Αφηρημένο

Κανονικό ανθρώπινο γονιδίωμα ΟΝΑ (Ν-DNA) και μεταλλαγμένου DNA (Μ-DNA) από Κ562 λευχαιμικά κύτταρα παρουσιάζουν διαφορετικά θερμοδυναμικών ιδιοτήτων και δεσμευτικές συγγένειες για αλληλεπίδραση με αντικαρκινικά φάρμακα? αδριαμυκίνη (ADR) και νταουνομυκίνη (DNM). Ισοθερμικό Θερμιδομέτρηση Θερμογραφήματα εκπροσωπούν τιτλοδότηση ADR /DNM με Ν-DNA και Μ-DNA για την ανάλυση καλύτερο είναι εφοδιασμένα με διαδοχική μοντέλο των τεσσάρων και τριών γεγονότα αντίστοιχα. Από Raman φασματοσκοπία έχει προσδιοριστεί ότι το Μ-ϋΝΑ είναι εν μέρει μετασχηματίζεται σε μία μορφή λόγω μεταλλάξεων και Ν-DNA επί της σύνδεσης των φαρμάκων πάρα πολύ διέρχεται μετάβαση σε μια μορφή DNA. Μια συσχέτιση της θερμοδυναμικής συνεισφοράς και διαρθρωτικά στοιχεία αποκαλύπτουν την παρουσία διαφορετικών δεσμευτικών εκδηλώσεων σε αλληλεπιδράσεις και DNA. Αυτά τα γεγονότα υποτίθεται ότι είναι αντιπροσωπευτικό του ανηλίκου συμπλοκοποίησης αυλάκι, αναπροσανατολισμός του φαρμάκου στο συγκρότημα, το DNA παραμόρφωση για να φιλοξενήσει τα φάρμακα και, τέλος, παρεμβολή. Δυναμική σκέδαση φωτός και ζήτα δυναμικό δεδομένα υποστηρίζουν επίσης διαφορές στη δομή και τη λειτουργία της πρόσδεσης του Ν και Μ DNA. Αυτή η μελέτη τονίζει ότι οι μεταλλάξεις μπορεί να εκδηλωθεί διαρθρωτικές αλλαγές στο DNA, το οποίο μπορεί να επηρεάσει τη σύνδεση της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων. Νέα γενιά φαρμάκων μπορεί να σχεδιασθεί η οποία αναγνωρίζει τη διαφορά στη δομή του DNA στα καρκινικά κύτταρα, αντί των βιοχημικών εκδήλωση τους

Παράθεση:. Ghosh D, Dey SK, Saha C (2014) Mutation Induced διαμορφωτικές αλλαγές σε Γονιδιωματικό DNA από Νεοπλασματικές Κ562 κύτταρα επηρεάσουν τους τρόπους σύνδεσης φαρμάκου-DNA. PLoS ONE 9 (1): e84880. doi: 10.1371 /journal.pone.0084880

Επιμέλεια: Heidar-Ali Tajmir-Riahi, Πανεπιστήμιο Quebect σε Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 30 του Σεπτέμβρη 2013? Αποδεκτές: 27 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Ghosh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Δρ. Chabita Saha είναι ευγνώμων στο Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας (DST), η κυβέρνηση της Ινδίας, για την οικονομική στήριξη. Η κα Debjani Ghosh υποστηρίζεται οικονομικά από το Συμβούλιο Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR), Ινδία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Βελτίωση θεραπευτική δράση και επιλεκτικότητα είναι ένας σημαντικός στόχος στην ανάπτυξη αντικαρκινικών παραγόντων. Οι γενετικές διαφορές μεταξύ των κανονικών κυττάρων και καρκινικών κυττάρων εκμετάλλευσης από αρκετές μοριακές στοχευμένες φάρμακα όπως imatinib και trastuzumab, τα οποία δείχνουν υποσχόμενη θεραπευτική δράση και χαμηλή τοξικές παρενέργειες [1], [2]. Τρέχουσα στόχευση γονιδίων θεραπευτικές στρατηγικές εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν σημαντικές προκλήσεις λόγω της επίκτητης αντοχής των ναρκωτικών και της γονιδιωματικής αστάθειας των καρκινικών κυττάρων [3] – [5]. Στόχευση τις μοναδικές βιοχημικές μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι εφικτή προσέγγιση σαν αυξημένη αερόβια γλυκόλυση, το οξειδωτικό στρες κ.λπ. Οι πολλαπλές γενετικές αλλοιώσεις (μεταλλάξεις) διαταράσσουν τη δομή του DNA στα καρκινικά κύτταρα και μπορούν επίσης να θεωρηθούν ως θεραπευτικός στόχος αντί των βιοχημικών εκδηλώσεων. Τέτοιες μεταβολές στην δομή του DNA ταυτοποιήθηκαν σε μυελοειδή λευχαιμικά κύτταρα (Κ562), όπου μία μερική διαμορφωτική μεταβολή από Β σε μία μορφή αναφέρθηκε από εμάς [6].

