Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες που σχετίζονται με τον καρκίνο του θανάτου παγκοσμίως, με περισσότερους από ένα εκατομμύριο θανάτους ετησίως. Η κακή πρόγνωση οφείλεται στην υψηλή επιθετικότητα του και νωρίς μετάσταση του. Αν και οι ακριβείς μηχανισμοί είναι ακόμη άγνωστες, η διαδικασία της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαίνεται να εμπλέκονται σε αυτές τις νεοπλασματικές διεργασίες. Έχουμε ήδη δείξει ότι τα επίπεδα του CCL18, ενός πρωτεύοντος συγκεκριμένη χημειοκίνη ορού, είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και συσχετίζονται με το χρόνο επιβίωσης των ασθενών τους με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι CCL18 μπορεί να εμπλέκεται άμεσα σε παθολογικές διαδικασίες του καρκίνου του πνεύμονα, π.χ. EMT. Ερευνήσαμε την επίδραση της CCL18 επί Α549, μία κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό, χημειοταξία, εισβολή, χημειοαντίσταση και τον πολλαπλασιασμό EMT και. Η έκθεση του Α549 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων σε CCL18 σε διάφορες συγκεντρώσεις μειώνει την επιθηλιακή δείκτη Ε-καδερίνης, ενώ FSP-1, ενός δείκτη των μεσεγχυματικών φαινότυπο αυξάνεται. Κατά συνέπεια, CCL18 επάγεται η μεταγραφική ρυθμιστική ΕΜΤ SNAIL1 κατά τρόπο που εξαρτάται από τη δόση. Σε αντίθεση, μία αυξανόμενη συγκέντρωση CCL18 συσχετίστηκε με μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επιπλέον, CCL18 επαγόμενη χημειοταξία των κυττάρων αυτών και αυξημένη χημειοαντίσταση τους. Ως εκ τούτου, CCL18 μπορεί να είναι ένα ενδιαφέρον θεραπευτικό στόχο για NSCLC

Παράθεση:. Ploenes Τ, Scholtes Β, Krohn Α, Burger Μ, Passlick Β, Müller-Quernheim J, et al. (2013) CC-χημειοκινών Ligand 18 Προκαλεί Τα επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκίνο του πνεύμονα Α549 κύτταρα και αυξάνει τη διεισδυτική ικανότητα. PLoS ONE 8 (1): e53068. doi: 10.1371 /journal.pone.0053068

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιουνίου, 2012? Αποδεκτές: 28 του Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 του Γενάρη του 2013

Copyright: © 2013 Ploenes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υπάρχουν Δεν υπάρχουν τρέχουσες εξωτερικές πηγές χρηματοδότησης για τη μελέτη αυτή. Τ.Ρ. είναι αποδέκτης της επιχορήγησης από τον Albert-Ludwig του Πανεπιστημίου του Freiburg (Stiftung Mattern). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. J.M.Q. και G.Z. έχουν υποβάλει αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για CCL18 και CCL18R ως βιοδεικτών και στόχος της θεραπείας (πατέντα). G.Z. Είναι μέλος PLoS ONE Συντακτική Επιτροπή. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

