Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα προκαλείται από συνδυασμούς διαφορετικών γενετικών μεταλλάξεων. Εδώ, για να καταλάβει τη σχέση των πυρηνικών υποδοχέων (NRS) στην ογκογονίδιο που σχετίζεται με παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα, ερευνήσαμε το προφίλ έκφρασης του συνόλου 48 NR μέλη χρησιμοποιώντας ανάλυση QPCR σε ένα πάνελ ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (HBECs) που περιελάμβανε προκαρκινικών και ογκογόνο HBECs υπόθαλψη ογκογόνο

K-ras

V12

και /ή

p53

αλλαγές. Η ανάλυση του προφίλ αποκάλυψε ότι ογκογόνος αλλοιώσεις συνοδεύονται μεταγραφική αλλαγές στην έκφραση των 19 NRs σε προκαρκινικές HBECs και 15 NRs σύμφωνα με την κακοήθη εξέλιξη του HBECs. Μεταξύ αυτών, ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γάμμα (ΡΡΑΡγ), ένα NR επιλεγεί ως μελέτη απόδειξη της αρχής, έδειξαν αυξημένη έκφραση σε προκαρκινικές HBECs, η οποία απροσδόκητα αντιστράφηκε όταν αυτοί οι HBECs αποκτήσει πλήρη

in vivo

ογκογονικότητας . Αξιοσημείωτα, ΡΡΑΚγ ενεργοποίηση από θειαζολιδινεδιόνη κατεργασία (TZD) ανέστρεψε την αυξημένη έκφραση των προ-φλεγμονωδών κυκλοοξυγενάση 2 (COX2) σε προκαρκινικές HBECs. Σε πλήρως ογκογόνο HBECs με επαγώγιμη έκφραση του ΡΡΑΚγ, ΤΖϋ θεραπείες ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων, κλωνογονίας, και μετανάστευση κυττάρων σε ένα PPARγ-τροποποίησή της με SUMO εξαρτώμενο τρόπο. Μηχανιστικά, η τροποποίησή της με SUMO του liganded-ΡΡΑΚγ μειωμένη έκφραση COX2 και αυξημένη έκφραση 15-hydroxyprostaglandin αφυδρογονάση. Αυτό υποδηλώνει ότι ο συνδέτης μεσολάβηση τροποποίησή της με SUMO του ΡΡΑΚγ διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα με ρύθμιση του μεταβολισμού προσταγλανδίνης

Παράθεση:. Kim J, Sato Μ, Choi JW, Kim HW, Yeh BI, Larsen JE, et al . (2015) των πυρηνικών υποδοχέων έκφρασης και λειτουργίας σε ανθρώπινο πνεύμονα Καρκίνος Παθογένεια. PLoS ONE 10 (8): e0134842. doi: 10.1371 /journal.pone.0134842

Επιμέλεια: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 4, Φεβ 2015? Αποδεκτές: 15 Ιουλ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 5 του Αύγ 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (NRF-2013R1A1A1A05005075 να YJ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο πυρηνικός υποδοχέας περιλαμβάνει υπεροικογένεια 48 μέλη των παραγόντων μεταγραφής που ως επί το πλείστον από συνδετήρα ενεργοποιείται και παίζουν κρίσιμους ρόλους σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και στο σώμα. Δυσλειτουργία οδών NR προκαλεί σοβαρή χρόνιες ασθένειες, όπως ο διαβήτης [1-3], αθηροσκλήρωση [4, 5], και διάφοροι τύποι καρκίνου [6-8]. Η έκφραση του συνόλου υπεροικογένειας NR έχει διερευνηθεί σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, όπως κινητά μοντέλα διαφοροποίησης [9-12], συστήματα ανατομική ποντικού [1], NCI60 ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών [6], και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και δείγματα ασθενών [7, 8]. Αυτές οι μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι τα υποσύνολα των NRs όχι μόνο συνδέονται με συγκεκριμένα φυσιολογία των ιστών, αλλά είναι επίσης σημαντικές για λειτουργική διαφοροποίηση σε ειδικούς κυτταρικούς γραμμώσεις [13, 14]. Επιπλέον, η γενετική υπογραφή της υπεροικογένειας NR ή των μεμονωμένων μελών NR είναι ένα προγνωστικό βιοδείκτης για τον καρκίνο του πνεύμονα, και μερικές NRs είναι druggable στόχους που μπορούν να αναπτυχθούν σε φαρμακολογικά πιθανών θεραπειών του καρκίνου [6-8, 15-19]. Πράγματι, πολλά στοιχεία δείχνουν ότι οι μεμονωμένες NRs που σχετίζονται με την έναρξη και ανάπτυξη, καθώς και τη θεραπεία ή χημειοπροφύλαξη του καρκίνου. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση της άλφα του ρετινοϊκού άλφα υποδοχέα οξύ (ΡΑΡα) λόγω της συγχώνευσής του σε PML (ΡΑΡα /PML) και οιστρογόνων υποδοχέων (ΕΡα) έκφραση αιτία εμφάνισης της λευχαιμίας και της εξέλιξης του καρκίνου του μαστού, αντίστοιχα [20-22]. Στόχευση ΕΚα χρησιμοποιώντας τον διαμορφωτή επιλεκτικό του υποδοχέα οιστρογόνου (SERM) ταμοξιφαίνη ή ραλοξιφαίνη και αποκλεισμός ή εκτομή του διυδροτεστοστερόνη (DHT), η οποία είναι η ισχυρότερη ενδογενής συνδέτης για τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR), είναι καλά γνωστά θεραπευτικά σχήματα στις κλινικές του καρκίνου για τη θεραπεία της αντιστοιχεί καρκίνων [19, 23-25]. Ενώ οι SERMs έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού ή ακόμη και κλινικά αξιολογηθεί ως παράγοντες προφύλαξης έναντι της συχνότητας εμφάνισης καρκίνου του μαστού, υψηλό κίνδυνο της μήτρας και του ενδομητρίου εμφάνισης καρκίνου έχει αναφερθεί προηγουμένως [26, 27]. Ομοίως, αν και οι αντι-διαβητικό TZDs φαρμάκου είναι σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, μοριακή λειτουργία του ΤΖϋ ενεργοποιημένης ΡΡΑΚγ δεν έχει σαφώς καθορισμένες ακόμη ως ένα αντι-ογκογόνο παράγοντα στον καρκίνο του πνεύμονα, ή ακόμη και υποστήριξε ως ένας όγκος προαγωγής παράγοντας σε άλλους τύπους καρκίνων, δηλαδή του καρκίνου του μαστού και του καρκίνου του προστάτη [28-30].

