Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή σπλαγχνική κακοήθεια στη Δυτική άνδρες και μια σημαντική αιτία των θανάτων από καρκίνο . Αυξημένη ενεργοποίηση των οδών ΑΚΤ και NFkB έχουν ταυτοποιηθεί ως κρίσιμα στάδια στην έναρξη του καρκίνου του προστάτη και της εξέλιξης. GGAP2 (GTP-δεσμευτική και ΟΤΡάσης πρωτεΐνη ενεργοποίησης 2) είναι μία πρωτεΐνη πολλών τομέων που περιέχει ένα Ν-τερματικό πεδίο Ras ομολογία (ΟΤΡάσης), ακολουθούμενο από ένα χώρο ΡΗ, ένα C-τερματικό πεδίο GAP και έναν τομέα επανάληψης ανκυρίνης. GGAP2 μπορεί άμεσα να ενεργοποιεί την σήμανση μέσω δύο οδών ΑΚΤ και NFkB και δρα ως κόμβος των αλληλοπαρεμβολών μεταξύ αυτών των οδών. Αυξημένη έκφραση GGAP2 είναι παρούσα σε τρία τέταρτα των καρκίνων του προστάτη. Μεταλλάξεις του GGAP2 έχουν αναφερθεί σε κυτταρικές σειρές από άλλες κακοήθειες. Ως εκ τούτου, αναλύθηκε 84 προστάτη καρκινικούς ιστούς και 43 καλοήθεις ιστούς του προστάτη για σωματικές μεταλλάξεις σε GGAP2 με άμεση αλληλούχιση των μεμονωμένων κλώνων που προέρχονται από το κενό και ΟΤΡάσης τομείς των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Συνολικά, το ήμισυ των καρκίνων που περιέχονται μεταλλαγμένων κλώνων τομέα GAP και στο 20% των καρκίνων, 30% ή περισσότερο των κλώνων ήταν μεταλλαγμένο στον τομέα GAP. Παραδόξως, οι μεταλλάξεις ήταν ετερογενής και μη κλωνική, με πολλαπλές διαφορετικές μεταλλάξεις είναι παρούσα σε πολλούς όγκους. Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν στην ανάλυση του τομέα ΟΤΡάσης. Μεταλλαγμένες πρωτεΐνες GGAP2 είχαν σημαντικά υψηλότερα μεταγραφική δραστικότητα χρησιμοποιώντας ΑΡ-1 αποκρίνεται ρεπόρτερ κατασκευάσματα σε σύγκριση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Επιπλέον, η παρουσία αυτών των μεταλλάξεων συσχετίστηκε με την επιθετική κλινική συμπεριφορά. Η παρουσία υψηλής συχνότητας μη κλωνική μεταλλάξεις ενός μοναδικού γονιδίου είναι νέα και αντιπροσωπεύει ένα νέο τρόπο γενετική αλλοίωση που μπορούν να προωθήσουν την εξέλιξη του όγκου. Ανάλυση μεταλλάξεων στον καρκίνο έχει χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει το αποτέλεσμα και κατευθύνει τις θεραπευτικές αναγνώρισης στόχου αλλά τέτοια ανάλυση έχει επικεντρωθεί σε κλωνική μεταλλάξεις. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρειαστεί να αξιολογηθούν καθώς και μη κλωνική μεταλλάξεις υψηλής συχνότητας

Παράθεση:. Cai Υ, Wang J, Ren C, Ittmann M (2012) Η συχνή ετερογενής εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις της GGAP2 στον καρκίνο του προστάτη : Συνέπειες για Tumor Βιολογίας, Κλωνικότητα και Ανάλυση μεταλλάξεων. PLoS ONE 7 (2): e32708. doi: 10.1371 /journal.pone.0032708

Επιμέλεια: Sharon Α Glynn, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ιρλανδίας Galway, Ιρλανδία

