Αφηρημένο

Cellular χημειοτακτισμού είναι η πιο γνωστή λειτουργία των υποδοχέων χημειοκινών που συνδέονται στενά με τη μετάσταση των όγκων. Στην πραγματικότητα, θετική έκφραση των υποδοχέων χημειοκινών θα μπορούσε επίσης να εντοπιστεί ακόμα και σε ορισμένους ασθενείς χωρίς μεταστατικούς όγκους, ενώ η κλινική σημασία αυτών των δεδομένων δεν έχει πλήρως τεκμηριωθεί. Οι μελέτες μας έχουν σχεδιαστεί για να αποσαφηνίσει τα προφίλ έκφρασης CCR4 και να διερευνήσει τις δυνατότητες ρόλο της στην ιστολογικά αρνητικούς λεμφαδένες (PN0) γαστρικό καρκίνο (GC). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) ή immunohistofluorescence ανάλυση (IHF) πραγματοποιήθηκε σε δείγματα που λαμβάνονται από 108 ασθενείς με PN0 GC. Βρήκαμε ότι CCR4 ήταν παρεκκλίνοντα υπερ-εκφράζεται ιστούς inpN0 GC, με διαφορετικά πρότυπα έκφρασης σε κύτταρα όγκου και να συνδέεται με Τ-στάδιο (

P

= 0,002). Το matrigel

in vitro δοκιμασία

εισβολή αποκάλυψε ότι η υπερ-έκφραση του CCR4 σε κυτταρικές σειρές GC ενίσχυσε σημαντικά την επεμβατική ικανότητα αυτών των κυττάρων. Τα αποτελέσματα από πραγματικού χρόνου RT-PCR και gelatinzymography παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -9 παραγωγής που προκαλείται από την αναγκαστική έκφραση του CCR4 σε κυτταρικές σειρές GC. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση CCR4 εμπλέκεται στην εισβολή του όγκου των PN0 GC και, θεωρητικά, οι ανταγωνιστές του CCR4 μπορεί να είναι χρήσιμο υποψήφιοι για τον έλεγχο νωρίς γεγονότα στην εξέλιξη του όγκου

Παράθεση:. Yang Υ, Du L, Γιανγκ Χ, Qu Α, Zhang Χ, Zhou C, et al. (2015) παρεκκλίνουσα έκφραση ΟΟΡ4 εμπλέκεται σε Όγκων εισβολή των λεμφαδένων-Αρνητική Ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10.1371 /journal.pone.0120059

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 29, Σεπτεμβρίου 2014? Αποδεκτές: τρίτης Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 19, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι τα δεδομένα τους είναι εντός του χειρογράφου και την τρέχουσα υποστήριξη του αρχείου πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81271916 και 81301506), το Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης της Κίνας (Αρ 20120131110055), Ανεξάρτητο Ίδρυμα Καινοτομίας του Πανεπιστημίου Shandong (IIFSDU, 2012TS174), το Τεχνολογικό Πρόγραμμα Shandong Ανάπτυξη (STDP, 2013GSF11859), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Shandong (Grant Νο ZR2013HM104) και το Εθνικό Key Κλινική Ιατρικό Ίδρυμα Ειδικότητες

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Όπως και οι περισσότερες των καρκίνων, γαστρικού καρκίνου (GC) είναι μια ιδιαίτερα. επιθετική κακοήθεια η οποία τείνει να εισβάλει περιβάλλοντα ιστό και μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα. Αν και οι ασθενείς με καρκίνο του στομάχου αρνητικούς λεμφαδένες έχουν καλύτερα αποτελέσματα από ό, τι τα άτομα με κομβικά μετάσταση [1, 2], μερικοί από τους οποίους εξακολουθούν να υποφέρει από τις τοπικές υποτροπές ή απομακρυσμένες μεταστάσεις μετά από θεραπευτική εκτομή [3-5]. Ο εντοπισμός πραγματικών συντελεστών ή κλειδί μόρια συνδέουν με την εξέλιξη της νόσου σε σταδιακή ασθενείς με γαστρικό καρκίνο αρνητικούς λεμφαδένες είναι απαραίτητη, δεδομένου ότι αυτοί οι ασθενείς θα μπορούσαν να επωφεληθούν από ανοσοενισχυτικό θεραπείες.