Έχουμε αναπτύξει ένα προκλινικό μοντέλο που περιλαμβάνει αθανατοποιημένα φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBECs) που μπορούν γενετικά να χειραγωγηθεί με συγκεκριμένες αλλαγές ογκογόνο για τη μελέτη των πνευμόνων παθογένεση του καρκίνου και την ανάπτυξη νέων στοχευμένων προσεγγίσεων για την έγκαιρη διάγνωση, την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Πρόσφατα, έχουμε τη δυνατότητα να αναπτύξουν πλήρως προοδευμένη και ογκογόνο μοντέλα με HBECs βασίζεται στην χειραγώγηση του p53, KRAS, και c-myc [31]. Αυτά τα προκαρκινικά και πλήρως ογκογόνο μοντέλα παρέχουν ένα ιδανικό σύστημα για τη μελέτη του ρόλου των NRs στον πνεύμονα παθογένεση του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων προνεοπλασίας και σχηματισμό όγκων.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προφίλ της έκφρασης του mRNA όλων των 48 NRs σε αυτή HBEC oncogene- που προκαλείται από το μοντέλο καρκίνο του πνεύμονα παθογένεια [32, 33]. Αυτό μας επέτρεψε να προσδιορίσει ένα βασικό ρόλο του PPARγ στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. Σε μια μηχανιστική μελέτη απόδειξη της αρχής, βρήκαμε ότι ΡΡΑΚγ τροποποίησή της με SUMO είναι σημαντική για την αντι-ογκογόνο δράση του TZDs στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. Αυτή η μελέτη παρέχει ενόραση σε μια βιοχημική τροποποίηση του ΡΡΑΚγ, το οποίο είναι χρήσιμο για την κατανόηση της παθογένεσης καρκίνου του πνεύμονα και επίσης δείχνει τη δύναμη αυτού του προκλινικών σύστημα για τη μελέτη του ρόλου των NRs στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα και τα αποτελέσματα αυτά θα πρέπει να είναι από κλινική αξία μετάφρασης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα αθανατοποιημένα με CDK4 και hTERT (HBEC-KT), που ακολουθείται από περαιτέρω σταθερή εισαγωγή ογκογόνο μεταβολές συμπεριλαμβανομένων K-ras

V12 υπερέκφραση, νοκ ντάουν του p53, ή και τα δύο [31-33]. Μια σειρά από HBEC-KTS περιλαμβάνονται HBEC-KT, HBEC-KTZ, HBEC-KT + pSRZ + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L ), HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

LacZ

(HBEC-KT53), και HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L53), όπου pSRZ και Plenti αντιπροσωπεύουν σταθερή shRNA και φορείς φακοϊού, αντίστοιχα [31]. Απαθανάτισε HBECs και ογκογόνα κλώνοι HBEC (C1 και C5) καλλιεργήθηκαν σε Κ-SFM (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) συμπληρωμένο με 50 μg /ml του εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδούς χωρίς επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και RPMI συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, αντίστοιχα.

Μοριακή κλωνοποίηση και σταθερή κυτταρική γραμμή

Τόσο γονιδίων PPARγ και ενισχυμένη πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού (EGFP) πλαισιώνεται από εσωτερική ριβοσωμική θέση εισόδου ήταν δισιστρονικώς κατασκευάστηκαν υπό τον έλεγχο του επαγόμενου τετρακυκλίνη (Tet /On) κυτταρομεγαλοϊού προαγωγέα του φορέα λεντοϊού (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). μεταλλάξεις κατευθυνόμενη σε θέση εισήχθησαν σε δύο τοποθεσίες τροποποίησή της με SUMO (K79R και K367R για PPARγ1? K107R και K395R για PPARγ2) σε PPARγ. Λεντιϊοί παρήχθησαν και μετάγονται σε ογκογόνες κυτταρικές σειρές HBEC-C1. Περαιτέρω διαδικασία διαλογής διεξήχθη για να επιλέξετε έναν κλώνο HBEC-C1-PPARγ στην οποία τόσο PPARγ και της έκφρασης EGFP οι αυστηρές ρυθμίσεις κατά την αγωγή τετρακυκλίνη.

ανοσοκηλίδας ανάλυση

Μια ομάδα αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές HBEC ήταν καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία PPARγ αγωνιστή τρογλιταζόνης ή πιογλιταζόνης για 48 ώρες και στη συνέχεια συνολικός κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Πρωτογενή αντισώματα για την κυτταρική σηματοδότηση περιλαμβάνονται για αντισώματα κατά του p53 (SC-126, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), K-ras (sc-30, Santa Cruz), φωσφο-ΜΕΚ1 /2 (# 9121, Cell Signaling τεχνολογία, Beverly, MA, USA), ΜΕΚ1 /2 (# 9122, Cell Signaling), COX2 (SC-19999, Σάντα Κρουζ), φωσφο-ERK1 /2 (# 9101, Cell Signaling), ERK1 /2 (# 9102, κυτταρική σηματοδότηση), β-ακτίνη (Ab6276, Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, Ηνωμένο Βασίλειο), με ψυχή από χονδροειδείς A /C (SC-7292, Santa Cruz), και PPARγ (# 2435, κυτταρική σηματοδότηση). Πρωτογενή αντισώματα για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου που περιλαμβάνονται αντισώματα έναντι cyclinD1 (# 2926, Cell Signaling), κυκλίνη Α (SC-239, Santa Cruz), p16

INK (SC-468, Santa Cruz), και ρ21

WAF1 ( OP64, Calbiochem, La Jolla, CA, USA).