Ελήφθη: 1 του Δεκέμβρη 2011? Αποδεκτές: 31 Ιανουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Φεβρουαρίου, 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση: Υποστήριξη για MI κατέστη δυνατή μέσω του Υπουργείου Άμυνας του προστάτη προγράμματος Έρευνας για τον Καρκίνο (W81XWH-07-1-0023? Http:. //Cdmrp .army.mil), το National Cancer Institute στο Dan L. Ντάνκαν Κέντρο Καρκίνου (P30CA125123? www.nih.gov) και με τη χρήση των εγκαταστάσεων του Michael E. DeBakey Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων Medical Center (www.houston .va.gov). Υποστήριξη για το YC κατέστη δυνατή μέσω του προγράμματος του Υπουργείου Άμυνας του προστάτη Cancer Research (W81 WH-07-01-0220? https://cdmrp.army.mil). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια ποικιλία από γενετικές και επιγενετικές μεταβολές έχουν περιγραφεί σε καρκίνο του προστάτη. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει συνεπή πρότυπα του αριθμού αντιγράφων αλλαγές, όπως η απώλεια 8ρ και 13q14 και αύξηση των 8q24 σε κλινικά εντοπισμένο και προχωρημένους καρκίνους του προστάτη [1], [2]. Επιγενετικές διαταραχές όπως μεθυλίωση είναι επίσης κοινά σε καρκίνο του προστάτη. Αντίθετα, οι περισσότερες μελέτες μέχρι σήμερα έχουν δείξει μόνο σπάνιες μεταλλάξεις κλώνων σημείο σε κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη [2], [3]. Σε πιο προχωρημένο καρκίνους του προστάτη, κλωνική σημειακών μεταλλάξεων των γονιδίων καταστολής όγκου όπως ΡΤΕΝ [4] και p53 [3] είναι πιο συχνές, σε αντίθεση με την χαμηλή συχνότητα μετάλλαξης αυτών των γονιδίων σε εντοπισμένο καρκίνο του [5], [6], αλλά δεν είναι ακόμη κοινά σε σύγκριση με τις περισσότερες κακοήθειες. Ενεργοποίηση κλωνική μεταλλάξεις σε ογκογονίδια, όπως RAS, δεν είναι κοινή σε καρκίνο του προστάτη στις ΗΠΑ [3], σε αντίθεση με την πιο συχνή μετάλλαξη παρατηρείται σε άλλους κοινούς ανθρώπινους καρκίνους όπως του παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα. Οι μεταλλάξεις του υποδοχέα ανδρογόνων Κλωνικές φαίνεται στο ευνουχισμού καρκίνο του προστάτη και ανθεκτικά φαίνεται να επιλέγονται για ως μηχανισμός με τον οποίο τα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη μπορούν να επιβιώσουν σε χαμηλά ανδρογόνα περιβάλλον [3]. Έτσι διαθέσιμα δεδομένα υποδεικνύουν ότι κλωνική μεταλλάξεις σημείου, ιδιαίτερα ογκογονίδια, είναι σπάνια σε κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη.

GGAP2 (επίσης γνωστή ως PIKE-Α) είναι μία G-πρωτεϊνη η οποία έχει μια ισχυρή δραστικότητα ΟΤΡάσης, όπως αναμενόταν από τον τομέα της ομολογίας RAS. Περιέχει επίσης μια περιοχή GAP μπορεί να ενεργοποιήσει τη δραστηριότητα ΟΤΡάσης είτε μέσω ενδομοριακών ή αλληλεπίδραση. GGAP2 δεσμεύεται σε ενεργοποιημένα ΑΚΤ και έντονα ενισχύει τη δράση της και αυτή η αλληλεπίδραση προωθείται από GTP δεσμευτικών [7]. Δείξαμε ότι ενεργοποιείται ΑΚΤ μπορεί να δεσμεύει και φωσφορυλιώνει GGAP2 στη σερίνη 629, η οποία ενισχύει δέσμευσης GTP από GGAP2 και ενεργοποίηση ΑΚΤ [8]. Το φωσφορυλιωμένο GGAP2 μπορεί επίσης να δεσμεύσει το ρ50 υπομονάδα της NFkB και ενισχύει NFkB μεταγραφική δραστηριότητα. Αυξημένη ενεργοποίηση των 3-φωσφατιδυλο-ινοσιτόλη κινάσης /ΑΚΤ και NFkB οδοί και οι δύο έχουν ταυτοποιηθεί ως κρίσιμες οδούς στον έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου σε μία ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Έχουμε αποδείξει σημαντικά αυξημένη έκφραση GGAP2 στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων του προστάτη [8]. Όταν GGAP2 εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ενισχύει τον πολλαπλασιασμό, σχηματισμό εστίαση in vitro και την εξέλιξη του όγκου in vivo. Έτσι αυξημένη έκφραση GGAP2, η οποία είναι παρούσα σε τρία τέταρτα των ανθρώπινων καρκίνων του προστάτη, μπορεί να ενεργοποιήσει δύο κρίσιμα οδούς που έχουν συνδεθεί με έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου του προστάτη και μπορεί να ενισχύσει την εξέλιξη του όγκου in vivo.