οξεία μυελογενή λευχαιμία είναι μια εξαιρετικά κακοήθης αιμοποιητικών όγκων αντιμετωπίζεται από ανθρακυκλίνη αντιβιοτικά, όπως αδριαμυκίνη (ADR) και νταουνομυκίνη (DNM). Αυτά τα φάρμακα αναστέλλουν τοποϊσομεράσες του DNA και στη συνέχεια να δεσμεύσουν την αντιγραφή του DNA που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο [7] – [9]. Η περιοχή παρεμβολή daunomycin είναι ειδική αλληλουχία, που προσδιορίζονται ως dCpGpATpCpG [10] – [12] Σύμφωνα με κρυσταλλογραφικές μελέτες ακτίνων Χ κατόπιν παρεμβολής εισάγεται σε δύο διαδοχικά ζεύγη βάσεων σε ορθές γωνίες το άγλυκο χρωμοφόρο του φαρμάκου στη μακρά διάσταση του DNA και ο δαουνοσαμίνης παραμένει στην ελάσσονα αύλακα (Εικ. 1) [13]. Το μεταλλαγμένο DNA Κ562 (Μ-DNA) έχει αλληλουχηθεί και έχει δέκα γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί με επίκτητη μεταλλάξεις σε σύγκριση με την κανονική ομόλογό (Ν-DNA) του [14]. Αυτές οι μεταλλάξεις επηρεάζουν την διαμόρφωση του DNA και να κάνει ADR και DNM δεσμευτικός πιο αποτελεσματική σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Οι αλλαγές στη δομή, όπως διαγνώστηκε με κυκλικό διχρωισμό (CD) και μετασχηματισμού Fourier υπερύθρων φασματοσκοπία (FTIR) που αποδίδεται σε αυτές τις μεταλλάξεις [6], [15]. Τέτοιες διαμορφωτικές αλλαγές και την επιρροή τους επί της σύνδεσης συγγένειες μπορούν να χαρακτηριστούν θερμοδυναμικά. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μια προσπάθεια προς αυτή την κατεύθυνση όπου οι διαρθρωτικές αλλαγές και ανεπίτρεπτες με φασματοσκοπία Raman και δυναμική σκέδαση φωτός μελέτες (DLS).

Χημική δομή της (α) αδριαμυκίνη (ADR) και (β) Νταουνομυκίνης (DNM ).