μετάσταση είναι μια σύνθετη εκδήλωση, που περιλαμβάνει πολλά βήματα, συμπεριλαμβανομένων διαχωρισμός των καρκινικών κυττάρων από το συμπαγές πρωτοπαθούς όγκου, η μετανάστευση σε σκάφη, εισβολή στον ιστό και σχηματισμό ενός δευτερογενούς οζιδίου όγκου. Αν και ακόμα υπό συζήτηση, επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) φαίνεται να είναι ένα από τα βασικά γεγονότα στην τοπική πρόοδο και τη μετάσταση των επιθηλιακών κακοηθειών [1], [2]. EMT είναι μια σύνθετη πολλών σταδίων γεγονός, το οποίο δεν αλλάζει μόνο η μορφολογία των κυττάρων, αλλά και επιτρέπει στα κύτταρα να αποκτήσουν σημαντικές νέες λειτουργίες, όπως την έκφραση των νέων μορίων ή τη μετανάστευση και εισβολή. Εκτός από τις μορφολογικές αλλαγές, η διαδικασία της ΕΜΤ χαρακτηρίζεται από διαφορές στην μεταγραφή και την έκφραση των γονιδίων επιθηλιακών και μεσεγχυματικών. Ένα από τα πιο σημαντικά μοριακών δεικτών των επιθηλιακών κυττάρων είναι η επιθηλιακή μορίου προσκόλλησης Ε-καδερίνης, μεσολαβώντας αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου [3]. Η διαδικασία της ΕΜΤ συνδέεται με μια απώλεια της Ε-καδερίνης, η οποία συσχετίζεται θετικά με το στάδιο του όγκου και κακή επιβίωση σε πολλά επιθηλιακά καρκινικά [4] – [6]. Εκτός από την απώλεια των επιθηλιακών δεικτών η έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών σαν FSP-1 είναι επίσης ένα σημαντικό βήμα στη διαδικασία της ΕΜΤ [7]. FSP-1, που ονομάζεται επίσης S100A4, συσχετίζεται με το μεταστατικό δυναμικό σε νεοπλάσματα και μερικοί συγγραφείς απέδειξαν ότι ένα υψηλό επίπεδο FSP-1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορους τύπους καρκίνου [8] – [10]. EMT ρυθμίζεται από διάφορους παράγοντες μεταγραφής [11]. Ένα από τα πιο σημαντικά είναι SNAIL1, το οποίο δρα επίσης ως Ε-καδερίνης καταστολέα. Έχει αποδειχθεί ότι η υψηλή έκφραση SNAIL1 συνδέεται με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του πνεύμονα [12]. EMT μπορεί να προκληθεί από διάφορους παράγοντες ανάπτυξης και κυτοκίνες, το σημαντικότερο από TGFbeta αλλά και από EGF, FGF, HGF και άλλοι [13]. Οι περισσότεροι από αυτούς τους παράγοντες είναι παρόντες στο περιβάλλον του όγκου και παράγεται από τα ίδια καρκινικά κύτταρα ή περιβάλλοντας κυτταρικά συστατικά. Το μικροπεριβάλλον στερεών όγκων είναι ένα πολύπλοκο μίγμα κυτταρικών και μη κυτταρικών παραγόντων, στην οποία τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) αντιπροσωπεύει έως και το 50% της μάζας του όγκου [14]. ΤΑΜ εναλλακτικά ενεργοποιημένα μακροφάγα εκκρίνουν ένα συγκεκριμένο μοτίβο αρκετών κυτοκινών προώθηση του όγκου και αυξητικούς παράγοντες. Μία από αυτές τις κυτοκίνες είναι η ανθρώπινη ειδική CC-χημοκίνης Ligand 18 (CCL18), η οποία είναι ιδιαίτερα παρούσα σε πνευμονικό ιστό και εμπλέκονται σε διάφορες παθολογικές διαδικασίες κακοήθων ασθενειών ή ίνωση [15] – [20]. Έχουμε ήδη αποδείξει ότι CCL18 είναι ιδιαίτερα αυξημένη σε ορούς ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου και συνολική επιβίωση στην υποομάδα των αδενοκαρκινώματος [21], [22]. Η μέση στάθμη των ασθενών με καρκίνο μη μικρού πνεύμονα CCL18 ορού ήταν 150 (857) ng /ml έναντι 32 (61) ng /ml στην ομάδα ελέγχου υγιών [22]. Εμείς, ως εκ τούτου, η υπόθεση ότι CCL18 είναι ένας επαγωγέας του EMT στο ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα κύτταρα του πνεύμονα και ενισχύει το μεταστατικό δυναμικό.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TGFbeta1 αγοράστηκε από την R & amp? D (R &? D Systems, Wiesbaden, FRG), ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CCL18 από Immunotools, Friesoyte, Γερμανία, πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού έναντι ανθρώπινου FSP-1 και της ανθρώπινης SNAIL1 και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης τουμπουλίνης αγοράστηκαν από Abcam (Abcam, Cambridge, UK) και ένα πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού έναντι ανθρώπινης Ε-καντερίνης ήταν από βόρεια της πολιτείας (βόρεια της πολιτείας, Billerica, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Πειράματα Cell Culture

ανθρώπινο αδενοκαρκινώματος κυτταρική σειρά Α549 (ATCC , CCL-185) καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagles Dulbecco (DMEM, Invitrogene, Carlsbad, USA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία), 100 μg /ml στρεπτομυκίνης και 100 μονάδες /ml πενικιλίνη (Invitrogen) στους 37 ° C σε

2 ατμόσφαιρα υγροποιημένη 5% CO. Καλλιέργειες κυττάρων συλλέχθηκαν σε 80% συρροή 24 ώρες πριν από τη διέγερση, μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων σε πυκνότητα 30.000 κύτταρα ανά ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν με CCL18 σε διάφορες συγκεντρώσεις (100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /ml) για 24 ώρες ή 72 ώρες σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό. TGFbeta (2 ng /ml,) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Omniscript RT Kit (Qiagene, Düsseldorf, ΟΔΓ). Ειδικοί εκκινητές για την ανθρώπινη SNAIL1, FSP-1, Ε-καδερίνης και GAPDH σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό AmplifX (https://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX-Home-page) χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων GenBank NLM (National Center for Biotechnology πληροφορίες? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/). Οι κωδικοί αριθμοί προσχώρησης για τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία των αντίστοιχων εκκινητές και οι αλληλουχίες εκκινητών που παρατίθενται στον πίνακα 1.

