Αφηρημένο

MKT-077, μια χρωστική rhodacyanine, φάνηκε να παράγουν καρκίνο συγκεκριμένο κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, οι επιπλοκές απέτρεψε την χρήση αυτής της ένωσης πέρα ​​κλινικές δοκιμές. Εδώ περιγράφουμε ΥΜ-1, ένα παράγωγο του MKT-077. Βρήκαμε ότι η ΥΜ-1 ήταν περισσότερο κυτταροτοξική και μεταφρασμένη με διαφορετικό τρόπο από ό, τι MKT-077. ΥΜ-1 κατέδειξε αυτή την κυτταροτοξικότητα σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Αυτή η τοξικότητα περιορίστηκε σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου? απαθανάτισε μοντέλα κυττάρου ήταν ανεπηρέαστη. Σύντομη εφαρμογές της ΥΜ-1 βρέθηκαν να είναι μη τοξικά. Σύντομη θεραπεία με ΥΜ-1 αποκατασταθεί ταμοξιφαίνη ευαισθησία σε ένα πυρίμαχο μοντέλο MCF7 κυττάρων ταμοξιφαίνη ανθεκτικά. Αυτό το αποτέλεσμα είναι δυνητικά οφείλεται σε αλλοιωμένη φωσφορυλίωση άλφα υποδοχέα οιστρογόνου, ένα αποτέλεσμα καθιζάνει με επιλεκτικές μειώσεις σε επίπεδα Akt (Akt /ΡΚΒ). Έτσι, τροποποιήσεις στο ικρίωμα rhodocyanine θα μπορούσε δυνητικά να γίνουν για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα και φαρμακοκινητικές ιδιότητες. Επιπλέον, ο αντίκτυπος στην ταμοξιφαίνη ευαισθησία θα μπορούσε να είναι ένα νέο εργαλείο για την ένωση αυτή την οικογένεια

Παράθεση:. Koren J ΙΙΙ, Miyata Υ, Kiray J, O’Leary JC III, Nguyen L, Guo J, et al. (2012) Rhodacyanine Παράγωγα στοχεύει επιλεκτικά καρκινικά κύτταρα και Προσπερνάει Tamoxifen Αντίστασης. PLoS ONE 7 (4): e35566. doi: 10.1371 /journal.pone.0035566

Συντάκτης: Leonard Petrucelli, Mayo Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 17 του Μάρτη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Απριλίου του 2012

Copyright: © 2012 Koren et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Δρ. Dickey υποστηρίχθηκε από το Σύλλογο Αλτσχάιμερ, CurePSP (Προοδευτική υπερπυρηνική παράλυση), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο για τη Γήρανση (ΝΙΗ /NIA) R00AG031291 και NINDS (Εθνικό Ινστιτούτο Νευρολογικών Διαταραχών και Εγκεφαλικού Επεισοδίου) R01NS073899. Ο Δρ Gestwicki υποστηρίχθηκε από το ΝΙΗ R01NS059690. Ο Δρ Cheng υποστηρίχθηκε από τον James & amp? Esther βασιλιάς Grant 1KG02-33967. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

MKT-077, ένα κατιονικό rhodacyanine, έχει αποδείξει καρκίνο ειδική τοξικότητα και την ανάπτυξη αναστολή

in vitro

και

in vivo

σε πολλές ποικιλίες του καρκίνου [1]. Προσδιορίστηκε ότι MKT-077 εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια [1]. MKT-077 συμμετείχαν στις κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του προχωρημένου και ανθεκτικούς στερεούς όγκους διαφόρων κυτταρικών προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων: των νεφρών, των πνευμόνων, του προστάτη, του παχέος εντέρου, αδενοκαρκινώματα, και μελανωμάτων [2], [3]. Η κύρια αρνητική παρενέργεια που παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις μελέτες ήταν νεφρική τοξικότητα [2], [3]. Η παρατηρούμενη τοξικότητα σταμάτησε την πρόσληψη σε μια δίκη ως παρόμοιες μελέτες σε ζώα έδειξαν μη αναστρέψιμη νεφρική τοξικότητα μετά από χορήγηση του MKT-077 [2], [3]. Αργότερα ανακαλύφθηκε ότι MKT-077 αλληλεπιδρά με mortalin (mot-2), ένα 70-kDa πρωτεΐνη θερμικού σοκ (Hsp70) μέλος της οικογένειας, και ότι η αλληλεπίδραση του MKT-077 με mot-2 που προκαλείται από την απελευθέρωση της καταστολής όγκου p53 από ένα συγκρότημα με mot-2 [4]. Αυτό το συγκρότημα mot-2 /p53 αδρανοποιούνται τις ικανότητες καταστολής όγκου της p53 από απομόνωσης είναι στο κυτταρόπλασμα

in vivo

[5].