η

Θερμοδυναμική παρέχει ένα απαραίτητο συμπλήρωμα για δομικές μελέτες, οι οποίες από μόνες τους είναι σε θέση να προσδιορίσει το μοριακό δυνάμεις που κυβερνούν το σχηματισμό συμπλόκου. Υπάρχουν ένας αριθμός θερμοδυναμικών μελέτες που εξετάζουν μεταβολές στην ελεύθερη ενέργεια σχετικά με παρεμβολή των διαφόρων φαρμάκων και των παραλλαγών τους [16] – [19]. Από τις μελέτες αυτές τονίζεται ότι παρεμβολή δεν επιτυγχάνεται σε ένα βήμα, αλλά κερδίζει τη σταθερότητα μετά από διάφορες διαρθρωτικές κατευθύνσεις του φαρμάκου, καθώς και DNA. Σύμφωνα με Chaires et al. παρεμβολή της ανθρακυκλίνης φαρμάκου επιτυγχάνεται με έξω πρόσδεση ακολουθείται από παρεμβολή και ανασχηματισμός του φαρμάκου στη θέση παρεμβολής? Αυτό είναι παρόμοιο με τις θεωρητικές προβλέψεις του Wilhelm et al [20], [21]. Άλλοι, όπως Rizzzo et al. έχουν προτείνει πέντε βήμα κινητικές λειτουργίες [22]. Raman και δονητική φασματοσκοπία έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως ένα σημαντικό εργαλείο για τον χαρακτηρισμό της φύσης των συμπλοκοποίησης ναρκωτικά DNA και το αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων στην μετάβαση της δευτερογενούς δομής των νουκλεϊκών οξέων από Β σε μία μορφή [23] – [25]. DLS είναι βολική και αποτελεσματική μέθοδος προσδιορισμού μεγέθους των βιολογικά σημαντικών μακρομορίων [26], [27]. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση μετάβαση μέγεθος DNA επί του σχηματισμού συμπλοκών φαρμάκου-DNA. Η αποτελεσματική πυκνότητα φορτίου είναι μια κρίσιμη παράμετρος για τον προσδιορισμό της δομής και της μορφολογίας του DNA σε συμπλεγμένη κατάσταση και αυτό εκφράστηκε με ζήτα δυναμικό [27]. Κενά εξακολουθεί να υφίσταται σε σχέση θερμοδυναμικής δεδομένων με τις διαρθρωτικές αλλαγές και την εξουδετέρωση επιβάρυνση λόγω συμπλοκών και αυτό έχει αντιμετωπιστεί στην παρούσα μελέτη.

Πειραματικές Διαδικασίες

Ηθικοί

Συλλογή των ανθρώπινων δειγμάτων αίματος από υγιείς δότες εγκρίθηκε από Θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας της Δυτικής Βεγγάλης University of Technology και ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί από κάθε άτομο να ικανοποιήσει τις ηθικές ανησυχίες.

Παρασκευή DNA και τα ναρκωτικά λύσεις

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από κανονικό ανθρώπινο αίμα συλλέχθηκε από υγιείς εθελοντές αιμοδότες και επίσης από μυελοειδούς λευχαιμίας κυτταρική γραμμή Κ562 χρησιμοποιώντας QIAmp Blood Midi Kit αγοράστηκε από την QIAGEN (Hilden, Germany). Απομονωμένα DNA καθαρίστηκε περαιτέρω με μέθοδο φαινόλης χλωροφορμίου και λυοφιλοποιήθηκε [6], [15]. Λυοφιλιωμένη DNA διαλύθηκε σε 50 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6.5) όταν απαιτείται, και η καθαρότητα εξακριβώθηκε με την αναλογία του Α

260 /Α

280? δείγματα με την αναλογία μεταξύ του 1,8-2,0 θεωρήθηκαν καθαρό. Συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε με την απορρόφηση στα 260 nm και η μοριακότητα (ζεύγη βάσεων) υπολογίστηκε με βάση την ε

260 = 13.200 Μ

-1 εκατοστά

-1. Αδριαμυκίνη και δαουνομυκίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Chemicals Company (St. Louis, ΜΟ, USA). Τα διαλύματα αποθέματος των φαρμάκων παρασκευάσθηκαν σε 50 mM ρυθμιστικό φωσφορικού (ρΗ 6.5) και 5% DMSO χρησιμοποιήθηκαν όπως και όταν απαιτείται. Στοκ διαλύματα αραιώθηκαν περαιτέρω με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα με τα πειραματικά απαιτούμενες συγκεντρώσεις και αποθηκεύεται στους 4 ° C. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού αντιδραστηρίου. Όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα παρασκευάστηκαν σε νερό ΜίΙΙίΟ.