Η

Όλα εκκινητές εσώνια που εκτείνονται και συντίθενται με Biomers (Biomers.net, Ulm, FRG ). Πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας iQ SYBR Green SuperMix, iCycler θερμοκυκλωτή και iCycler iQ 3,0 λογισμικού (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, ΟΔΓ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ανάλυση καμπύλης τήξης χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η ειδικότητα των προϊόντων ενίσχυσης. Αριθ ενίσχυση της μη ειδικής προϊόντων παρατηρήθηκε σε οποιαδήποτε από τις αντιδράσεις. Μια τιμή κύκλος κατωφλίου (Ct) υπολογίστηκε και χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το σχετικό επίπεδο ειδικού mRNA σε δείγματα μας από τον ακόλουθο τύπο:

Western Blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS και αποξέστηκαν από τον πυθμένα. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,1% Trition-Χ) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) με αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Λύματα ολόκληρων κυττάρων έβρασαν στους 93 ° C για 5 λεπτά σε ίσους όγκους ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (0,5 Μ Tris-HCl ρΗ 6,8, 2% SDS, 0, 05% βρωμοφαινόλης μπλε, 20% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερίνη ).

Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 12% νάτριο δωδεκυλοθειικό-PAGE, διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση και μεταφέρεται σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Μετά τον αποκλεισμό επί 2 ώρες σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (TBS) που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:200 (FSP-1), 1:500 (Ε-καδερίνης) ή 1: 3000 (SNAIL1) με TBS που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Οπτικοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με IRDye 800CW ή IRDye 700CW (Li-COR Bioscience, Bad Homburg, ΟΔΓ) αραιώνονται 1:10 000-1:20000 για 2 ώρες και σαρώνεται χρησιμοποιώντας σύστημα Odyssey (Li-COR Bioscience, Bad Homburg , ΟΔΓ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Δοκιμασία χημειόταξης

χημειοταξίας δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 10 φρεατίων θαλάμου χημειοταξίας (NeuroProbe, Gaithersburg, USA). Τα κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με 400 μΙ ϋΜΕΜ που περιέχει CCL18 σε συγκεντρώσεις 100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, και 100 ng /ml (έλεγχος: TGFbeta 2 ng /ml). Μια πολυβινυλοπυρρολιδόνη χωρίς φίλτρο πολυανθρακικού 12 μm πόρου διαμέτρου (NeuroProbe, Gaithersburg, USA) τοποθετήθηκε επί της πλάκας πυθμένα. Ένα παρέμβυσμα πυριτίου και η άνω πλάκα με 12 οπές συνέχεια τοποθετείται, σχηματίζει το ανώτερο πηγάδια. 2 × 10

4 κύτταρα προστέθηκαν σε όγκο 285 μλ. Σε παράλληλα πειράματα, DMEM χωρίς χημειοκίνης φορτώθηκε στα φρεάτια πυθμένα ως αρνητικός έλεγχος. Ένα δεύτερο αρνητικό δείγμα αναφοράς με χημειοκίνης της ίδιας συγκέντρωσης στην άνω και στην κάτω καλά διεξήχθη επίσης. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C και 5% CO2, το φύλλο φίλτρο απομακρύνθηκε και μη κύτταρα που μετανάστευσαν σκουπίζονται από την άνω πλευρά του φίλτρου. Το φίλτρο στη συνέχεια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) και σταθεροποιήθηκαν σε διαφανές βερνίκι. Μετά από αυτό το 9 υψηλής ισχύος πεδίων ανά φίλτρο μετρήθηκαν στα 200-πλάσια μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Zeiss.

Εισβολή Δοκιμασία

Η ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν διαμέσου μιας μήτρας βασικής μεμβράνης Matrigel μετρήθηκε χρησιμοποιώντας η κυτταρική διείσδυση Assay Kit (Chemicon International, Temecula CA) με 8 μm μεμβράνη μεγέθους πόρων πολυανθρακικό. Μετά επανυδάτωση των γελών για 2 ώρες, 1 × 10

5 κύτταρα σε DMEM ελεύθερο ορού εφαρμόσθηκαν στον άνω θάλαμο, ενώ ο κάτω θάλαμος περιείχε DMEM ελεύθερο ορού ή ελεύθερο ορού DMEM συμπληρωμένο με CCL18 σε διάφορες συγκεντρώσεις ή TGFbeta ως μάρτυρας. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 24 ώρες, όλα τα κύτταρα του άνω πλευρά του θαλάμου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα και η μεμβράνη αφαιρέθηκε και τα επεμβατικές κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας cristal ιώδες. Η ανάλυση διεξήχθη μετρώντας 9 πεδία υψηλής ισχύος ανά φίλτρο στους 200 φορές μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Ολύμπου (Olympus, Tokio, JPN).