η ανάπτυξη των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών δοκιμασία

δοκιμασία μετρώντας κυττάρων διεξήχθη για μέτρηση αποκρίσεων κυτταρική ανάπτυξη. Για τη δοκιμασία μετρώντας κύτταρο, δύο εκατοντάδες HBECs σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε τελικό όγκο μέσων 100 μΐ ανά φρεάτιο, που ακολουθείται από κατεργασία τρογλιταζόνη σε συγκεντρώσεις των 3 μΜ με την παρουσία 100 ηΜ συνθετικό LG268 προσδέματος RXR. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε σε πέντε ημέρες μετά την αγωγή. Η σχετική ανάπτυξη% ομαλοποιήθηκε για κάθε δόση με κατεργασία του οχήματος. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, πέντε χιλιάδες κύτταρα HBEC διαχωρίστηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΡΡΑΚγ ή ΡΡΑΚα συνδετήρες. Οι αποικίες βάφτηκαν με μπλε του μεθυλενίου μετά από 7 έως 10 ημέρες συνδέτη θεραπεία.

Η μετανάστευση των κυττάρων

δοκιμασία

HBECs με επαγώγιμη έκφραση του wt-ΡΡΑΚγ ή SUMO-ΡΡΑΚγ σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και πλήρως αναπτύχθηκαν με 100% συρροή, που ακολουθείται από κατεργασία με μιτομυκίνη C για την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Μια πληγή που σχηματίζεται από το ξύσιμο κυτταρικό στρώμα με στείρο ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου με ή χωρίς επαγωγή τετρακυκλίνη για την έκφραση του υποδοχέα, και ακολουθείται από κατεργασία συνδετήρα. Η μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 24 ώρες θεραπείας συνδέτη PPARγ μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν στους τραυματίες περιοχές.

έκθεση Λουσιφεράσης δοκιμασία

ΗΕΚ 293 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με την ισοδύναμη ποσότητα (15 ng ) είτε το πλασμίδιο έκφρασης ή πλασμίδια ελέγχου για άγριου τύπου (wt-PPARγ) ή τροποποίησή της με SUMO μεταλλάκτη (SUMO-ΡΡΑΚγ) του ΡΡΑΚγ σε συνδυασμό με ένα πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης του στοιχείου απόκρισης PPAR (ΤΚ-PPRE3x-Luc, 50 ng) και έναν β- πλασμίδιο γαλακτοσιδάσης (β-Gal, 20 ng) για την ομαλοποίηση της αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με όχημα (EtOH), 1 μΜ από πιογλιταζόνη ή τρογλιταζόνης και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης.

αντίστροφη μεταγραφή και QPCR δοκιμασία

Όλα τα RNA παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen και αντιστροφής μεταγράφονται σε cDNA για προσδιορισμό QPCR (μέθοδος TaqMan) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Η αντίστροφη μεταγραφή 2 μ§ ολικού RNA σε 100 μΐ όγκο αντίδρασης περαιτέρω ρυθμίστηκε σε 200 μΙ τελικούς όγκους. Το SDS έκδοσης 2.1 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του πραγματικού χρόνου PCR αντίδραση εκτελείται στο σύστημα ΑΒΙ 7900HT. πρότυπες δοκιμασίες καμπύλη αποδοτικότητας διορθωμένη έχουν βελτιστοποιηθεί για nonbiased, σύγκριση πολύδισκος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8].

δεδομένα QPCR ανάλυση

Ένα Macro δημιουργήθηκε για να αναλύσει τα πρωτογενή δεδομένα που εισάγονται στο Microsoft Excel. Η αποτελεσματικότητα της PCR (ε), υπολογίστηκε ως e = 10

[- 1 /κλίση], όπου η κλίση λαμβάνεται από την πρότυπη καμπύλη με SDS 2.1 του λογισμικού, για την αναφορά 18S και NR ενδιαφέροντος. Η μακροοικονομική περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στατιστικούς υπολογισμούς. Η ποσότητα του μέσου όρου (. Avg) για μεμονωμένα δείγματα προήλθε από τη μέση σχετική ποσότητα του τριπλούν, όπου η ποσότητα είναι ίση με e

-Ct (δηλαδή,

ποσότητα

= (10

[- 1 /κλίση])

-Ct). Ο συντελεστής μεταβλητότητας (CV) μπορούν να ληφθούν περαιτέρω από τη διαίρεση της τυπικής απόκλισης του μέσου όρου (STDEV) από τη μέση ποσότητα (avg.), CV = STDEV /avg. Η στατιστική σημείο ακραία τιμή αποκλείστηκε αν ήταν & gt? 17% CV. Με τη χρήση αυτών των ποσοτήτων για τις δύο 18S και NR ενδιαφέροντος, η κανονικοποιημένη τιμή για κάθε έκφραση NR υπολογίστηκε περαιτέρω από την διαίρεση της NR ποσότητα avg από την ποσότητα αναφοράς για το AVG. (Δηλαδή, κανονικοποιημένη τιμή = NR μ.ο. ποσότητα ποσότητα avg /αναφοράς). Επιπλέον, η τυπική απόκλιση για την ομαλοποιημένη τιμή υπολογίστηκε ως Τ.Α. = (Κανονικοποιημένη τιμή) Χ {(CV αναφοράς)

2 + (CV του NR)