Hu et al εντόπισαν μεταλλαγμένες μορφές της GGAP2 σε σάρκωμα, νευροβλάστωμα και κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος [9]. In vitro μελέτες δείχνουν αυτές οι μεταλλαγμένες μορφές έχουν αυξημένη δραστηριότητα ΘΤΡάσης και ενεργοποιούν πιο έντονα ΑΚΤ από άγριου τύπου GGAP2. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις οι μεταλλάκτες GGAP2 την προαγωγή της ανάπτυξης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος και μετασχηματισμό κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 [10]. Ως εκ τούτου, προσπάθησε να εντοπίσει μεταλλάξεις του GGAP2 σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Έχουμε βρει υψηλές συχνότητες του εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις GGAP2 σε κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη του ανθρώπου. Παραδόξως, οι μεταλλάξεις είναι ετερογενείς και μη κλωνική, με πολλαπλές διαφορετικές μεταλλάξεις είναι παρούσα σε πολλούς όγκους. Η παρουσία αυτών των μεταλλάξεων συσχετίστηκε με την επιθετική κλινική συμπεριφορά και αυξημένη ΑΡ-1 μεταγραφικής δραστικότητας. Έτσι, GGAP2 είναι η πιο συχνά μεταλλαγμένο ογκογονίδιο στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη μέχρι σήμερα, αλλά οι μεταλλάξεις είναι ετερογενείς και όχι κλωνική, υπονοώντας σημειώνονται κλωνική ετερογένεια σε κλινικά εντοπισμένο ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη. Η παρουσία υψηλής συχνότητας μη κλωνική μεταλλάξεις ενός μοναδικού γονιδίου είναι νέα και αντιπροσωπεύει ένα νέο τρόπο γενετική αλλοίωση που μπορούν να προωθήσουν την εξέλιξη του όγκου.

Αποτελέσματα

Η ανάλυση της μεταλλαγής της περιοχής GAP του GGAP2

για να προσδιορίσετε αν GGAP2 μεταλλάσσεται σε καρκίνο του προστάτη που αρχικά επικεντρώθηκε στην περιοχή GAP, δεδομένου ότι η περιοχή αυτή είναι μια σημαντική αρνητικός ρυθμιστής της δραστηριότητας GGAP2. Αναλύσαμε τα cDNA από 15 καρκίνους και 9 καλοήθεις ιστούς του προστάτη από ριζική προστατεκτομή δείγματα. Ο τομέας GAP ενισχύθηκε και ξεχωριστοί κλώνοι απομονώθηκαν και η αλληλουχία τους. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 1. Δώδεκα από δεκαπέντε περιπτώσεων καρκίνου είχε τουλάχιστον ένα κλώνο με παρανοηματικές GGAP2 ή /και να σταματήσει μεταλλάξεις ενώ μόνο 2 από 9 καλοήθεις περιπτώσεις είχαν τέτοιες μεταλλάξεις. Οι καλοήθεις περιπτώσεις είχαν μόνο μία μεταλλαγμένο κλώνο καθένα ενώ μέχρι 42 τοις εκατό των κλώνων στις περιπτώσεις καρκίνου του μεταλλάχθηκαν. Συνολικά 38 από 206 κλώνων από τους ιστούς του καρκίνου του ήταν μεταλλαγμένα έναντι 2 από 137 σε καλοήθεις. Αυτή η διαφορά ήταν πολύ στατιστικώς σημαντική (p Η συχνότητα παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη που παρατηρείται στον τομέα GAP σε καρκινικούς ιστούς ήταν 370 × 10