χημειοαντίσταση Δοκιμασία

Για να μετρηθεί η επίδραση της CCL18 για χημειοαντίσταση των κυττάρων του όγκου, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 και 72 ώρες, με ή χωρίς CCL18 σε συγκεντρώσεις, όπως υποδεικνύεται. Στη συνέχεια, προστέθηκε μία σειρά αραίωσης του Cisplatin που κυμαίνονται από 0,4 έως 25 μg /ml για επιπλέον 72 ώρες. Στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας, τα ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν με τη χρήση ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου] δοκιμασίας. Το μέσο αλλάχθηκε και προστέθηκε διάλυμα ΜΤΤ (5 mg /ml σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο /εκβάθυνση) επί 4 ώρες και το παραγόμενο φορμαζάνη διαλύθηκε σε ισοπροπανόλη και μετράται φασματοφωτομετρικά στα 563 nm. Η πυκνότητα οπτικής ανακτηθούν για μη επεξεργασμένα κύτταρα ορίστηκε 100% και χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των ποσοστών των βιώσιμων κυττάρων στις επεξεργασμένες καλλιέργειες.

δοκιμασία BRDU -Proliferation

σύνθεση DNA μετρήθηκε με τη χρήση βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) Kit κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Calbiochem, Darmstadt, ΟΔΓ). διάλυμα σήμανσης BrdU προστέθηκε στα κύτταρα σε συνδυασμό με τις διαφορετικές θεραπείες και επωάστηκαν για 24 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του μέσου καλλιέργειας, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και το DNA μετουσιώθηκε μέσω μικροκυμάτων. Αντι-BrdU αντίσωμα προστέθηκε για μία ώρα πριν από την προσθήκη του συζυγούς IgG ποντικού-υπεροξειδάσης για 20 λεπτά. Το σήμα αναπτύχθηκε με τετραμεθυλβενζιδίνη λύση στο σκοτάδι. Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας στα 450 nm με μήκος κύματος αναφοράς στα 595 nm.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη με τη χρήση StatView (SAS Institute, Cary, NC). Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον από ένα ελάχιστο τριών ανεξάρτητα διεξήγαγε πειράματα. Δόση-εξαρτήσεις υπολογίστηκαν από Friedman Test ακολουθείται από ζεύγη συγκρίσεις χρησιμοποιώντας το τεστ Wilcoxon.

Αποτελέσματα

Αλλαγή των κυττάρων Μορφολογία

Αρχικά, Α549 αποκαλύπτεται ένα τυπικό ορθογώνιο παραλληλεπίπεδο επιθηλιακά μορφολογία με σφιχτό επαφές κυττάρου-κυττάρου (Εικ. 1Α). Κατεργασία των κυττάρων με CCL18 για 24 ώρες επαγόμενη σημειώνονται αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων (σχ. 1C και D). Κύτταρα άλλαξε τη μορφολογία τους από κυβοειδές ή τρίγωνο σχήμα με άξονα σχήμα? ανεπτυγμένες παρατεταμένη κυτταρική εξωθήσεις και επαφής κυττάρου-κυττάρου ήταν λιγότερο έντονη. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να παρατηρηθεί σε ένα δοσολογικό εύρος από 1 έως 100 ng /ml (Εικ. 1 C). Όπως ήταν αναμενόμενο, η διέγερση με 2 ng /ml ΤΟΡ-β για 24 ώρες επάγεται επίσης έναν άξονα σχήματος, που μοιάζουν με ινοβλάστες φαινότυπο (Εικ. 1Β). Έτσι, CCL18 και TGFbeta επάγει μορφολογικές αλλαγές συμβατό με EMT

Οι μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με CCL18 και TGFbeta:. Ακατέργαστα κύτταρα Α549 δείχνουν τυπικό επιθηλιακό μορφολογία με τους στενούς κύτταρο-κύτταρο-επαφές, οι οποίες σημειώνονται με λευκά βέλη ( ΈΝΑ). Μετά τη θεραπεία με 2 ng /ml -β κυττάρων άλλαξε το φαινότυπο σε μια πιο μεσεγχυματικά μορφολογία με την παρατεταμένη εξώθησης κυττάρου και χαλάρωσε κυττάρου-κυττάρου-επαφές σημειώνονται με βέλη. (Β) CCL18 αλλάζει επίσης τη μορφολογία των κυττάρων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (C [1 ng /ml] και Α [10 ng /ml]) για να μοιάζουν με ινοβλάστες μεσεγχυματικών φαινότυπο και χαλάρωσε κυττάρου-κυττάρου-επαφές σημειώνονται με βέλη.