2}

1/2.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός απαθανάτισε HBECs

Το συνολικό σχήμα για τη δημιουργία απαθανάτισε και ογκογόνο HBECs φαίνεται στο σχήμα 1Α. Να κατανοήσουν την επίδραση των ογκογόνων αλλαγές στην ογκογόνο δυναμικό των βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων, δημιουργήσαμε προηγουμένως ένα πάνελ απαθανάτισε HBECs φιλοξενούν είτε

K-ras

V12

έκφρασης, ρ53 νοκ ντάουν, ή και τα δύο αλλαγές, οι οποίες είναι σημαντικές μεταλλάξεις σε καρκίνο του πνεύμονα [32, 33]. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, HBEC κλώνοι, C1 και C5, ταυτοποιήθηκαν να είναι ογκογόνα και χαρακτηρίστηκαν. Σταθερό knockdown της ρ53 επιβεβαιώθηκε τόσο mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας QPCR προσδιορισμού και ανάλυση ανοσοστυπώματος, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β και S1 Εικ). Η δραστηριότητα των ογκογόνων

K-ras

V12

σταθερά εισαχθεί στα αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές HBEC επιβεβαιώθηκε με φωσφορυλίωση ΜΕΚ, κατάντη της κινάσης στόχου από K-ras (Σχήμα 1Β) . Αυτές οι γενετικές αλλαγές που προκαλούνται σαφώς χυμοτόπια-όπως κυτταρική μορφολογική αλλαγή που φάνηκε να είναι κυτταρική γήρανση, η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματα από την προηγούμενη έκθεση [31] (Σχήμα 1C).

(Α) Σχηματικά να δημιουργήσει ένα πάνελ της HBEC κυττάρων. (Β, C)

In vitro

χαρακτηρισμό HBECs. (Β) δοκιμασίες ανοσοστυπώματος διεξήχθησαν για την έκφραση του K-ras

V12, ρ53, pMEK, σύνολο ΜΕΚ, και β-ακτίνης σε κύτταρα HBEC. (C) Μια μικροσκοπική όψη των κυττάρων HBEC (μεγέθυνση, 1χ). Σημειώστε ότι HBEC-KT σημαίνει κυτταρικές σειρές HBEC απαθανάτισε ο

CDK4

συν

hTERT

? KTR

L, KT συν ογκογόνο

K-ras

V12

? KT53, KT συν

p53

knock-down? KTR

L53, KTR

L συν

p53

knock-down.

Η

έκφραση NR στο HBEC πίνακα

Από τη στιγμή που πρόσφατα κατέδειξε ότι η πρότυπο έκφρασης των 48 NRs είναι ένας προγνωστικός βιοδείκτης ορίζεται καθώς επίσης και ενδεχομένως να είναι θεραπευτικοί στόχοι για τον καρκίνο του πνεύμονα [6-8], αναρωτηθήκαμε εάν τυχόν NRs συνδέονται με παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, να διερευνήσει κατά πόσον η εισαγωγή του

K-ras

V12

και

p53

ογκογόνο αλλαγές επηρέασαν την έκφραση των NRs σε ανθρώπινο πνεύμονα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, που πρώτα προφίλ της έκφρασης του mRNA όλων των 48 μελών του NR υπεροικογένειας από QPCR στην ισογονικών πάνελ HBEC που ογκογονικώς σαφώς καθορισμένες και αποτελούνται από γενετικώς πανομοιότυπα βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (σχήμα 2 και S2 Εικ). Βρήκαμε 31 από 50 NRs (συμπεριλαμβανομένων PPARδ2 και PPARγ2, ισομορφές του ΡΡΑΡδ και ΡΡΑΡγ, αντίστοιχα) για να παρουσιάζουν καμία διαφορά στην ισογονικών πίνακα (είτε δεν είχε καμία έκφραση ή καμία μεταβολή στην έκφραση) (S2 Εικ). Αντίθετα, 19 NRs έδειξε διακριτά πρότυπα έκφρασης σε όλες τις ισογονιδιακές πάνελ HBEC, το οποίο έπεσε σε τρεις διαφορετικές ομάδες. Η πρώτη ομάδα (ρ53 εξαρτώμενη) περιελάμβανε δύο μέλη, ωολευκωματίνη κοτόπουλου ανοδικά παράγοντα προαγωγό μεταγραφής (Coup-ΤΡ) α, υποδοχέα οιστρογόνου (ER) β, NRs παρουσιάζει ένα πρότυπο έκφρασης p53-εξαρτώμενο (Σχήμα 2Α). Η δεύτερη ομάδα που αντιπροσωπεύεται από NRs με Κ-ras

πρότυπο έκφρασης V12 εξαρτώμενη συμπεριλαμβανομένων Coup-TFβ, που σχετίζεται με οιστρογόνο υποδοχέα (ERR) α, πυρηνικού παράγοντα των γεννητικών κυττάρων (GCNF), νευρικό αυξητικό επαγόμενη παράγοντας γονίδιο Β (ΝΘΡΙΒ ) 3, ορφανό υποδοχέα νευρώνες που προέρχονται από 1 (NOR1), ΡΡΑΚα, ΡΡΑΚδ, PPARδ2, αντίστροφη-eRB (Rev-eRB) α, και το ρετινοϊκό ορφανό υποδοχέα που σχετίζονται με οξέα (ROR) α, υποδοχέα ορμόνης του θυρεοειδούς (TR) β (Εικ 2Β). Η τρίτη ομάδα (K-ras

V12 και των εξαρτώμενων ρ53) ήταν ΕΚα, ηπατοκυττάρων πυρηνικού παράγοντα 4 (HNF4) γ, παράγοντας Nur που σχετίζονται με 1 (NURR1), ΡΡΑΡγ, υποδοχέα ρετινοειδούς οξέος (RAR) β, RAR σχετίζονται ορφανό υποδοχέα (ROR) β, οι οποίες ήταν NRs με μια διπλή μορφή έκφρασης του ογκογονιδίου-εξαρτώμενο (Σχήμα 2C). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από την προηγούμενη έκθεσή μας στην οποία η έκφραση NR ήταν ιδιαίτερα σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα [7], το αποτέλεσμα αυτό ενισχύει την άποψη ότι υποσύνολα NRs θα μπορούσε επίσης να εμπλέκονται στην παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από το

K-ras

V12

υπερέκφραση και /ή απώλεια της λειτουργίας ρ53.