Η χημειοταξία παίζει ένα ρόλο κλειδί στη μετάσταση του όγκου, να κατευθύνει την κινητικότητα του μεταστατικά κύτταρα μέσω κλίσεις του χημειοπροσελκυστικά. Ειδικότερα, οι υποδοχείς χημειοκινών μεσολαβούν οργάνου-ειδική μετάσταση των όγκων από την αλληλεπίδραση με ταίριασμα χημειοκίνες τους στα όργανα στόχοι [6]. Γαστρικό καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να εκφράσουν διάφορους υποδοχείς χημειοκινών, όπως ο υποδοχέας χημειοκίνης 4 (CXCR4) και του υποδοχέα χημειοκίνης 7 (CCR7), και συν-επιλέξουν αυτά τα μόρια για μετάσταση [7-12]. Άλλοι ρόλοι των υποδοχέων χημειοκινών στην πρόοδο του καρκίνου, εκτός από χημειοταξία έχουν σπάνια ακάλυπτο. CCR4, ένας C-C χημειοκίνης υποδοχέα τύπου, έχει προηγουμένως επικεντρώθηκε στην βιολογική λειτουργία της σε ανοσοπαθογένειας αιματολογικών όγκων [13]. Μέχρι σήμερα, έχει δοθεί σχετικά λίγη προσοχή στον ρόλο του CCR4 στην προώθηση μετάσταση ορισμένων συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων γαστρικού καρκίνου [14-17]. Η ομάδα μας έχει δείξει ότι οι λεμφοκυττάρων πλούσια GCs έχουν την τάση να είναι πιο συχνά θετικά για CCR4, και βρήκε ένα νέο ρόλο του CCR4 στην προκαλούμενη από όγκο ανοσοκαταστολή [18], υποδηλώνοντας διάφορα προφίλ έκφραση του CCR4 σε ιστούς GC και πολυλειτουργικό ρόλο αυτού του μορίου στην εξέλιξη της GC.

είναι γνωστό ότι εισβολή είναι το πρώτο βήμα που οδηγεί σε μετάσταση καρκίνου. Αποδεικτικά στοιχεία έχουν δείξει ότι ορισμένοι υποδοχείς χημειοκινών, όπως ο CXCR4 [19] και CCR7 [20], την προώθηση των Β-κυττάρων χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία εισβολή κυττάρων μέσω αυξητική ρύθμιση ΜΜΡ-9. Πρόσφατα, Yu et al. έδειξε ότι θα μπορούσε να προωθήσει CXCR4 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω επαγωγής της έκφρασης της ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-13 σε στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [21]. Λι και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι CCR7 συμμετείχε στην ανθρώπινη εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της MMP-9 [22]. Δεν είναι σαφές, ωστόσο, εάν CCR4 θα μπορούσε επίσης να προωθήσει καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Δεδομένης της ευρείας κατανομής των υποδοχέων χημειοκινών στους όγκους ΚΑΙΤΩΝ δυναμικό ρόλους στη διείσδυση και μετάσταση όγκων, υποθέσαμε ότι PN0 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο μεταφέρουν ορισμένα χημειοκίνης υποδοχείς μπορεί να είναι πιο πιθανό να παρουσιάσουν περαιτέρω πρόοδο. Για να ελέγξετε την υπόθεσή μας, ερευνήσαμε τα προφίλ έκφρασης του CCR4 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα του PN0 ασθενείς και το ρόλο του στο γαστρικό καρκίνο κυττάρων εισβολής.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

δείγματα ιστών λήφθηκαν από 108 ασθενείς (75 άνδρες και 33 γυναίκες, ηλικίας 35-71 ετών, μέση ηλικία 62 έτη) με PN0 γαστρικό καρκίνο που υποβάλλονται σε θεραπευτική εκτομή του πρωτογενούς όγκου σε Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Shandong (Jinan, Κίνα). Χρησιμοποιήσαμε παραπάνω ταιριάζουν δίπλα φυσιολογικούς ιστούς και ιστούς του στομάχου από 56 ασθενείς με γαστρικό δυσπλασία (36 άνδρες και 20 γυναίκες, ηλικίας 35-68 ετών, με μέσο όρο ηλικίας 48 χρόνια) ως μάρτυρες. Όλες οι ιστοπαθολογικές διαγνώσεις και κακοήθεις ταξινομήσεις προσδιορίστηκαν από την ανώτερη παθολόγους κατά τη στιγμή της διάγνωσης, σύμφωνα με την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας Διεθνής ιστολογική ταξινόμηση των όγκων [23], και η μετεγχειρητική παθολογική στάσης καθορίστηκε με βάση τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (UICC) [24 ]. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο, και γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς ελήφθη επίσης.