Η έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων

Χρησιμοποιώντας RT-PCR, δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε σαφή επίδραση της CCL18 επί της έκφρασης Ε-καδερίνης σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται μετά από ένα χρόνο διέγερση 72 ώρες (Σχ. 2Α). Σε αντίθεση, η διέγερση των Α549 με CCL18 για 72 ώρες αυξάνει SNAIL1 (Σχ. 2Β) και FSP-1 έκφραση (Σχ. 2C). Η αύξηση των FSP-1 έκφραση ήταν στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,03). Είναι ενδιαφέρον ότι, η επίδραση ήταν μέγιστη σε 1 ng /ml CCL18 και μειώθηκε ελαφρά με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (Σχ. 2C).. Σε σύγκριση με τον έλεγχο της διέγερσης CCL18 σχεδόν διπλασιάστηκε μέσο έκφρασης SNAIL1. Ωστόσο, αυτή η αύξηση δεν έφθασε σημασία και καμία σαφής σχέση δοσολογίας μπορούσε να ανιχνευθεί (σχ. 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και TGFbeta προκάλεσε μια αύξηση στην έκφραση SNAIL1 και FSP1, τα αποτελέσματα ήταν χαμηλότερα από ό, τι παρατηρείται με την αντίστοιχη συγκέντρωση CCL18 (1 ng /ml). Και πάλι, θα μπορούσε να βρεθεί καμία επίδραση στην έκφραση Ε-καδερίνης.

επίπεδα του mRNA του (Α) Ε-καδερίνης, (Β) SNAIL1, (Γ) FSP-1 μετά από διέγερση με -β ή διάφορες συγκεντρώσεις CCL18 για 72 ώρες σε σχέση με την μη-διεγερμένη ελέγχου. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέσο ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας να εξομαλύνει τις διαφορές στην ποσότητα του ολικού RNA.

Η

μεταβολές στην έκφραση της EMT που σχετίζονται με Proteines

Για την επιβεβαίωση των ευρημάτων της PCR μας, αναλύσαμε πρωτεΐνη έκφραση με Western Blot. Παράλληλα με τα αποτελέσματα της PCR, η έκφραση Ε-καδερίνης αποκαλύπτεται μία ελαφρά αλλά στατιστικά μη σημαντική μείωση όταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν με CCL18 για 72 ώρες (Σχ. 3Α). Αντίθετα, διαπιστώσαμε σημαντικά αυξημένο SNAIL1 (ρ & lt? 0,005? Εικ. 3Β) και FSP-1 εκφράσεις (ρ & lt? 0,05? Σχ. 3C) με σαράντα και πενήντα τοις εκατό, αντίστοιχα. TGFbeta (2 ng /ml) που προκαλείται είτε όχι (snail1) ή μόνο περιθωριακό και ασήμαντες αλλαγές (Ε-καδερίνης, FSP1, Σχ. 3).

Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Μπαρ συνοψίζουν τα αποτελέσματα των τριών ανεξάρτητων κηλίδα western αναλύσεις, στο δεξί πάνελ μία κηλίδα εκπρόσωπο απεικονίζεται.

Η

σχετίζονται CCL18 χημειοταξία και εισβολή

πειράματα θαλάμου Boyden αποκάλυψε ότι CCL18 προκαλεί χημειόταξη κύτταρα Α549 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση και σημαντική (ρ & lt? 0.0001) αύξηση της χημειοταξίας που προκαλείται από CCL18, η οποία έφθασε στο μέγιστο (50% σε σχέση με τον έλεγχο) σε μια δόση των 100 ng /ml CCL18 (Εικ. 4). TGFbeta (2 ng /ml) ενισχύει την χημειοταξία κατά 40%, το οποίο ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,0001). Το κέρδος της ικανότητας για εισβολή σε ένα ιστό ή μήτρα είναι ένα πρόσθετο και σημαντικό χαρακτηριστικό της ΕΜΤ απαιτούν πρωτεολυτική δραστηριότητα επιπλέον προς τη χημειοταξία. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την επίδραση του CCL18 στην ικανότητα εισβολής. Βρήκαμε ότι η CCL18 (1 ng /ml) αυξάνει εισβολή υπερδιπλασίαση σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,0001? Εικ. 5). . TGFbeta (2 ng /ml) αυξάνει την επεμβατική στο ίδιο εύρος, αλλά λιγότερο έντονη (ρ & lt? 0,0001)

Έννοιες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ζεύγη σύγκριση (Wilcoxon Signed Rank Test), έλεγχος: μη επεξεργασμένα κύτταρα (η = 4) .

