Οι

Αφηρημένο

Multi-κυτταρική σφαιροειδή εμπλουτισμένο σε ασκίτη του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (OVCA) ασθενείς. Αντιπροσωπεύουν μια επεμβατική και χημειοθεραπεία κυτταρικού πληθυσμού θεμελιώδους σημασίας για τη μεταστατική διάδοση. Οι μοριακοί μηχανισμοί ενεργοποίησης μόνο κύτταρο επεμβατική έξοδο από σφαιροειδή παραμένει αινιγματική. mDia formins είναι Rho ΟΤΡάσης τελεστές που αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της F-ακτίνης δυναμική του κυτταροσκελετού. Υποθέσαμε ότι mDia2 με γνώμονα F-ακτίνης δυναμική προώθηση επεμβατική μεταβάσεις μόνο κύτταρο σε κλινικά σχετικές τρισδιάστατη σφαιροειδή (3D) OVCA. Η παρούσα μελέτη είναι μια ανατομή της συνεισφοράς του F-ακτίνη παράγοντα συναρμολόγησης mDia2 formin στην επεμβατική μεταβάσεις και χρησιμοποιώντας ένα κλινικά σχετικό μοντέλο σφαιροειδές καρκίνο των ωοθηκών. Δείχνουμε ότι RhoA-κατευθυνόμενη δραστηριότητα mDia2 απαιτείται για σφιχτή οργάνωση σφαιροειδές, και τον εμπλουτισμό των mDia2 στις επεμβατικές κυψελοειδή προεξοχές του κολλαγόνου-ενσωματωμένη σφαιροειδή OVCA429. Καταστρέφουν mDia2 στην ES-2 σφαιροειδή ενισχυμένη επεμβατική διάδοση των μεμονωμένων κυττάρων amoeboid σχήμα. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με σφαιροειδή αντιμετωπίζεται με έλεγχο siRNA, όπου ένα μεσεγχυματικά πρόγραμμα εισβολή κυριαρχούσε. Αναστολή της άλλης τελεστή RhoA, ROCK, δεν είχε καμία επίπτωση στην ES-2 σφαιροειδές σχηματισμό αλλά δραματικά ανέστειλε την εισβολή σφαιροειδές μέσω επαγωγής μιας εξαιρετικά επιμήκη μορφολογία. Η ταυτόχρονη αναστολή της ROCK και mDia2 μπλοκάρει ενιαίο εισβολή κυττάρων από ES-2 σφαιροειδή πιο αποτελεσματικά από την αναστολή είτε μόνη της πρωτεΐνης, υποδεικνύοντας ότι επεμβατική έξοδο της amoeboid κυττάρων από mDia2-απεμπλουτισμένου σφαιροειδή είναι ROCK-εξαρτώμενη. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι οι πολλαπλές τελεστές ΟΤΡάσης πρέπει να κατασταλεί προκειμένου να εμποδίσει πλήρως επεμβατική έξοδο από σφαιροειδή καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, σφιχτά οργανωμένη αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK και mDia2 μονοπάτια σηματοδότησης υπαγορεύει τις επεμβατικές ικανότητες και τον τύπο του προγράμματος εισβολής που χρησιμοποιούνται από κινητικό σφαιροειδές που προέρχονται από τον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα. Καθώς η απώλεια του γονιδίου που κωδικοποιεί mDia2,

DRF3,

έχει συνδεθεί με την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση, τα αποτελέσματά μας θέτουν το στάδιο για την κατανόηση μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην mDia2 εξαρτώμενη από την έξοδο των μεταστατικών κυττάρων από πρωτογενείς επιθηλιακών όγκων.

Παράθεση: Pettee KM, Dvorak KM, Nestor-Kalinoski AL, Eisenmann KM (2014) Μια mDia2 /ROCK Σηματοδοσίας Άξονα Ρυθμίζει Επεμβατική έξοδος από Επιθηλιακά καρκίνου των ωοθηκών σφαιροειδή. PLoS ONE 9 (2): e90371. doi: 10.1371 /journal.pone.0090371

Επιμέλεια: Πόντου Aspenstrom, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 22 του Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 3η Φεβρουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 28 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Pettee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο του Τολέδο Ιδρύματος (ΚΜΕ, ALNK), το Υπουργείο άμυνας των ωοθηκών Βραβείο Concept (ΚΜΕ, OC073269), το DeArce Memorial Κληροδότημα για τη στήριξη Ιατρικής Έρευνας και Ανάπτυξης (ΚΜΕ), και το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου ( ΚΜΕ, ALNK R01CA151632). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών (OVCA) είναι το 5

ου κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις αμερικανικές γυναίκες. Η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία προβλέπει 22.000 νέες διαγνώσεις και 15.000 θάνατοι από επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) το 2012. Τα κύτταρα που προέρχονται από το λογαριασμό επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών για & gt? 90% της πρωτογενούς OVCA και μεταστατικών βλαβών [1]. Τα αποφλοιωμένα κύτταρα OVCA ανιχνεύεται σε περιτοναϊκή ασκίτη ως απλά κύτταρα, μικρά συσσωματώματα ή πολύ-παραγγείλει και συμπιέζεται πολυκύτταρων σφαιροειδών [1] – [5]. Συμπυκνωμένα σφαιροειδή είναι ελάχιστα κατανοητή επεμβατική και χημειοθεραπεία δομές. Κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις, που υποστηρίζεται εν μέρει από Ν- και Ε-καδερίνης οδηγεί το σχηματισμό και τη συμπίεση του OVCA σφαιροειδή [6]. Δεν είναι σαφές ποιες συγκεκριμένες μοριακές ή περιβαλλοντικά συνθήματα συμβάλλουν στην επεμβατική μεταβάσεις στα σφαιροειδή.

Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι συμπαγή σφαιροειδή προώθηση OVCA μετάσταση μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα.