Η δοκιμασία διεξήχθη QPCR για έκφραση mRNA ολόκληρου υπεροικογένειας NR σε αθανατοποιημένα πάνελ HBEC. (Α)

p53

νοκ ντάουν-εξαρτώμενη έκφραση. (Β) τον ογκογόνο

K-ras

V12

εξαρτώμενη έκφραση. (C)

p53

νοκ ντάουν και

K-ras

V12

εξαρτώμενη έκφραση. Σημειώστε ότι HBEC-KT σημαίνει κυτταρικές σειρές HBEC απαθανάτισε ο

CDK4

συν

hTERT

? KTZ, KT συν πλασμίδιο ελέγχου με ζεοκίνη δείκτη επιλογής? KTR

L, KT συν ογκογόνο

K-ras

V12

? KT53Z, KTZ συν

p53

knock-down? KTR

L53, KTR

L συν

p53

νοκ ντάουν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι δείχνουν στατιστικά σημαντικές μονάδες, όπως αξιολογήθηκε από

ANOVA

. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με HBEC-ΚΤ.

Η

ενεργοποίηση του PPARγ αντιστραφεί το ογκογόνο

K-ras

V12

επαγόμενη έκφραση της COX2 πρωτεΐνης

από την PPARγ έχει σχετικά καλά μελετηθεί μεταξύ άλλων NRs σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες (π.χ., τη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων, τον έλεγχο της φλεγμονής) και ο συνδετήρας ΤΖϋδ του διαθέσιμα στην κλινική του διαβήτη τύπου ΙΙ, είμαστε δίπλα αποφάσισε να ερευνήσει τη μοριακή μελέτη του PPARγ , ως έννοια απόδειξη της, εκτός από τα 48 NRs στην μοριακή παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα [11, 34, 35]. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι η έκφραση της COX2 σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα [36, 37], παρατηρήσαμε μια δραματική αύξηση στην έκφραση COX2 σε HBECs τροποποιηθεί ώστε να περιέχει ογκογόνους

K-ras

V12

(Σχήμα 3Α και 3Β). Ενώ ΡΡΑΚγ mRNA αυξήθηκαν παράλληλα με την έκφραση της COX2, PPARγ εκφράσεις πρωτεΐνης ήταν συγκρίσιμα σε όλες τις 4 κύτταρα HBEC υποδηλώνοντας μετα-μεταγραφική ρύθμιση της ΡΡΑΚγ mRNA (σχήμα 3Β). Δεδομένου ότι ΡΡΑΚγ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αντι-φλεγμονώδη απόκριση [34, 35], θέλαμε να δοκιμάσουμε εάν η ενεργοποίηση PPARγ αναστέλλει την προ-φλεγμονώδη έκφραση COX2 στο μοντέλο παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα. Πράγματι, η τρογλιταζόνη αγωνιστής ΡΡΑΚγ ανέστρεψε την αυξημένη έκφραση του COX2 mRNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 3Α και 3Β). Μαζί με την αναστολή του πολλαπλασιασμού PPARγ καρκίνου του πνεύμονα, όπως έχει ήδη αναφερθεί [38, 39], το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι ΡΡΑΚγ καταστολή της έκφρασης COX2 θα μπορούσε να είναι σημαντική στη ρύθμιση ογκογονίδιο επαγόμενη κακοήθη μετασχηματισμό του HBECs σε καρκίνο του πνεύμονα. Με την απώλεια της λειτουργίας ρ53, την έκφραση της κυκλίνης D1 πρωτεΐνης, ένας βασικός παράγοντας στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από G1 σε φάση S, μειώθηκε σε HBECs με p53 νοκ ντάουν και μειώθηκαν ακόμη περισσότερο σε HBECs με διπλή

p53

και

K-ras

V12

ογκογόνο αλλαγές σε συνδυασμό με τη θεραπεία με τρογλιταζόνη (Σχήμα 3Β). Αντίθετα, η κυκλίνη D1 παρουσίασαν καμία μεταβολή στην HBECs μόνο με K-ras

έκφρασης V12, με ή χωρίς τρογλιταζόνη. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι κατά τη διάρκεια προκαρκινικές αλλοιώσεις (χαρακτηρίζεται από τα κύτταρα HBEC με

p53

απώλεια και

K-ras

V12 αλλαγές

), PPARγ εκφράζεται και της ενεργοποίηση εξαρτώμενη από συνδέτη μπορεί να οδηγήσει σε δραματικές αλλαγές στην COX-2 και την έκφραση της κυκλίνης D1 (Σχήμα 3Α και 3Β). Ωστόσο, η θεραπεία τρογλιταζόνη έδειξε ίση αναστολή του πολλαπλασιασμού HBEC-ΚΤ σε όλη την ισογονιδιακές πίνακα (Σχήμα 3C). Αυτό υποδηλώνει ότι επιπρόσθετοι παράγοντες, μαζί με την COX-2 και κυκλίνη D1, μπορεί να εμπλέκεται σε PPARγ μεσολάβηση καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HBEC.