Η

Έννοιες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ζεύγη συγκρίσεις (Wilcoxon Signed Rank Test), έλεγχος: μη επεξεργασμένα κύτταρα (n = 3)

Η

Διάδοση

Για να. προσδιοριστεί η επίδραση της CCL18 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες είτε με 2 ng /ml ΤΟΡ-β ή 0,1 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, ή 100 ng /ml CCL18, αντίστοιχα, και στη συνέχεια μια δοκιμασία BrdU διεξήχθη. Η επώαση με CCL18 μείωσε το ρυθμό πολλαπλασιασμού σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο την επίτευξη σημαντικής μείωσης του 50% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου στα 1000 ng /ml (ρ & lt? 0,001? Εικ. 6). TGFbeta (2 ng /ml) μείωσε τον ρυθμό πολλαπλασιασμού κατά 55% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p & lt? 0.001).

Η

χημειοαντίσταση

Ερευνήσαμε περαιτέρω εάν CCL18 ρυθμίζει την ευαισθησία των κυττάρων Α549 στη θεραπεία Cisplatin. Συνεπώς, επωάσαμε τα κύτταρα με CCL18 και στη συνέχεια κατεργάζεται τα κύτταρα με διαδοχικές αραιώσεις Cisplatin. Μετά από διέγερση CCL18 επί 72 ώρες, θα μπορούσε να ανιχνευθεί καμία τοξικές επιδράσεις του CCL18 ή TGFbeta (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). LD

50 των μη επεξεργασμένων κυττάρων Α549 ήταν 6 μg /ml Cisplatin. Μετά από διέγερση CCL18 (0,1 ng /ml) των κυττάρων για 72 ώρες, το LD

50 αυξήθηκε σε 9 μg /ml Cisplatin. Ομοίως, η LD50 του διεγερμένων κυττάρων αυξήθηκε σε 10 μg /ml όταν τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 1 ng /ml CCL18 (Εικ. 7). Υψηλότερες συγκεντρώσεις CCL18 δοκιμάστηκαν αλλά καμία πρόσθετη επίδραση παρατηρήθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία -TGFbeta ή CCL18 στις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Μετά την περίοδο καλλιέργειας, το μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν με σισπλατίνη για επιπλέον 72 ώρες σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,4 έως 25 μg /ml. Η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Η οριζόντια γραμμή δείχνει την LD

50, κάθετες γραμμές δείχνουν την LD

50 για την αντίστοιχη κατάσταση προ-επώαση (n = 4).