Οι καρκίνοι του μαστού είναι μεταξύ των πιο κοινών καρκίνων διαγιγνώσκονται σε γυναίκες [ ,,,0],6]. Δημοσιευμένα δεδομένα δηλώνει ότι κατεργασία κυττάρων MCF7, ένα μοντέλο κύτταρο καρκίνου του μαστού, με MKT-077 παράγει κυτταροτοξικότητα και μεταβάλλει την ανάπτυξη [1], [2]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των δύο δημοσιευμένες κλινικές δοκιμές Φάσης, δεν υπάρχουν ασθενείς με συμπαγή όγκο μαστού ή πυρίμαχου όγκου μαστού συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη [2], [3]. Αν και υπάρχουν πολλές χημειοθεραπείες του καρκίνου του μαστού, η αντίσταση στην θεραπείες του καρκίνου του μαστού μπορεί να προκύψουν σε περίπου 30% των γυναικών σε θεραπεία για καρκίνο του μαστού [7]. Γνωστοί αντιστάσεις σε καρκίνους του μαστού έχουν παρατηρηθεί όχι μόνο πρότυπο στρατηγικές κατά του καρκίνου, όπως η δοξορουβικίνη, αλλά επίσης trastuzumab και ταμοξιφένη (4-ΟΗΤ) [8], [9], [10].

Μαστού καρκίνοι έχουν επίσης ένα υψηλό επιπολασμό της μεταλλάξεων? μεταλλάξεις οι οποίες μπορούν να προωθήσουν την ογκογένεση και την επιβίωση [11]. Αν και αυτές οι μεταλλάξεις παράγουν στόχους για θεραπείες, άλλες μεταλλάξεις μπορούν να ξεπεράσουν σηματοδότησης κύκλωμα δίκτυο καταρράκτη για την εξάλειψη ανάντη στόχων [12], [13]. Αυτό μειώνει τον αριθμό των πιθανών στόχων, μειώνοντας το μόνιμο προσωπικό των επιλογών θεραπείας, και την αύξηση του δυναμικού για την αντίσταση γένεση. Επιπλέον, η αντίσταση μπορεί να προκύψουν όταν οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες μεταβάλλονται για να επιτρέψει πρωτεΐνες προ-επιβίωσης να ενεργήσει με αμείωτη ένταση. Αρκετές κινάσες που σχετίζονται με την επιβίωση των κυττάρων έχουν εμπλακεί στη διευκόλυνση αντίσταση χημειοθεραπεία [14], [15], [16], [17], [18]. Για παράδειγμα, η φωσφορυλίωση των άλφα υποδοχέα οιστρογόνου (ΕΚα) προκαλεί ΕΚα να δραστηριοποιηθούν ανεξάρτητα από οιστρογόνου δέσμευσης, καταλήγοντας σε αντίσταση σε 4-ΟΗΤ. Έτσι, οι στρατηγικές για την εκ νέου ευαισθητοποίηση των πυρίμαχων καρκινικά κύτταρα με τις υπάρχουσες θεραπείες είναι απολύτως απαραίτητη.

Σε αυτά τα δεδομένα, έχουμε εντοπίσει ένα λειτουργικό παράγωγο του MKT-077 που έδειξαν αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε πολλές ποικιλίες του καρκίνου, ενώ εξακολουθεί να διατηρεί την ιδιαιτερότητα του καρκίνου που συνδέονται με MKT-077. Αυτή η ενισχυμένη δραστηριότητα οφείλεται στην ενδοκυτταρική εντόπιση της ένωσης. Επιπλέον, σύντομη θεραπείες με ΥΜ-1 ήταν σε θέση να επαναευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα που είχαν αναπτύξει αντίσταση στον ανταγωνιστή ΕΚα, ταμοξιφένη. Ένας τρόπος με τον οποίο αυτές οι ενώσεις που εργάζονται είναι με τη μείωση των συνολικών επιπέδων Akt, το οποίο μπορεί να συμβάλει στην ΕΚα αναισθησία με την ταμοξιφαίνη. Σε συνδυασμό, το ικρίωμα rhodacyanine κατέχει μεγάλες δυνατότητες ως θεραπευτικό του καρκίνου, τόσο σε ατομικό στρατηγική θεραπείας, αλλά και, ενδεχομένως, ως συνδυαστική ή συνεργική επιλογή για χρήση με τα υπάρχοντα σχήματα.

Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων

Tamoxifen ανθεκτικά (TR-MCF7) και τα γονικά κύτταρα MCF7 ήταν γενναιόδωρα από τον Dr. Jin Q. Cheng της Moffitt Κέντρο Καρκίνου (Tampa, FL). Η γραμμή MCF7 δημιουργήθηκε αρχικά από το Ίδρυμα Καρκίνου Michigan και ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA) και το TR-αντίσταση παρήχθη από χρόνια θεραπεία χαμηλής δόσης με ταμοξιφένη. ΗΕΚ-293, Μ17, Η4, MDA-MB-231, Hs578T και ΝΙΗ-3Τ3 κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Τα κύτταρα HeLa γενναιόδωρα από τον Dr. Kenneth E. Ugen στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα. Εκείνος αρχικά να ληφθεί από την ATCC (Manassas, VA). Αυτά τα κύτταρα που παράγονται από του τραχήλου της μήτρας όγκου από Henrietta Στερείται.

Χημικά και αντισώματα

Το κυανό του μεθυλενίου (MB) αγοράστηκε από Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). MKT-077 και ΥΜ-1 συνετέθησαν όπως περιγράφεται [19]. Anti-Akt1, Akt2, και pAktS473 αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Anti-ΕΡα και pERα S167 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-ακτίνης αγοράστηκε από Sigma Aldrich. Anti-GAPDH αγοράστηκε από την Meridian Life Science (Memphis, TN).