(Α) και ΡΡΑΚγ έκφραση COX2 mRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία QPCR στις γραμμές HBEC με ή χωρίς θεραπεία τρογλιταζόνη. (Β) Τα ανοσοστυπώματα χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι COX2, κυκλίνη D1, PPARγ ή βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η αντίστοιχη έκφραση της πρωτεΐνης στον πίνακα HBEC όταν αντιμετωπίζεται ή όχι επεξεργασία με 1 μΜ της τρογλιταζόνης. (Γ) απόκριση ανάπτυξης των κυτταρικών γραμμών HBEC-KT στη συνδυασμένη θεραπεία της τρογλιταζόνης ΡΡΑΚγ συνδέτη (3 μΜ) και LG268 προσδέματος RXR (100 ηΜ). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι δείχνουν στατιστικά σημαντικές μονάδες, όπως αξιολογήθηκε από

ANOVA

. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο HBEC-KT,

###

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με K-ras

έλεγχο V12,

+++

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με K-ras

V12 + ελέγχου p53shRNA.

Η

Χαρακτηρισμός ογκογόνο κλώνων HBEC

Από τα διαφορετικά επίπεδα της έκφρασης του PPARγ αντανακλάται καμία διαφορά στην αναστολή της ανάπτυξης των μη ογκογόνων HBECs όταν έλαβαν θεραπεία με τρογλιταζόνη (Σχήμα 3C), αναρωτηθήκαμε εάν τα μετασχηματισμένα HBECs δείχνουν μία διαφορετική απόκριση στην θεραπεία συνδέτη PPARγ και διακριτά πρότυπα έκφρασης των άλλων NRs σε σύγκριση με τα προ-καρκινικά HBECs. Εμείς χαρακτηριζόμενη πρώτα τα δύο ογκογόνα κλώνους, HBEC-C1-C5 και, σε κυτταρικό και ιστού επιπέδων. Η ιστολογική χαρακτηρισμός των όγκων ξενομοσχεύματος αποκάλυψε, όπως φαίνεται πρόσφατα από εμάς, ότι HBEC-ΚΤ με p53 knockdown και K-ras

χειραγώγηση V12 υψηλή έκφραση μπορεί να οδηγήσει σε κλωνική παράγωγα με διαφορετικές histologies- πλακώδες καρκίνωμα (SCC, HBEC-C1 ) και το αδενοκαρκίνωμα (ΑΔΚ, HBEC-C5) [31] (Εικόνα 4Α). Βιοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι οι δύο ογκογόνους αλλαγές,

K-ras

V12

δραστηριοτήτων, καθώς και την απώλεια της

p53

έκφρασης, ήταν εξίσου διατηρηθεί στην ογκογόνο HBEC- C1-C5 και κλώνους (Εικόνα 4Β). Απροσδόκητα, αμφότερα ΡΡΑΚγ και COX2 εκφράσεις ήταν μειωθεί δραματικά σε ογκογόνα κλώνους HBEC (Εικόνα 4Β και S3 Εικ) και οι ογκογόνων κλώνοι ήταν σταθερά ανθεκτικά στην ΡΡΑΚγ ανάπτυξη αναστολής (Σχήμα 4C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν την πιθανότητα ότι κατά τη διάρκεια premalignancy οδηγείται από

p53

και

K-ras ογκογόνο

αλλαγές που ΡΡΑΚγ και COX2 μπορεί να είναι θεραπευτικοί στόχοι αλλά ότι με την ανάπτυξη του πλήρους κακοήθειας που οι όγκοι παρακάμπτουν αυτό ελέγχου, η οποία σε ορισμένες περιπτώσεις λαμβάνει χώρα με προς τα κάτω ρύθμιση του ΡΡΑΚγ. Τέτοια ευρήματα θα ήταν σύμφωνη με αναφορές ότι η χρήση μη-στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (NSAID) μπορεί να προστατεύσει από την ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα στους άνδρες, ενώ η χρήση τους σε πλήρως ανεπτυγμένη καρκίνων του πνεύμονα δεν φαίνεται να είναι θεραπευτικός [40].

(Α) Η ιστολογική ανάλυση των ογκογόνο κλώνους? C1 όγκου κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα με μεγάλα κύτταρα που υποδηλώνουν ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (H & amp? E, x40) (αριστερά) και C5 όγκου κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα με τα χαρακτηριστικά του αδενοκαρκινώματος (H & amp? E, x40) (δεξιά). (Β)

In vitro

χαρακτηρισμό HBEC ογκογόνο κλώνων C1 και C5. ανιχνεύσεις ανοσοκηλιδώσεως διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι K-ras, ρ53, pERK, ολική ΕΚΚ, και β-ακτίνης σε ογκογόνα κλώνους HBEC. Χρησιμοποιώντας δοκιμασία QPCR, η έκφραση του mRNA του ΡΡΑΚγ μετρήθηκε σε ογκογόνα κλώνους (κάτω στο Β). (Γ) απόκριση ανάπτυξης του ογκογόνων κλώνων HBEC στη συνδυασμένη θεραπεία του ΡΡΑΚγ (3 μΜ τρογλιταζόνη) και RXR (100 ηΜ LG268) συνδέτες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική σημείο, όπως αξιολογήθηκε από

ANOVA

. *

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο HBEC-ΚΤ.