Η

Συζήτηση

πνεύμονα ο καρκίνος είναι μία από τις κακοήθειες με την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης στο δυτικό κόσμο και, παρά τις προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία μία από τις κύριες αιτίες που σχετίζονται με τον καρκίνο θάνατο [23]. Σχεδόν το 85% αυτών των ασθενών πάσχουν από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), η οποία υποδιαιρείται σε πλακώδες καρκίνωμα, αδενοκαρκίνωμα, μεγάλου κυττάρου καρκινώματα και άλλα σπάνια υποτύπους [24]. Αδενοκαρκινώματος αντιπροσωπεύει τα υψηλότερα ποσοστά NSCLC και από το 1970 το ποσοστό της αυξάνεται [25]. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης η πλειονότητα των ασθενών με NSCLC πάσχουν ήδη από προχωρημένη ή μεταστατική νόσο, η οποία σχετίζεται με κακή πρόγνωση [26]. Ο μηχανισμός της μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) φαίνεται να είναι ένας σημαντικό γεγονός στην διαδικασία της μετάστασης. Μερικοί συγγραφείς ήδη αποδείξει ότι διάφορες μεσολαβητές που απελευθερώνονται στο μικροπεριβάλλον των στερεών όγκων είναι ικανά να επάγουν ΕΜΤ και επομένως την προώθηση της εξέλιξης της νόσου [14]. CCL18 είναι μια χημειοκίνη που παράγεται και απελευθερώνεται από μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) στο μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων και της πνευμονικής ίνωσης [16], [17]. Θα μπορούσε να αποδείξει ότι CCL18 είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε ασθενείς με NSCLC και συσχετίζεται με την T-σταδίου και ο μέσος χρόνος επιβίωσης σε υποομάδα αδενοκαρκίνωμα [21]. Αυτό οδηγεί στο ερώτημα αν CCL18 είναι άμεσα εμπλέκονται στην παθογόνο διαδικασίες σε ασθένειες του καρκίνου. Από CCL18 βρέθηκε να επάγει κολλαγόνου σε ινοβλάστες πνεύμονα και να ενεργούν με παρόμοιο τρόπο όπως TGFbeta [17], [27], [28], υποθέσαμε ότι CCL18 μπορεί να προάγει τη διαδικασία της μετάστασης μέσω EMT. Τα κύτταρα Α549 είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο ανθρώπινη κυτταρική γραμμή απομονώθηκε από ένα αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, το οποίο έχει ήδη χρησιμοποιηθεί σε αρκετές μελέτες που διερευνούν την επαγωγή της ΕΜΤ από τον TGF-β [29], [30]. Σε συμφωνία με τους άλλους, μπορούμε να αποδείξει ότι Α549 κύτταρα κατεργασμένα με ακόμη χαμηλή δόση του ΤΟΡ-β υποβλήθηκαν μορφολογικές αλλαγές από κυβοειδή επιθηλιακά κύτταρα να ατρακτοειδή μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα και απέκτησε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά μετά από 24 ώρες θεραπείας. Ομοίως, θα ήταν επίσης σε θέση να αποδείξει ότι CCL18 προκαλεί τις ίδιες μορφολογικές αλλαγές, όπως TGF-β. Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από την ανάλυση του προτύπου έκφρασης των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών γονιδίων σε mRNA και το επίπεδο της πρωτεΐνης. Η αυξητική ρύθμιση των γονιδίων μεσεγχυματικών σαν FSP-1 ή SNAIL1 είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα στη διαδικασία της ΕΜΤ. Οι παρατηρούμενες μεταβολές του χαρακτηριστικού περιγράμματος έκφρασης ήταν αρκετά παρόμοια σε ΤΟΡ-β και σε διεγέρσεις CCL18. Στο πλαίσιο αυτό, είναι αξιοσημείωτο ότι Miyazaki et al. που δημοσιεύθηκε το 2006, ότι οι ασθενείς με πνευμονική αδενοκαρκίνωμα επιδεικνύοντας μια χαμηλή έκφραση Ε-καδερίνης σε συνδυασμό με μια υψηλή έκφραση FSP-1 έχουν να αντιμετωπίσουν μια σημαντική χειρότερη πρόγνωση λόγω αιματογενής μετάσταση [9]. Παρατηρήσαμε επίσης ότι SNAIL1, ένας παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στα πρώιμα γεγονότα της ΕΜΤ, ήταν πάνω ρυθμισμένα με κατεργασία CCL18 με τον ίδιο τρόπο όπως με TGFbeta. Κατά τη διαδικασία της μετάστασης, τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν νέες δυνατότητες όπως εισβολή, ενισχυμένη μετανάστευση και ρύθμιση προς τα κάτω του πολλαπλασιασμού. Εμείς, ως εκ τούτου, μελέτησε επίσης την επίδραση της CCL18 σε αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες και παρατηρήθηκε μια ενισχυμένη μεταναστευτικών και επιθετική πιθανότητα μετά από 24 ώρες θεραπείας CCL18. Επιπλέον, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των Α549 μειώθηκαν μετά από 24 ώρες θεραπείας CCL18, η οποία μπορεί να οφείλεται στην έναρξη της διαφοροποίησης των διαδικασιών. Συνολικά, αυτές οι μεγάλες αλλαγές στην κυτταρικές λειτουργίες που αναφέρθηκαν παραπάνω επιδεικνύουν ισχυρή επιρροή του CCL18 κατά τη διαδικασία της μετάστασης. Έτσι, με βάση τα δεδομένα μας παρουσιάζονται εδώ, προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα μας ότι η αυξημένη CCL18 ορού συσχετίζεται με μειωμένο χρόνο επιβίωσης σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [22] και στην παρατήρηση από τους Chen et al. αποδεικνύοντας ότι η CCL18 προωθεί μετάσταση στον καρκίνο του μαστού [5] υποθέσαμε ότι CCL18 μπορεί να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες που οδηγούν EMT στο περιβάλλον του όγκου.