In vitro,

κύτταρα εντός OVCA σφαιροειδή υφίστανται ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, διαχωριζόμενη κατά την προσκόλληση σε τρισδιάστατη πηκτώματα (3D) κολλαγόνο-Ι και εισβάλλουν υποκείμενη μεσοθηλιακών κυττάρων [7] – [9]. Είναι σημαντικό, ο σχηματισμός σφαιροειδές και συμπύκνωση συσχετίζεται άμεσα με την εισβολή [3], [4]. Ανθρώπινα κύτταρα OVCA με την ικανότητα να σχηματίζουν μια συμπαγή σφαιροειδή

in vitro

μπορούν να δημιουργήσουν ισχυρή όγκους όταν εγχέονται ενδοπεριτοναϊκά σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια. Σε αντίθεση, μη σφαιροειδές κυττάρων που σχηματίζουν αποτυγχάνουν να σχηματίσουν όγκους σε ποντίκια [10]. Η προφανής σύνδεση μεταξύ του σχηματισμού των συμπαγών σφαιριδίων και της διάδοσης των χωροκατακτητικών OVCA κυττάρων υπογραμμίζει την ανάγκη για καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που υποστηρίζουν τις διαδικασίες αυτές [11].

Σε απάντηση προς εξωκυττάρια ερεθίσματα, επιθηλιακά προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να μετατρέψει σε μεσεγχυματικά φαινότυπο. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί μέσω της διάσπασης σφιχτό και ενώσεις προσφύσεως (AJ), αποκόλληση μονά κύτταρα από φύλλα επιθηλιακών ή 3D δομών, και μετανάστευση σε γειτονικούς ιστούς (που επισκοπείται στο [12] – [15]). Hallmark κυτταρικές και μοριακές αλλαγές που σχετίζονται με την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) και την εισβολή στα γύρω στρώμα περιλαμβάνουν απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης, προς τα πάνω ρύθμιση μεταλλοπρωτεασών μήτρας (ΜΜΡ), την ενεργοποίηση των μεταγραφικών ρυθμιστών και υιοθέτηση ενός άξονα-όπως, πολωμένο ινοβλαστική μορφολογία. Κατά τη διάρκεια της μεσεγχυματικά μετανάστευση, την επέκταση της πρόσθιας ακμής και η αναδίπλωση του ουραίου άκρου του κινητικών κύτταρα περιλαμβάνει συντεταγμένη ρύθμιση του φλοιώδους F-ακτίνης πολυμερισμού και συστολή ακτομυοσίνης. F-ακτίνης συγκρότημα προηγείται συστολή για να προωθήσουν την επέκταση των προεξοχών ακτίνης-πλούσια, και φωσφορυλίωση ROCK μεσολάβηση του φωτός αλυσίδα μυοσίνης (pMLC) ρυθμίζει τη συστολή ακτινομυοσίνης [16].

Formins έχουν αναδειχθεί ως βασικούς ρυθμιστές της F-ακτίνης και τη δυναμική των μικροσωληνίσκων κυτταροσκελετού. Formin οικογένεια πρωτεϊνών που είναι Rho ΟΤΡάσης τελεστές. Οι αραιή (mDia)-σχετικών formins θηλαστικών (mDia1-3) έχουν κρίσιμο ρόλο σε διάφορες κυτταρικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής του γονιδίου, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της εμπορίας μεμβράνη. mDia πρωτεΐνες ρυθμίζουν επίσης F-ακτίνης δίκτυα κρίσιμες για τη διατήρηση της ακεραιότητας των πολυκύτταρων επιθηλιακών δομών [17] – [22]. Για παράδειγμα, η εξάντληση του mDia αναστέλλει το σχηματισμό του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις σε κύτταρα MDCK [23], και διαταράσσει MCF-7 μονοστιβάδες με mislocalizing Ε-καδερίνης μακριά από κυττάρου-κυττάρου επαφές [24]. Επιπλέον, καταστολή αραιή, το ομόλογο mDia στο

Δ. melanogaster,

μειώθηκε pMLC σε AJs και αποσταθεροποιεί φυσιολογικό όρια του ιστού και την αύξηση των κυττάρων protrusiveness [25]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα εμπλέκουν τον άξονα σηματοδότησης mDia-Rho στην οργάνωση των πολύπλοκων 3D δομές σημαντική για την μορφογένεση, και ενδεχομένως, για την εξέλιξη του όγκου.

Πολλά στοιχεία δείχνουν ότι formins παίζουν συντηρημένο ρόλο στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων κινητικότητα , εισβολή και μετάσταση. mDia2 επηρεάζει την επεμβατική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων του μαστού, το οποίο τελικά εξαρτάται από ΜΜΡ και το σχηματισμό των προεξοχών ακτίνης πλούσια ονομάζεται invadopodia [26]. Αλληλεπίδραση mDia2 με αρνητικός ρυθμιστής της, DIP [27], προωθεί τη μετάβαση των μεσεγχυματικών κυττάρων MDA-MB-231 σε πολύ κινητικό και επεμβατικές amoeboid κύτταρα ROCK-εξαρτώμενη [28]. Ομοίως, η διαμόρφωση των mDia2 επηρεάζει επίσης amoeboid εισβολή και τη μετανάστευση στην DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη [29], [30]. Ένα σχετικό formin, mDia1 κατευθύνει χημειοταξία των ουδετερόφιλων [31], [32], η εισβολή των κυττάρων [33], και η μετανάστευση των Τ-κυττάρων και της εμπορίας σε περιφερικά λεμφικά όργανα [34], [35]. Άλλες formin μέλη της οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων των ισομορφών του FRL, FHOD και Formin1, έχουν επίσης εμπλακεί στη ρύθμιση των μεταναστευτικών πλαστικότητα και ενδομετατροπή μεταξύ μεσεγχυματικών και αμοιβαδοειδή κινητικότητα σε μαστού και άλλων κυττάρων του όγκου [36] – [41].