-6 ανά bp αλληλουχία και για τον τομέα ΘΤΡάση 298 × 10

-6 ανά bp. Bielas et al [15] έδειξαν ότι η συχνότητα της τυχαίας μετάλλαξης σε καρκινικούς ιστούς είναι περίπου 2,1 × 10

-6 ανά bp σε πολλαπλές μορφές καρκίνου. Έτσι παρατηρούμενη συχνότητα μας για παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη σε GGAP2 είναι 100-φορές υψηλότερο από το ποσοστό φόντο της μετάλλαξης, υπονοώντας έντονα επιλεκτικό πλεονέκτημα ανάπτυξης για τις μεταλλαγμένων κλώνων. Βρήκαμε επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας μετάλλαξης στον τομέα GAP και κλινικές και παθολογικές παραμέτρους που σχετίζονται με την επιθετική νόσο, υποδεικνύοντας ότι είναι κλινικά σημαντική. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι στο 20% των περιπτώσεων που εξετάστηκαν ότι περισσότερο από το 30% των κλώνων από καρκίνο ήταν μεταλλαγμένο στον τομέα GAP. Δεδομένου ότι οι ιστοί που αναλύθηκαν ήταν περίπου το 80% του καρκίνου, κατά μέσο όρο, τουλάχιστον το 75% των καρκινικών κυττάρων θα περιέχει ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο (υποθέτοντας μία μετάλλαξη ανά κύτταρο) σε τέτοιες περιπτώσεις. Αυτό είναι ένα ελάχιστο ποσό, δεδομένου ότι δεν περιλαμβάνει τις μεταλλάξεις της περιοχής ΟΤΡάσης και πιθανές μεταλλάξεις σε άλλες περιοχές της GGAP2, οι οποίες έχουν αναφερθεί [9]. Έτσι, οι ετερογενείς μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν υψηλής συχνότητας θα μπορούσε να συμβάλει άμεσα στην τοπική ανάπτυξη του όγκου σε πολλές περιπτώσεις. Επιπλέον, οι πιο ισχυρές μεταλλάξεις μπορεί να προάγει την μετάσταση ειδικών κυτταρικών κλώνων. υπάρχουν στοιχεία που να υποστηρίζουν την ιδέα ότι μη κλωνική μεταλλάξεις p53 σε πρωτογενείς καρκίνους του προστάτη μπορεί να οδηγήσει σε μεταστατικές βλάβες [16]. Η υψηλή συχνότητα των ποικίλων μη κλωνική μεταλλάξεις στο GGAP2 μπορεί να παρέχει πολλές πιθανές μεταστατικό κλώνους.