Cell Culture και φαρμακευτικές αγωγές

MCF7, MDA-MB-231, Hs578T και HeLa κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],20]. Η4 και ΗΕΚ-293 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Ορίί – τροποποιημένο μέσο Eagle (ΟΡΤΙ-ΜΕΜ) από την Invitrogen συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% Penstrep (Invitrogen). κύτταρα Μ17 καλλιεργήθηκαν σε ΟΡΤΙ-ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% Penstrep και 100 mg /L Πυρουβικό Νάτριο. ΝΙΗ-3Τ3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με διττανθρακικό χαμηλού νατρίου (1.5 g /L) από ATCC συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% Penstrep. κύτταρα TR-MCF7 αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (που περιγράφεται με κύτταρα MCF7) συμπληρωμένο με 10 μΜ 4-ΟΗΤ. MKT-077 και ΥΜ-1 διαλύθηκαν σε DMSO. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως όχημα για MKT-077 και ΥΜ-1, όπου ενδείκνυται. Ακριβής στρατηγικές θεραπείας συνοδεύουν τα δεδομένα στο τμήμα αποτελέσματα. Συλλογή

Πρωτεΐνες, ποσοτικοποίηση, και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με την εφαρμογή του αντιδραστηρίου εκχύλισης πρωτεϊνών θηλαστικών (Θέρμο) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. μέτρηση Πρωτεΐνης επίπεδο, εξισορρόπηση, κηλίδωση Western και ανίχνευση έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Γαλακτική δεϋδρογενάση (LDH) Δοκιμασία

υποδεικνύεται κυτταρικές γραμμές απλώθηκαν σε καθορισμένο μέσο. Μόλις τα κύτταρα έφτασαν -95% συρροή, MKT-077 ή ΥΜ-1 εφαρμόστηκε σε DMEM χωρίς ερυθρό της φαινόλης. Μετά φορές υποδεικνύεται ανά πείραμα, μέσο συλλέχθηκε από κάθε κατεργασία και φυγοκέντρηση για να ιζηματοποιηθούν τα νεκρά κύτταρα και υπολείμματα. Πρωτόκολλο ακολουθήθηκε όπως παρέχεται από Cytotox-96 kit (Promega).

μιτοχονδριακού Απομόνωση και Φασματοσκοπία

κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6 ώρες με όχημα (DMSO), MB, ΥΜ-1, ή MKT-077. Μετά τα κύτταρα αγωγή συλλέχθηκαν και υποκυτταρικά κλάσματα συλλέγονται χρησιμοποιώντας Pierce μιτοχονδριακού κιτ απομόνωσης από την Thermo Scientific (Rockford, IL). Ανάλυση του εντοπισμού των ναρκωτικών έγινε με φασματοσκοπία στο Thermo Scientific Nanodrop φασματοφωτόμετρο. Συγκεντρώσεις και μετέπειτα ποσοστά αυτά προσεγγίζεται από δημιουργείται συγκέντρωση:. Απορρόφηση καμπύλη (δεν φαίνεται)

ΜΤΤ την Κυτταρική Βιωσιμότητα Δοκιμασία

κύτταρα TR-MCF7 τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων σε μέσο που περιέχει 10 μΜ 4- ΟΗΤ. Όταν τα κύτταρα έφθασαν -90% των κυττάρων συρροή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε ΟΡΤΙ-ΜΕΜ σε μία από τις τέσσερις συνθήκες 1: 10 μΜ 4-ΟΗΤ σε ΟΡΤΙ-ΜΕΜ για την πλήρη 48 ώρες του πειράματος. 2: ΥΜ-1 (ή όχημα) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις επί 4 ώρες ακολουθούμενη από ανταλλαγή ΥΜ-1 μέσο με μέσο που περιέχει 10 μΜ 4-ΟΗΤ. 3: ΥΜ-1 (ή όχημα) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις επί 4 ώρες ακολουθούμενη από ανταλλαγή ΥΜ-1 μέσο με μέσο που περιέχει 95% EtOH (όχημα για 4-ΟΗΤ). Ή, 4: ΥΜ-1 (ή όχημα) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για την πλήρη 48 ώρες του πειράματος. κιτ δοκιμασίας ΜΤΤ αγοράστηκε από το ATCC και δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται.

Απομόνωση πυρηνικών πρωτεϊνών

κύτταρα TR-MCF7 αναπτύχθηκαν σε καθορισμένους μέσο σε δίσκους 10 εκ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 4 ώρες με 10 μΜ 4-ΟΗΤ, 10 μΜ ΥΜ-1, και τα δύο ή οχήματος (ων) για τις δύο ενώσεις. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια και παρεχόμενο πρωτόκολλο από την Qproteome πυρηνική πρωτείνη Kit (Qiagen).

