές σειρές. Συν-εκφράζεται υβρίδιο γονιδιώματα θα μπορούσε να εξηγήσει την πολυπλοκότητα των προτύπων έκφρασης γονιδίου σε καρκινικά κύτταρα και επίσης πώς τα κακοήθη κύτταρα θα μπορούσαν να έχουν ένα τόσο μεγάλο ρεπερτόριο του μυελοειδούς-όπως ικανότητες, όπως η αγγειογένεση, μετατροπές μήτρα, κινητικότητα, χημειόταξη και τις οδούς του ανοσοποιητικού σηματοδότησης, καθώς και ως υφίστανται επιδερμική-μεσοδέρματος μετάβαση [1], [41].

Ένα μοντέλο για μετάσταση που προκύπτουν από σύντηξη κυττάρων που προέρχονται από μυελό των οστών είναι διαγραμματικά σχηματικά στο Σχήμα 5. Αν και αυτό έχει σε μεγάλο βαθμό επαληθεύεται ζωικά μοντέλα όγκων και κυτταρική καλλιέργεια, τα αποδεικτικά στοιχεία για τη σύντηξη στον καρκίνο του ανθρώπου έχει μέχρι τούδε λείπει. Τα ευρήματά μας δείχνουν για πρώτη φορά σε έναν άνθρωπο καρκίνου που παραγωγή ενός μετάστασης και την απόκτηση του έκτροπου γενετικά μοτίβα του προέκυψαν από την σύντηξη και γονιδιωματικό υβριδισμό μεταξύ ενός BMDC και ενός καρκινικού κυττάρου. Ανάλογα με τη συχνότητα τέτοιων γεγονότων, τα ευρήματα θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για την κατανόηση μετάσταση, συμπεριλαμβανομένων των προέλευση των καρκινικών κυττάρων για την έναρξη και την επιγονιδιώματος καρκίνου.

Ένα κινητικό BMDC (κόκκινο), όπως ένα μακροφάγων ή βλαστικών κυττάρων είναι που σε ένα καρκινικό κύτταρο (μπλε). Οι εξωτερικές κυτταρικές μεμβράνες των δύο κυττάρων γίνει συνδέονται. Η σύντηξη πραγματοποιείται με το σχηματισμό ενός δι-εμπύρηνα ετεροκάρυο που έχει ένα πυρήνα από κάθε μία από τους εταίρους σύντηξης. Η ετεροκαρυωτικό περνά μέσα από γονιδιωματικής υβριδοποίησης δημιουργώντας ένα υβριδικό μελάνωμα-BMDC με συν-εκφράζεται epigenomes, προσδίδει απορυθμισμένη κυτταρική διαίρεση και την μεταστατική ικανότητα στο υβριδικό.

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Τα σχήματα S1, S2, S3, S4, S5 και πίνακα S1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0066731.s001

(PDF)

αρχείου S2.

Σχήματα S6, S7, S8, S9 και Πίνακας S2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0066731.s002

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθ Douglas Παράτολμο, Ιατρική Σχολή του Γέιλ, για πρώτη προτείνοντας τη χρήση των δευτεροπαθών κακοηθειών μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών και για τη βοήθειά του με το χειρόγραφο.