Οι περισσότερες μελέτες μεταλλάξεων στον καρκίνο έχουν δικαιολογημένα επικεντρώθηκε στην κλωνική μεταλλάξεις δεδομένου ότι είναι ευκολότερο να δούμε τη σημασία αυτών των μεταλλάξεων. Ετερογενείς μη κλωνική μεταλλάξεις δεν θα ανιχνευθούν από πολλές αναλυτικές μεθόδους ή δεν αναλύονται περαιτέρω δεδομένου ότι είναι ασαφές κατά πόσον μπορούν να είναι αντικείμενα PCR ή απλά μεταλλάξεις των επιβατών. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι σε ορισμένες περιπτώσεις υψηλής συχνότητας ετερογενείς μη κλωνική μεταλλάξεις μπορεί να συμβεί και μπορεί να είναι κλινικά σημαντική. Μένει να προσδιοριστεί πόσο συχνά συμβαίνει αυτό με τα άλλα γονίδια καταστολής όγκων και ογκογονίδια. Σε ορισμένες περιπτώσεις ομάδες έχουν αναλύσει πρωτογενείς καρκίνους προστάτη για την παρουσία της μετάλλαξης χρησιμοποιώντας απλούς προσδιορισμούς πολυμορφισμός έλικος που ακολουθείται από αλληλούχηση των ασυνήθιστα μεταναστεύουν συγκροτήματα και βρέθηκε σχετικά υψηλούς ρυθμούς μετάλλαξης σε μερικά γονίδια. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, οι μεταλλάξεις σε plexin-B1 σε ταυτοποιήθηκαν στο 46% των πρωτογενών καρκίνων του προστάτη [17], αλλά είναι δύσκολο να προσδιοριστεί το ακριβές ποσοστό των κυττάρων του όγκου σε έναν όγκο με την εν λόγω μετάλλαξη. Δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις είναι αρκετά συχνές ώστε να δώσει μια ξεχωριστή ταινία για το λανθάνον δοκιμασίες μόνο διάπλασης πολυμορφισμού πρέπει να είναι αρκετά συχνή, αν και δεν κλωνική. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα ευρήματά μας σε GGAP2 στην οποία οι μεταλλάξεις είναι εξαιρετικά ετερογενείς. Έτσι μεταβλητή επίπεδα μη κλωνική μεταλλάξεων, από εξαιρετικά ετερογενείς προς ολιγοκλωνικά μπορούν να υπάρχουν σε καρκίνο του προστάτη. Από την άλλη πλευρά, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση παρόμοια με τη δική μας, Steinkamp et al [18] η αλληλουχία mRNAs υποδοχέα ανδρογόνων από ανθεκτικά ευνουχισμού μετάσταση του καρκίνου του προστάτη. Βρήκαν υψηλά επίπεδα ετερογένειας των μεταλλάξεων με πολλές μεταλλάξεις είναι παρούσα σε μόνο το 5-10% των κλώνων. Το εύρημα αυτό είναι παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε GGAP2. Η ανδρογόνων υποδοχέας παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου του προστάτη και την επιβίωση έτσι υπάρχει ισχυρή εκλεκτική πίεση για να διατηρήσει μεταλλάξεις που οδηγούν σε δραστηριότητα στο πρόσωπο του αντι-ανδρογόνων θεραπείες. Δείξαμε ότι GGAP2 συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη και μπορεί να ενεργοποιήσει δύο βασικές οδούς σε προστάτη εξέλιξης του καρκίνου δηλαδή η ΝΡκΒ και οδούς ΑΚΤ. Επιπλέον, έχει ένα σχετικά μεγάλο αρνητικό ρυθμιστικό πεδίο που μπορεί να είναι επιρρεπή σε διάσπαση, η οποία μπορεί να καταστήσει πολύ ευκολότερο να ενεργοποιήσει κάποιες από ογκογονίδια όπως RAS που απαιτούν ειδικές σημειακές μεταλλάξεις. Πρόσθετες αναλύσεις θα χρειαστούν για να καθορίσει το βαθμό στον οποίο άλλα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και άλλα ογκογονίδια, έχουν υψηλή συχνότητα μη κλωνική εσφαλμένου νοήματος ή να σταματήσει μεταλλάξεις.

Η δυνατότητα για μη κλωνική μετάλλαξη υψηλής συχνότητας προσθέτει άλλο ένα στρώμα πολυπλοκότητα στο συγκρότημα μεταλλάξεως τοπίο των κοινών καρκίνων που έχει αποκαλυφθεί από μεγάλης κλίμακας προσδιορισμό της αλληλουχίας [19], [20], [21]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, έχει δειχθεί ότι οι μεταλλάξεις σε μη κλωνική K-RAS στον καρκίνο του πνεύμονα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς της τυροσινικής κινάσης επηρεάσουν σημαντικά την επιβίωση [22]. Έτσι, θα είναι σημαντικό να προσδιοριστεί ο βαθμός στον οποίο συμβαίνουν μη κλωνική μεταλλάξεις σε όλη την ευρεία γκάμα των γονιδίων στον προστάτη και άλλων μορφών καρκίνου και κατά πόσο αυτές επηρεάζουν την επιβίωση και την ανταπόκριση στη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ανθρώπινου ιστού