Αποτελέσματα

Τα προφίλ κυτταροτοξικότητας μιας σειράς παραγώγων για MKT-077 επί MCF7 κύτταρα συγκρίθηκαν σε μία οθόνη μικρής κλίμακας. Το παράγωγο ΥΜ-1 ήταν η μόνη ένωση βρέθηκε να έχει τη δόση εξαρτώμενο υψηλότερη τοξικότητα από MKT-077 μετά από 24 ώρες (τιμές LDH κανονικοποιήθηκαν για αριθμό κυττάρων) (Σχήμα 1Α). Ένας πιθανός λόγος γι ‘αυτή την βελτιωμένη ισχύ ήταν κυτταρικό εντοπισμό. Αξιοποιώντας τις μοναδικές φασματικές ιδιότητες αυτών των ενώσεων, τα κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MKT-077 ή ΥΜ-1 και κυτταρική διαχωρισμό των μιτοχονδρίων και κυτοσολίου διεξήχθησαν. Μπλε του μεθυλενίου, μία ένωση που είναι γνωστό ότι εντοπίζονται στα μιτοχόνδρια, χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας [21]. Τα υποκυτταρικά κλάσματα αναλύθηκαν φασματοφωτομετρικά. Αυτές οι τιμές συγκρίθηκαν με ένα πρότυπη καμπύλη του Abs: συγκέντρωση (τα δεδομένα δεν φαίνονται) για να δώσει ένα κατά προσέγγιση συγκέντρωση της ένωσης σε κάθε κλάσμα και ως εκ τούτου ένα ποσοστό του φαρμάκου ανά τοποθεσία. Είναι ενδιαφέρον ότι, ΥΜ-1, σε αντίθεση με MKT-077 ήταν πιο διαδεδομένη στα κυτοσολικά κλάσματα (Σχήμα 1Β).

κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με τρεις συγκεντρώσεις του MKT-077 ή ΥΜ-1. Μετά από 24 ώρες, το μέσο συλλέχθηκε και αναλύθηκε με δοκιμασία LDH. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι ένα% της θεραπείας οχήματος ± SD (Α). κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MKT-077, ΥΜ-1 ή μπλε του μεθυλενίου (ΜΒ). Μιτοχονδριακή κλάσματα συλλέχθηκαν και ένωση τοποθεσία μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο (Β).

Η

Εκφράζοντας την ανησυχία ότι η έλλειψη του μιτοχονδριακού αλληλεπίδρασης θα μειώσει την κυτταροτοξική ειδικότητα δει με rhodacyanine για καρκινικά κύτταρα, την επιλεκτικότητα των ΥΜ-1 για αρκετές καρκίνου και αθανατοποιημένα κύτταρα γραμμές εξετάστηκαν. Αυτές περιλάμβαναν: MCF7, Hs578T και MDA-MB-231 (καρκίνος του μαστού), Μ17 (νευροβλάστωμα), Η4 (νευρογλοίωμα), HeLa (καρκίνος του τραχήλου της μήτρας), και δύο αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές: ΗΕΚ 293 (ανθρώπινος εμβρυϊκός νεφρός) και ΝΙΗ 3Τ3 ( ινοβλαστών ποντικού). Ανθεκτική κυτταροτοξικότητα (1323% του οχήματος), όπως μετράται με γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) δοκιμασία, παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF7 μετά από 24-ωρη θεραπεία ΥΜ-1 (Σχήμα 2Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, αυτές οι τιμές τοξικότητα ήταν υψηλότερες από αυτές που παρατηρούνται στο Σχήμα 1Α αφού χρησιμοποιήσαμε έναν πληθυσμό μεγαλύτερο κελί (1A≈0.2 × 10

6 κύτταρα? 2A≈1.2 × 10

6 κύτταρα) και έτσι περισσότερο LDH απελευθερώθηκε από την σχετική τοξικότητα. Οι άλλες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν όλες εμφανιστεί τοξικότητα μετά ΥΜ-1 διοίκησης? ότι, οι δύο αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται ελάχιστη έως μηδενική τοξικότητα με δοκιμασία LDH (Σχήμα 2Β). Αυτό έδειξε ότι η κυτοσολική εντοπισμός του ΥΜ-1 δεν επηρέασε την ειδικότητα του για τα καρκινικά κύτταρα.

MCF7 κύτταρα (καρκίνος του μαστού) υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΥΜ-1. Μετά από 24 ώρες, το μέσο συλλέχθηκε και αναλύθηκε με δοκιμασία LDH κυτταροτοξικότητας. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι ένα% της θεραπείας οχήματος ± SD (Α). Hs578T και MDA-MB-231 (καρκίνος του μαστού), Μ17 (νευροβλάστωμα), Η4 (νευρογλοίωμα) και HeLa (καρκίνος τραχήλου) κυττάρων σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΥΜ-1 και την τοξικότητα συγκρίθηκε με ΝΙΗ-3Τ3 (ποντικός εμβρυϊκών ινοβλαστών ) και ΗΕΚ 293 () κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού για τον καρκίνο ειδική τοξικότητα. Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, μέσα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με δοκιμασία LDH. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι ένα% της θεραπείας οχήματος ± SD (Β).

Η

ΥΜ-1 αποτελεσματικότητα στη συνέχεια ελέγχθηκε σε ένα μοντέλο κύτταρο ταμοξιφαίνη αντίστασης. Η τοξικότητα των ΥΜ-1 σε ένα πυρίμαχο ταμοξιφένη (4-ΟΗΤ) ανθεκτικά MCF7 (TR-MCF7) κυτταρική γραμμή συγκρίθηκε με εκείνη του πατρικού MCF7 (μη ανθεκτικά) κυτταρική γραμμή. Πράγματι, ΥΜ-1 σκότωσε αποτελεσματικά τόσο πρότυπο και ανθεκτικών κυττάρων (TR-MCF7) μετά από 48-ώρες επώασης (Σχήμα 3Α). Λαμβάνοντας υπόψη τις προηγούμενες ανησυχίες με χρόνια θεραπεία MKT-077, έχουμε σκεφτεί ότι μια βραχύτερη θεραπεία με ΥΜ-1 μπορεί να είναι εξίσου τοξικά. Για να ελεγχθεί αυτό, κύτταρα MCF7 και κύτταρα TR-MCF7 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΥΜ-1 για 4 ώρες. Αυτό απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με όχημα για 44 ώρες. Επιπλέον, τα κύτταρα TR-MCF7 υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 4-ΟΗΤ ή οχήματος για 4-ΟΗΤ (95% EtOH) (Σχήμα 3Β). Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε ελάχιστη τοξικότητα.