Η ανοσοϊστοχημεία και immunohistofluorescence

IHC ή IHF έγινε σε τομές παραφίνης με τη χρήση αντισωμάτων κατά της ανθρώπινης CCR4 (LS-A351? LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, USA) και αντι-pan Cytokeratin (CK) αντίσωμα (ab80826? Abcam, Cambridge, MA, USA), ακολουθώντας τις οδηγίες που παρέχονται από κάθε κατασκευαστή. Φθορίζοντα αντισώματα περιλαμβάνουν αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού TRITC-συζευγμένο (E031320? Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Κίνα), αντι-ποντικού συζευγμένο με FITC αντισώματα κατσίκας (E0312400? Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Κίνα). Τα δείγματα έγιναν ορατές και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (IX81? Ολύμπου, Τόκιο, Ιαπωνία), καθώς και τα αποτελέσματα IHC αναλύθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18]

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο γαστρικό. καρκινικές κυτταρικές σειρές SGC-7901 και BGC-823 αγοράστηκαν από τη Συλλογή Πολιτισμού της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ℃ σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Παροδική υπερ-έκφραση του CCR4 στο SGC-7901 και BGC-823 κύτταρα

Παροδικά επιμόλυνση του πλασμιδίου EGFP-CCR4 (CCR4) ή φορέα έκφρασης EGFP (MOCK) σε γαστρικό κυτταρικές γραμμές διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18]. Και οι αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης προσδιορίστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού, αλυσίδα αντίστροφης μεταγραφής-αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR) και κυτταρομετρία ροής (FCM), αντίστοιχα.

Ποσοτικοποίηση του mRNA με RT-PCR και ανάλυση πραγματικού χρόνου RT -PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και αντίστροφη αντιδράσεις μεταγραφάσης διεξήχθησαν με kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία ). Για RT-PCR, οι εκκινητές και οι συνθήκες PCR για την ενίσχυση του CCR4 χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Και τα ανθρώπινα αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) (προς τα εμπρός εναρκτήρας, 5′-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 ‘? Αντίστροφος εκκινητής, 5′-GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3’) ήταν χρησιμοποιείται όπως διατίθεται ένα εσωτερικό πρότυπο. Για πραγματικού χρόνου RT-PCR, εκκινητές για CCR4, ΜΜΡ-9 και GAPDH και συνθήκες ενίσχυσης χρησιμοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18, 25, 26].

FCM ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν επωάστηκαν με ένα φυκοερυθρίνη (ΡΕ) μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CCR4 (FAB1567P, R &? D Systems) ή με έναν IgG2b-ΡΕ ελέγχου ισοτύπου ποντικού (IC0041P, R &? D Systems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ανάλυση FCM Στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur (Becton Dickinson, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) για την ανάλυση της έκφρασης CCR4 επί SGC-7901 και BGC-823 κύτταρα, αντίστοιχα.

προσδιορισμούς εισβολής Matrigel

Το

in vitro δοκιμασία

εισβολή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα ένθετα 24 κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει 8-μm μεμβρανών (BD Biosciences, San Jose, CA). Κάθε μεμβράνη επικαλύφθηκε με Matrigel (30 μg, Becton Dickinson, San Jose, CA) και επωάστηκαν για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 0,2 ml επιμολύνονται ή γονικά κύτταρα GC επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 χωρίς ορό με συγκέντρωση 1.5 × 10

5 /ml και τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο, και 0,6 ml RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS ήταν προστίθεται στο βασεοπλευρικό θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ℃ με 5% CO

2, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.2% ηωσίνη Υ Ο αριθμός των κυττάρων τα οποία είχαν μεταναστεύσει στην βασική πλευρά της μεμβράνης ποσοστώθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός στα 200 × μεγέθυνση.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας CCK8 (Beyotime, Haimen, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm μήκος κύματος. Κάθε χρονικό σημείο επαναλήφθηκε σε τρία φρεάτια και η δοκιμασία independentlyperformed για τρεις φορές.