Η

έκφραση NR στην ογκογόνο κλώνους HBEC

Από την έκφραση του PPARγ είχε αξιοσημείωτα κατέστειλε στα πλήρως κακοήθη HBECs, αναρωτηθήκαμε αν άλλες NRs είναι διαφορετικά εκφράζεται με την ίδια ογκογόνο εξέλιξη. Έτσι, ολοκληρώθηκε το προφίλ έκφρασης mRNA του συνόλου υπεροικογένειας NR στον πίνακα των μη ογκογόνων HBEC-KTR

L53 κύτταρα και τα ογκογόνα κλωνική παράγωγα, συμπεριλαμβανομένων των ογκογόνων κυτταρικών σειρών που έχουν καταρτισθεί από C1 και C5 όγκων, και η ίδια C5 όγκου (Εικ 5Α και S4 σχήμα). Δεκαπέντε από τα 50 NRs έδειξε πρότυπα έκφρασης που ενδεχομένως συνδέονται με την κακοήθη εξέλιξη της HBEC-KTR

L53 κυττάρων σε όγκους HBEC (Σχήμα 5Α). Που περιλαμβάνονται σε αυτή την ομάδα ήταν AR, Πραξικόπημα-TFα, Πραξικόπημα-TFβ, δοσολογία ευαίσθητη σεξ αναστροφή-επινεφριδίων υποπλασία συγγενή κρίσιμη περιοχή στο χρωμόσωμα Χ, το γονίδιο 1 (DAX1), ΕΡα, ERRα, HNF4γ, υποδοχέα του ήπατος ομόλογο-1 (LRH1 ), NOR1, NURR1, PPARγ, ΚΑΚβ, ΚΟΚα, ΡΟΡβ, και VDR (Σχήμα 5Α). Είναι ενδιαφέρον, εννέα από τα 15 NRs (AR, Πραξικόπημα-TFα, DAX1, HNF4γ, LRH1, NOR1, NURR1, ΚΟΚα, και ΡΟΡβ) έδειξε συνεχώς αυξανόμενη πρότυπο έκφρασης κατά την ογκογόνο εξέλιξης (Σχήμα 5Β). AR και DAX1 έδειξαν δραματικά αυξημένη έκφραση μόνο σε όγκους HBEC, αλλά όχι στα αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές HBEC. ERRα και VDR έδειξε μειωμένη έκφραση κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης από μη ογκογόνους HBEC-KT, μέσω HBEC-KTR

L53 για να HBEC όγκους (Σχήμα 5Β). Πραξικόπημα-TFβ, ΕΚα και ΚΑΚβ έδειξε ένα διφασικό πρότυπο έκφρασης, όπου η αρχική έκφραση των NRs σε HBEC-KT μειώθηκε σε HBEC-KTR

L53, αλλά ανέκαμψε σε όγκους HBEC, η οποία είναι αντίθετη προς την πλήρη απώλεια της ΡΡΑΚγ έκφραση σε HBEC όγκους (Σχήμα 5Β). Ακόμη πιο ενδιαφέρον, τύπος αδενοκαρκινώματος κύτταρα HBEC-C5 και όγκων, αλλά όχι το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων HBEC-C1, έδειξαν αυξημένη έκφραση του Πραξικόπημα-TFα και β, και μειωμένη έκφραση ERRα και VDR, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι τέσσερις NRs μπορεί να εμπλέκονται ειδικά σε αδενοκαρκίνωμα ειδικού τύπου παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα.

Ο προσδιορισμός QPCR έγινε για την έκφραση του mRNA του συνόλου NR υπεροικογένεια σε μη-ογκογόνο HBEC-KTR

L53 κύτταρα με

p53

και

K-ras

V12

αλλαγές, δύο ογκογόνο κλώνοι C1 και C5, και καρκινικό ιστό ξενομοσχεύματος C5. (Α) Ποσοτική mRNA προφίλ έκφρασης των υποομάδων NR με διακριτό πρότυπο έκφρασης σε όλη την οθόνη. Σημειώστε ότι το υπόλοιπο του προφίλ NR δείχθηκε στο S4 Σχ. (Β) Περίληψη της έκφρασης NR από τον πίνακα Α και Σχήμα 2 για να δείξει καταρράκτες έκφραση NR συσχετίζεται με ογκογόνο εξέλιξη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι δείχνουν στατιστικά σημαντικές μονάδες, όπως αξιολογήθηκε από

ANOVA

. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με HBEC-KTR

L53.

Η

PPARγ τροποποίησή της με SUMO-εξαρτώμενη αναστολή ογκογόνο αύξηση HBEC και μετανάστευση