Η γονίδια που κωδικοποιούν mDia ή FMNL /FRL συχνά χάνονται σε μαστού, του προστάτη, του παχέος εντέρου, ηπατικά καρκινώματα, και αιμοποιητικά καρκίνων [29], [30], [41], [42]. mDia πρωτεΐνες λειτουργούν επίσης στην κανονική ωοθήκη, καθώς και καρκίνους των ωοθηκών. Η διακοπή του

αραιή

συνδέεται με την πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια [43]. Απώλεια

DIAPH1 /DRF1

, το γονίδιο που κωδικοποιεί mDia1, δείχθηκε σε μοντέλο OVCA εξέλιξης [10]. Επιπλέον, τα γονίδια που κωδικοποιούν mDia2 (

DIAPH3 /DRF3

) και formin 1 (

FMN1

) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω στις αρχές να OVCA κύτταρα προχωρημένο στάδιο. Αυτό συνοδεύτηκε από διακοπή της συσσώρευσης F-ακτίνης και αυξήσεις των κυττάρων παραμόρφωσης [44], [45]. Στο σύνολό τους, οι διατάξεις των προηγούμενων παρατηρήσεις προτείνουν ένα ρόλο για mDia ελεγχόμενη δυναμική ακτίνη στην εξέλιξη των ωοθηκών. Δεν είναι σαφές εάν οι αλλαγές στην κατάσταση ενεργοποίησης των συμφύσεων μεταξύ κυττάρων επιρροή mDia να διατηρήσει την ακεραιότητα σφαιροειδές OVCA, ή εάν διαμόρφωση mDia κατευθύνει τις μεταβάσεις που αποτελούν τη βάση των κυττάρων εισβολή στο υποκείμενο mesothelium.

Για να διερευνήσουν αυτές τις ερωτήσεις, εξετάσαμε το ρόλο της Rho /mDia σηματοδότηση σε OVCA μετανάστευση και εισβολή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μια RhoA /mDia2 /ROCK σηματοδότησης δίσκους άξονα επεμβατική μεταβάσεις στην ES-2 κύτταρα OVCA σε 2D πολιτισμών και ένα 3D μοντέλο σφαιροειδές εισβολή. Η ενεργοποίηση της RhoA αυξήθηκε κατά τη διάρκεια του σχηματισμού σφαιροειδές, ενώ η καταστολή των mDia2 διαταράσσεται σφαιροειδές αρχιτεκτονική. Σε αντίθεση με τις επιδράσεις της mDia2, εξάντληση mDia1 δεν είχε καμία επίδραση στο σχηματισμό ή την ακεραιότητα των σφαιροειδή. Όταν mDia2-εξαντλημένο σφαιροειδή εγκλείστηκαν σε πηκτώματα κολλαγόνου-Ι, ήταν δυνατό να ενισχυθεί ενιαίο εισβολή των κυττάρων μέσω μιας αμοιβαδοειδή μετάβαση ROCK-εξαρτώμενη. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν την αλληλεξάρτηση των mDia2 και ROCK για την προώθηση των επεκτατικών μεταβάσεις στην OVCA σφαιροειδή.

Αποτελέσματα

Χωρική εντοπισμό των πρωτεϊνών mDia στο θέμα της μετάβασης ανθρώπινα OVCA κύτταρα

Έχουμε λάβει μια ομάδα ανθρώπινων OVCA κυτταρικές γραμμές που αντιπροσωπεύουν διάφορες κλινικές υποκατηγορίες, συμπεριλαμβανομένων ορώδες και σαφή αδενοκαρκινώματα κυττάρων. Ορισμένες από αυτές τις κυτταρικές γραμμές να σχηματίζουν συμπαγείς σφαιροειδή (OVCA429 και ES-2), ενώ άλλοι σχηματίζουν χαλαρές κυψελοειδείς δομές (SKOV3) (Σχήμα S1 και [4]). Όλοι οι τύποι κυττάρων που εκφράζονται mDia1 και mDia2, ανεξάρτητα από σφαιροειδή ικανότητα σχηματισμού (Σχήμα 1Α).

A. mDia1 και mDia2 αξιολογήθηκαν με ανοσοκαθίζηση ή /και κηλίδωση Western σε ένα πάνελ ανθρώπινων OVCA κυττάρων. Τουμπουλίνης στυπώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β κυτταρική πρόσφυση προς BSA- ή κολλαγόνο-Ι-επικαλυμμένα φρεάτια. Το πείραμα διεξήχθη σε φρεάτια εις τριπλούν και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. ρ τιμές είναι BSA εναντίον κολλαγόνου-Ι για κάθε κυτταρική γραμμή. δοκιμασίες μετανάστευσης C. Transwell πραγματοποιήθηκαν σε τριπλά φρεάτια και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές για 5 ώρες προς SFM ή 20% FBS. MDA-MB-231 ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κύτταρα είναι ένας θετικός έλεγχος της μετανάστευσης. τιμές ρ είναι για SFM έναντι 20% FBS για κάθε κυτταρική γραμμή. δοκιμασίες εισβολή Δ Transwell πραγματοποιήθηκαν σε τριπλά φρεάτια και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές για 24 ώρες έως 2 mg /ml κολλαγόνο-Ι πηκτώματα είτε προς SFM ή 20% FBS. MDA-MB-231 κύτταρα είναι ένας θετικός έλεγχος εισβολή. ρ τιμές είναι SFM έναντι 20% FBS για κάθε κυτταρική γραμμή. κύτταρα Ε OVCA429 μετανάστευσαν προς 20% FBS για 5 ώρες σε ένα θάλαμο Dunn. mDia1, mDia2 και το F-ακτίνης αρχιτεκτονική έγιναν ορατά με IF. Βέλος υποδηλώνει την κατεύθυνση της κλίσης. N.S. = Δεν είναι σημαντική. Όλες οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε SDS Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά πειράματα από κάθε δοκιμασία.

Η

Ο πίνακας OVCA σαρώθηκε για κόλλα, μεταναστευτικά και επεμβατικές ιδιότητες (Εικόνα 1, Β-D, αντίστοιχα) για την αναγνώριση ενός πολύ επεμβατική , σφαιροειδή σχηματίζουν κυτταρική γραμμή. SKOV3, OVCA429 και ES-2 κύτταρα ήταν εξίσου κόλλα σε υποστρώματα 2D κολλαγόνου. Ωστόσο, τα κύτταρα ES-2 OVCA429 και ήταν πιο μεταναστευτικών και επεμβατική από τη γραμμή SKOV-3, ανάλογα με FBS κλίσεις. Ως εκ τούτου, απομένει μελέτες μας έγιναν είτε με OVCA429 ή ES-2 κύτταρα.

Η χωρική εντοπισμός των ενδογενών πρωτεϊνών mDia αξιολογήθηκε σε μεταναστεύουν OVCA429 κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο Dunn να διατηρήσει μια σταθερή κλίση FBS. Ανοσοφθορισμού (IF) πραγματοποιήθηκε μετά από 5 ώρες μετανάστευση (Σχήμα 1 Ε). Τόσο mDia1 και mDia2 εμφάνισε μια πολωμένη κατανομή προσανατολισμένη προς την κλίση FBS εντός μεταναστεύουν OVCA429 κύτταρα (βέλος δείχνει κλίση θέση). mDia1 και mDia2 εντοπίζεται κυρίως στα πετάλια, σε αντίθεση με το F-ακτίνης πλούσια ελασματοπόδιων, όπως φαίνεται προηγουμένως στο μεταναστεύουν επιθηλιακά κύτταρα [46]. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν μια πιθανή ρόλο για mDia1 ή /και mDia2 στη σταθεροποίηση του φλοιού πισίνες ακτίνης κατά τη διάρκεια OVCA χημειοταξία.

Απαίτηση για mDia2 στην χημειοτακτική μετανάστευση στην OVCA429 κύτταρα

επόμενο ρώτησε αν η δραστηριότητα της πρωτεΐνης mDia και ή /και έκφραση ήταν απαραίτητα για χημειοτακτική μετανάστευση. Η απόσταση μετανάστευσαν από επιμολυσμένα OVCA429 κυττάρων σε ένα θάλαμο Dunn ποσοτικά με παρακολούθηση ζωντανών κυττάρων. Τα κύτταρα με γενετική μηχανική για να εκφράσουν είτε πρωτεΐνες mDia-YFP-σύντηξης μόνη, ή διάφοροι συνδυασμοί φορέα ελέγχου YFP και FLAG-tagged πρωτεΐνες. mDia υπερέκφραση ελέγχθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α). Κύτταρα που εκφράζουν κυρίαρχο-αρνητικό YFP-mDia-FH2ΔN, η οποία έρχεται σε επαφή με αμφότερα mDia1 και mDia2 με γνώμονα τη συναρμολόγηση F-ακτίνης, [34], [47], [48] μετανάστευσαν ανεπαρκώς σχέση με τους μάρτυρες YFP. Αντίθετα, τα κύτταρα που εκφράζουν το συστατικά που ενεργοποιούνται mDia2 M1041A [49], με την οποία απαλλάσσεται η autoinhibited κατάσταση, παρουσίασαν αύξηση της μετανάστευσης σε σχέση με YFP + 3XFLAG ελέγχους κενό φορέα. mDia1 υπερέκφραση δεν μετέβαλε την κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι mDia2 αυτο-αναστολή πρέπει να απελευθερωθούν προκειμένου για την αποτελεσματική κυτταρική μετανάστευση να συμβεί. Στην επόμενη σειρά μελετών, ο ρόλος των mDia2 σε χημειοτακτικής μετανάστευσης εκτιμήθηκε με σπορά mDia2 εξαντλημένο OVCA429 κυττάρων σε transwells. Ενώ λιπιδίων και ελέγχου κύτταρα siRNA επεξεργασμένα σθεναρά μετανάστευσαν προς FBS (σε σχέση με φρεάτια αναφοράς χωρίς ορό), η μετανάστευση ήταν σημαντικά μειωμένη στα mDia2-εξαντλημένο κύτταρα (Σχήμα 2C). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έκφραση και /ή δραστικότητα mDia2 απαιτείται για τη βέλτιστη χημειοτακτική μετανάστευση των OVCA429 κυττάρων.

A. Επιυολυσυένα OVCA429 μετανάστευσαν για 5% FBS. Ζωντανά παρακολούθησης μονοκύτταροι επιμολυσμένων κυττάρων πραγματοποιήθηκε, και η συνολική απόσταση μετανάστευσαν υπολογιστεί. Τουλάχιστον 10 κύτταρα παρακολουθούνται ανά συνθήκη. Οι τιμές ρ που απαριθμούνται υπολογίζεται σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους άδειο φορέα. κύτταρα Β OVCA429 επιμολύνθηκαν με λιπίδιο μόνο, ελέγχουν siRNA ή siRNA που κατευθύνεται έναντι mDia2 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (25, 50, 100 ηΜ, συμβολίζεται με σφήνες) είτε για 72 ή 96 ώρες. εξάντληση mDia2 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western. κύτταρα C. OVCA429 επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ siRNA για 72 ώρες, και σε προσδιορισμούς μετανάστευσης transwell πραγματοποιείται για 5 ώρες προς ένα SFM ή 10% FBS. Η δοκιμασία διεξήχθη σε φρεάτια εις τριπλούν και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. p τιμή που εμφανίζεται είναι 10% FBS αντιμετωπίζονται ελέγχου έναντι mDia2 εξαντλημένο κύτταρα. Όλες οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε ΔΔΑ για αυτό το αντιπροσωπευτικό πείραμα.

Η

Η RhoA /mDia2 άξονα σηματοδότησης στο σχηματισμό των συμπαγών σφαιριδίων OVCA

Rho-απόκρισης πρωτεΐνες mDia μπορεί να ρυθμίσει τις επαφές κυττάρου-κυττάρου και προώθηση μόνο κύτταρο κινητικότητα [18], [26] – [28], [49]. Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί αν ο άξονας σηματοδότησης RhoA /mDia2 συμμετείχε στο σχηματισμό OVCA σφαιροειδές. ES κύτταρα-2 που σχηματίζεται ταχέως άκρως συμπιεσμένη σφαιροειδή (σχήμα S1) και χρησιμοποιήθηκαν για τις υπόλοιπες μελέτες. Η απαίτηση για δραστικότητα ΟΤΡάσης Rho στο σχηματισμό σφαιροειδές ελέγχθηκε εκθέτοντας κύτταρα ES-2 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0,5-2,0 μg /ml) του C3 τρανσφεράσης, έναν αναστολέα του RhoA-C. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2A, C3-αγωγή σφαιροειδή πιο χαλαρά οργανωμένη και λιγότερο συμπιεσμένο σε σχέση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα. Από προηγούμενη εργασία έχει δείξει ότι τα συνολικά επίπεδα RhoA αυξήθηκε σε σφαιροειδή που προέρχονται από ηπατοκαρκινώματος [50], από την επόμενη ρωτήθηκε αν οι αλλαγές σε δραστηριότητα RhoA συμβαίνουν σε συνδυασμό με το σχηματισμό ES-2 σφαιροειδή. Τα σφαιροειδή σχηματίστηκαν από 500 κύτταρα εντός 24 h (Σχήμα 3Α). RhoA και έκφραση των κατάντη τελεστές της, mDia1 και mDia2 στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε προϊόντα λύσης από τις κυτταρικές μονοστοιβάδες και συνενώθηκαν σφαιροειδή συγκομίζονται μεταξύ 24-120 ώρες. Συνολικά, τα επίπεδα mDia2 μειώθηκαν σε σφαιροειδή σε σχέση με μονοστοιβάδες. Εντός των πληθυσμών σφαιροειδείς, χρονο-εξαρτώμενη διαφορές στην έκφραση mDia2 παρατηρήθηκαν, με ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα σημειώνεται στο 72 και 96 h σφαιροειδή, σε σχέση με 24, 48 και 120 ώρες σφαιροειδή (Σχήματα 3Β και S3A). Σε αντίθεση με mDia2, τα επίπεδα mDia1 αυξήθηκαν σε σχέση με σφαιροειδή μονοστοιβάδες. Στα σφαιροειδή mDia1 μειώθηκε ελαφρώς από 24 ώρες έως 120 ώρες (Εικόνες 3Β και S3b). Τα συνολικά επίπεδα RhoA μειώθηκε επίσης σε σφαιροειδή, σε σχέση με μονοστιβάδες. Ωστόσο, τα επίπεδα RhoA ανακτάται δραματικά στους 120 h σχηματισμού σφαιροειδούς (Σχήμα 3Β και S3C). Δεδομένου ότι, η αλληλεπίδραση της RhoA με κατάντη δράστες της (όπως mDia ή ROCK) εξαρτάται από την ενεργοποίηση από σύνδεσης GTP, έχουμε την επόμενη ποσοτικοποιηθεί τα επίπεδα της δραστικής ΟΤΡ-δεσμευμένη RhoA σε σφαιροειδή με G-LISA. Η ποσότητα του RhoA-GTP ήταν σημαντικά αυξημένη σε σφαιροειδή που σχηματίζονται για 48-120 ώρες σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα ES-2 μονοστοιβάδες κυττάρων, προσεγγίζοντας εκείνη που παρατηρήθηκε σε μονοστιβάδες σε επεξεργασία με ένα γνωστό ενεργοποιητή RhoA, λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) (Σχήμα 3C). Ως εκ τούτου, τα συνολικά επίπεδα της ενεργοποίησης RhoA ενισχυμένη κατά σφαιροειδές ωρίμανση.

Α. ES-2 σφαιροειδή απεικονίστηκαν από φωτεινού μικροσκοπίου. Κλίμακα bar = 250 μm. (Σημείωση: εκτός εστίασης πλάκας επικάλυψης τεχνούργημα απεικόνισης ή /και συμπύκνωσης εντός ακανόνιστο πλαστικά πιάτα δει εδώ είναι κοινή για απεικόνιση BF). B. Τα προϊόντα της λύσης από ES-2 μονοστιβάδες ή σφαιροειδή δυτικού καθάρισε μετά τους καθορισμένους χρόνους. Γ RhoA G-Lisas πραγματοποιήθηκαν κατά την θεραπεία ή LPA-θεραπεία ES-2 μονοστιβάδες ή σφαιροειδή. ρ τιμές είναι σχετικές με τα μη επεξεργασμένα μονοστιβάδας. Το πείραμα διεξήχθη σε φρεάτια εις τετραπλούν και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές, στη συνέχεια. Τα δεδομένα συνδυάστηκαν από 3 πειραμάτων παρουσιάζονται. Οι τιμές ρ φαίνεται παραπάνω μπαρ και είναι σε σχέση με μη κατεργασμένους ελέγχους μονοστιβάδας. D. Τα σφαιροειδή που σχηματίζονται για 72 ώρες ενσωματώθηκαν, σταθερό και mDia2 οπτικοποιήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας στόχου 20 × με 3D-απόδοση των σειριακών φέτες. Bar = 25 μm. Ανοικτό βέλη δείχνουν περιοχές της επικάλυψης, ενώ κλειστά βέλη δείχνουν μια αντιπαράθεση των F-ακτίνης και mDia2. Όλες οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε ΔΔΑ για αυτό το αντιπροσωπευτικό πείραμα, εκτός και αν αναφέρεται διαφορετικά.

Η

Ως πρώτο βήμα προς τον καθορισμό του εάν RhoA-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των mDia2 μπορεί να επηρεάσει το σχηματισμό του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις, έχουμε την επόμενη ρώτησε αν mDia2 και F-ακτίνης είναι συν-εντοπίζεται σε σφαιροειδή στο κύτταρο-κύτταρο κόμβων (Σχήμα 3D). Τα σφαιροειδή που σχηματίζονται για 72 ώρες απεκάλυψε διακεκριμένες F-ακτίνης εμπλουτισμένου κόμβων κυττάρου-κυττάρου, με στικτή mDia2 υποκείμενες /εγγύς σε αυτές τις διασταυρώσεις (γεμάτο βέλος). Σε ορισμένες διασταυρώσεις, mDia2 φάνηκε να συν-εντοπίζεται με F-ακτίνη (άδειο βέλος). Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο για mDia2 στη ρύθμιση F-ακτίνη δυναμική απαραίτητη για την ανάπτυξη ή τη συντήρηση του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις.