TR-MCF7 και γονικά κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με 10 μΜ ΥΜ-1. Μετά από 48 ώρες, μέσα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με δοκιμασία LDH. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι ένα% της θεραπείας οχήματος ± SD (Α). κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 4 ώρες με 10 μΜ ΥΜ-1. Στις 4 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με πρότυπο μέσο ανάπτυξης για 44 ώρες. κύτταρα TR-MCF7 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΥΜ-1 για 4 ώρες. Στις 4 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με πρότυπα μέσα TR-MCF7 που περιέχει 10 μΜ 4-ΟΗΤ ή 95% EtOH, το όχημα για 4-ΟΗΤ, για 44 ώρες. Μετά από 48 ώρες από την αρχική θεραπεία, μέσα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με δοκιμασία LDH. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι ένα% της θεραπείας οχήματος ± SD (Β).

Η

Κυτταρική βιωσιμότητα (ΜΤΤ) δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για να ελεγχθεί αν αυτή η βραχύτερη στρατηγική αγωγής που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα κύτταρα TR-MCF7 αναπτύχθηκαν σε μέσα που περιέχουν 10 μΜ 4-ΟΗΤ. σχεδιασμένη στρατηγική θεραπείας μας περιείχε τέσσερα συνθήκες όλα περάτωση σε 48 ώρες: 1. 10 μΜ 4-ΟΗΤ μόνος για 48 ώρες, 2. ΥΜ-1 (ή όχημα) θεραπεία για 4 ώρες ακολουθούμενη από εκ νέου προσθήκη 10 μΜ 4-ΟΗΤ για 44 ώρες, 3. ΥΜ-1 (ή όχημα) θεραπεία για 4 ώρες ακολουθούμενη από 95% EtOH (όχημα για 4-ΟΗΤ), και 4. ΥΜ-1 (ή όχημα) θεραπεία για την πλήρη 48-ωρών. προσδιορισμοί ΜΤΤ αποκάλυψε ότι η 4-ώρες 10 μΜ ΥΜ-1 που ακολουθείται από 10 μΜ κατεργασία 4-ΟΗΤ μειωμένη βιωσιμότητα κατά 60% σε σχέση με τη θεραπεία 4-ΟΗΤ μόνο. Το 10 μΜ ΥΜ-1 που ακολουθείται από 95% EtOH θεραπεία δεν μετέβαλλε τη βιωσιμότητα (Σχήμα 4Α). Το 48-ώρες 10 μΜ ΥΜ-1 θεραπεία ελαττωμένη βιωσιμότητα κατά 40% σε σύγκριση με 48-ωρη θεραπεία 4-ΟΗΤ, παρόμοιο με το Σχήμα 3Α.

κύτταρα TR-MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4-ΟΗΤ για 48 ώρες, ΥΜ-1 (ή όχημα) για 4 ώρες ακολουθούμενη από 44 ώρες είτε 4-ΟΗΤ ή 95% EtOH, ή ΥΜ-1 (ή όχημα) για 48 ώρες. Στις 48 ώρες από την αρχική θεραπεία, διεξήχθησαν δοκιμασίες βιωσιμότητας ΜΤΤ. τιμές βιωσιμότητας της κάθε θεραπείας ως% του 48 ώρες κατεργασίας 4-ΟΗΤ ± SD (Α). 2-Way ANOVA ανάλυση συγκρίνοντας όλες τις ομάδες ΥΜ-1 θεραπεία (Gray τετράγωνα- 4 ωρών ΥΜ-1then 4-ΟΗΤ, ανοιχτή diamonds- 48 ώρες ΥΜ-1, μαύρο triangles- 4 ωρών ΥΜ-1, στη συνέχεια 95% EtOH), αποκάλυψε σημασία σε όλη συγκεντρώσεις (F (2,30) = 54,22, p & lt? 0,0001), και τη στρατηγική της θεραπείας (F (4, 30) = 41.04, p & lt? 0,0001), αλλά καμία σημαντική αλληλεπίδραση (F (8,30) = 1.83 , ρ = 0.1107). * – Δεικνύει σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) 4-ώρες ΥΜ-1, έπειτα 4-ΟΗΤ από άλλες δύο ομάδες με εξαίρεση 10 μΜ θεραπείες, σημασία όπως υποδεικνύεται (ns = p & gt? 0,05) (Β). 1-way ANOVA της στρατηγικής ΥΜ-1 + 4-ΟΗΤ αποκαλύπτοντας σημασία των 10 μΜ συγκέντρωση (F (4,10) = 16.49, ρ = 0.0002) (C). Ανάλυση των ΥΜ-1 + 95% EtOH, με ANOVA 1 δρόμου, αποκάλυψαν καμία σημασία σε όλη συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν (F (4,10) = 3.435, p = 0,0516) (D). 48-ώρες ΥΜ-1 θεραπεία έδειξε διαφορές σημασία μεταξύ όλων των συγκεντρώσεων και η συγκέντρωση 10 μΜ, με ANOVA 1 δρόμου (F (4,10) = 12.32, ρ = 0.0007) (Ε). 1-way ANOVA ανάλυση (F, (5,12) = 24.33, ρ & lt? 0,0001) συγκρίνοντας τους 10 μΜ ΥΜ-1 θεραπείες, 48ωρη 4-ΟΗΤ, και θεραπείες όχημα δεν αποκάλυψαν καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των 48 ωρών 4-ΟΗΤ και οι δύο 4-ώρες 10 μΜ ΥΜ-1 + 95% EtOH και 48 ώρες 10 μΜ ΥΜ-1 θεραπείες? λαμβάνοντας υπόψη ότι η 48ωρη 4-ΟΗΤ και η 4-ώρες 10 μΜ ΥΜ-1 + 95% EtOH ήταν σημαντικά διαφορετικό από το ΥΜ-1 θεραπεία 4-ώρες + 4-ΟΗΤ (ρ & lt? 0,05). (F)

