Αφηρημένο

Σας παρουσιάζουμε τα αποτελέσματα μιας παγκόσμιας μελέτης της απορρύθμισης του miRNAs σε ζεύγη δειγμάτων του φυσιολογικού βλεννογόνου και όγκου από οκτώ ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Αν και υπάρχει υπάρχοντα δεδομένα της συμβολής miRNA να ορθοκολικό ογκογένεση, οι μελέτες αυτές είναι συνήθως μικρές σε μελέτες μεσαίας κλίμακας κυτταρικών σειρών ή μη ζευγαρωμένα δείγματα όγκου. Η παρούσα μελέτη είναι η γνώση μας για το μοναδικό σε δύο σημεία. Πρώτον, τα φυσιολογικά και τα γειτονικά δείγματα καρκινικού ιστού σε συνδυασμό, λαμβάνοντας έτσι υπόψη τις διαφορές βασικής γραμμής μεταξύ των ατόμων κατά τη δοκιμή για διαφορική έκφραση. Δεύτερον, χρησιμοποιούμε αλληλουχίας υψηλής απόδοσης, επιτρέποντας έτσι μια ολοκληρωμένη μελέτη όλων των miRNAs που εκφράζονται στους ιστούς. Χρησιμοποιούμε την τεχνολογία αλληλούχισης Illumina να εκτελέσει αλληλουχίας και δύο διαφορετικά εργαλεία σε στατιστικά τεστ για διαφορές στις μετρήσεις ανάγνωσης ανά γονίδιο μεταξύ των δειγμάτων: Edger όταν χρησιμοποιούν τις πληροφορίες ζευγάρι και DESeq όταν αγνοεί την πληροφορία αυτή, δηλαδή, τη θεραπεία όγκων και φυσιολογικά δείγματα ως ανεξάρτητες ομάδες. Έχουμε εντοπίσει 37 miRNAs που απορυθμίζεται σημαντικά και στις δύο στατιστικές προσεγγίσεις, 19 κάτω-ρυθμίζονται και 18 up-ρυθμίζεται. Μερικά από αυτά τα miRNAs έχουν προηγουμένως δημοσιευθεί ως πιθανοί ρυθμιστές του ορθοκολικού αδενοκαρκινώματα, όπως miR-1, miR-96 και miR-145. ολοκληρωμένη μελέτη των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μας επιβεβαιώνει εκ τούτου ορισμένες από τις υφιστάμενες ευρήματα. Ανακαλύψαμε επίσης 16 απορυθμισμένη miRNAs, που με τις γνώσεις μας δεν έχουν προηγουμένως συσχετιστεί με ορθοκολικό καρκινογένεση: τα ακόλουθα σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται miR-490-3p, -628-3p /-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5P, -3656 και το up-ρυθμίζεται miR-105, -549, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p, -4326. Αν και η μελέτη είναι προκαταρκτική με περιλαμβάνεται μόνο οκτώ ασθενείς, πιστεύουμε ότι τα αποτελέσματα Προσθέστε την παρούσα γνώση σχετικά με miRNA απορρύθμισης στις παχέος καρκινογένεση. Ως εκ τούτου τα αποτελέσματα θα χρησιμεύσει ως ένα ισχυρό κατάρτισης που για την επικύρωση των πιθανών βιοδεικτών σε μια μεγαλύτερη μελέτη κοόρτης. Τέλος, έχουμε επίσης παρόντα στοιχεία υποστηρίζουν την υπόθεση ότι υπάρχουν διαφορές στην έκφραση των miRNAs μεταξύ αδενοκαρκινώματα και νευροενδοκρινείς όγκους του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Hamfjord J, Stangeland AM, Hughes Τ, Skrede ML, Tveit KM, Ikdahl Τ , et al. (2012) διαφορική έκφραση των miRNAs στον Καρκίνο του παχέος εντέρου: Σύγκριση των Paired όγκου ιστών και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο χρησιμοποιώντας High-Throughput αλληλουχίας. PLoS ONE 7 (4): e34150. doi: 10.1371 /journal.pone.0034150

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 6η Σεπτεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 23 Φλεβάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17, Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Hamfjord et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εξωτερική χρηματοδότηση έλαβε από «Ivar, Ragna og Morten Τρύπες Legat til fremme av kreftforskningen i Norge» (Ivar, Ragna και Ίδρυμα Morten τρύπες »για να εξυπηρετήσει έρευνα για τον καρκίνο στη Νορβηγία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο συχνά εμφανιζόμενες καρκίνους παγκοσμίως [1]. Πρόγνωση εξαρτάται από το στάδιο του όγκου κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Υπάρχει μεγάλη έμφαση στην ανακάλυψη και την επικύρωση των δεικτών έγκαιρης ανίχνευσης, καθώς και για την έξυπνη και προγνωστικούς παράγοντες όπως επανεξεταστεί από Asghar

et al

. [2]. Η μοριακή γένεση του CRC είναι από τις καλύτερες που περιγράφεται όλων των ανθρώπινων καρκίνων. Το μοντέλο Vogelstein [3] έχει όλα αυτά τα χρόνια έχουν τροποποιηθεί και να επεκταθεί, όπως αποδεικνύεται από Slaby

et al

. [4].

Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης μόρια RNA 18-25 νουκλεοτιδίων σε μήκος, ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στις αρχές της δεκαετίας του 1990 στο

C. elegans

[5]. Υποστηρίζουν ομοιόσταση με μεταβολή έκφρασης γονιδίου σε διαφορετικούς κυτταρικές διεργασίες, όπως η διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την απόπτωση [6]. Εκτιμάται ότι περισσότερο από το 10% όλων των ανθρώπινων γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μπορεί να ρυθμίζεται από αυτούς τους μηχανισμούς [7]. Η τελευταία σειρά των ανθρωπίνων Mirs καταγράφονται στο miRBase υπερβαίνει χίλια [8], και η αυξανόμενη χρήση της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης είναι η κινητήρια δύναμη περαιτέρω ανακάλυψη. Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι μπορούν να Mirs απορρυθμισμένη σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους, και ως εκ τούτου δρουν ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [9], [10]. Αυτά τα μόρια είναι ενδιαφέρουσα, δεδομένου ότι μπορεί να είναι δυνητικοί βιοδείκτες διάγνωση ή πρόγνωση και δρουν ως πιθανοί στόχοι στον καρκίνο ειδική θεραπεία, όπως αναθεωρούνται από Cho

et al

. [11], [12]. Ο τελικός στόχος θα είναι εξατομικευμένη ιατρική με τα δίκτυα του καρκίνου του γονότυπου-φαινότυπου ως οδικός χάρτης για κλινικές αποφάσεις [13].

Πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην έκφραση του miR προφίλ σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες έχουν αναλύσει ένα μικρότερο αριθμό Mirs χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR) ή την τεχνολογία υβριδισμού που βασίζεται, εν μέρει από κυτταρικές σειρές ή μη ζευγαρωμένα ιστούς των ασθενών [14], [15], [16], [17 ], [18]. Μόνο λίγες μελέτες έχουν πιο σφαιρικά αλληλουχία Mirs σε μεγαλύτερη κλίμακα για το προφίλ έκφρασης, όπως και η μελέτη για την μελανώματος [19] και του παχέος [20] microRNAome. Η τελευταία μελέτη ήταν μοναδικό στο είδος του και παρουσίασε μια σειρά νέων υποθετικών Mirs χρησιμοποιώντας μια πειραματική προσέγγιση που ονομάζεται Mirage. Ωστόσο, όπως η μελέτη αυτή χρονολογείται από αρκετά χρόνια, μόνο ένα υποσύνολο των ώριμων Mirs γνωστή σήμερα ενεργά διερευνηθεί.

Η παγκόσμια έκφραση της Mirs έχει παραδοσιακά αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας υβριδοποίηση τεχνολογίες που βασίζονται σε σειρά. Αυτές οι συστοιχίες βασίζονται σε ειδική υβριδοποίηση αλληλουχία μετά από σήμανση με μια φθορίζουσα χρωστική. Η ένταση φθορισμού καταγράφεται και αντικατοπτρίζει την έκφραση ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Με τη χρήση πολλαπλών χρωμάτων, η διαφορά στον φθορισμό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της γονιδιακής έκφρασης. αλληλούχιση υψηλής απόδοσης, από την άλλη πλευρά, χρησιμοποιεί δείγμα μεταγραφές ως αρχικό πρότυπο. Απευθείας αλληλούχιση διεξάγεται στη συνέχεια με μια σειρά αντιδράσεων με χρήση φθοροφόρου νουκλεοτίδια περατώσεως. Ακολουθία διαβάζει στη συνέχεια χαρτογραφούνται πίσω στο γονιδίωμα αναφοράς ή μια βάση δεδομένων των προϊόντων μετεγγραφής και τον αριθμό ακολουθίας διαβάζει χαρτογράφησης πίσω σε μια συγκεκριμένη μεταγραφή είναι ένα μέτρο της γονιδιακής έκφρασης. Στην γενική περίπτωση του mRNA, αυτή η μέτρηση θα πρέπει να ομαλοποιηθούν για το μήκος της μεταγραφής και του συνολικού αριθμού των αναγνώσεις δημιουργήθηκε για το δείγμα. Στην περίπτωση του Mir, η ομαλοποίηση για το μήκος μεταγραφήματος δεν απαιτείται ως ο διαβάζει την κάλυψη της πλήρους μήκους της μεταγραφής. Η διαφορική έκφραση συνέχεια μετράται από τη διαφορά στην κανονικοποιημένη μετράει για ένα δεδομένο γονίδιο. Μια πρόσφατη δημοσίευση συγκρίνει διαφορική γονιδιακή έκφραση στο

Δ. pseudoobscura

κατά τη χρήση της τεχνολογίας συστοιχία και αλληλούχιση υψηλής απόδοσης. Η πλειοψηφία των επιπέδων έκφρασης είναι παρόμοια μεταξύ των μεθόδων με συγκρίσιμη απόδοση [21]. Μια παρόμοια μελέτη για

S. cerevisiae

έχει δείξει ότι οι μέθοδοι που συμφωνούν αρκετά καλά για τα γονίδια με μέτρια επίπεδα έκφρασης, αλλά ο συσχετισμός είναι πολύ χαμηλή για τα γονίδια είτε με χαμηλά ή υψηλά επίπεδα έκφρασης. Αυτό οφείλεται εν μέρει στην πολύ αυξημένη δυναμική περιοχή για την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης που παρέχονται από την μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης [22]. αλληλουχίας υψηλής απόδοσης περαιτέρω θεωρείται ανώτερη σε σχέση με τη δομή και τη δυναμική της μεταγραφικό. Παραδείγματα αυτού περιλαμβάνουν την έκφραση των άγνωστων αλληλουχιών στόχου, επεξεργασία RNA εκδηλώσεις και άλλες παραλλαγές αλληλουχίας RNA όπως πολυμορφισμών [21], [22], [23].

Δεδομένου ότι αυτά τα χαρακτηριστικά της αλληλούχισης υψηλής απόδοσης δείχνουν ότι είναι μια εξαιρετική μέθοδος για την παγκόσμια έρευνες των μικρών RNAs, συμπεριλάβαμε οκτώ ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή του παχέος εντέρου για τη μελέτη των όγκων συγκεκριμένες αλλαγές στην έκφραση του miR χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αλληλούχισης υψηλής απόδοσης Illumina. Οι ιστοί του φυσιολογικού βλεννογόνου και όγκου συλλέχθηκαν από χειρουργικά δείγματα για όλους τους ασθενείς, ως εκ τούτου αποδίδοντας ένα μοναδικό σύνολο ζευγών δειγμάτων. Η ανάλυσή μας των συνόλων δεδομένων ακολουθίας που παράγεται από αυτά τα δείγματα μας δίνει τη δυνατότητα να εντοπίσει Mirs που δεν έχουν προηγουμένως συσχετιστεί με ορθοκολικό αδενοκαρκινώματα. Έχουμε επίσης προσδιορίσει διαφορές στην έκφραση μεταξύ miR αδενοκαρκινώματα και νευροενδοκρινούς όγκου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα αυτά προσθέτουν στην παρούσα γνώση σχετικά με miR απορρύθμισης στις παχέος καρκινογένεση.

Αποτελέσματα

Οκτώ ασθενείς επιλέχθηκαν τυχαία σύμφωνα με τις προδιαγραφές των φύλων (άνδρες μόνο) από ορθοκολικό καρκίνο ομάδα. Ολικό RNA από ιστό του όγκου και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο εκχυλίζεται. Στην προκαταρκτική ανάλυση της διαφορικής έκφρασης μεταξύ του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικό βλεννογόνο, ένα ζεύγος επέδειξε ένα πρότυπο έκφρασης διαφορετικό από το υπόλοιπο των ζευγών. Ιστοπαθολογική εξέταση εξετάστηκε από παθολόγο (Πίνακας 1), και ήταν προφανές ότι ένας ασθενής ταξινομείται εσφαλμένα και έτρεφε ένα άτυπο νευροενδοκρινικών όγκων (NET), ενώ οι υπόλοιποι ήταν αδενοκαρκινώματα. Όλες οι περαιτέρω στατιστικές αναλύσεις αντιμετωπίζονται με τον ασθενή με ΝΕΤ ως μια ξεχωριστή περίπτωση από τους υπόλοιπους ασθενείς. Τα ποσοστά των κυττάρων του όγκου και των συστατικών στρωματικά επίσης εκτιμήθηκε σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήματα από πρωτογενή όγκο, δείχνοντας ότι επτά από τις οκτώ δείγματα που φιλοξενούνται τα καρκινικά κύτταρα περισσότερο από 60% (Πίνακας 1).

Η

Ο 16 δείγματα αλληλουχήθηκαν επιτυχώς χρησιμοποιώντας Illumina Genome Analyzer II (Illumina, CA, USA) και επεξεργασία με χρήση miRanalyzer [24] με ένα μέσο όρο 562 ώριμου Mirs χαρτογραφηθεί σε miRBase ανά πείραμα αλληλούχισης όταν επιτρέπει ένα νουκλεοτίδιο αναντιστοιχία (Σχήμα 1Β). Περίπου το 80% των αλληλούχισης αναγνώσεις χαρτογραφηθεί να ωριμάσει ανθρώπινη Mirs σε miRBase (απελευθερώνουν 16) σε δεκαεπτά από δεκαοκτώ τρέχει αλληλουχίας, το υπόλοιπο διαβάζει κυρίως χάρτη σε άλλα μέρη του μεταγραφικό. Στο τελευταίο δείγμα (φυσιολογικός ιστός Ν7) υπήρχε πολύ χαμηλότερο ποσοστό αναφέρει ότι χάρτη για να miRBase (37,2% του συνόλου διαβάσει) (Σχήμα 1Α). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε τεχνικά ζητήματα κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας του δείγματος. Επιπλέον, μερικές εκατοντάδες υποθετικές νέες miR αλληλουχιών και γονιδιακούς τόπους στο γονιδίωμα αναφοράς (HSA hg18) έχουν προβλεφθεί από τις πίστες αλληλούχισης. Αυτές οι υποθετικές αλληλουχίες ανέρχονται σε ένα μικρό κλάσμα του συνολικού διαβάσει καταμέτρηση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Πίνακας Α με ποσοστό αλληλούχισης αναγνώσεις χαρτογραφηθεί να ωριμάσει Mirs (μαύρο) των συνολικών διαβάζει ανά πείραμα. Πίνακας Β με τον αριθμό των ώριμων Mirs προσδιορίζονται ανά πείραμα αλληλουχίας. Ο συνολικός αριθμός των ώριμων ανθρώπινων Mirs στο miRBase απελευθερώσει 16 (n = 1212) περιλαμβάνεται ως αναφορά.

Η

Η διαφορική έκφραση (DE) των προσδιορισμένων Mirs από miRBase υπολογίστηκε με τη χρήση δύο εργαλείων βιοπληροφορικής, DESeq [25 ] και edger [26]. Edger υλοποιεί τη λειτουργικότητα και με τα δύο ζεύγη και μη αξιόπιστη δοκιμές (οι πληροφορίες ζευγάρι αγνοείται, και φυσιολογικά και τα δείγματα όγκων αντιμετωπίζονται ως ανεξάρτητες ομάδες), ενώ DESeq δεν μπορεί να εκτελέσει ζεύγη δοκιμές, αλλά τα οφέλη από πρόσθετα στατιστικά βελτιώσεις σε σχέση με edger. Η αντιμετώπιση των φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων ως δύο ανεξάρτητες ομάδες θεωρητικά προβλέπεται να είναι το πιο συντηρητική δοκιμή αφού, σε αντίθεση με το τεστ ζεύγους, δεν αντιπροσωπεύουν την αρχική τιμή διαφορές μεταξύ των ασθενών. Με τη χρήση των δύο μεθόδων, έχουμε δύο σειρές σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων Mirs. Η τομή μεταξύ των δύο αυτών συνόλων είναι μια πολύ συντηρητική πρόβλεψη των σημαντικά απορρυθμιστεί Mirs. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να παρατηρούν σε ποιο βαθμό η μη αξιόπιστη δοκιμή είναι πιο συντηρητικές από την αντιστοιχισμένη. Πρώτη αλλαγή φορές γνωστών Mirs αναλύθηκε μεταξύ των ομάδων του αδενοκαρκινώματος (n = 7) και φυσιολογικό βλεννογόνο (n = 8), στη συνέχεια μεταξύ της υπόθεσης νευροενδοκρινικό (n = 1) και φυσιολογικό βλεννογόνο (n = 8) χρησιμοποιώντας DESeq (Σχήματα 2Α και 2C). Όταν κοιτάζετε τα αδενοκαρκινώματα ως ομάδα και χρησιμοποιώντας την Benjamini και Hochberg προσαρμογής [27] για πολλαπλές δοκιμές (FDR & lt? 0.1), συνολικά 52 Mirs ήταν σημαντικά απορρυθμισμένη σε σύγκριση με εκείνη του φυσιολογικού βλεννογόνου: 28 ήταν κάτω-ρυθμίζονται και 24 up-ρύθμιση (Πίνακας S1). Η υπόθεση νευροενδοκρινείς, ωστόσο, έδειξε συνολικά 38 Mirs σημαντικά απορρυθμισμένης σε σύγκριση με την κανονική ομάδα βλεννογόνου, όλα τα επάνω ρυθμισμένη (Πίνακας S2). Είναι ενδιαφέρον, μόνο 6 Mirs αντιπροσωπεύονται και στις δύο ομάδες ιστοπαθολογικές: miR-7, -96, -204, -1269, -1827 και -3177. Σε αυτή την ανάλυση, υπάρχουν ως εκ τούτου, συνολικά 46 και 32 Mirs που φαίνεται κάπως ειδικά για το αδενοκαρκίνωμα και νευροενδοκρινείς ιστοπαθολογική, αντίστοιχα.

Σχηματική απεικόνιση στατιστική προσέγγιση. Πίνακες Α και προσέγγιση παράσταση C χρησιμοποιώντας μη αξιόπιστη στατιστική και το εργαλείο DESeq. Πίνακας Β δείχνει την προσέγγιση χρησιμοποιώντας ζεύγη στατιστικές και το εργαλείο edger. Δείτε το κείμενο για περισσότερες λεπτομέρειες.

Η

Από τη στιγμή που εξέταζαν ζευγαρωμένα δείγματα όγκου και φυσιολογικό βλεννογόνο ιστό από τους ίδιους ασθενείς, πραγματοποιήσαμε επίσης μια δοκιμή από τις επτά περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος χρησιμοποιώντας ζεύγη στατιστικών στο Edger (Εικόνα 2Β ). Συνολικά 118 Mirs ταυτοποιήθηκαν ως σημαντικά δυσρυθμισμένη υπό τους ίδιους όρους όπως και για τη μη αξιόπιστη ανάλυση (Πίνακας S3). Από αυτούς, υπήρχαν 81 Mirs που δεν προσδιορίζονται στην μη αξιόπιστη ανάλυση, και μια κοινή επικάλυψη των 37 και για τις δύο προσεγγίσεις. Αυτό επιβεβαιώνει την πρόβλεψη ότι το μη ζευγαρωμένα ανάλυση είναι η πιο συντηρητική δοκιμή, αν και υπάρχουν 15 Mirs προσδιορίζονται ως δυσρυθμισμένη στο μη ζευγαρωμένα δοκιμή DESeq που δεν αναγνωρίστηκαν με την αντιστοιχισμένη ανάλυση σε Edger (Σχήμα 3).

είναι προφανές ότι υπάρχουν 37 κοινές Mirs βρέθηκε να απορυθμίζεται σημαντικά κατά τη χρήση τόσο στατιστικές προσεγγίσεις (Πίνακας 2). Υπάρχει περίπου ίση κατανομή μεταξύ του κατάντη και up-ρύθμιση Mirs. Υπάρχουν δύο ταπεινούς (περίπου 10-10 000 απόλυτο διαβάζει) και πολύ (περίπου 10 000-5 000 000 απόλυτη διαβάζει) εκφράζεται Mirs εκπροσωπούνται στο κοινό υποσύνολο miR, δύο αξιοσημείωτα παραδείγματα είναι miR-7 και miR-1, αντίστοιχα. Όταν κοιτάζετε τα επίπεδα έκφρασης σε παγκόσμιο επίπεδο από την άποψη όλων των ταυτοποιημένων Mirs, υπάρχει μια παγκόσμια up-ρύθμιση της έκφρασης στον όγκο σε σύγκριση με εκείνη του φυσιολογικού βλεννογόνου (θεωρείται από την αντιστοιχισμένη ανάλυση της αδενοκαρκινώματα).

Η

Η αλληλούχιση υψηλής διεκπεραιωτικότητας πειραματικά επικυρωθεί χρησιμοποιώντας μια ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για επιλεγμένες Mirs και δείγματα ιστών (Σχήμα S1). Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με τα προηγούμενα αποτελέσματα της επικύρωσης μεταξύ πλατφόρμας [28]:. τα αποτελέσματα μεταξύ των διαφόρων μεθόδων που συσχετίζονται, αλλά αυτή η συσχέτιση είναι πολύ από το τέλειο

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι Mirs είναι γενικά κάτω-ρυθμίζονται σε διαφορετικούς καρκίνους, με μια συσχέτιση μεταξύ του βαθμού επίπεδα διαφοροποίησης και την παγκόσμια έκφραση της Mirs. Αν και έχει αναφερθεί ότι η παγκόσμια ρύθμιση προς τα κάτω προάγει τον κυτταρικό μετασχηματισμό και την ογκογένεση [10], [15], [29], μια μεγάλη έκφραση προφίλ μελέτη των συμπαγών όγκων με Volinia

κ.ά.

. δεν τήρησε τα κάτω ρύθμιση των Mirs όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30]. Η μελέτη μας δείχνει ότι η παγκόσμια ρύθμιση προς τα κάτω δεν είναι η περίπτωση για τα παχέος αδενοκαρκινώματα σε ομάδα μας, ακόμα κι αν ένας σημαντικός αριθμός των μεμονωμένων Mirs ρυθμίζονται προς τα κάτω στα αδενοκαρκινώματα σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα.

Σύμφωνα με την βάση δεδομένων miRecords [31], miR-1 έχει 117 επικυρωμένες στόχους και θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με πολλά σημαντικά γονίδια στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου. Σε μια μελέτη από το 2009, miR-1 και miR-551b (μεταξύ άλλων) βρέθηκαν να έχουν χαμηλότερη έκφραση σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα σε σχέση με διαφοροποιημένα κύτταρα και σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο [17]. Αυτό είναι σύμφωνο με τα ευρήματά μας από τα κάτω-ρυθμίζονται miR-1 και miR-551b στα αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου. Down-ρυθμίζεται miR-1 παρατηρείται επίσης και στην περίπτωση νευροενδοκρινείς. miR-1 έχει περαιτέρω αναφερθεί ότι είναι κάτω-ρυθμιζόμενη και πρότεινε μια λειτουργία όγκο-κατασταλτική στοχεύοντας το transgelin 2 γονίδιο (

TAGLN2

) στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [32] και κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματα [33] .

miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω στις adenocarcenomas της μελέτης μας, και αυτό το miR έχει συχνά συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω σε καρκίνους του παχέος εντέρου [16], [34], [35], [36] . Θεωρείται ότι έχει ένα ρόλο καταστολέα όγκων, εν μέρει με τη στόχευση του υποδοχέα υπόστρωμα υποδοχέα ινσουλίνης 1 (ISR-1) και τύπου Ι που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα (IGF-IR). Απώλεια miR-145 αυξάνει την αναστολή αντι-αποπτωτικών σημάτων στο κύτταρο και να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων [37], [38].

Σε μια μελέτη από το 2010, miR-195 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε 81 παχέος καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο και αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα μας για τις αδενοκαρκινώματα. Αυτό miR πιστεύεται να στοχεύσει Bcl-2 και ως εκ τούτου ασκούν προ-αποπτωτική λειτουργία του όταν φυσιολογικά ρυθμίζεται [39]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η μειωμένη έκφραση του miR-195 εμφανίσθηκε πιο συχνά σε ασθενείς με μετάσταση στους λεμφαδένες και προηγμένο στάδιο του όγκου. Χαμηλά επίπεδα έκφρασης ήταν επίσης κακή πρόβλεψης της συνολικής επιβίωσης [40].

Σε δύο μικρές μελέτες, μια από καρκίνο του παχέος εντέρου χωρίς λεμφαδένα μετάσταση [41] και το άλλο του γαστρικού καρκίνου [31], miR-378 ήταν βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω στους όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικά γειτονικό ιστό, όπως φαίνεται στη μελέτη μας. Έχει όμως αναφερθεί ότι το miR-378 προάγει την κυτταρική επιβίωση και την ανάπτυξη του όγκου με στόχευση Sufu και Fus-1 [42] και μπορεί επίσης να διαδραματίσει έναν ρόλο τροποποιητικό με άλλα Mirs στην αγγειογένεση [43]. Υπάρχει περαιτέρω απόδειξη ότι η λειτουργική μονάδα Myc /miR-378 /TOB2 /κυκλίνης D1 ρυθμίζει ογκογόνο μετασχηματισμό [44].

miR-383 είναι επίσης κάτω-ρυθμίζονται στα αδενοκαρκινώματα σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό. Απ ‘όσο γνωρίζουμε αυτό δεν έχει αναφερθεί για τον ορθοκολικό αδενοκαρκινώματα, αλλά έχει παρατηρηθεί σε μια μικρή μελέτη για τον καρκίνο του στομάχου [45]. Υπάρχει καλή συμφωνία μεταξύ των ευρημάτων μας κάτω-ρυθμίζονται Mirs στην παχέος αδενοκαρκινώματα και προηγουμένως δημοσιευμένες αναφορές. Καθώς και οι Mirs περιγράφεται παραπάνω, ταυτοποιήσαμε ένα σημαντικό αριθμό άλλων ομοιόμορφα κάτω ρυθμισμένα Mirs, λιγότερο αναφέρεται στη βιβλιογραφία? -139-5p, -363, -422a, -486-5p, -490-3p, -628-3p, -628-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5P και -3656 (Πίνακας 2 ). Αυτό τονίζει το δυναμικό της υψηλής αλληλουχίας διακίνηση ως ένα εργαλείο για τον εντοπισμό Mirs πιθανώς σχετίζονται με την καρκινογένεση που θα μπορούσαν να έχουν χαθεί με τη χρήση συστοιχίας που βασίζονται στην τεχνολογία.

miR-7 έχει ένα λειτουργικό ρόλο στη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων στο έντερο , επανεξετάζονται από Tazawa

et al

. [46]. Θεωρείται ότι ρυθμίζει την έκφραση των διαμεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνικών CD98 το οποίο έχει ένα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση μέσω αλληλεπίδρασης με ιντεγκρίνης βήτα-1. Up-ρύθμιση του miR-7 καταστέλλει την έκφραση CD98 σε κύτταρα Caco2-BBE και ως εκ τούτου διαμορφώνει βήτα-1-ιντεγκρίνης-λαμινίνη-1 αλληλεπιδράσεις. Αυτό μπορεί να επηρεάσει περαιτέρω πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των εντεροκυττάρων κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης κατά μήκος του άξονα κρύπτη-λάχνης [47]. miR-7 έχει αναφερθεί να λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικού σε σβαννώματα [48], αλλά ως ένα ογκογονίδιο στον πνεύμονα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [49]. Διαφαίνονται στοιχεία ότι η αυξημένη έκφραση του EGFR σχετίζεται με αυξημένο επίπεδο miR-7, τουλάχιστον σε καρκινώματα πλακωδών κυττάρων. Το miR-7 με τη σειρά του στοχεύει παράγοντα Ets2 καταστολέα (ΕΤΠ), εξασθενεί την έκφραση EGFR και ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη [49]. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι miR-7 μπορεί να λειτουργεί σε διάφορες ανατροφοδότηση και μεταδράσεως βρόχων, τόσο ως ογκοκατασταλτικού και ογκογονιδίου ανάλογα με τον τύπο του όγκου. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι miR-7 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω και στις δύο παχέος αδενοκαρκινώματα, και στην περίπτωση νευροενδοκρινείς. Με βάση τις προηγούμενες διαπιστώσεις και δημοσίευσε επικυρωθεί στόχους για miR-7, όπως

EGFR

,

ΡΑΚ1

,

RAF1, IRS1 /2

και

CD98

[ ,,,0],31], είναι δίκαιο να υποθέσουμε ότι αυτό το miR μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των καρκίνων του παχέος εντέρου.

Οι εκφράσεις του miR-96, miR-135b και miR-493 αυξήθηκαν σε αρκετές μελέτες σχετικά με καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και στη μελέτη μας [14], [17], [50]. miR-135 έχει αποδειχθεί ότι στοχεύουν άμεσα το 3 ‘UTR του

APC

και επάγουν την κατάντη Wnt μονοπατιού [51]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι miR-552 και -592 εκφράσεις αυξήθηκαν στα αδενοκαρκινώματα σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Προηγουμένως δημοσιευμένα στοιχεία για τα δύο αυτά Mirs αποδειχθεί μια ρύθμιση προς τα πάνω σε καρκίνους του παχέος με την κατάσταση επισκευής καλά αναντιστοιχία (MMR), αλλά κάτω ρύθμιση σε ανεπάρκεια όγκους MMR σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου [17]. Υοοη

κ.ά.

παρατηρηθεί ότι miR-296 αλληλεπιδρά με το 3 ‘UTR του γονιδίου

CDKN1A

(p21 /WAF1), και ότι αυτή η miR ήταν συχνά τα πάνω ρυθμισμένη κατά τη διάρκεια αθανατοποίηση των ανθρώπινων κυττάρων [52]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρούμε επίσης μια ρύθμιση προς τα πάνω του miR-296-3p. Αυτό το miR θα μπορούσε ως εκ τούτου να συμβάλει στην καρκινογένεση μέσω της αναστολής της p53-p21 /WAF1 οδού.

Δεν υπάρχουν πολλές δημοσιεύσεις σχετικά με τη λειτουργία των miR-549 (CHR15 στο

KIAA1199

), και να κανένας γνώσεις μας σε σχέση με καρκίνο του παχέος εντέρου. Είναι ενδιαφέρον, το γονίδιο μεταγραφή αυτό το miR εντοπίζεται στο

KIAA1199

γονίδιο. Αυτό το γονίδιο της αβέβαιης λειτουργία έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι έντονα πάνω ρυθμισμένα σε ορθοκολικό αδενώματα (n = 32) και τα καρκινώματα (η = 25) αναλύθηκαν σε μια μελέτη από Sabatés-Bellver

κ.ά.

. Η μελέτη επίσης δείχνουν ότι η έκφραση του 19 Wnt στόχων ήταν συσχετίζεται στενά με τα πάνω ρύθμιση του

KIAA1199

, και ότι η έκφραση σε φυσιολογικό βλεννογόνο περιορίστηκε σε κύτταρα στο κατώτερο τμήμα του κόλου κρυπτών [53], [ ,,,0],54]. Η υπερέκφραση του

KIAA1199

επιβεβαιώθηκε αργότερα για παχέος αδενώματα [55] και του γαστρικού καρκίνου [56]. Εάν

KIAA1199

και miR-549 είναι συν-μεταγράφονται, αυτό μπορεί να εξηγήσει τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του miR-549 βρέθηκε στη μελέτη μας. Επιπλέον, δεδομένου ότι η προς τα πάνω ρύθμιση φαίνεται να είναι μια πρώιμη εκδήλωση από προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες, το miR-549 θα μπορούσε ενδεχομένως να είναι ένα υποκατάστατο βιοδείκτη για την ανάπτυξη αδενώματος και τα πρώτα στάδια του αδενοκαρκινώματος. Αυτό θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω σε μεγαλύτερες μελέτες.

Μια μελέτη για επιγενετικώς σιγήσει Mirs στον καρκίνο του παχέος εντέρου βρέθηκε ότι το miR-1247 μεθυλιώθηκε στα κύτταρα HCT116. HCT116 και DLD1 κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με ένα miR-1247 μιμούνται το οποίο οδήγησε σε σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων και μεταβολική δραστηριότητα στις δύο κυτταρικές σειρές. κύτταρα DKO (HCT 116 κύτταρα διαγράφονται για το DNA μεθυλοτρανσφεράση) έκανε, ωστόσο, δεν μειώνουν την ανάπτυξη των κυττάρων όταν εισήχθη στο μιμούνται, αλλά προκάλεσε διαταραχή της κυτταρικής μετανάστευσης [57]. Ο ρόλος αυτού του miR παραμένει ασαφής, αλλά έχει υποτεθεί ότι λειτουργεί ως καταστολέας όγκου. Βρήκαμε αυτό το miR να είναι up-ρυθμίζονται στα αδενοκαρκινώματα, το οποίο θα μπορούσε να δείξει διαφορετικούς στόχους στις καθαρές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με εκείνη ενός οργανωμένου ιστού του όγκου.

Τέλος, υπάρχουν λίγα, εάν υπάρχουν, εκθέσεις σχετικά με τη λειτουργία και ρόλο στην παχέος αδενοκαρκινώματα από τις ακόλουθες Mirs πάνω ρυθμισμένα στη μελέτη μας: -105, -483-3p, -584, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -4326 -3180-3p και (Πίνακας 2).

όπως έχουμε περιλάμβανε όγκου νευροενδοκρινείς (ΝΕΤ) στη μελέτη αυτή, θα μπορούσαμε να επωφεληθούν από την ανάλυση αυτή ξεχωριστά, χρησιμοποιώντας μια παρόμοια στατιστική προσέγγιση ως προς τα αδενοκαρκινώματα. Παρά το γεγονός ότι, εργαζόμαστε εν μέρει, χωρίς επαναλήψεις, το εργαλείο DESeq μπορεί να χειριστεί αυτή την πρόκληση [25]. NET, είναι σπάνιες οι όγκοι που προέρχονται από νευροενδοκρινικά κύτταρα σε διαφορετικά σημεία του σώματος, συμπεριλαμβανομένης της γαστρεντερικής ιστοσελίδα. Υπάρχει μια αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης, εν μέρει λόγω της καλύτερης καταχώρησης και, ενδεχομένως, καλύτερα διαγνωστικά εργαλεία [58]. Ωστόσο, πολύ λίγες μελέτες έχουν εξετάσει την έκφραση του miR στη ΝΕΤ. Στη μελέτη μας, η καθαρή μετοχές μερικές σημαντικές Mirs με τα αδενοκαρκινώματα, αλλά αυτό που είναι πιο εντυπωσιακό είναι μερικά από τα μοναδικά και άκρως εκφράζεται Mirs (Πίνακας S2). Αυτά έχουν μεγάλες αλλαγές φορές σε σύγκριση με μη ζευγαρωμένα φυσιολογικούς ιστούς επίσης και μια υψηλότερη σχετική έκφραση σε σύγκριση με τα αδενοκαρκινώματα. Το πρότυπο έκφρασης του Mirs στην ΝΕΤ διαφέρει εκτενώς από την κανονική βλεννογόνο. Αυτό μπορεί φυσικά να οφείλεται εν μέρει στην ίδια νευροενδοκρινική ιστό ο οποίος είναι λειτουργικά και γενετικά διαφορετικό από φυσιολογικό επιθήλιο και στρώμα. Παρ ‘όλα αυτά, η προσδιορισμένη Mirs μπορεί ενδεχομένως να βοηθήσει στη διαφοροδιάγνωση μεταξύ κακοήθη νευροενδοκρινών κυττάρων του παχέος εντέρου και του φυσιολογικού βλεννογόνου (όπως υποδηλώνει δεδομένα μας), και πιθανόν μεταξύ καλοήθων νευροενδοκρινών κυττάρων και φυσιολογικό βλεννογόνο (δεν υπάρχουν στοιχεία). Το μέγεθος του δείγματος ενός σημαίνει ότι η καθαρή δεδομένα μπορούν να θεωρηθούν μόνο ενδεικτικά. Ωστόσο, κατά τη γνώμη μας, οι σημαντικές διαφορές στα σύνολα των διαφορικά ρυθμίζονται Mirs μεταξύ των δύο τύπων καρκίνων αξίζει να αναφερθεί. παρατήρηση μας δείχνει ότι μπορεί να είναι καρποφόρα να διερευνήσει περαιτέρω αυτούς τους δείκτες miR καθώς μπορεί να είναι χρήσιμο για τον καθορισμό της προέλευσης των χαμηλής διαφοροποίησης του παχέος εντέρου.

Μικροεκτομή του καρκινικού ιστού δεν ήταν το πρότυπο για μελέτες στο παρελθόν πραγματοποιηθεί. Ωστόσο, έχουμε εξετάσει την ιστοπαθολογική εξέταση των δειγμάτων ιστού, και εκτιμάται ότι τα ποσοστά όγκου και στρωματικά. Το ποσοστό του όγκου ήταν περίπου 67% κατά μέσο όρο, αρκετά πάνω από το μέσο όρο για μια υποομάδα της κλάσης KAM (n = 139), η οποία ήταν 49% +/- 24% (τα δεδομένα δεν έχει δημοσιευθεί). Δυστυχώς, ένα δείγμα στο σύνολο δεδομένων ήταν παρεκκλίνουσα με ποσοστό χαμηλότερο του όγκου (Πίνακας 1), και αυτό είναι μια αδυναμία της μελέτης μας. Ιδανικά, τα δείγματα της μελέτης θα έπρεπε να έχει μια πιο ομοιογενή πληθυσμό όγκου. Υπάρχει, ωστόσο, μια έννοια που η κανονική βλεννογόνος αποτελείται κυρίως των επιθηλιακών κυττάρων και στρώματος. Κατά τη σύγκριση του ιστού του όγκου και φυσιολογικό βλεννογόνο, είμαστε κυρίως συγκρίνοντας καρκινικά κύτταρα (με ποικίλες ποσότητες στρώμα) με επιθηλιακά κύτταρα και στρώμα στην κανονική βλεννογόνο. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι η επίδραση μιας ποσοστιαίας πολύ χαμηλό όγκο θα είναι ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.

Σε πειράματα υψηλής απόδοσης (είτε συστοιχία ή αλληλουχίας βάση), είναι σύνηθες να εκτελέσει ένα πείραμα επικύρωσης χρησιμοποιώντας άλλη τεχνολογία. Πραγματοποιήσαμε μια τέτοια πείραμα επικύρωση χρησιμοποιώντας ένα ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για την επιλεγμένη Mirs και δείγματα ιστών (Σχήμα S1). Τα αποτελέσματα δείχνουν μια θετική συσχέτιση μεταξύ των δύο διαφορετικών τεχνολογικών πλατφορμών. Υπάρχουν επτά Mirs για τα οποία οι φορές οι αλλαγές είναι πολύ διαφορετική στην επικύρωση. Αυτές οι διαφορές στην φορές αλλαγή μεταξύ της τεχνολογίας πλατφόρμες δεν είναι ασυνήθιστο, όπως αποδεικνύεται από μια μελέτη της διαφορικής έκφρασης miR χρησιμοποιώντας τις πλατφόρμες μικροσυστοιχιών Affymetrix, Agilent, και Illumina, καθώς και ποσοτική PCR και αλληλούχιση υψηλής απόδοσης [28]. Αν και ανησυχίας, η παρατήρηση αυτή δεν αναιρεί τα αποτελέσματα που επιτεύχθηκαν. Πράγματι, έχει παρατηρηθεί ότι οι μέθοδοι για miR προφίλ γονιδιακής έκφρασης είναι έντονα προκατειλημμένη προς ορισμένες Mirs, εμποδίζοντας ο ακριβής προσδιορισμός της απόλυτους αριθμούς. Η παρατηρούμενη πόλωση έντονα καθορίζεται από τη μέθοδο που χρησιμοποιείται για την παρασκευή της βιβλιοθήκης. Ωστόσο, δεδομένου ότι οι προκαταλήψεις είναι συστηματικές και εξαιρετικά αναπαραγώγιμη για μία δεδομένη τεχνολογία, προφίλ γονιδιακής έκφρασης είναι κατάλληλη για τον προσδιορισμό σχετικών διαφορών έκφραση μεταξύ των δειγμάτων όσο διάστημα η ίδια τεχνολογία που χρησιμοποιείται σε όλη δειγμάτων [23]. Στη μελέτη μας, εξαιτίας των μεγάλων ποσοτήτων cDNA που απαιτούνται για την ανάλυση της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης, δεν έχουν επαρκή cDNA διαθέσιμο για την ποσοτική επικύρωση PCR για όλους τους ασθενείς. Ως εκ τούτου, έπρεπε να κάνει ένα δεύτερο γύρο της εκχύλισης RNA από γειτονικούς ιστούς όπου αυτά είναι διαθέσιμα. Κάθε ετερογένεια μεταξύ των παρακείμενων ιστών μπορεί να προσθέσει στην μεταβλητότητα που παρατηρήθηκε στα δεδομένα επικύρωσης (Σχήμα S1).

Αυτή η μελέτη είναι σε γνώση μας μοναδικό σε αυτό το παγκόσμιο αλληλουχίας υψηλής απόδοσης έχει χρησιμοποιηθεί για να χαρακτηρίσει την έκφραση του miR σε ζεύγη ορθοκολικό καρκινικό ιστό και παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. Αν και προκαταρκτικά, πιστεύουμε ότι τα αποτελέσματα μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ισχυρό σύνολο εκπαίδευσης για μια μεγαλύτερη μελέτη κοόρτης. Αξιοποιήσαμε ζεύγη και μη αξιόπιστη στατιστική, και εντόπισε 37 Mirs που απορυθμίζεται στις επτά περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος και στις δύο στατιστικές προσεγγίσεις? 19 κάτω-ρυθμίζονται και 18 up-ρυθμίζεται. ολοκληρωμένη μελέτη των διαφορικά εκφρασμένων Mirs μας επιβεβαιώνει κάποια υπάρχοντα ευρήματα. Ανακαλύψαμε επίσης 16 απορυθμισμένη Mirs οποία, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχουν προηγουμένως συσχετιστεί με ορθοκολικό καρκινογένεση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτοί μπορεί να είναι σημαντικοί ρυθμιστές και ότι περαιτέρω έρευνες για πιθανούς στόχους miR και την πιθανή χρήση τους ως τα προγνωστικά ή προγνωστικούς δείκτες δικαιολογημένη. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γονίδιο miR-549 που βρίσκεται στο

KIAA1199

που η ίδια έχει προηγουμένως συνδέονται με τη ρύθμιση στην παχέος αδενωμάτων και καρκινωμάτων. Εάν το miR είναι συν-μεταγράφεται, θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός υποκατάστατος δείκτης για έγκαιρη διάγνωση της νόσου σε σωματικά υγρά ή περιττώματα. Η μελέτη, επίσης, να ρίξει νέο φως στο δυναμικό βιοδείκτες miR που φαίνεται να είναι ειδικά για τα δίχτυα στο παχύ έντερο.

επιλέχθηκαν Υλικά και Μέθοδοι

Cohort

Οκτώ ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου από μια νορβηγική ορθοκολικό καρκίνο ομάδα (

Kolorectalcancer, ARV og miljø,

KAM) με βάση την ηλικία και το φύλο παραμέτρους. Όλοι οι ασθενείς ήταν άνδρες με μέσο όρο ηλικίας των 60 ετών. Όλα τα δείγματα ιστού εκχυλίστηκαν από χειρουργικά δείγματα. Η κανονική βλεννογόνος συλλέχθηκε σε ένα απομακρυσμένο τμήμα του εντέρου κοντά στα περιθώρια εκτομή. Τα δείγματα στη συνέχεια καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται σε καταψύκτη στους -80 βαθμούς Κελσίου. Επτά από τους ασθενείς επιβεβαιώθηκε ότι έχουν αδενοκαρκινώματα και μία χαρακτηρίστηκε ως νευροενδοκρινούς όγκου με ιστοπαθολογική εξέταση. Τα κλινικά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

RNA Εκχύλιση και Digital Sequencing

Ολικό RNA από τους ασθενείς εκχυλίστηκε από 10 κατεψυγμένες τομές 10 μm για όγκο και φυσιολογικό ιστό αντίστοιχα χρησιμοποιώντας το κιτ mirVana (Ambion, ΤΧ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μερικά δείγματα συγκεντρώθηκαν σε μία φυγόκεντρο κενού για να ληφθεί η αναγκαία συγκέντρωση 1 μg /μl. Η παρουσία των μικρών RNA επιβεβαιώθηκε σε Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, USA) χωρίς ένδειξη της υποβάθμισης κατά την αξιολόγηση OD αναλογία 260/280. Το αρχικό ποσό ήταν 10 μg ολικού RNA, και το πρωτόκολλο παρασκεύασμα διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Μικρές RNA απομονώθηκε από το συνολικό RNA σε μια 15% Novex ΤΒΕ-ουρίας PAGE γέλη. Το μέγεθος λωρίδα 18-30 νουκλεοτίδια (nt) περιοχή που αντιπροσωπεύει αποκόπηκε και κατακερματισμένη, RNA εκλούστηκε σε 0,3 Μ NaCl και καθαρίστηκε σε μία στήλη Spin Χ. Το 5′-προσαρμογέας συνδέθηκε επί 6 ώρες στους 20 ° C. Μικρό RNA με 5′-προσδεμένο προσαρμογέας απομονώθηκε σε 15% Novex PAGE ΤΒΕ-ουρίας γέλης (Invitrogen, CA, USA).