Ζελατίνη zymography

Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση μετά από 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και διαχωρίστηκαν σε ένα πήγμα SDS-PAGE που περιείχε 0,1% (w /v) ζελατίνη. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες αναδιατάχθηκαν με πλύση της πηκτής δύο φορές για 40 λεπτά σε 2.5% Triton Χ-100 που ακολουθείται από επώαση για 18 ώρες στους 37 ° C σε ένα μίγμα που περιέχει Tris-HCl 50 mM (ρΗ 7,6), CaCl

2 5mMm και NaCl 200 mM. Στη συνέχεια, η πηκτή ξεπλύθηκε σύντομα σε απεσταγμένο νερό και χρωματίστηκαν με 0.25% Coomassie Brilliant Blue R250 /45% μεθανόλη /10% οξικό οξύ για 4 ώρες και στη συνέχεια αποχρωματίζεται σε 45% μεθανόλη, 8% οξικό οξύ. Οι πηκτές στη συνέχεια σαρώνονται και φωτογραφήθηκαν με συστήματα Kodark.

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν και εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD. Η σχέση μεταξύ της έκφρασης CCR4 και Τ-στάδιο αναλύθηκε με δοκιμασία χ τετράγωνο. Άλλα δεδομένα αναλύθηκαν με Student t τεστ ή ANOVA όπου αυτό κρίνεται σκόπιμο. Ένα

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση στατιστικού λογισμικού (εκδόσεις 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Υπερ-έκφραση του CCR4 με διακριτά πρότυπα έκφρασης σε PN0 αρχές του ιστού γαστρικού καρκίνου

έκφραση CCR4 στα καρκινικά κύτταρα ανιχνεύθηκε σε διάφορα επίπεδα. Μεταξύ 108 ιστούς παραφίνης, 29 περιπτώσεις (26,9%) έδειξε αρνητική έκφραση (-), 30 περιπτώσεις (27,8%) έδειξε ασθενή έκφραση (+), 35 περιπτώσεις (32,4%) έδειξε μέτρια έκφραση (++), και 14 περιπτώσεις (13,0%) έδειξε ισχυρή έκφραση (+++) (Σχ. 1Α-D). Όλα τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς στομάχι έδειξε αρνητική χρώση για CCR4, και μόνο 2 (3,6%) περιπτώσεων γαστρικού δυσπλασίας έδειξαν ασθενή έκφραση του CCR4 μεμβράνης (Σχ. 1 Ε και F).

CCR4 ανιχνεύθηκε σε διαφορετικά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένων αρνητική έκφραση (-) (Α), ασθενή έκφραση (+) (Β), μέτρια έκφραση (++) (C) και ισχυρή έκφραση (+++) (D). Η έκφραση ήταν αρνητική σε μη νεοπλασματικά κύτταρα (η δεξιά περιοχή στην εικόνα) που γειτνιάζουν με CCR4 θετικό γαστρικό καρκίνο κύτταρα (Ε), και ασθενής έκφραση του CCR4 μεμβράνης βρέθηκε σε γαστρικό προνεοπλαστικών βλαβών (F). Μεγέθυνση, × 400 (AD, F), × 200 (Ε).

Η

Τόσο έκφραση μεμβράνης και κυτταροπλάσματος του CCR4 παρατηρήθηκαν συχνότερα σε καλά διαφοροποιημένο φωλιές όγκου του εντερικού τύπου, ενώ ο μειο- διαφοροποιημένα κύτταρα έτειναν να εμφανιστεί μια κυτταροπλασματική σχήμα έκφρασης CCR4 σε διάχυτη τύπου γαστρικό καρκίνο (Εικ. 2). Ένα ενδιαφέρον φαινόμενο ήταν ότι τα κύτταρα με υψηλά επεμβατικές δυνατότητες, όπως η μυϊκή εισβολή, αγγειακή διείσδυση και νεύρο εισβολή, εμφανίζεται επίσης μια κυτταροπλασματική πρότυπο έκφρασης CCR4 (Εικ. 3).

Ο πράσινος φθορισμός παριστά θετικά κύτταρα με μεμβράνη και κυτταροπλασματική κατανομή των CK, κόκκινο φθορισμό αντιπροσωπεύει CCR4-θετικών κυττάρων, ενώ κίτρινο αντιπροσωπεύει τη συγχώνευση των δύο. Και οι δύο μεμβράνη και το κυτταρόπλασμα έκφραση του CCR4 παρατηρήθηκαν πιο συχνά σε καλά διαφοροποιημένο φωλιές όγκου του εντερικού τύπου, ενώ οι λιγότερο διαφοροποιημένα κύτταρα έτειναν να εμφανίσετε μια κυτταροπλασματική μοτίβο έκφρασης ΟΟΡ4 στο διάχυτο τύπο καρκίνο του στομάχου. Η μεγέθυνση, × 400.