Όλοι οι στρατηγικές θεραπείας που περιέχει ΥΜ-1 αναλύθηκαν με αμφίδρομη ANOVA (Εικόνα 4Β). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε μια σημαντική επίδραση από τη στρατηγική της θεραπείας και τη συγκέντρωση των ΥΜ1 (F (4, 30) = 41.04, p & lt? 0,0001), (F (2,30) = 54,22, p & lt? 0,0001). Η αλληλεπίδραση μεταξύ της στρατηγικής της θεραπείας και η συγκέντρωση δεν ήταν σημαντική (F (8,30) = 1.83, p = 0,1107). Bonferroni post-hoc ανάλυση αυτού του 2-way ANOVA δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ οποιωνδήποτε από τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την 48-ωρη θεραπεία ΥΜ-1 και το 4-ώρες ΥΜ-1 που ακολουθείται από 95% θεραπεία EtOH (όλα τα p & gt? 0,05) ? ότι, όλες οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται για την 4-ωρη ΥΜ-1 που ακολουθείται από κατεργασία 4-ΟΗΤ ήταν σημαντικά διαφορετική από την 4-ωρη ΥΜ-1 που ακολουθείται από 95% θεραπεία EtOH (όλα ρ & lt? 0,05). Όλες οι συγκεντρώσεις του 4-ώρες ΥΜ-1 που ακολουθείται από 4-ΟΗΤ και η 48-ωρη ΥΜ-1 ήταν σημαντικά διαφορετικές (όλο ρ & lt? 0,05) με εξαίρεση την συγκέντρωση ΥΜ-1 10 μΜ (ρ & gt? 0,05). Εμείς απέδωσε την έλλειψη σημασίας για τη γενική τοξικότητα που προκαλείται από την 48-ωρη 10 μΜ συγκέντρωση του ΥΜ-1 (βλέπε Σχήμα 3Α & amp? Β). Ένας μονόδρομη ANOVA της καμπύλης συγκέντρωσης ΥΜ-1 για των 4 ωρών ΥΜ-1 θεραπεία που ακολουθείται από 44 ώρες κατεργασίας 4-ΟΗΤ αποκάλυψε ότι η συγκέντρωση 10 μΜ ήταν σημαντικά διαφορετική από όλες τις άλλες συγκεντρώσεις (F (4,10) = 16.49, ρ = 0.0002) (Σχήμα 4C). Η καμπύλη συγκέντρωσης για των 4 ωρών ΥΜ 1-θεραπεία που ακολουθείται από 95% EtOH θεραπεία εμφανίζεται ότι δεν συγκέντρωση ήταν σημαντική από οποιαδήποτε άλλη συγκέντρωση με μονόδρομη ANOVA (F (4,10) = 3.435, p = 0,0516) (Εικόνα 4D) . Σύγκριση του συνόλου των ΥΜ-1 συγκεντρώσεις 48 ωρών, με μονόδρομη ANOVA, εμφανίζεται ότι, και πάλι, η συγκέντρωση 10 μΜ ήταν σημαντικά διαφορετική από όλες τις άλλες συγκεντρώσεις σε αυτή τη θεραπεία (F (4,10) = 12.32, ρ = 0,0007 ) (Σχήμα 4Ε). Συνεχίσαμε την ανάλυσή μας με τη σύγκριση της συγκέντρωσης 10 μΜ ΥΜ-1, από όλες τις ομάδες θεραπείας, με τη μηδενική θεραπεία. τιμές βιωσιμότητα όλων των προαναφερθέντων συνθηκών επεξεργασίας, με την προσθήκη του 4-ΟΗΤ 48 ώρες αγωγή και θεραπείες οχήματος ως ξεχωριστές ομάδες, αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA (F, (5,12) = 24.33, ρ & lt? 0,0001). δοκιμή post-hoc Tukey έδειξε ότι 4 ώρα ΥΜ-1 που ακολουθείται από 4-ΟΗΤ ήταν σημαντικά διαφορετική από την επεξεργασία 4-ΟΗΤ σε 48 ώρες (ρ & lt? 0,05), ενώ και οι δύο των 48 ώρα και 10 μΜ ΥΜ-1 και η 4 ώρα και 10 μΜ ΥΜ-1 που ακολουθείται από 95% EtOH θεραπείες δεν ήταν σημαντικά σημαντικές από 4-ΟΗΤ 48 ωρη συνεδρία της (Σχήμα 4F). Η ανάλυση έδειξε επίσης ότι 10 μΜ ΥΜ1 που ακολουθείται από 4-ΟΗΤ είναι σημαντικά διαφορετική από 10 μΜ ΥΜ1 που ακολουθείται από 95% EtOH (ρ & lt? 0,05).

Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι απλώς μία αγωγή 4 ωρών 10 μΜ ΥΜ -1 θα μπορούσε εκ νέου να ευαισθητοποιήσει κύτταρα TR-MCF7 με ταμοξιφαίνη /4-ΟΗΤ, σταματώντας την ανάπτυξη των κυττάρων χωρίς να προκαλεί εμφανή τοξικότητα. Οι πιθανοί μηχανισμοί για αυτό το φαινόμενο στη συνέχεια διερευνώνται. Ένας εύλογος μηχανισμός ήταν παρεκκλίνουσα δραστικότητα κινάσης, το οποίο είναι γνωστό ότι προάγει την ταμοξιφαίνη αντίσταση με φωσφορυλίωση ΕΚα σε μία θέση γνωστή για την προώθηση της ανεξάρτητης δραστηριότητα οιστρογόνων [14], [15], [16], [17], [18]. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα TR-MCF7 όπως περιγράφεται για τα πειράματα στο Σχήμα 4Α & amp? Β πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν και διερευνήθηκαν για τα επίπεδα της Ετα pS167, μια περιοχή ότι όταν φωσφορυλιωμένη, διαβιβάζει ταμοξιφαίνη ανεξαρτησία. Πράγματι, η φωσφορυλίωση του ΕΚα pS167 ανυψώθηκε με την παρουσία 4-ΟΗΤ? Ωστόσο, η προσθήκη 10 μΜ ΥΜ-1 καταργηθεί αυτό το συμβάν (Σχήμα 5Α & amp? Β). ΥΜ-1 δεν μετέβαλε την πυρηνική εντόπιση του ΕΚα στον πυρήνα (Σχήμα 5C & amp? D).

κύτταρα TR-MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συνθήκες για 4 ώρες. Πυρηνική απομονώσεις και κυτοσολίων κλάσματα σε σύγκριση με κηλίδα Western, εκπρόσωπος κηλίδες εμφανίζονται (amp A &? C). ανάλυση πυκνότητας των επιπέδων pERα και ΕΡα εμφανίζεται ως% της θεραπείας του οχήματος ± SD (amp B &? D)

Η

S167 της Ετα πέφτει περιέχεται μέσα σε μια συναινετική θέση Akt (Akt /PKB).. Akt είναι μία κινάση προ-επιβίωσης με δύο ισομορφές που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με ΕΚα. Εμείς κατεργασμένα κύτταρα MCF7 με 10 μΜ ΥΜ-1 για 6 ώρες για να αποφευχθεί η τοξικότητα και αναζήτησαν μεταβολών είτε επίπεδα Akt ή ενεργοποίηση. Τα επίπεδα του Akt1 και Akt2 είχαν δόση εξαρτώμενο μειώνεται κατά ΥΜ-1 (Σχήμα 6Α & amp? Β). Αυτό υποδηλώνει ότι ΥΜ-1 μπορεί να προκαλέσει τοξικότητα ειδικά για καρκινικά κύτταρα, παρόμοια με την μητρική ένωση MKT-077, αλλά ότι ΥΜ-1 επιτυγχάνεται με τη μείωση των κινασών προ-επιβίωσης όπως Akt, οδηγώντας ενδεχομένως σε μεταβολές στην μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε πυρίμαχα όγκους. Αυτά τα δεδομένα συμφωνεί με την εργασία προηγούμενες εργασίες που αποδεικνύουν ότι τα αποτελέσματα της LY294002, ένας αναστολέας της ΡΙ3Κ /Akt αναστολέα οδού σηματοδότησης, στην ταμοξιφαίνη επαγόμενη απόπτωση ήταν ειδικά για την αναστολή της δραστικότητας Akt [16].

κύτταρα MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σημειωθεί συγκεντρώσεις ΥΜ-1 για 6 ώρες. Τα κύτταρα λύματα αναλύθηκαν με κηλίδα Western (Α). ανάλυση πυκνότητας των Akt-1 και τα επίπεδα Akt2 εμφανίζεται ως% της θεραπείας του οχήματος ± SD (Β).

Η

Συζήτηση

Εδώ περιγράφουμε το θεραπευτικό δυναμικό ενός MKT-077 παράγωγο, ΥΜ-1. Αυτή η ένωση, που είναι παρόμοια με MKT-077, ήταν ειδικά τοξικά σε καρκινικά κύτταρα. ΥΜ-1 είχε επίσης μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα και κυτοσολίων εντοπισμού από MKT-077. Σύντομη έκθεση σε ΥΜ-1 ήταν σε θέση να αποκαταστήσει ευαισθητοποιήσει πυρίμαχων κύτταρα καρκίνου του μαστού με την ταμοξιφαίνη, μια κοινή θεραπεία που χρησιμοποιείται στην κλινική. Αυτός ο μηχανισμός αποδείχθηκε ότι είναι Akt εξαρτώμενη ως ΥΜ-1 ήταν σε θέση να μειώσει τα επίπεδα Akt, καθώς και τη φωσφορυλίωση του ΕΚα σε Akt συναινετική θέση. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν το δυναμικό για τα παράγωγα rhodacyanine στη θεραπεία των πυρίμαχων καρκίνων.