εξάντληση mDia2 οδηγεί στο σχηματισμό μικρότερων, αποδιοργανωμένη σφαιροειδή

Για την περαιτέρω αξιολόγηση ο ρόλος των πρωτεϊνών mDia στο ωοθηκών σφαιροειδή σχηματισμό /ακεραιότητα, χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική παρεμβολή RNA. Στιβαρή siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν είτε mDia2 ή mDia1 ελέγχθηκε μέσω 120 ώρες σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας, με ελαφρά ανάκαμψη από 144 ώρες (Εικόνα 4Α και S4). Τα σφαιροειδή σχηματίστηκαν από κύτταρα μονοστοιβάδα 72 ώρες μετά τη θεραπεία siRNA. Σφαιροειδές διάμετροι μετρήθηκαν στη συνέχεια 24-48 ώρες αργότερα (96-120 h θεραπεία σύνολο siRNA). εξάντληση mDia2 στις 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια μέτρια, αλλά στατιστικά σημαντική μείωση (10-20%) σε σφαιροειδή διάμετρο σε σχέση με τον έλεγχο της θεραπείας siRNA. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν mDia2 εξαντλήθηκε με πισίνες siRNA ή μεμονωμένων siRNA που κατευθύνεται έναντι mDia2 (Σχήμα S4), αν και η καταστολή της έκφρασης mDia2 με ομαδοποιήθηκαν siRNA ήταν πιο σταθερή και παρατεταμένη. Ως εκ τούτου, όλες οι μεταγενέστερες μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση συγκεντρωμένα siRNA. Εκτός από την ελαφρά μείωση στο σφαιροειδές διαμέτρου, mDia2-εξαντλημένο ES-2 σφαιροειδή ήταν εμφανώς λιγότερο οργανωμένη με οδοντωτές άκρες και μερικά μεμονωμένα κύτταρα χαλαρά προσκολλημένο στα άκρα. Μια παρόμοια αποδιοργανωμένη φαινότυπο σφαιροειδές προέκυψε από την προσθήκη ενός αναστολέα mDia1 /mDia2 FH2, SMIFH2 (Σχήμα S5) [51]. αποτελέσματα Υπήρχαν οφείλεται σε εξάντληση mDia2, όπως η εξάντληση mDia1 δεν είχε καμία επίδραση από το μέγεθος σφαιροειδές (Σχήμα 4Β, C).

Α. siRNA μεσολάβηση mDia1 (άνω) ή mDia2 (κάτω) knockdowns πραγματοποιήθηκαν κατά ES-2 μονοστιβάδες (Σημείωση: εκτός εστίασης απεικόνισης πλάκας επικάλυψης τεχνούργημα /συμπύκνωσης εντός ακανόνιστο πλαστικά πιάτα δει εδώ είναι κοινή για απεικόνιση BF). Π.Χ. Μετά από 72 ώρες μετά την siRNA ή θεραπεία ελέγχου, σφαιροειδή σχηματίστηκαν και διάμετροι μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτεινού 48 ώρες αργότερα (120 h θεραπεία μετα-siRNA). Bar = 100 μm. Τουλάχιστον 30 σφαιροειδή μετρήθηκαν για κάθε κατάσταση. Οι τιμές ρ αναφέρονται παραπάνω μπαρ και είναι σε σχέση με τον έλεγχο σφαιροειδή siRNA. D-E. ES-2 μονοστοιβάδες ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με τις ορισθείσες siRNAs για 48 ώρες, σφαιροειδή που σχηματίζονται για επιπλέον 48 ώρες, και κηλίδες Western ή RhoA G-Lisas εκτελείται επί προϊόντων λύσης. LPA είναι ένας θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση RhoA. Το πείραμα G-LISA διεξήχθη δύο φορές, εις τετραπλούν, και σε συνδυασμό δεδομένα παρουσιάζονται με ρ τιμές που απαριθμούνται στην πλευρά του μπαρ. τιμές P είναι σε σχέση με είτε χωρίς θεραπεία ή έλεγχο σφαιροειδή siRNA-θεραπεία, όπως σημειώνεται. ΣΤ Ανεπεξέργαστα (UT), λιπίδιο μόνο ή siRNA μεσολάβηση ελέγχου και mDia2 knockdowns διεξήχθησαν κατά ES-2 μονοστιβάδων για 72 ώρες και τα επίπεδα pMLC2 αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. knockdowns G. Έλεγχος και mDia2 διεξήχθησαν για 72 ώρες, και σφαιροειδή που σχηματίζονται. Σφαιροειδή αναλύονται στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά τον σχηματισμό και τα κύτταρα μετρήθηκαν. Το πείραμα επαναλήφθηκε 5 φορές. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. Οι ράβδοι σφάλματος αντιστοιχούν σε SDS από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα.

Η

πιθανές εξηγήσεις για το ελαφρώς μικρότερο μέγεθος των ES-2 θα μπορούσαν να περιλαμβάνουν σφαιροειδή μειωθεί κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μειωμένη μέσο μέγεθος κύτταρο, κύτταρο απόσπαση ή μεγαλύτερη συμπίεση σφαιροειδές μέσω αυξημένης RhoA-κατευθυνόμενη δραστηριότητα pMLC2. Ως εκ τούτου, καθορίζεται εάν τα επίπεδα RhoA-GTP μεταβλήθηκαν σε mDia2-εξαντλημένο σφαιροειδή. εξάντληση mDia2 ελέγχθηκε σε σφαιροειδή που σχηματίζονται για 24-48 h (θεραπεία siRNA για 72-96 h) (Εικόνα 4D). Σε 96 ώρες μετά την siRNA θεραπεία, δραστηριότητα RhoA-GTP ήταν ανεπηρέαστο τον έλεγχο και mDia2 εξαντλημένο σφαιροειδή (σχήμα 4Ε). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, pMLC2 παρέμεινε αμετάβλητη σε μονοστοιβάδες κυττάρων (Σχήμα 4F). Επιπλέον, η εξάντληση mDia2 δεν άλλαξε τις κυτταρικές αριθμούς μέσα αναλύονται σφαιροειδή (Εικόνα 4G). Αυτό δείχνει ότι ούτε κυτταρικού πολλαπλασιασμού ούτε απώλεια de-προσκολλημένα κύτταρα ήταν αποκλειστικά υπεύθυνος για το μικρότερο μέγεθος σφαιροειδές. Προτείνει, επίσης, ότι ενώ το siRNA μεσολάβηση εξάντληση των mDia2 προκαλεί μια πιο αποδιοργανωμένη και ακανόνιστη διάταξη σφαιροειδές, το υπόλοιπο της πρωτεΐνης mDia2 είναι πιθανό επαρκούν για να καλύψουν τόσο RhoA μεσολάβηση συσταλτικότητας και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η τελευταία αυτή έννοια είναι συνεπής με μια προηγούμενη μελέτη της mDia1 στην ενεργοποίηση των Τ κυττάρων, όπου τα χαμηλά επίπεδα των πρωτεϊνών mDia φάνηκε να είναι επαρκής για να διατηρήσει κάποια κυτταρικές διεργασίες (

π.χ.

., F-ακτίνης συσσώρευση vs. δυναμική των μικροσωληνίσκων) , ενώ παράλληλα αλλοιώνοντας άλλες λειτουργίες [52].