Η

έκφραση CCR4 ήταν χαμηλή σε λιγότερο επιθετική και καλά διαφοροποιημένο καρκίνο κύτταρα (Α), whereascytoplasmic έκφραση CCR4 ήταν υψηλή σε άκρως διηθητικό καρκίνο κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με μυϊκή εισβολή (Β) , αγγειακή διείσδυση (C) και νεύρο εισβολή (D). Μεγέθυνσης, × 400.

Η

ΟΟΡ4 υπερέκφραση προωθεί γαστρικό εισβολή των καρκινικών κυττάρων

Στις τυπικές διατομές, είχε επίσης δείξει ότι το επίπεδο έκφρασης του CCR4 έτεινε να αυξάνεται με το βάθος της προσβολή όγκου (Εικ. 3). Η ανάλυση IHC σαφώς έδειξε ότι η υπερέκφραση του CCR4 συσχετιζόταν θετικά με το στάδιο Τ (

P

= 0,002), αγγειακή εισβολή (

P

= 0.001) και περινευρικό εισβολή (P = 0,002) σε PN0 GC (Πίνακας 1).

η

Έχουμε αναφέρει ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης CCR4 ήταν αρκετά χαμηλή σε ορισμένες γαστρικού κυτταρικές σειρές [18], και έτσι να πάρετε περισσότερες πληροφορίες στο ΟΟΡ4 μεσολάβηση εισβολή όγκου , υπερ-έκφραση του CCR4 στο γαστρικό κυτταρικές σειρές διεξήχθη όπως περιγράψαμε προηγουμένως [18]. Υψηλή αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR, FCM και μικροσκοπία φθορισμού, αντίστοιχα (Σχ. 4Α-C). Η EGFP εκφράστηκε στον πυρήνα, κυτόπλασμα και μεμβράνη των κυττάρων ελέγχου φορέα, τα οποία έχουν επιμολυνθεί με το πλασμίδιο MOCK? και η φθορίζουσα πρωτεΐνη σύντηξης εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη του πλασμιδίου επιμολυσμένα κύτταρα CCR4. δοκιμασία εισβολή Matrigel έδειξε ότι ο αριθμός των γαστρικών καρκινικών κυττάρων EGFP-ΟΟΚ4-επιμολυσμένα διέρχεται από το matrigel ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές των ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα γαστρικού καρκίνου (Εικ. 4D). Η δοκιμασία CCK8 έδειξε ότι η υπερέκφραση του CCR4 δεν είχε καμία επίδραση στην γαστρική καρκινικών κυττάρων πολλαπλασιασμό (S1 Σχήμα).

SGC-7901 και BGC-823 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό (MOCK) είτε εκφράζουν CCR4 φορέα (EGFP -CCR4) χρησιμοποιώντας lipofectamine2000, και η αποδοτικότητα διαμόλυνσης επιβεβαιώθηκε με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Α), RT-PCR (Β) και FCM (C) σε 24 ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα. D, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ ελεύθερο ορού RPMI-1640 με συγκέντρωση 1.5 × 10

5 /ml μετά την διαμόλυνση σε 24 ώρες, και στη συνέχεια αφέθηκε να εισβάλουν τα ένθετα Transwell (8-μm πόρους) επικαλυμμένα με Matrigel για μία άλλη 24h. Τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσω των ενθέτων μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός στα 200 × μεγέθυνση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές εικόνες ή ως η μέση τιμή ± SD (η = 3 σε κάθε στήλη) από περισσότερα από τρία ξεχωριστά πειράματα. Γκρι-γεμάτο ιστόγραμμα, CCR4? άδειο ιστόγραμμα, ισοτόπου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές εικόνες και η μέση ± SD και για τρία ξεχωριστά πειράματα από κάθε ομάδα. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0.01.

Η

ΟΟΡ4-ρυθμίζεται η παραγωγή MMP-9 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Για να ελέγξετε τους πιθανούς μηχανισμούς που διέπουν ΟΟΡ4 μεσολάβηση εισβολή όγκου, αξιολογήσαμε την επίδραση του CCR4 στην MMP-9 έκφραση και δραστικότητα. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR (Σχ. 5Α) έδειξαν ότι EGFP-ΟΟΚ4-επιμολυσμένα γαστρικών καρκινικών κυττάρων εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα ΜΜΡ-9 mRNA σε σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. ανάλυση Ζελατίνη ζυμογραφία (Εικ. 5Β) αποκάλυψε ότι η έκκριση και δράση της ΜΜΡ-9 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στα υπερκείμενα των κυττάρων EGFP-ΟΟΚ4-επιμολυσμένα σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα σε 48 h μετά την επιμόλυνση, με ή χωρίς την προσθήκη εξωγενή CCL22.