Είναι πιθανό ότι η παρουσία κυτοσολικό ΥΜ-1, έναντι των μιτοχονδρίων του MKT-077, οδηγεί η αυξημένη τοξικότητα και κάθαρση Akt παρατηρούν με ΥΜ -1. Αν και οι πτυχές της μιτοχονδριακής MKT-077 είναι καλά χαρακτηρισμένες [1], [2], [3], πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι MKT-077 μπορεί επίσης να αλληλεπιδράσει με τα μέλη της οικογένειας κυτοσολική Hsp70 [22]. Εάν MKT-077 είναι ικανή να αναστείλει κυτοσολική Hsp70 όπως κάνει mortalin [4], [5], ΥΜ-1 μπορεί επίσης να αναστέλλουν την κυτοσολική Hsp70. αναστολείς Hsp70 έδειξαν ειδικότητα του καρκίνου, καθώς και την ικανότητα να μειώνουν πρωτεΐνες πελάτη Hsp70 [20], [23], [24], [25]. Υποψιαζόμαστε ότι η αναστολή Hsp70 θα μπορούσε να είναι ο μηχανισμός της ΥΜ-1? Ωστόσο, περαιτέρω εξέταση είναι απαραίτητη.

Tamoxifen θεραπείες συνήθως αποτυγχάνουν λόγω της ανάπτυξης της αντίστασης. Κεκτημένα αντιστάσεις χρειάζονται χρόνο για να αναπτυχθούν. Οι μελέτες μας έχουν δείξει ότι η σύντομη θεραπείες με ΥΜ-1 μπορεί εκ νέου να ευαισθητοποιήσει πυρίμαχα καρκίνων με την ταμοξιφαίνη. Το όφελος από μια τέτοια σύντομη θεραπεία είναι η έλλειψη ευκαιρία για μια αντίσταση σε ΥΜ-1 ίδια, καθώς και μειωμένη πιθανότητα για τοξικότητες εκτός στόχου. Επιπλέον, η δυνατότητα να αναιρεί τις υφιστάμενες αντιστάσεις επιτρέπει την επαναφορά του υποθετικού χημειοθεραπείες? αποτρέποντας την ανάγκη για πιο δαπανηρή και δυνητικά επικίνδυνη δευτερογενή και τριτογενή θεραπευτικές στρατηγικές. Επιπλέον, ΥΜ-1 θεραπεία μόνη της ήταν σε θέση να σκοτώσει επιλεκτικά μόνο ορισμένα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει όχι μόνο την ανεκτικότητα με την προσέγγιση, αλλά και την ανάγκη για περαιτέρω χαρακτηρισμό για τους ειδικούς τύπους κυττάρων που θα μπορούσαν να είναι ευαίσθητα σε αυτές τις ενώσεις και εξάντληση Akt. Αυτά τα οφέλη για τους ασθενείς σε συνδυασμό με τον υψηλό αριθμό των ποικιλιών του καρκίνου που συνδέονται με δυσλειτουργία του Akt παρέχει μια πλατφόρμα για τη συνεχή μελέτη και την ανάπτυξη νέων ενώσεων για να καταστρέφουν Akt, μέσω χειραγώγησης του ικριώματος rhodocyanine.

Ενώ άλλες κινάσες έχουν εντοπιστεί προς φωσφορυλιωμένο ΕΚα, Akt είναι μια σημαντική κινάση επιβίωση, ανεξάρτητα από το φαινότυπο αντίστασης, και η κάθαρση του θα μπορούσε να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα χημειοθεραπευτικών. Αν η υπόθεση μας ότι ΥΜ-1 είναι ένας αναστολέας Hsp70 είναι ακριβής, αυτή η κάθαρση θα μπορούσε να οφείλεται σε αυξημένη ουβικουϊτινίωση της Akt, καθώς η ubiquitin λιγάση για Akt, CHIP (καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης Hsc70) [26], είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με hsp70 [27].

Οι μελέτες αυτές καταδεικνύουν την ανάγκη για περισσότερο μηχανιστική κατανόηση του τρόπου δράσης της rhodacyanines. Μικρές αλλαγές μεταξύ MKT-077 και ΥΜ-1 οδηγούν σε αυξημένη κυτοσολικά παρουσία που ήταν σε θέση να διατηρήσει παρόμοια ειδικότητα. Αυτό υποδηλώνει ότι οι τροποποιήσεις αυτής της ικρίωμα θα μπορούσε να προκαλέσει ειδική τοξικότητα ή μειώνουν τη νεφρική τοξικότητα, όπως παρατηρείται στις κλινικές και εργαστηριακές δοκιμές [1], [2], [3]. Στην πραγματικότητα, τα δεδομένα μας καταδεικνύουν μια σχεδόν προτιμησιακή θανάτωση κυττάρων καρκίνου του μαστού, έναντι άλλων τύπων καρκινικών κυττάρων, υποδηλώνει ότι η ειδικότητα για συγκεκριμένες ποικιλίες όγκου θα μπορούσε να κατασκευαστεί μέσα στο ικρίωμα rhodacyanine.