εξάντληση mDia2 ενισχύει ES-2 σφαιροειδές εισβολή μέσω amoeboid μετάβαση

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι λειτουργίες άξονα RhoA /mDia2 στο σφαιροειδές εισβολή, ES-2 σφαιροειδή εγκλείστηκαν σε κολλαγόνο στο (Τ0) και αφέθηκε να εισβάλλουν μέσω 168 h (Σχήμα 5Α). Μία ραγδαίως αναπτυσσόμενη μπροστά μεταστατικών κυττάρων εμφανίστηκε από 24 ώρες, και συστολή γέλη ήταν αρκετά εκτεταμένη ώστε να σχίσει τα τζελ μέσα σε 72 ώρες. Σφαιροειδές εισβολή μετρήθηκε με χαραχθεί μια περιοχή ενδιαφέροντος γύρω από την περίμετρο του μεταναστευτικό μέτωπο, η οποία περιλάμβανε τουλάχιστον το 95% των μεταστατικών κυττάρων (όπως προσδιορίζεται με την επισήμανση φθορισμού). Εισβολή εξαρτιόταν από Rho ΟΤΡάσες, όπως η επεμβατική μέτωπο ήταν σημαντικά μειωμένη σε ES-2 σφαιροειδή που αναπτύχθηκαν και ενσωματωμένα σε παρουσία C3 τρανσφεράσης, σε σχέση με μάρτυρα σφαιροειδή όχημα (Σχήμα S2, Β και C). Από Rho-κατευθυνόμενη πρωτεΐνες mDia οδηγούν εισβολή σε μια ποικιλία επιθηλιακών προερχόμενων καρκινικών κυττάρων [26], [29], [30], μπορούμε οπτικοποιείται το χωρικό εντοπισμό των πρωτεϊνών mDia σε σταθερές επεμβατική ES-2 σφαιροειδή. mDia2 διανεμήθηκε σε ένα πολωμένο μοτίβο, με εμπλουτισμό στα σφαιροειδή άκρα όπου μεταστατικών κυττάρων εντός του προήλθε κολλαγόνου (Σχήμα 5Β). Σε μεγαλύτερη μεγέθυνση της επεμβατικής μπροστά, mDia2 δραματικά εντοπισμένη σε επιμήκεις δομές που μοιάζουν με tubulated endosomes [53], η οποία επεκτάθηκε σε όλες τις μεγάλες προεξοχές των μεσεγχυματικών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, mDia1 ήταν ως επί το πλείστον σε πυρηνικό εισβάλλοντα κύτταρα, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές για τις πυρηνικές ενεργοποιείται mDia1 κατευθύνοντας SRF μεσολάβηση Ρ-ακτίνης δυναμική εντός του πυρήνα [54]. Παρατηρήσαμε πολλαπλών κυτταρικών μορφολογίες σε επεμβατικές κυττάρων σε κολλαγόνο, συμπεριλαμβανομένων σφαιρικά αμοιβαδοειδή κύτταρα (~ 40% των κυττάρων που εισβάλλουν), και επιμήκη, πολωμένα μεσεγχυματικά κύτταρα (~ 60% εισβάλλοντα κύτταρα) που μεταναστεύουν σε κλώνους (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον, επεμβατική σφαιροειδή αναπαραγώγιμα (χρησιμοποιώντας αρκετά πρωτογενή αντισώματα διαφορετικών ξενιστών και εμπορικές παραγωγές) έδειξαν διακριτή, στικτή κηλίδωση mDia2 εντός της μήτρας (Σχήμα 5C, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προηγουμένως, mDia πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν σε προμεταναστευτικές OVCA που προέρχονται από μικροσωματίδια [55] και mDia2 κατευθύνεται προμεταναστευτικές oncosome σχηματισμό σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [29]. Βιοχημικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για τον χαρακτηρισμό των mDia2 εμπλουτισμένο εξωκυττάριο σωματίδια που υπάρχουν στο εισβάλλουν OVCA σφαιροειδή.

Α. Σφαιροειδή διαμορφώθηκαν πρώτα για 48-Ι τζελ, και απεικονίζεται με μικροσκοπία φωτεινού μετά τους καθορισμένους χρόνους. Bar = 150 μm. B. σφαιροειδή σχηματίστηκαν επί 72 ώρες, ενσωματωμένα σε πήγματα κολλαγόνου Ι και αφέθηκε να εισβάλουν για 24 ώρες. Σφαιροειδή μονιμοποιήθηκαν και αν πραγματοποιηθεί για mDia1, mDia2 και F-ακτίνη. Bar = 100 μm. C. Μεγαλύτερη μεγέθυνση εικόνας (63 ×) της εισβολής κυττάρων από την ορισθείσα ROI στο Β mDia1, mDia2, και F-ακτίνης οπτικοποιήθηκαν με συνεστιακή μικροσκόπηση. Bar = 25 μm. D. Μετά από 56 ώρες μετά την αγωγή με siRNA, σφαιροειδή σχηματίστηκαν και ενσωματωμένα σε κολλαγόνο σε 104 h θεραπεία μετα-siRNA. Η περιοχή για ROI που αντιστοιχούν στο 95% των μεταστατικών κυττάρων υπολογίστηκε για 0 ​​και 18 ώρες μετά την εισβολή (122 h θεραπεία μετα-siRNA). Αντιπροσωπευτικά σφαιροειδή σε 4Χ δείχνεται χρώση για phalloidin και εικόνες αντίθεση ενισχυμένη. Bar = 100 μm. Τουλάχιστον 30 σφαιροειδή μετρήθηκαν για κάθε κατάσταση. Οι τιμές ρ εμφανίζονται πάνω από το ιστόγραμμα και σε σχέση με την εισβολή σε 18 ώρες είτε για λιπιδίων ή σφαιροειδή αντιμετωπίζονται έλεγχο. Ε Επιμήκυνση δείκτες υπολογίστηκαν για επεμβατική κύτταρα από D. Τουλάχιστον 30 επεμβατική κύτταρα μετρήθηκαν ανά συνθήκη. Εκπρόσωπος χρώση phalloidin εμφανίζεται. Bar = 25 μm. ΕΙ & gt? 2 (διακεκομμένη γραμμή) θεωρείται μεσεγχυματικά κυτταρικό τύπο. Οι τιμές ρ εμφανίζονται πάνω από την πλοκή και είναι σχετικές με την εισβολή σε 18 ώρες είτε για λιπιδίων ή σφαιροειδή αντιμετωπίζονται έλεγχο. Όλες οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε SD από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα.