Α, πραγματικού χρόνου RT-PCR έδειξε ότι η ΜΜΡ-9 mRNA έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε κύτταρα GC CCR4 επιμολυσμένα σε σύγκριση με εκείνη σε ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Β, ζυμογραμμάτων δείχνοντας πέψη ζελατίνης με προ-ΜΜΡ-9 (92 kd) και ενεργός ΜΜΡ-9 (85 kd). Η έκκριση της ΜΜΡ-9 ήταν σαφώς πάνω ρυθμισμένα στα υπερκείμενα των κυττάρων CCR4-επιμολυσμένα σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα σε 48 h μετά την επιμόλυνση, με ή χωρίς την προσθήκη εξωγενούς CCL22. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές εικόνες ή σημαίνουν ± SD και για τρία ξεχωριστά πειράματα από κάθε ομάδα. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0.01.

Η

Συζήτηση

Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υποδοχέων χημειοκινών των καρκινικών κυττάρων και ταιριάζουν χημειοκινών τους αποτελούν κρίσιμα βήματα στη μετάσταση του όγκου. Ωστόσο, τα ευρήματα της τρέχουσας μας studyshowed ότι ένας ορισμένος αριθμός ασθενών με γαστρικό καρκίνο χωρίς λεμφικού μετάσταση ήταν επίσης θετικά για χρώση CCR4. Αντίθετα με τις περισσότερες προηγούμενες μελέτες σχετικά με τις λειτουργίες της χημειοταξίας που προκαλείται από ορισμένους υποδοχείς χημειοκινών, η έρευνα αυτή έδειξε μία νέα, επεμβατική συμπεριφορά του CCR4.

υποδοχείς χημειοκινών ανήκουν σε μια οικογένεια των επτά διαμεμβρανικών-G-πρωτεΐνη υποδοχέων συζευγμένων οποία είναι μεμβράνη οι πρωτεΐνες, και οι λειτουργικές συνέπειες της δράσης του υποδοχέα χημειοκίνης γενικά πιστεύεται ότι εξαρτάται από διέγερση από εξωκυτταρικό προσδέματα [27]. Ωστόσο, τα ιστολογικά δείγματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι υπήρχαν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης για CCR4. CCR4 σε μη νεοπλασματικά κύτταρα έδειξαν αρνητική χρώση, με μόνο αμυδρή χρώση μεμβράνης σε γαστρικές αλλοιώσεις δυσπλασία. Μεμβράνη και κυτταροπλασματική έκφραση του CCR4 εμφανίστηκε πιο συχνά σε μέτρια έως καλά διαφοροποιημένο φωλιές όγκου, ενώ η έκφραση σε λιγότερο διαφοροποιημένα κύτταρα έτειναν να περιορίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Και το πιο περίεργο, όπως φαίνεται στο τυπικό τμήματα, τα καρκινικά κύτταρα που εμφανίζουν υψηλή επεμβατικές δυνατότητες, όπως η μυϊκή εισβολή, αγγειακή διείσδυση και των νεύρων εισβολή, συχνά παρουσίασαν αυξημένη κυτταροπλασματική έκφραση του CCR4. Τα δεδομένα μας έδειξε μια στενή σχέση μεταξύ της κυτταροπλασματικής πρότυπο έκφρασης CCR4 και επιθετικές συμπεριφορές των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Αυτό το εύρημα είναι αντίθετο προς την κοινή παραδοχή ότι η εξωκυτταρική περιοχή ενός υποδοχέα χημειοκίνης απαιτεί κατ ‘ανάγκη μετάσταση όγκου μέσω της αλληλεπίδρασης με τον συνδέτη της. Παρόμοια φαινόμενα έχουν παρατηρηθεί με τον υποδοχέα χημειοκίνης CXCR4, της οποίας πυρηνικού εντοπισμού συνδέθηκε με την εξέλιξη διαφόρων όγκων [28-30]. Αυτά τα δεδομένα indictate ότι τα γαστρικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να εισβάλουν κοντινούς ιστούς μέσω CCR4 σε ένα πρόσδεμα-ανεξάρτητο τρόπο. Η άλλη υπόθεση ήταν ότι η εσωτερίκευση CCR4 προκαλούνται από συνδετήρα αυτού μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μηχανισμό που έχει εξελιχθεί στην κυτταροπλασματική πρότυπο έκφρασης CCR4. CCL22, ο συνδετήρας CCR4 που παράγεται από ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο ιστούς [31], είναι επίσης γνωστό ότι causeCCR4 εσωτερικοποίηση από μεμβράνη προς κυτταρόπλασμα [32, 33], υποδηλώνοντας κυτταροπλασματική χρώση μπορεί να δείξει ενεργοποιείται σηματοδότηση εξής ΟΟΚ4-CCL22 απολίνωση. Οι περισσότερες μελέτες για να αποκαλύψει τις ακριβείς μηχανισμοί που διέπουν αυτά τα μη φυσιολογικά μοτίβα έκφρασης των υποδοχέων χημειοκινών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου. Επιπλέον, η αργά ενισχύση την έκφραση του CCR4 στο προ-κακοήθη ιστούς, αν και στατιστικά ασήμαντο βαθμό υψηλότερο από το όγκο-παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, πρότεινε ότι CCR4 θα μπορούσε επίσης να συμμετέχουν στις προ-νεοπλασματικών στάδια της ανάπτυξης όγκων σε πρώιμο στάδιο.

Στην προηγούμενη μας μελέτη, διαπιστώσαμε ότι CCR4 ήταν υπερεκφράζεται σε ιστό GC, αλλά δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ασθενών με και χωρίς λεμφαδένα μετάσταση [18]. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι οι υποδοχείς χημοκίνης μπορεί επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του PN0 ασθενών. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας έδειξαν θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης CCR4 και Τ-στάδιο, το οποίο ήταν σύμφωνα με τα ευρήματα ανοσοϊστοχημεία μας ότι η έκφραση CCR4 έτεινε να αυξηθεί καθώς το βάθος της εισβολής καρκινικών προχωρούσε. Η επίδραση του CCR4 επί γαστρικού καρκίνου κυτταρική εισβολή επιβεβαιώθηκε μερικώς από επικοινωνούντα προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής. Αυτές οι δοκιμασίες διεξήχθησαν κάτω από συνθήκες όπου δεν προστέθηκε εξωγενής πρόσδεμα υποδοχέα CCR4. Ήταν πιθανό ότι διαφορετικοί μηχανισμοί μπορούν να υπάρχουν για τη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από την εισβολή CCR4 σε ένα πρόσδεμα-ανεξάρτητο τρόπο, σύμφωνο με το φαινόμενο της κυτταροπλασματικής μοτίβο του CCR4 που σχετίζονται με την άκρως διεισδυτική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων στον ιστό GC. Επιβεβαιώσαμε ότι η υπερ-έκφραση του CCR4 συνδέθηκε στενά με υψηλότερο βαθμό εξάπλωσης του όγκου, υποδεικνύοντας έτσι ότι CCR4 υπερ-έκφραση θα μπορούσε να προσδώσει μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων GC και περαιτέρω προώθηση της εξέλιξης του όγκου. Υποθέσαμε ότι οι αυτοκρινείς συνδέτες ΟΟΡ4 συμμετείχαν επίσης στην κυτταρική κινητικότητα

in vitro

. Οι συγκεντρώσεις των CCL22 στον πολιτιστικό κυτταρικές γραμμές υπερκείμενο GC επιμολυσμένα με ή χωρίς CCR4 ήταν αρκετά χαμηλό όπως αξιολογήσαμε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, το ενδεχόμενο δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι η αυτοκρινή ή παρακρινή παραγωγή CCL22 θα μπορούσε να συμβάλει στην εισβολή όγκου μέσω CCL22 /άξονα ΟΟΡ4

in vivo

. CCL17 και CCL22, όπως υψηλή συνδέτες CCR4 συγγένειας, παράγονται με GC και άλλους ιστούς του καρκίνου. Ειδικότερα, CCL22, το οποίο παράγεται είτε από τα καρκινικά κύτταρα ή μακροφάγα που σχετίζονται με όγκο, έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στη μετάσταση αρκετών καρκίνων [15-17]. Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή αυτοκρινή /παρακρινή βρόχος που περιλαμβάνουν CCL22 και CCR4 μεταξύ διαφορετικών τύπων κυττάρων.

ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι οι πιο οικείο και καλά χαρακτηρισμένο MMPs με ισχυρή πρωτεολυτική δραστικότητα στην εξωκυτταρική μήτρα (ECM). Η συνοχή μεταξύ πραγματικού χρόνου RT-PCR δοκιμασίες και πειράματα ζελατίνη ζυμογραφία έδειξε σαφώς ότι η υπερ-έκφραση του CCR4 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα ενίσχυσε σημαντικά MMP-9 έκφρασης και δραστηριότητας. Αυτά τα πειράματα τόνισε περαιτέρω και να αναγράφεται ο πραγματικός ρόλος της στην εισβολή του όγκου υπό ορισμένες προϋποθέσεις, με ή χωρίς διέγερση από εξωγενείς CCL22. Πιστεύεται ότι μήτρα ΜΜΡ-9 αποικοδομεί κολλαγόνο τύπου IV η οποία είναι ένα κύριο συστατικό της βασικής μεμβράνης και σχετίζεται με τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή και μετάσταση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου [34]. Εδώ, έχουμε παρέχονται νέες ενδείξεις σχετικά με τον υποκείμενο μηχανισμό που CCR4 μπορεί να προάγει τη γαστρική εισβολή των καρκινικών κυττάρων με ρύθμιση προς τα πάνω της ΜΜΡ-9. Παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν γίνει επίσης σε σχέση με την εισβολή όγκου μέσω κάποιων υποδοχέων χημειοκινών, όπως CXCR4 και CCR7 [19, 20, 22]. Και ΜΜΡ-2, η δομή του οποίου ήταν παρόμοια με ΜΜΡ-9, αναφέρθηκε επίσης ότι συνδέεται με καρκίνο του στομάχου [35]. Ωστόσο, βρήκαμε ΜΜΡ-9, αλλά όχι ΜΜΡ-2, ήταν ένα βασικό μόριο που εμπλέκονται στην CCR4 μεσολάβηση εισβολή όγκου, η οποία μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικά συν-ρυθμιστές που αλληλεπιδρούν με CCR4 σε διάφορα μικροπεριβάλλοντα. Αν και η έκφραση ΜΜΡ-2 σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα CCR4 επιμολυσμένα φάνηκε επίσης να είναι υψηλότερη από ότι σε ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα, η διαφορά ήταν στατιστικώς ασήμαντη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας έδειξαν ότι η υπερέκφραση του CCR4 δεν είχε καμία επίδραση επί του γαστρικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

, το οποίο ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που έδειξαν τις προσδέματα CCR4 δεν θα μπορούσε να επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [14], αποφεύγοντας έτσι την ενδεχομένως ότι μπορεί να επηρεάσει δείκτη εισβολή ή MMP-9 ποσού. Αυτές οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν με ή χωρίς εξωγενή CCL22, με σημαντικές διαφορές στη MMP-9 έκφραση μεταξύ CCR4 και ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα. Εμείς κάνουμε εικασίες τους πιθανούς μηχανισμούς της ενισχυμένης έκφρασης ΜΜΡ-9 με CCR4-υπερέκφραση μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην αυτοκρινή ή παρακρινή έκφραση του CCL22

in vivo

. Ακόμα άλλα MMPs που θα μπορούσαν να συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία και τις ακριβείς μονοπάτια σηματοδότησης παρέμειναν που πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω στο μέλλον.

Εν κατακλείδι, ανέφερε για πρώτη φορά ότι CCR4 ήταν έκτροπα υπερ-εκφράζεται σε PN0 γαστρικό καρκίνο και θα μπορούσε να προωθήσει την εισβολή του όγκου. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι CCR4 επαγόμενη παραγωγή ΜΜΡ-9 θα μπορούσαν να αποτελούν τη βάση τουλάχιστον εν μέρει το νέο μηχανισμό για CCR4 μεσολάβηση εισβολή όγκου. Έτσι, οι ανταγωνιστές του CCR4 μπορεί να είναι χρήσιμο υποψήφιοι για τον έλεγχο νωρίς γεγονότα στην εξέλιξη των όγκων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Η υπερέκφραση του CCR4 δεν είχε καμία επίδραση επί του γαστρικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

.

Μετά την επιμόλυνση με CCR4 ή MOCK πλασμιδίου και διέγερση με ή χωρίς εξωγενή CCL22, SGC-7901 και BGC-823 κύτταρα επανακαλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία CCK8 σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120059.s001

(ΔΕΘ)