Κανονική ζώνη και καρκινικούς ιστούς περιφερικών συλλέχθηκαν με τη γραπτή συγκατάθεση από τους άνδρες που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή με το Baylor College of Medicine του προστάτη Προγράμματος καρκινικού ιστού Τράπεζας και καταψύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Οι ασθενείς ήταν ηλικίας 43 έως 73 ετών και ήταν κυρίως Καυκάσιοι. Σε όλες τις περιπτώσεις, η προεγχειρητική απεικόνιση και κλινική εξέταση αποκάλυψε κλινικά εντοπισμένη νόσο. Παθολογική στάσης της ριζικής προστατεκτομής δειγμάτων και πυελική λεμφαδένες έδειξαν περίπου 30% Στάδιο 2 (T2N0)? 50% Στάδιο 3 (T3N0) και 20% Στάδιο 4 (Οποιοδήποτε Τ, Ν1). Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για δωρεά ιστών για την έρευνα και οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Baylor College of Medicine Board κριτική Θεσμική. Καλοήθης ιστοί επιβεβαιώθηκε ότι είναι απαλλαγμένο από καρκίνο και καρκίνο ιστοί που περιέχονται τουλάχιστον 70% καρκίνωμα. RNA και ΟΝΑ εκχυλίσθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], [25]. PSA υποτροπή ορίστηκε ως PSA ορού & gt?. 0.2 ng /ml, με πρώιμη υποτροπή είναι υποτροπή εντός 2 ετών από τη χειρουργική επέμβαση

Μετάλλαξη ανάλυση

Το Ν-τερματικό πεδίο ΟΤΡάσης και το C-τερματικό GAP περιοχή του γονιδίου GGAP2 ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα ΤΟΡΟ PCR 2.1 χρησιμοποιώντας κιτ κλωνοποίησης ΤΟΡΟ τΑ (Invitrogen). PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Platinum Taq (Invitrogen) για να ελαχιστοποιηθεί λανθασμένη ενσωμάτωση. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση ήταν: για τον τομέα ΘΤΡάσης Forward: CCGCTCCATTCCTGAACTG? Αντίστροφη: GTTGCTGCTTGCGCAAG για τον τομέα GAP: Εμπρός: CACAGACAGCCAAAGCGA? Αντίστροφη: CCAAAAGCAGGAGAACGGTAG. DNAs αλληλουχήθηκαν και στις δύο κατευθύνσεις και όλες οι αλλαγές ζευγών βάσεων ονομάζεται από το μηχάνημα διαβάστε της αλληλουχίας επιβεβαιώθηκαν με οπτική εξέταση ιχνών αλληλούχιση. Οι κλώνοι με ίχνη αλληλουχίας κακής ποιότητας δεν αναλύθηκαν. Δεν ανιχνεύθηκαν νέες παραλλαγές ανακοινώσιμα βλαστικής.

Ιστότοπος κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση

Ενιαία νουκλεοτίδιο μεταλλαξογένεση διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Stratagene). Εν συντομία, αρχικά τεμάχια με τις στοχευόμενες μεταλλάξεις χρησιμοποιήθηκαν σε PCR για να παράγουν κατασκευές έκφρασης GGAP2 περιέχει 9 διαφορετικές μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 4. Dpn1enzyme προστέθηκε σε PCR προϊόντα για 1 ώρα στους 37 ° C για να αφομοιώσουν εκμαγείο DNA πλασμιδίου πριν από την μεταμόρφωση. Οι κλώνοι αλληλουχήθηκαν για την επαλήθευση των μεταλλάξεων.

Η

λουσιφεράσης δοκιμασίες μεταγραφικής ρεπόρτερ

λουσιφεράσης μεταγραφικές δοκιμασίες ανταποκριτού διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11] με τη χρήση κυττάρων 293Τ. Τόσο ΑΡ-1 φορέα αναφοράς λουσιφεράσης και φορέα pRL Renilla λουσιφεράσης λήφθηκαν από την Stratagene (Cat # 219077 και # E2810). Οι pRL Renilla Luciferase Reporter Vectors προορίζονται για χρήση ως εσωτερικό ρεπόρτερ ελέγχου σε συνδυασμό με την ΑΡ-1 σε κύτταρα 293Τ παράλληλης διαμολύνσεως. Παροδική διαμόλυνση διεξήχθη εις τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε και ομαλοποιήθηκε ως προς το σήμα της λουσιφεράσης της Renilla για κάθε δείγμα. Ανεξάρτητες δοκιμασίες διεξήχθησαν 3 με 9 φορές.

Η στατιστική ανάλυση

Για να συγκρίνετε τιμές της μετάλλαξης μεταξύ των ομάδων chi τετράγωνο ή Fisher ακριβή ανάλυση πραγματοποιήθηκε. Η δραστικότητα λουσιφεράσης των μεταλλαγμένων κλώνων συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Για όλες τις δοκιμές p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Ευχαριστίες

Η βοήθεια της Patricia Castro αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη

..