Λαμβάνοντας υπόψη ότι η πλειοψηφία των ασθενών που χρειάζονται χημειοθεραπεία είτε ως πρόσθετο ή εισαγωγική μέρος μιας πολυτροπικής προσέγγισης ή ως μια ενιαία θεραπεία, χημειοαντίσταση εξακολουθεί να είναι ένα από τα κύρια εμπόδια στην επαρκή θεραπεία του NSCLC και ο λόγος της προόδου του όγκου, υποτροπής και θανάτου όγκου. Η χημειοθεραπεία του NSCLC εξακολουθεί να βασίζεται σε παράγωγα πλατίνας φάρμακα αν και είναι γνωστό ότι υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί πώς καρκινικά κύτταρα πνεύμονα ξεφύγουν σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα και CCL18 μπορούσε να είναι ένα καίριο μεσολαβητής σε αυτές τις διαδικασίες. Οι μηχανισμοί αυτοί φαίνονται να συνδέονται με EMT επειδή παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν ΕΜΤ ρυθμίζουν επίσης πρωτεΐνες μεταφορείς που σχετίζονται με την αυξημένη αντίσταση σε παράγοντες πλατίνας [31], [32]. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε το ρόλο της CCL18 στην χημειοαντίσταση. Παρατηρήσαμε πράγματι αυξημένο χημειοαντίσταση που προκαλείται από CCL18. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αύξηση αυτή των χημειοαντίσταση κορυφώθηκε στην ίδια περιοχή ως δείκτες της EMT (π.χ. FSP1). Αυτό παρέχει απόδειξη για ένα ρόλο του CCL18 στην επαγωγή χημειοαντίσταση. Επειδή CCL18 είναι μια χημειοκίνη, η οποία μπορεί επίσης να εμπλέκεται στην παλιννόστηση των καρκινικών κυττάρων, ερευνήσαμε επίσης τις ιδιότητες των chemotacic CCL18 σε κύτταρα Α549. Παρατηρήσαμε ότι CCL18 ασκεί μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην χημειοταξία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα που δείχνει, ότι CCL18 προσελκύει καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σε δικτυακούς τόπους της απελευθέρωσης CCL18. Καθώς ο πνεύμονας είναι το όργανο με το υψηλότερο επίπεδο της παραγωγής CCL18, αυτό το αποτέλεσμα θα μπορούσε να επηρεάσει την homing των CCL18 αποκρίνονται καρκινικών κυττάρων στον πνεύμονα.

Είναι ενδιαφέρον ότι, στα περισσότερα από τα πειράματα δεν μπορέσαμε να παρατηρήσουμε μια σαφή δοσοεξαρτώμενη επίδραση της CCL18. Αντίθετα, η αύξηση των συγκεντρώσεων των CCL18 συχνά οδηγεί σε μείωση του αποτελέσματος CCL18. Αυτό είναι συμβατό με την έκφραση των διαφορετικών αγωνιστικών και ανταγωνιστικών υποδοχείς CCL18. Πρόσφατα, Catusse et al. δημοσιεύθηκε ότι CCL18, προκαλώντας μέσω GPR30, δρα αγωνιστική και μειώνει CXCR4-μεσολάβηση αποτελέσματα της CXCL12 [15]. Chen et al. απέδειξε ότι PITPNM3, μια πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή μεταφοράς φωσφατιδυλινοσιτόλη μεμβράνη που σχετίζονται, μπορεί να δράσει ως υποδοχέας CCL18 [5]. Έχουμε εντοπίσει το ήδη γνωστό CCR6 υποδοχέα χημειοκινών ως υποδοχέας CCL18 με ισχύ για να κινήσει τις περιγράφονται οι δραστηριότητες σε ινοβλάστες [33]. Αυτό δείχνει ότι CCL18 θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει διάφορους υποδοχείς και την ισορροπία της έκφρασης του υποδοχέα θα μπορούσε να ρυθμίζουν την αγωνιστική και ανταγωνιστική επιδράσεις της CCL18.

Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι CCL18 επάγει ΕΜΤ σε κύτταρα Α549, ενισχύει

μεταστατικό δυναμικό τους και υποστηρίζει την αντίσταση χημειοθεραπεία. Έτσι, CCL18 δεν είναι μόνο ένας μεσολαβητής που απελευθερώνεται από μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους και πιθανώς αντικατοπτρίζει το μέγεθος του όγκου, αλλά επηρεάζει επίσης νεοπλασματικές διεργασίες του αδενοκαρκινώματος. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ καταδεικνύουν ότι CCL18 είναι σε θέση να προκαλέσει τα γεγονότα που εμπλέκονται στη μετάσταση των όγκων, όπως η αλλαγή από πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα του όγκου σε μεταναστευτικά μεσεγχυματικών κυττάρων, χημειόταξη, και εισβολή. Επιπλέον, CCL18 επίσης προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα από τη χημειοθεραπεία αυξάνοντας χημειοαντίσταση. Έτσι, συμπεραίνουμε ότι CCL18 θα είναι ένας μελλοντικός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.