Η

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της mDia σε μονό κύτταρο εισβολής, μετρήθηκε η επεμβατική περιοχή των ενσωματωμένων mDia1 ή mDia2 εξαντλημένο σφαιροειδή ES2 μετά από 0 h (104 h μετά την νοκ ντάουν) και 18 ώρες (122 ώρες μετά-νοκ ντάουν). Τα ανεπεξέργαστα και ελέγχου siRNA που έλαβαν σφαιροειδή εισέβαλε δυναμικά τη μήτρα κολλαγόνου μέσα σε 20 ώρες. Ωστόσο, mDia2-εξαντλημένο σφαιροειδή αποκάλυψε σημαντικά ενισχυμένη εισβολή σε σχέση με τους μάρτυρες (Σχήμα 5D και το Σχήμα S4C), παρά μετρίως μικρότερου μεγέθους τους, κατά την ενσωμάτωση (Σχήμα 4C). Αντιστρόφως, mDia1-εξαντλημένο σφαιροειδή εισέβαλαν στον ίδιο βαθμό όπως σφαιροειδή ελέγχου (Σχήμα S6), υποδεικνύοντας ότι mDia1 δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην OVCA σφαιροειδές εισβολή. Επειδή αλλαγές στην έκφραση και /ή λειτουργία mDia2 συνδέονται με αμοιβαδοειδή μεταβάσεις [27] – [29], υπολογίσαμε δείκτες επιμήκυνση (ΕΙ) στις επεμβατικές κύτταρα που προέρχονται από τα σφαιροειδή διαιρώντας το μακρύ άξονα του κυττάρου με τον μικρό άξονα? Μια EI 2 ή περισσοτέρων υποδεικνύει ένα επίμηκες σχήμα μεσεγχυματικά, ενώ ένα ΕΙ από λιγότερο από 2 δείχνει μια πιο εμφανή στρογγυλεμένη, αμοιβαδοειδή φαινότυπο. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα σφαιροειδή όπου εξάντληση mDia2 ενισχυμένη εισβολή, οι επεμβατικές κύτταρα ήταν κυρίως αμοιβαδοειδή σε σχήμα σε σχέση με το μη επεξεργασμένο και τον έλεγχο σφαιροειδή siRNA-αγωγή (Σχήμα 5Ε).

ROCK υποστηρίζει και τα δύο προγράμματα κινητικότητας μεσεγχυματικών και αμοιβαδοειδή 3D στην επεμβατική ES-2 σφαιροειδή

amoeboid μεταβάσεις μπορεί να περιλαμβάνει Rho-σκηνοθεσία ROCK σηματοδότησης σε άμεση συσταλτικότητα [56], [57]. ROCK ανταγωνίζεται επίσης πρωτεΐνες mDia όσον αφορά τη διατήρηση συνδέσεων μεταξύ κυττάρων σε 2D μονοστοιβάδες [18]. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK και πρωτεϊνών mDia για τη διατήρηση κόμβους κυττάρου-κυττάρου σε 3D δομές όπως OVCA σφαιροειδή είναι ασαφής. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε τον ρόλο της δραστηριότητας ROCK στο σχηματισμό σφαιροειδών. Εμείς μπλοκαριστεί δραστηριότητα ROCK με κατεργασία σφαιροειδή με τον συγκεκριμένο αναστολέα, Y27632. Σφαιροειδές μέγεθος ήταν ελαφρώς μειωμένη μέσω 48 ώρες της θεραπείας (Σχήμα 6Α), προτείνοντας ότι η ROCK /μυοσίνη μεσολάβηση διαδικτύωση mDia ρυθμιζόμενων F-ακτίνης μπορεί να παίζει ένα ρόλο στο σχηματισμό σφαιροειδών. Η αναστολή της ROCK καταστέλλεται δραματικά σφαιροειδές εισβολή σχέση με τους μάρτυρες (Σχήμα 6Β), σε συνέπεια με προηγούμενες μελέτες που εμπλέκουν ROCK σε διόγκωση του παχέος [58] και Caov3 κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών μονοστοιβάδα [59]. Ένα εντυπωσιακά υπερβολική μετάβαση μεσεγχυματικά κυριαρχούσαν στα λίγα κύτταρα εποίκηση τη μέτρια επεμβατική μπροστά στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολέα ROCK (Σχήμα 6C), υποδεικνύοντας μια απαίτηση για ROCK για την αποτελεσματική άμεση κυτταρική συσταλτικότητας και στα δύο προγράμματα εισβολή amoeboid και μεσεγχυματικά.

Α. Τα σφαιροειδή σχηματίστηκαν με την παρουσία του οχήματος ή 90 μΜ Y27632 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Σφαιροειδές διάμετροι συνέχεια μετρήθηκαν για τουλάχιστον 30 σφαιροειδή σε 10 ×. Bar = 100 μm. Οι τιμές ρ εμφανίζονται πάνω από το οικόπεδο και ελέγχου H

σφαιροειδή 20-θεραπεία. B. σφαιροειδή σχηματίστηκαν επί 48 ώρες με την παρουσία Y27632, και στη συνέχεια, ενσωματωμένα σε κολλαγόνο Ι για 0-48 ώρες παρουσία του οχήματος ή Y27632. Επεμβατική μέτωπα μετρήθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο για τουλάχιστον 30 σφαιρίδια ανά συνθήκη. Bar = 400 μm. Αντιπροσωπευτικά σφαιροειδή σε 4 × δείχνεται χρώση για phalloidin και εικόνες αντίθεση ενισχυμένη. Οι τιμές P αναφέρονται πάνω από το γράφημα και σε σχέση με τον έλεγχο της H

20 επεξεργασμένο σφαιροειδή. Γ Επιμήκυνση δείκτες υπολογίστηκαν για επεμβατικές κύτταρα τα πήγματα κολλαγόνου φαίνεται στο Β ΕΙ & gt? 2 (διακεκομμένη γραμμή) θεωρήθηκαν μεσεγχυματικά κυτταρικό τύπο. Τουλάχιστον 30 κύτταρα μετρήθηκαν ανά συνθήκη.