Όπως συνδέτη μεσολάβηση ΡΡΑΚγ τροποποίησή της με SUMO καταστέλλει την έκφραση της επαγώγιμης νιτρικού οξειδίου συνθάσης (iNOS), ένα πολύ γνωστό προφλεγμονωδών ένζυμο που παράγει μονοξείδιο του αζώτου, και η αντι-φλεγμονώδης ρόλο του ΡΡΑΚγ πιστεύεται ότι συμβάλλει στην κατασταλτική του όγκου λειτουργία του εν λόγω υποδοχέα [34], ελέγξαμε εάν PPARγ τροποποίησή της με SUMO είναι κρίσιμη για την αντι -tumorigenic λειτουργία αυτού του υποδοχέα στη σειρά εξέλιξης HBEC. Για να γίνει αυτό, ιδρύσαμε ογκογόνο σταθερές κυτταρικές σειρές (HBEC-C1) που εκφράζει την αγρίου τύπου (WT-PPARγ) ή τροποποίησή της με SUMO μεταλλαγμένο (SUMO-PPARγ) μορφή του PPARγ να μελετήσει αν το κέρδος-of-λειτουργία των διαφόρων μορφών του PPARγ ( κβ-PPARγ εναντίον SUMO-PPARγ) θα μπορούσε να αντιστρέψει την αντίσταση ανάπτυξη της ογκογόνο HBEC-C1 έως συνδέτη θεραπεία. Εντοπίσαμε ότι και οι δύο μορφές ΡΡΑΚγ δεν έδειξε διαφορά στη λειτουργία τρανς-ενεργοποιήσεως προσδέματος μεσολάβηση για έκφραση γονιδίου-στόχου χρησιμοποιώντας μία λουσιφεράση δοκιμασίας (Σχήμα 6Α). κύτταρα HBEC-C1 σφικτά ρυθμίζεται η έκφραση του wt-ΡΡΑΚγ ή SUMO-ΡΡΑΚγ υπό τον έλεγχο του τετρακυκλίνη επαγόμενου υποκινητή λειτουργίας (Tet /ON) (σχήμα 6Β). HBEC-C1 κυττάρων με επαγόμενη έκφραση του wt-ΡΡΑΚγ έδειξε σημαντική αναστολή ανάπτυξης κατά περισσότερο από 50% όταν έλαβαν πιογλιταζόνη ή τρογλιταζόνη (TZDs) (Εικ 7Α). Ωστόσο, αυτή η απόκριση αναστολής αύξησης ήταν σε μεγάλο βαθμό μειωμένη σε κύτταρα HBEC-C1 με επαγώγιμη έκφραση SUMO-ΡΡΑΚγ υπό τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας όπως τα αντίστοιχα κύτταρα HBEC-C1 που εκφράζει wt-ΡΡΑΚγ (Σχήμα 7Α και 7Β). Ομοίως, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας υγρό έδειξε ότι ΡΡΑΚγ συνδέτη θεραπείες ανέστειλε κλωνογονίας του HBECs εκφράζουν WT-ΡΡΑΚγ και άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, όπως CALU6 και H2347 εκφράζουν endogenouse PPARγ, αλλά όχι από τη μία με SUMO-ΡΡΑΚγ (Σχ 7Β και 7C). Ωστόσο, η θεραπεία του συνδέτη ΡΡΑΚα WY-14643 δεν έδειξαν colonogenic αποτέλεσμα και σε WT-ΡΡΑΚγ και SUMO-ΡΡΑΚγ εκφράζουν HBECs (Σχήμα 7C). Αυτό υποδηλώνει ότι ανασταλτική επίδραση της TZDs εξαρτάται συγκεκριμένα από ΡΡΑΚγ τροποποίησή της με SUMO. ενεργοποίηση ΡΡΑΚγ επίσης ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση σε ένα τροποποίησή της με SUMO-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 7D). Σε συμφωνία με αυτό, η έκφραση και των δύο κυκλίνη Α και η κυκλίνη D1 μειώθηκε σε κύτταρα HBEC-C1 που εκφράζει WT-ΡΡΑΚγ, αλλά δεν άλλαξε σε κύτταρα HBEC-C1 που εκφράζει SUMO-ΡΡΑΚγ, όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TZDs (Σχ 8Α και S5A Εικ). Σημειώστε ότι η έκφραση της κυκλίνης-εξαρτώμενη κινάση αναστολείς, ρ16 και ρ21, δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά στις ίδιες συνθήκες κατεργασίας (Σχήμα 8Α και S5A Εικ). Επιπλέον, ερευνήσαμε αρκετές οδούς σηματοδότησης φλεγμονής που συμμετέχουν στην παραγωγή νιτρικού οξειδίου, προσταγλανδίνη βιοχημεία, και μεταγωγή σήματος TNFa. Περιέργως, βρήκαμε ότι ΤΖϋ ενεργοποίηση του wt-ΡΡΑΚγ μείωσε την έκφραση της COX2 προφλεγμονώδεις από τρεις φορές, ενώ η ενεργοποίηση SUMO-ΡΡΑΚγ, κυρίως, αύξησε την έκφραση της COX2 πρωτεΐνης με έξι φορές σε κύτταρα HBEC-C1 (Σχήμα 8Β). Περαιτέρω, η έκφραση του 15-hydroxyprostaglandin αφυδρογονάση (HPGD), ένα ένζυμο προσταγλανδίνη-μεταβολίζουν, ήταν δραματικά επάγεται από δεκαοκτώ φορές όταν το wt-ΡΡΑΚγ ενεργοποιήθηκε με TZDs. Ωστόσο, τα κύτταρα HBEC-C1-SUMO-PPARγ που προκαλείται από την έκφραση HPGD σημαντικά λιγότερο (πέντε έως επτά φορές), όταν αντιμετωπίζονται με ΤΖϋδ. ενεργοποίηση ΡΡΑΚγ επίσης κατέστειλε σημαντικά την έκφραση TNFa, αλλά όχι άλλα ΝΡκΒ παράγοντες σηματοδότησης, σε μια τροποποίησή της με SUMO-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα S5B). Σημειώστε ότι iNOS δεν εκφράστηκε σε ογκογόνο κλώνους HBEC (S5c σχήμα). Στο σύνολό τους, αυτό υποδηλώνει ότι επάγεται με συνδέτη ΡΡΑΚγ τροποποίησή της με SUMO εμπλέκεται ειδικά στην καταστολή της φλεγμονώδους COX2 και TNFa μονοπάτια σηματοδότησης, αλλά όχι την οδό iNOS, στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης του άγριου τύπου και τροποποίησή της με SUMO μεταλλαγμένα PPARγ πλασμίδια. RLU, σχετική μονάδα λουσιφεράσης. (Β) τετρακυκλίνη-επαγόμενη έκφραση του ΡΡΑΚγ και EGFP πρωτεΐνη σε σταθερά επιμολυσμένα HBEC-C1-wt-ΡΡΑΚγ κλώνο. Μια μικροσκοπική όψη της έκφρασης EFGP τετρακυκλίνης που προκαλείται (επάνω στο Β). δοκιμασίες ανοσοστυπώματος για την έκφραση λαμίνη A /C και τετρακυκλίνη επαγόμενη ΡΡΑΚγ (κάτω στο Β). Ένα δισιστρονικό κατασκεύασμα του ΡΡΑΚγ και EGFP εισήχθη σταθερά σε ένα ογκογόνο HBEC κλώνου για να δημιουργήσει κυτταρικές σειρές HBEC-C1-ΡΡΑΚγ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι δείχνουν στατιστικά σημαντικές μονάδες, όπως αξιολογήθηκε από

ANOVA

. *

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο HBEC-ΚΤ.

Η

ανταπόκριση ανάπτυξη και την κυτταρική μετανάστευση του καρκίνου του πνεύμονα αναλύθηκαν με τη θεραπεία με συνδέτες PPARγ. απόκριση (Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων.