Αφηρημένο

EMT (επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης) είναι ζωτικής σημασίας για τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν επεμβατική φαινοτύπους. Σε Α549 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα, ΤΟΡ-β προκάλεσε EMT σε Smad-εξαρτώμενο τρόπο και TNF-α επιτάχυνε τη διαδικασία αυτή, όπως επιβεβαιώνεται από τη μορφολογία των κυττάρων, έκφραση δεικτών EMT, ικανότητα λύσης ζελατίνης και κυτταρική εισβολή. ΤΝΡ-α διέγειραν την φωσφορυλίωση της περιοχής συνδετήρα Smad2, και αυτό το αποτέλεσμα ήταν εξασθενημένος με αναστολή ΜΕΚ ή JNK οδό. Πλήρης ανάλυση της έκφρασης κατέρρευσε γονίδια διαφορικά ρυθμίζονται από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α, όπως κυτοκίνες, χημειοκίνες, αυξητικοί παράγοντες και ECM (εξωκυτταρικές μήτρες), υποδηλώνοντας την δραστική αλλαγή στα σήματα αυτοκρινή /παρακρινή καθώς και κυττάρου-προς-ECM αλληλεπιδράσεις. Ολοκληρωμένη ανάλυση των microRNA υπογραφή μας έδωσε τη δυνατότητα να προσδιορίσει ένα υποσύνολο των γονιδίων, πιθανώς ρυθμίζονται από microRNAs. Μεταξύ αυτών, επιβεβαιώσαμε ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη επαγωγή της miR-23a σε κυτταρικές σειρές πνευμονικού επιθηλίου, γονίδια στόχους των οποίων περαιτέρω προσδιορίζονται από προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Σε συνδυασμό με το προσεγγίσεις silico, προσδιορίσαμε HMGN2 ως μεταγενέστερος στόχος των miR-23a. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν μια σειρά από στοιχεία που αποδεικνύουν ότι οι επιδράσεις του TGF-β και TNF-α ήταν εν μέρει διαμεσολαβείται από microRNAs, και να ρίξει φως στην πολυπλοκότητα των μοριακών γεγονότων που προκαλούνται από τον TGF-β και TNF-α.

Παράθεση : Saito Α, Suzuki HI, Horie Μ, Ohshima Μ, Morishita Υ, Abiko Y, et al. (2013) Μια ολοκληρωμένη Profiling Έκφραση αποκαλύπτει γονιδίων στόχων του TGF-β και TNF-α Ενδεχομένως διαμεσολαβείται από Τα microRNAs σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (2): e56587. doi: 10.1371 /journal.pone.0056587

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30, Αυγ 2012? Αποδεκτές: 11 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από KAKENHI (επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας και επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ο πιο συχνός τύπος καρκίνου, η οποία προκαλεί το θάνατο περισσότερων από ένα εκατομμύριο ανθρώπους κάθε χρόνο. Κατανόηση των μοριακών γεγονότων που διέπουν επεμβατικές /μεταστατική εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών του καρκίνου του πνεύμονα. Μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) είναι ο διακόπτης διαφοροποίηση κατευθύνοντας τα επιθηλιακά κύτταρα να αποκτήσουν φαινοτύπους μεσεγχύματος, η οποία παίζει ρόλο κλειδί κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, καθώς και ο καρκίνος εισβολή /μετάσταση. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του ΕΜΤ είναι Ε-καδερίνης κατιούσα ρύθμιση και την επακόλουθη απώλεια του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις, η οποία σε συνδυασμό με την αυξημένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών συμπεριλαμβανομένων Ν-καντερίνης και βιμεντίνη. Επιπλέον EMT συνοδεύεται με κυτταρικές μορφολογικές αλλαγές από τη «κυβοειδές» σε «άξονα-όπως» εμφανίσεις, οι οποίες αντιστοιχούν σε αναδιοργάνωση της ακτίνης και cytoskeltal αλλαγές, που οδηγούν στην απόκτηση του ινοβλαστών-όπως μεταναστευτικών φαινότυπο [1], [2].

Μετασχηματισμός αυξητικός παράγοντας (TGF) -β παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της ΕΜΤ και παρουσιάζει πλειοτροπικές επιδράσεις της μέσω σύνδεσης σε υποδοχείς τύπου Ι (TβR-Ι) και τύπου II (TβR-ΙΙ). Μετά ετερομερές σχηματισμός συμπλόκου προσδέματος που επάγεται μεταξύ TβR-Ι και TβR-ΙΙ, TβR-Ι φωσφορυλιώνεται από TβR-ΙΙ και μεσολαβεί ειδική ενδοκυτταρική σηματοδότηση μέσω φωσφορυλίωσης του Smads υποδοχέα ρυθμιζόμενη (R-Smads: Smad2 και Smad3 για ΤΟΡ-β) . Η φωσφορυλιωμένη R-Smads αλληλεπιδρούν με Smad4 και μετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου ρυθμίζουν την μεταγραφή των γονιδίων στόχων [3], [4]. ΤΟΡ-β είναι συχνά υπερεκφράζεται σε ιστούς όγκων, και διευκολύνει την εξέλιξη του καρκίνου μέσω μιας ποικίλο ρεπερτόριο του όγκου-κυττάρου-αυτόνομα και ξενιστή-όγκου αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της βελτίωσης της κινητικότητας των κυττάρων και εισβολή, η οποία περιλαμβάνει τη διαδικασία της ΕΜΤ [5].

Συσσωρευμένα στοιχεία που ξετυλίγεται τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων φλεγμονώδεις αντιδράσεις προωθούν την εξέλιξη του όγκου [6]. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF) -α είναι ένα από τα πιο ισχυρά προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες που παράγονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Κατά τη διέγερση, ενεργοποιημένα ΙΚΚ (ΙκΒ κινάση) φωσφορυλιώνει αναστολέα ΝΡκΒ (ΙκΒ) και πυροδοτεί ταχεία αποδόμηση του μέσω πρωτεασώματος πρωτεόλυση, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του ΝΡκΒ, η οποία στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα και επάγει μια μυριάδα της έκφρασης γονιδίου που εμπλέκεται στην ανοσολογική απόκριση [7 ]. Η συμβολή του ΝΡκΒ σηματοδοσίας προς την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου είναι σαφώς τεκμηριωμένη, και πολλά στοιχεία καταδεικνύουν ότι ο ΤΝΡ-α ή /και σηματοδότηση ΝΡκΒ παίζει ένα ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της ΕΜΤ [8], [9], [10 ].

μη κωδικοποιητικές microRNAs (miRNAs) προσελκύουν αυξανόμενη προσοχή ως βασικά συστατικά της κυτταρικής σηματοδότησης, οι οποίες ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης πολλαπλών πρωτεϊνών, κυρίως με δέσμευση στο 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) των στόχων. έχουν σημαντικούς ρόλους για miRNAs δειχθεί στην πρόοδο του όγκου με διαμόρφωση κυτταρικής διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού, εισβολή, και μετάσταση. MicroRNA-200 (MIR-200) και miR-205 είναι κρίσιμα εμπλέκονται στη διατήρηση του φαινοτύπου των επιθηλιακών κυττάρων και καταστέλλονται από τον TGF-β [11]. Είναι, επίσης, αναφερθεί ότι miR-21 και miR-31 είναι συνεργικά επάγεται από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α, οι οποίες διευκολύνουν την προσβολή καρκινικών κυττάρων [12].

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ο ΤΝΡ-α ενισχύει ΤΟΡ β μεσολάβηση EMT στα πνευμονικά επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου /[13], [14], [15], υποδηλώνοντας τις πιθανές crosstalks μεταξύ αυτών των σημάτων. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τις μοριακά γεγονότα πώς αυτά τα σήματα ενορχηστρωμένες να διαμορφώνει EMT. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι ο ΤΟΡ-β επάγει ΕΜΤ σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 πνεύμονα [16], που φιλοξενούν ένα ενεργοποίησης μετάλλαξη Κ-ras και σχηματίζουν έναν όγκο με καλά διαφοροποιημένο ιστολογία αδενοκαρκινώματος όταν υποδόρια ένεση σε ανοσοκατεσταλμένοι ποντικούς [17], [18] . Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν ΕΜΤ διαμεσολαβείται από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α σε κύτταρα Α549. Σε αναζήτηση των γονιδίων στόχων και των miRNAs, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ολοκληρωμένη έκφραση σε συνδυασμό με τον προσυμπτωματικό έλεγχο silico. Αυτά τα δεδομένα οριοθετείται υποσύνολα γονιδίων διαφορικά ή συνεργατικά ρυθμίζονται από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α, και προσδιορίζονται miR-23a ως στόχος miRNA του ΤΟΡ-β. Οι αναλύσεις αυτές υπονοείται περαιτέρω την πιθανότητα ότι ένα υποσύνολο των γονιδίων στόχων του ΤΟΡ-β θα μπορούσε να ρυθμίζεται από miRNAs, ρίχνοντας φως στην πολυπλοκότητα των μοριακών γεγονότων που προκαλείται από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

ΤΟΡ-β1 και TNF-α αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ), και ήταν χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση 5 ng /ml και 10 ng /ml, αντίστοιχα. Anti-Smad2, φωσφορυλιωμένη (φωσφο) Smad2 σε Ser 245/250/255, φωσφο-Smad2 σε Ser 465/467, Smad3, φωσφο-Smad3 σε Ser 423/425, Smad4, ΕΚΚ, φωσφο-ΕΚΚ, p38, φωσφο- ρ38, φωσφο-c-Jun και Ε-καδερίνης αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). αντίσωμα αντι-N-cadherin ήταν από BD Pharmingen (Transduction Laboratories, Lexington, KY). Αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα ήταν από τη Sigma-Aldrich. αντίσωμα αντι-HMGN2 ήταν από την Millipore (Darmstadt, Γερμανία). LY-364947 (TβR-Ι αναστολέα) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 3 μΜ. U0126 (ΜΕΚ 1/2 αναστολέας), SP600125 (αναστολέας JNK) και SB203580 (αναστολέας της p38) χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 25 μΜ.

Cell Culture

αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κύτταρα [19] ήταν προικισμένος από τη Cell Resource Center Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ινστιτούτο Ανάπτυξης, γήρανση και ο καρκίνος, το Πανεπιστήμιο Tohoku (Σεντάι, Ιαπωνία). ΝΟΙ-Η441 (Η441) κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονος και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ ήταν από την American Type Culture Collection. Τα μετασχηματισμένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (κύτταρα BEAS2B) αγοράστηκαν από την Summit Pharmaceuticals International (Tokyo, Japan). Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus, Tokyo, Japan). Κυττάρων κυκλικότητα μετρήθηκε με ΝΙΗ Image J λογισμικού.

Η επιμόλυνση

αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για siRNA διαμόλυνση σε κύτταρα Α549, και η τελική συγκέντρωση του siRNA ήταν 20 ηΜ. Ανθρώπινα Smad4 siRNA (Stealth RNAi VHS41118) και αρνητικό siRNA ελέγχου αγοράστηκαν από την Invitrogen. Τα διαμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες και σπάρθηκαν με την ίδια πυκνότητα κυττάρων, που ακολουθείται από επώαση με ΤΟΡ-β1 ή /και ΤΝΡ-α. Για να αξιολογηθεί η επίδραση του miR-23a, 10 ηΜ συνθετικό πρόδρομο miR-23a (προ-miR-23a) ή Cy3-επισημασμένο αρνητικό έλεγχο (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) διαμολύνθηκε σε κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης κρίνεται από φθορισμό Cy3 ήταν περισσότερο από 95%, όπως επιβεβαιώνεται με κυτταρομετρία ροής. Για την ανάλυση μικροσυστοιχίας, δείγμα RNA συλλέχθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Τα κύτταρα τέθηκαν σε πάγο και ξεπλένονται με PBS, μετά λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης για ανοσοκηλίδωση. Μετά από φυγοκέντρηση σε 15,000 rpm για 15 min, τα λύματα των κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά για περιεκτικότητα πρωτεΐνης με BCA κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης (Pierce, Rockford, IL) και ίσες ποσότητες των συνολικών πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε SDS-PAGE, που ακολουθήθηκε από ημίξηρο μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μη-ειδική πρόσδεση των πρωτεϊνών στη μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με επώαση με Amersham ECL Prime Παράγοντα Αναστολής (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween- 20). Οι ανοσοστυπώθηκαν πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με το σύστημα ECL blotting και σύστημα απεικόνισης /Ez-Capture LightCapture (ΑΤΤΟ, Tokyo, Japan).

Απομόνωση RNA και RT-PCR

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Η σύνθεση του cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση Mx-3000P (Stratagene, La Jolla, CA) και QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). επίπεδο έκφρασης ομαλοποιήθηκε με εκείνη της γλυκεραλδεϋδο-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

). Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S1. MicroRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Ώριμη miR-23a μεταγράφηκε αντίστροφα, και ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς TaqMan microRNA (Applied Biosystems). επίπεδο έκφρασης ομαλοποιήθηκε με εκείνη της U6.

ζυμογραφία ζελατίνης

ρυθμισμένα μέσα χωρίς FBS συλλέχθηκαν και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης αναμείχθηκαν με 4 Χ μη-αναγωγικό ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS-PAGE. Τα δείγματα εφαρμόστηκαν σε 10% (w /v) γέλη πολυακρυλαμιδίου εμποτισμένη με 1 mg /ml ζελατίνης (Sigma-Aldrich). Μετά την ηλεκτροφόρηση, το SDS απομακρύνθηκε από το πήκτωμα με έκπλυση 3 φορές για 20 λεπτά σε 2.5% Triton Χ-100 διαλύματος. Στη συνέχεια, οι πηκτές επωάστηκαν όλη τη νύκτα με ήπια ανάδευση στους 37 ° C σε ρυθμιστικό (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,6, 5 mM ΟαΟ

2, 200 mM NaCl, 0,02% Brij35). Το πήγμα κηλιδώνεται με 0,5% Coomassie blue R250 σε 50% μεθανόλη και 5% οξικό οξύ για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και μετέπειτα αποχρωματίζονται με διάλυμα 40% μεθανόλη-10% οξικό οξύ έως ότου οι ζώνες έγινε διαυγές.

εισβολή δοκιμασία

δοκιμασία κυττάρων εισβολή έγινε με χρήση κυτταρικής καλλιέργειας Εισάγει με μέγεθος πόρων 8 μm (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Η άνω επιφάνεια του θαλάμου επικαλύφθηκε με αυξητικό παράγοντα μειωμένη Matrigel (BD Biosciences). Τα κύτταρα Α549 (4 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) επαναιωρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού σπάρθηκαν στην άνω πλευρά του θαλάμου. Στην κάτω πλευρά του θαλάμου, το μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με προστέθηκε 10% FBS. ΤΟΡ-β1 ή /και ΤΝΡ-α προστέθηκαν σε αμφότερες τις πλευρές του θαλάμου. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του θαλάμου τρυψινοποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS και μετρήθηκαν με αιματοκυτταρόμετρο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τριπλούν και επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος του λόγου σε σύγκριση με τον έλεγχο, από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Έκφραση Profiling

προφίλ γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα GeneChip® Human Gene 1,0 ST Array (Affymetrix , Santa Clara, CA). Η επεξεργασία μικροσυστοιχία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση των 19.734 γονιδίων που παρακολουθήθηκε, και τα δεδομένα που εισάγονται στο λογισμικό GeneSpring GX (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) για την επιλογή της επαγόμενης και καταπιεσμένη γονίδια.

Η έκφραση του 1223 ώριμη microRNAs έχει περίγραμμα χρησιμοποιώντας miRCURY LNA Array Exiqon, η 6η γενιά (Filgen, Ναγκόγια, Ιαπωνία). Εν συντομία, RNA δείγματα ελέγχονται για την ακεραιότητά του RNA επί Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Wilmington, DE), επισημασμένα με Hy3, και υβριδοποιήθηκε. Διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας GenePix®4000B (Molecular Devices, Union City, CA), και οι εικόνες ψηφιοποιήθηκαν με Array-Pro Analyzer Ver. 4.5 (Media Cybernetic, Silver Spring, MD). Τέλος, τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν και εκφράζονται ως φορές αύξηση με την ανάλυση εργαλείο Ver Microarray Data. 3.2 (Filgen).

Ingenuity Pathways Ανάλυση (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε σχετικές μεθόδους με βάση τις λειτουργικές σχολιασμού του γονιδίου και είναι γνωστό μοριακές αλληλεπιδράσεις. Για την ολοκληρωμένη ανάλυση των miRNA και mRNA υπογραφές, το φίλτρο miRNA Στόχος το ΙΡΑ είχε προσληφθεί, το οποίο εξάγεται πιθανές αλληλεπιδράσεις miRNA-mRNA με βάση τις βάσεις δεδομένων, όπως TarBase, miRecords και TargetScan.

λουσιφεράσης Δοκιμασία

Pri-miR23a φορέα έκφρασης παράχθηκε με κλωνοποίηση του μικρού θραύσματος του pri-miRNA που περιέχει προ-miRNA και πλευρική αλληλουχία σε pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR (Invitrogen). Για το κατασκεύασμα αναφοράς, το τμήμα 3’UTR του γονιδίου της ανθρώπινης HMGN2 κλωνοποιήθηκε στον φορέα λουσιφεράσης ανταποκριτή. Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιούνται δίνονται στον Πίνακα S2. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με κάθε κατασκεύασμα ανταποκριτή με ή χωρίς PRI-miR23a φορέα έκφρασης χρησιμοποιώντας Fugene6 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). Η αναλογία της Renilla να λουσιφεράση πυγολαμπίδας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI).

Αποτελέσματα

ΤΝΡ-α Ενισχύει ΤΟΡ-β μεσολάβηση EMT σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

Πρώτα χαρακτηριζόμενη την επίδραση του ΤΟΡ-β και /ή ΤΝΡ-α σε ΕΜΤ σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Στη συρροή, τα κύτταρα Α549 εμφανίζεται πλακόστρωτα-όπως εμφανίσεις και θεραπεία TGF-β οδήγησε στην κυτταρική μορφολογική αλλαγή σε επίμηκες σχήμα. TNF-α ήταν επίσης ισχυρή στην επαγωγή κυτταρικής μορφολογική αλλαγή ατρακτοειδόμορφα εμφανίσεις. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, συνδιέγερση του ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α κατέληξε σε δραματική αλλαγή του σχήματος του κυττάρου σε παρόμοια με ινοβλάστη εμφανίσεις [14], το οποίο ήταν σαφώς διακριτό από εκείνα που παρατηρούνται στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΤΟΡ-β ή ΤΝΡ-α μόνο ( Σχήμα 1Α, το άνω πάνελ).

(Α) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με LY-364947 (TβR-Ι αναστολέα) ή να ελέγξει DMSO για 60 λεπτά, περαιτέρω καλλιεργήθηκαν με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 και /ή 10 ng /ml ΤΝΡ-α για 48 ώρες, και αναλύθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Bar: 50 μm. (Β) κυττάρων κυκλικότητα μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού J Εικόνα για την ποσοτικοποίηση των κυττάρων μορφολογική μεταβολή μετά την περιγραφείσα επεξεργασία. (C) Ανοσοκηλίδωση αναλύσεις Ε-καδερίνης και Ν-καντερίνης σε κύτταρα Α549 που διεγείρονται με ΤΟΡ-β1 ή /και ΤΝΡ-α για 48 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία LY-364947. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) ζυμογραφία ζελατίνης. Α549 κύτταρα που κατεργάζονται όπως περιγράφεται καλλιεργήθηκαν με μέσο ελεύθερο ορού για επιπλέον 48 ώρες. Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και η ίδια ποσότητα πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκε. πέψη Ζελατίνη από ενεργοποιημένα ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 οπτικοποιήθηκε με χρώση με Coomassie blue. (Ε) δοκιμασία κυττάρων εισβολή. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μέσα από τα ένθετα καλλιέργειας επικαλυμμένα με Matrigel θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και παρουσιάστηκαν τα μέσος όρος σχετικές αναλογίες από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος: SD. *

P

& lt?. 0.05 (t-test του Student)

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της TβR-Ι κινάσης αναστολέα, LY-364947. Ο αποκλεισμός της ενδογενούς σηματοδότησης ΤΟΡ-β με LY-364947 είχε σαν αποτέλεσμα ομοιόμορφα κυβοειδή μορφολογία των κυττάρων, και η επίδραση της εξωγενούς ΤΟΡ-β ήταν σαφώς καταργήθηκε με την παρουσία LY-364947. Από την άλλη πλευρά, ο TNF-α με τη μεσολάβηση κυττάρων μορφολογική μεταβολή παρατηρήθηκε ακόμη, αν και σε μικρότερο βαθμό, στα κύτταρα προκατεργάστηκαν με LY-364947, ενδεικτικό του αποτελέσματος του ΤΝΡ-α μόνη που ασκείται στην απουσία ενδογενούς ΤΟΡ-β σηματοδότηση (Εικόνα 1Α, κάτω πάνελ).

Αυτές οι μορφολογικές αλλαγές ποσοτικοποιήθηκαν μέσω μέτρησης της κυτταρικής κυκλικότητας (Σχήμα 1Β). Στα κύτταρα συνδιεγέρθηκε με ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α, κύτταρο κυκλικότητα ήταν σημαντικά μειωμένη, γεγονός που υποδηλώνει την συνεργική επίδραση στην κυτταρική μορφολογία. Με την παρουσία του LY-364947, τα αποτελέσματα τους ήταν ως επί το πλείστον αναστέλλεται, πράγμα που συνεπάγεται την κρίσιμη συνεισφορά του ΤΟΡ-β στην παρατηρούμενη συνεργική επίδραση.

Η διαδικασία της ΕΜΤ συνοδεύεται από ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης και προς τα πάνω ρύθμιση του Ν -cadherin, η οποία έχει ονομαστεί ως διακόπτης cadherin [1], [2]. Στα ακόλουθα πειράματα, εξετάσαμε την έκφραση Ε-καδερίνης και Ν-cadherin, ως δείκτες επιθηλιακής και μεσεγχυματικής, αντίστοιχα. έκφραση Ε-καντερίνης ως επί το πλείστον καταργήθηκε με επεξεργασία TGF-β, ενώ TNF-α μόνο εμφανίζεται μια οριακή επίδραση στο E-cadherin προς τα κάτω ρύθμιση σε επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 1Γ). Συνεπής με την αλλαγή στην έκφραση Ε-καδερίνης, Ν-καντερίνης ρυθμίζεται αυξητικά με θεραπεία με ΤΟΡ-β ή ΤΝΡ-α. Επιπλέον, σύμφωνα με τη δραματική αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία, ΤΝΡ-α αύξησε την επίδραση του ΤΟΡ-β επί δεικτών επιθηλιακά /μεσεγχυματικά. Η επίδραση του ΤΟΡ-β επί της έκφρασης Ε-καδερίνης /N-cadherin ανεστάλη με LY-364947 ενώ TNF-α διαμεσολαβούμενη αυξητική ρύθμιση του Ν-καδερίνης παρατηρήθηκε επίσης ανεξάρτητα από LY-364947 θεραπεία.

EMT συνοδεύεται με ενίσχυση των δραστηριοτήτων πρωτεάσης που διευκολύνουν αποικοδόμηση της βασικής μεμβράνης και εξωκυτταρικές μήτρες (ECM) που περιβάλλει τα κύτταρα του όγκου, η οποία είναι κρίσιμη για την εισβολή όγκου /μεταστάσεως. Για την ανάλυση πρωτεολυτικών δραστηριοτήτων των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) στα κύτταρα σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β και /ή ΤΝΡ-α, εκτελέσαμε ζυμογραφία ζελατίνης (Σχήμα 1 D). ΤΟΡ-β αύξησε την δραστικότητα του ΜΜΡ-2, ενώ ο ΤΝΡ-α ενισχυμένη εκείνη της ΜΜΡ-9. Αξιοσημείωτα, συνδιέγερση με ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α προωθείται δραστικά τις δραστηριότητες τόσο ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, προτείνοντας την συνεργική επίδραση για την ενίσχυση των δραστηριοτήτων των ΜΜΡ. Με την παρουσία του LY-364947, η επίδραση του ΤΟΡ-β ήταν σαφώς αναστέλλεται, ενώ η επίδραση του ΤΝΡ-α για την ενίσχυση της δραστικότητας ΜΜΡ-9 παρατηρήθηκε ακόμη αν και σε μικρότερο βαθμό, με την απουσία του ενδογενούς σηματοδότησης ΤΟΡ-β.

Για να εξεταστεί η λειτουργική πτυχή της EMT, πραγματοποιήσαμε ανάλυση εισβολή, η οποία χρησιμοποιεί θαλάμους επικαλυμμένα με Matrigel, μιμούμενη τη βασική μεμβράνη. ΤΟΡ-β ή θεραπεία TNF-α κατέληξε σε μετρίως αυξημένο αριθμό εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια των θαλάμων, ενώ συνδιέγερση με ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α οδήγησε σε αυξημένη επεμβατική ικανότητα, σε συμφωνία με τις ανωτέρω παρατηρήθηκαν αλλαγές (Εικόνα 1Ε). TGF-β θεραπεία απέτυχε να ενισχύσει επεμβατική ικανότητα τόσο ισχυρή όσο οι αλλαγές στους δείκτες EMT, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές στους δείκτες δεν συνδέονται άμεσα με τα κινητά εισβολής. Η διαδικασία της εισβολής περιλαμβάνει βελτιωμένη κινητικότητα των κυττάρων και πρωτεολυτικών δραστηριοτήτων. Μαζί με τα αποτελέσματα της ζυμογραφία ζελατίνης, η αυξημένη ικανότητα επεμβατικές στα κύτταρα συνδιεγέρθηκε με ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α φαίνεται να σχετίζονται με την αυξημένη δραστηριότητα των ΜΜΡ.

Στο σύνολό τους, ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη EMT ήταν σαφώς βελτιωμένη από TNF-α, όπως κρίνεται από την μορφολογία του κυττάρου, δείκτες EMT, λύση ζελατίνη και κυτταρική εισβολή. TNF-α και μόνο θα μπορούσε επίσης να επάγει μέρος αυτών των αλλαγών, ακόμη και με την παρουσία του LY-364947, όπως Ν-καντερίνης προς τα πάνω ρύθμιση και ενεργοποίηση ΜΜΡ-9. Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησε να διερευνήσει τις πιθανές crosstalks μεταξύ TGF-β και TNF-α, και μοριακά γεγονότα που ρυθμίζουν EMT σε κύτταρα Α549.

TGF-β-μεσολάβηση EMT είναι Smad-εξαρτώμενη

Smads είναι η κύρια αισθητήριο της σηματοδότησης ΤΟΡ-β? Smad2 και Smad3 φωσφορυλιώνονται από TβR-Ι, και σχηματίζουν σύμπλοκα με Smad4. Αυτά τα συμπλέγματα συσσωρεύονται στον πυρήνα και ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων [20]. Εκτός Smad-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή, ΤΟΡ-β ενεργοποιεί άλλα καταρράκτες σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ΜΑΡΚ (ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση) οδών [21].

Για να εξεταστεί αν Smad μεσολάβηση σηματοδότηση εμπλέκεται στη ρύθμιση της ΕΜΤ σε Α549 κύτταρα, θα χτυπηθεί κάτω ενδογενή Smad4, η οποία συνήθως απαιτείται για την Smad μεσολάβηση μεταγραφική ρύθμιση. Η επιμόλυνση του siRNA σιγήσει αποτελεσματικά έκφραση Smad4 (Σχήμα 2Α, αριστερά), και περαιτέρω κατέστειλε την έκφραση των Smad-ρυθμιζόμενων γονιδίων στόχων του ΤΟΡ-β, όπως Smad7 και ΡΑΙ-1 (αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1, επίσης γνωστή ως

SERPINE1

) (Σχήμα 2Β). Σε αυτή τη ρύθμιση, ο ΤΟΡ-β απέτυχε να ρυθμίζουν προς τα κάτω Ε-καδερίνης όπως κρίθηκε με ποσοτική RT-PCR (Σχήμα 2Α, δεξιά), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη EMT ρυθμίζεται κυρίως από Smad οδό. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με ανοσοαποτύπωση. ΤΟΡ-β απέτυχε να ρυθμίζουν προς τα κάτω Ε-καδερίνης ή ρυθμίζουν προς τα πάνω Ν-καντερίνης αποτελεσματικά ως έλεγχος siRNA επιμολυσμένα κύτταρα όταν ενδογενής Smad4 σίγησε (Σχήμα 2C).

(Α-Β) Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA για Smad4 ( si Smad4), ή αρνητική siRNAs ελέγχου (si NTC) και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα περαιτέρω καλλιεργήθηκαν με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 και /ή 10 ng /ml ΤΝΡ-α για 2 ώρες (Β) ή 24 ώρες (Α), και το RNA συλλέγεται. Ποσοτική PCR διεξήχθη για Smad4, Ε-καδερίνη, Smad7 και ΡΑΙ-1 κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. Έκφραση ομαλοποιήθηκε με εκείνη του GAPDH. Οι ράβδοι σφάλματος: SD. (Γ) Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά ΤΟΡ-β1 ή /και ΤΝΡ-α θεραπεία. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για Ε-καδερίνης, Ν-cadherin και Smad4. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

ΤΝΡ-α φωσφορυλιώνει Smad2 Linker περιοχή

R-Smad και Smad4 περιέχουν συντηρημένες Ν-τερματικό MH1 και C-τελικές περιοχές MH2, συνοδευτικά το συνδετικό τμήμα. Που επάγεται με συνδέτη αλληλεπίδραση του R-Smads με ενεργοποιημένο αποτελέσματα TβR-Ι σε άμεση φωσφορυλίωση των Ο-τερματικών SSXS μοτίβο [20], η οποία είναι το κλειδί περίπτωση ενεργοποίησης Smad. Επιπλέον, άλλες οδοί κινάση ρυθμίζει περαιτέρω Smad σηματοδότησης μέσω φωσφορυλίωσης της περιοχής συνδετήρα του R-Smads [21], [22]. Εκτός ΝΡκΒ σηματοδότηση, ΤΝΡ-α είναι γνωστό ότι προκαλεί μονοπάτια ΜΑΡΚ, οι οποίες αποτελούνταν από τρία υπο-οικογένειες, δηλαδή εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (Erk) 1 και 2, p38 ΜΑΡΚ και η c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK).

Για να διερευνήσουν τις δυνατότητες διαμόρφωσης των Smad σηματοδότησης από τον TNF-α, ερευνήσαμε την φωσφορυλίωση των C-τερματικό ή συνδετήρας περιοχές του R-Smads. ΤΟΡ-β προκάλεσε έντονα φωσφορυλίωση Smad2 και Smad3 C-τερματικές περιοχές ενώ TNF-α δεν έδειξε καμία επίδραση. Από την άλλη πλευρά, ο TNF-α διέγερση οδήγησε σε φωσφορυλίωση της περιοχής συνδετήρα του Smad2, ανεξάρτητα από ΤΟΡ-β διέγερση (Εικόνα 3Α).

(Α) κύτταρα Α549 διεγέρθηκαν με ΤGF-β1 και /ή TNF-α για 60 λεπτά και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε για το σύνολο Smad2, φωσφορυλιωμένη Smad2 (περιοχή συνδετήρα: Ser 245/250/255), φωσφορυλιωμένο Smad2 (C-τελική περιοχή: Ser 465/467), το συνολικό Smad3, φωσφορυλιωμένη Smad3 (C- τερματική περιοχή: Ser 423/425). (Β) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με DMSO ή χημικών αναστολέων (LY-364947, U0126, SP600125 και SB203580) για 60 λεπτά, ακολουθούμενη από διέγερση ΤΝΡ-α. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για Smad2, φωσφορυλιωμένη Smad2 (περιοχή συνδετήρα: Ser 245/250/255), Erk, φωσφορυλιωμένη Erk, ρ38, φωσφορυλιωμένο ρ38 και φωσφορυλιωμένη c-Jun. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Στη συνέχεια περαιτέρω επιδίωξε να διευκρινίσει ποια κινάσης εμπλέκεται στην ΤΝΡ-α με τη μεσολάβηση φωσφορυλίωση της περιοχής συνδετήρα Smad2, τη χρήση χημικών αναστολείς όπως LY-364947, U0126 , SP600125 και SB203580 (Σχήμα 3Β). διέγερση ΤΝΡ-α οδήγησε σε φωσφορυλίωση της Erk, ρ38 και c-Jun, ενός υποστρώματος της JNK. διέγερση ΤΝΡ-α προκάλεσε επίσης φωσφορυλίωση του συνδετήρα του Smad2 σε 30-120 λεπτά, φθάνοντας μια κορυφή στα 60 λεπτά. LY-364947 απέτυχαν να καταργήσουν αυτό το αποτέλεσμα, που δείχνει την επίδραση του ΤΝΡ-α ανεξάρτητη από TβR-Ι κινάσης. Από τους αναστολείς που δοκιμάστηκαν, TNF-α με τη μεσολάβηση Smad2 συνδέτη φωσφορυλίωσης καταργήθηκε με U0126, έναν αναστολέα ΜΕΚ που θα μπορούσε επίσης να καταργήσει τη φωσφορυλίωση της ERK, κατάντη υπόστρωμα ΜΕΚ. Ο αναστολέας JNK, SP600125 καταργηθεί φωσφορυλίωση του c-Jun, μεταγενέστερος υπόστρωμα της JNK, και μερικώς ανέστειλε Smad2 συνδετήρα φωσφορυλίωση. Ο αναστολέας ρ38 ΜΑΡΚ, SB203580 απέτυχε να επηρεάσει συνδετήρα φωσφορυλίωση Smad2 στην συγκέντρωση που φαίνεται να είναι αποτελεσματική σε προηγούμενες εκθέσεις.

Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ο ΤΝΡ-α προκαλεί φωσφορυλίωση της περιοχής συνδετήρα Smad2, που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν Smad-ρυθμιζόμενο γονίδιο μεταγραφής [22]. Αυτή η επίδραση φαίνεται να διαμεσολαβείται σε μεγάλο βαθμό από ΜΕΚ-ΕΚΚ μονοπάτι και πιθανώς JNK θα μπορούσε επίσης να παίξει ένα ρόλο, αν και σε μικρότερο βαθμό (Σχήμα 3Β).

Microarray Ανάλυση Εμφανίζει διαφορική γονιδιακή κανονισμού από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α α

Για να αποκτήσετε ολοκληρωμένη γνώσεις σχετικά με τις μεταγραφικές αλλαγές που συμβαίνουν κατά TGF-β ή /και τη θεραπεία TNF-α, προφίλ γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε. Σύνολο RNA δείγματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β και /ή ΤΝΡ-α για 2 ώρες ή 24 ώρες, και αναλύθηκαν περαιτέρω με ανάλυση μικροσυστοιχιών (Σχήμα 4Α). Οι μεταγραφές που προκαλούνται & gt? 1,5 φορές ή καταπιεσμένη & lt?. 0,67 φορές, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που δεν σχολιασμένη, εισήχθησαν στο αρχείο S1 και S2 αρχείου (τα δεδομένα σε 2 ώρες και 24 ώρες, αντίστοιχα)

(Α ) αναπαράσταση διάγραμμα διασποράς μεταγράφων στα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με ΤΟΡ-β1 ή /και ΤΝΡ-α για 2 ώρες ή 24 ώρες (Υ-άξονας), σε σύγκριση με εκείνα των μη διεγερμένων ελέγχου (Χ-άξονας). Οι μεταγραφές σχεδιάζονται χρησιμοποιώντας log2 κανονικοποιημένα δεδομένα. Το όριο των επιπέδων μεταγραφής ορίστηκε ως προκαλούμενη & gt? 2,0-φορές ή καταπιεσμένη & lt? 0,5-φορές, και ενδείκνυται σε κάθε διάγραμμα διασποράς. διάγραμμα (Β) Venn που απεικονίζει την αλληλεπικάλυψη μεταξύ των γονιδίων ρυθμίζεται αυξητικά (Up) ή μειωτικά (Κάτω) από τον TGF-β1 και /ή θεραπεία του ΤΝΡ-α για 2 ώρες ή 24 ώρες. Το όριο των επιπέδων μεταγραφής ορίστηκε ως προκαλούμενη & gt? 2,0-φορές ή καταπιεσμένη & lt? 0,5 ​​φορές. Οι αριθμοί δείχνουν τον αριθμό των σχολιασμένη γονιδίων. οικόπεδο αναπαράσταση (C) διασπορά του ώριμου miRNAs στα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με ΤΟΡ-β1 ή /και ΤΝΡ-α για 24 ώρες (Χ-άξονας), σε σύγκριση με εκείνα των μη διεγερμένων ελέγχου (Υ-άξονας). Το όριο των επιπέδων των miRNAs ορίστηκε ως προκαλούμενη & gt? 2,0-φορές ή καταπιεσμένη & lt? 0,5-φορές, και ενδείκνυται σε κάθε διάγραμμα διασποράς. (Δ) Ποσοτική RT-PCR για τις ώριμες miR-23a. Α549, Η441 και BEAS2B κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 για 24 ώρες. Έκφραση ομαλοποιήθηκε με εκείνη της U6. . Οι ράβδοι σφάλματος: SD

Η

Για την περαιτέρω ανάλυση, θέσαμε το όριο των επιπέδων μεταγραφής ως προκαλούμενη & gt? 2,0-φορές ή καταπιεσμένη & lt? 0,5-φορές, και αποκλείονται σχολιαζομένων μεταγραφές. Έτσι προσδιορίσαμε γονίδια με τροποποιημένη έκφραση, σε σύγκριση με μη διεγερμένα ελέγχου, σε 3 συγκριτικές σειρές, δηλαδή ΤΟΡ-β που διεγείρεται, TNF-α-διεγερμένα και ομάδες TGF-β /ΤΝΡ-α-διεγερμένα (Σχήμα 4Β).

Ως μια συνολική τάση, ΤΟΡ-β-ρυθμιζόμενων γονιδίων και TNF-α-ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό αποκλειστική, εμφανίζοντας απόκλιση ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής. Επιπλέον, ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια εντοπίστηκαν πολύ περισσότερο από ό, τι εκείνες που ρυθμίζεται προς τα κάτω. Τα γονίδια που προκαλείται από ΤΝΡ-α ήταν πιο εμφανή από ΤΟΡ-β σε 2 ώρες, ενώ ο αριθμός των γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα πάνω από τον TGF-β ήταν πολύ μεγαλύτερη στις 24 ώρες σε σύγκριση με εκείνες στις 2 ώρες, ή εκείνα από TNF-α. Στις 24 ώρες, υπήρχε ένα μέρος των γονιδίων τα οποία ήταν άνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη με ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α συνδιέγερσης, αλλά όχι οποιοδήποτε από αυτά.

Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε τα δημοσιευμένα σύνολα δεδομένων των μικροσυστοιχιών, οι οποίες ήταν πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα Α549 που διεγείρονται με ΤΟΡ-β [23], [24]. Θεωρώντας επαγωγή & gt?. 2.0 φορές ως σημαντική, εξάγαμε δυναμικό γονιδίων στόχων ΤΟΡ-β συνήθως προκαλείται σε τρεις ανεξάρτητες μελέτες, δηλαδή 17 γονίδια σε 2 ώρες, και 129 γονίδια στις 24 ώρες, οι οποίες φαίνονται στον S3 File

Υποσύνολα Genes διαφορικά ή συνεργατικά Ρυθμίζεται από ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α

Αρκετοί παράγοντες μεταγραφής έχουν εμπλακεί στην μεταγραφική καταστολή της Ε-καδερίνης, συμπεριλαμβανομένων των

SNAI1

(σαλιγκάρι),

SNAI2

(Slug),

ZEB1

,

ZEB2

και

TWIST1

[25], [26]. Από αυτές,

SNAI1

ταχέως επάγεται από ΤΟΡ-β στις 2 ώρες, ενώ ο ΤΝΡ-α μάλλον κατέστειλε, υπονοώντας των διαφορικών μηχανισμών για τη ρύθμιση EMT. Στις 24 ώρες, Ε-καδερίνης (

Cdh1

) ήταν σαφώς μειωτικά από τον TGF-β (0,27 φορές), ενώ η κατασταλτική δράση του ΤΝΡ-α ήταν μέτρια (0,78 φορές). Σύμφωνα, ΤΟΡ-β και ΤΝΡ-α απορυθμίζεται την έκφραση της Ν-καδερίνης (

CDH2

) έως 2,32 φορές και 1,47 φορές αντίστοιχα. Η συνεργική δράση του TGF-β και TNF-α παρατηρήθηκε επίσης όσον αφορά τη μεταγραφική ρύθμιση του

Cdh1

και

CDH2

, σύμφωνα με τα αποτελέσματα στο Σχήμα 1.

Περαιτέρω, τα γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω πάνω από 3,0 φορές σε 2 ώρες ή 24 ώρες, έγιναν υποταξινομούνται και παρατίθενται στον πίνακα 1 και 2, σύμφωνα με τις γνωστές λειτουργίες. Ως οξεία απόκριση στις 2 ώρες, ΤΝΡ-α ισχυρώς προκάλεσε μια σειρά από κυτοκίνες /χημειοκίνες όπως

CCL2

(MCP-1),

CCL5

(RANTES),

CCL20

,

CXCL1

,

CXCL8

(IL8),

IL1A

,

IL1B

και

IL6

. Σηματοδότησης συστατικά του TNF-α-NFκB οδός επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω, συμπεριλαμβανομένων

TNF

,

ΤΚΑΡ1

,

NFKB1

,

NFKBIA

και

NFKBIE

. Επιπλέον, μόρια κυτταρικής προσκόλλησης όπως

VCAM1

και

ICAM1

προκλήθηκαν. Σε 2 ώρες μετά τη διέγερση, ΤΟΡ-β επαγόμενη περιορισμένο αριθμό γονιδίων που περιλαμβάνουν τις γνωστές άμεσοι στόχοι όπως

Smad7

και

HEY1

. Στις 24 ώρες, ο ΤΟΡ-β διέγερση οδήγησε σε αυξημένη έκφραση διαφόρων γονιδίων κατηγοριοποιούνται ως (i) ρυθμιστής μικρών ΟΤΡάσης, (ii) το μόριο κυτταρικής προσκόλλησης, και (iii) ECM, ενώ ο ΤΝΡ-α διέγερση έδειξε μόνο μικρές επιδράσεις σε αυτά.

η

Ρυθμιστικών Αρχών των μικρών ΟΤΡάσης περιλαμβάνονται παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEFs) όπως

RASGRP1

,

RASGRP3

,

RASGRF2

,

DOCK2

και

DOCK4

, που ενεργοποιούν Ras, Rac και Rap1, καθώς και τα μέλη της οικογένειας Rho GTPases όπως

RND1

και

RHOU

. Η κυτταρική κινητικότητα και μορφολογικές αλλαγές ρυθμίζονται από μικρές ΟΤΡάσες όπως οικογένειες Ras, Rac, Rho και Cdc42, η οποία μπορεί να διαμορφωθεί προς τα κάτω του ΤΟΡ-β σηματοδότηση [27].