Ισοθερμική Τιτλοδότηση θερμιδομετρίας

DNA παρεμβολείς όπως ADR και DNM περιέχουν επίπεδους αρωματικούς χρωμοφόρα απαιτούν υψηλότερες συγκεντρώσεις για μετρήσεις ITC. Στις υψηλές συγκεντρώσεις που παρουσιάζουν είτε συνάθροιση ή αυτο-ένωση που εμποδίζουν την απόδοση της ITC. Όπως συνάθροιση ή αυτο συναρμολόγησης έχει αναφερθεί για μόρια όπως thiazotropsin και το DNA αποδείχθηκε από την ITC σχετικά με την αραίωση [28]. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα στα παρόντα πειράματα φαρμάκων σε χαμηλές συγκεντρώσεις φορτώθηκαν στο κύτταρο και DNA εγχύθηκε σε αυτό από τη σύριγγα (όπως ονομάζεται πείραμα Reverse-ITC) [29]. Θερμιδομετρικά τιτλοδοτήσεις διεξήχθησαν στους 25 ° C σε ένα μικροκαλορίμετρο MicroCal VP-ITC. Πριν από τη φόρτωση, τα διαλύματα επιμελώς απαερώνεται. δείγματα DNA σε 50 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6.5) χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Τυπικά, 200 μl διάλυμα φαρμάκου (3.5 μΜ ADR /DNM για το M-DNA και 0,17 μΜ ADR /DNM για Ν-DNA), που έχει τοποθετηθεί στον Θερμιδομέτρηση κυττάρων τιτλοδοτήθηκε έναντι 0,2 mM από κάθε διάλυμα DNA χωριστά (20 ενέσεις από 2 μl κάθε ). Διαδοχική τιτλοδοτήσεις διεξήχθησαν για να εξασφαλίσει την πλήρη κατάληψη των θέσεων πρόσδεσης από την φόρτωση και τιτλοδοτήσεως με τον ίδιο συνδέτη χωρίς απομάκρυνση των δειγμάτων από το κύτταρο έως ότου το σήμα τιτλοδότηση ήταν ουσιαστικά σταθερός όπως περιγράφεται από τους Arora et al. [30] Κάθε ένεση δημιουργείται μια καμπύλη θερμότητας έκρηξη (μcal s

-1) συναρτήσει του χρόνου (λεπτά). Η περιοχή κάτω από κάθε κορυφή προσδιορίσθηκε με ενσωμάτωση χρησιμοποιώντας λογισμικό Origin (Microcal, Inc.) για να δώσει το μέτρο της θερμότητας που συνδέεται με την ένεση. Τα προκύπτοντα συνδεδεμένα θερμοκρασίες σχεδιάστηκαν έναντι μοριακή αναλογία. Το προκύπτον πειραματικό ισόθερμος δεσμευτικές διορθώθηκε για τη θερμική επίδραση του τιτλοδότηση κάθε DNA σε ρυθμιστικό διάλυμα. Οι προκύπτουσες Θερμογραφήματα δεν ταίριαζε καλά με τα μοντέλα που δεσμεύουν ένα ή δύο ιστοσελίδα. Διαδοχική θέσεις σύνδεσης μοντέλο (Levenberg-Marquardt μη γραμμική τουλάχιστον καμπύλης τετραγώνων αλγόριθμο) ενσωματωμένη στο λογισμικό MicroCal LLC τοποθετηθεί το καλύτερο για να δώσει σταθερές σύνδεσης (Κ) και την ενθαλπία σύνδεσης (ΔΗ). Κατά συνέπεια, οι αλλαγές στην ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG) και οι μεταβολές της εντροπίας (ΔS) μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες εξισώσεις:

ΔG = -RT Lnk και ΔG = ΔΗ-TΔS

όπου Τ είναι η θερμοκρασία της αντίδρασης (σε K) και R σηματοδοτεί την παγκόσμια σταθερά των αερίων (1.986 cal Κ

-1 mol

-1).

φασματοσκοπία Raman

φασματοσκοπία Raman είναι καλά εδραιωμένη, αν και ακόμη υποτιμημένη μέθοδος κατάλληλη για δομικές μελέτες των νουκλεϊκών οξέων διαμορφώσεων [31], [32]. Τα σύμπλοκα φαρμάκου-DNA παρασκευάστηκαν με ανάμιξη 2 μΜ διαλύματα DNA με ισομοριακές συγκεντρώσεις φαρμάκων στους 25 ° C και επώαση για 2 ώρες. Ακολούθως φάσματα Raman και των δύο τύπων του DNA και των αντίστοιχων συμπλοκών φαρμάκου τους καταγράφηκαν σε ένα φασματόμετρο Perkin Elmer Raman, με τη χρήση 514,4 nm γραμμή ενός λέιζερ αργού. Raman φάσματα των δύο μορφών του DNA καταγράφηκαν πάνω από την φασματική περιοχή 400-4000 cm

-1. Τα φάσματα συνήθως καταγράφονται στα 4 cm

-1 πλάτος της σχισμής με χρόνο ολοκλήρωσης 2 δευτερόλεπτα σε κάθε 2 εκατοστά

-1 αύξηση της συχνότητας. Είχαν συνήθως φόντο διορθωμένη αφαιρώντας κατάλληλη πολυώνυμο λειτουργία από την αρχική καμπύλη.

Dynamic Light Scattering (DLS)

DLS χρησιμοποιείται για να καθορίσει το προφίλ κατανομής των βιολογικών μακρομορίων όπως πρωτεΐνες, DNA, χρωματίνη κ.λπ. [33], [34]. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της ADR και DNM στο υδροδυναμικό μέγεθος και ζήτα δυναμικό του Ν-DNA και Μ-DNA, τα δείγματα (2 μΜ) υποβλήθηκαν σε αγωγή με ισομοριακή συγκέντρωση των φαρμάκων στους 25 ° C και επωάστηκαν για 2 ώρες. Στη συνέχεια, αυτά τα δείγματα παρακολουθήθηκαν με DLS χρησιμοποιώντας ένα όργανο Zetasizer, Nano-ZS (Malvern Instruments, Southborough, UK). Μετριέται το μέγεθος του DNA και των συμπλόκων τους για τα ναρκωτικά παρουσιάστηκαν ως η μέση τιμή των 100 τρεξίματα. Νανο-ZS (Malvern Instruments, Southborough, UK) με τη χρήση λέιζερ ροομετρία Doppler και σκέδαση φωτός ανάλυση φάση χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του δυναμικού ζήτα. Ζήτα δυναμικό μετρήσεις για διαφορετικούς τύπους συμπλοκών DNA και φάρμακο-ϋΝΑ διεξήχθησαν στο πρότυπο τριχοειδή ηλεκτροφόρηση κύτταρο του Zetasizer 2000 HS (Malvern, UK). Μέσες τιμές υπολογίσθηκαν από τρία σύνολα πειραματικών δεδομένων.

Αποτελέσματα

Θερμιδομετρικά μελέτες

Ισοθερμική τιτλοδότηση θερμιδομετρία (ITC) χρησιμοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει αποτελεσματικά και αναγνωρίζουν τόσο υψηλή συγγένεια και χαμηλή συγγένεια διαμοριακές αλληλεπιδράσεις γρήγορα και με ακρίβεια. Τυπικά πειραματικά ITC θερμόγραμμα που λήφθηκε για τιτλοδότηση των φαρμάκων (ADR /ϋΝΜ) με Ν-DNA και Μ-ϋΝΑ απεικονίζεται στο Σχ. 2 και τα προκύπτοντα δεσμευτικές παράμετροι παρατίθενται στον Πίνακα 1. Για τα δύο φάρμακα εξετάζονται οι θερμογράμματα ITC έδειξαν αρνητική εκτροπή της θερμότητας, σύμφωνα με εξώθερμη δεσμευτικές και στους δύο τύπους του DNA. Αυτά τα θερμογραφήματα από το ενσωματωμένο λογισμικό τοποθετηθεί καλύτερα με διαδοχική μοντέλο δέσμευσης. Ύπαρξη τέτοιων διαδοχικών γεγονότων θα μπορούσε να έχει καθοριστεί, λόγω της τεχνικής της αντίστροφης τιτλοδότηση όπου πολύ χαμηλή συγκέντρωση του φαρμάκου που χρησιμοποιείται για να ξεπεραστούν αυτο συσσωμάτωση των φαρμάκων. Αυτό το μοντέλο απέδωσε τέσσερα θερμοδυναμικά διαφορετικά γεγονότα αλληλεπίδρασης φαρμάκου Ν-DNA, τα οποία σχηματίζονται από την άλλη συνεχώς με το σπάσιμο και λήψης ισχυρής ή ασθενούς δεσμούς. Οι εκδηλώσεις αυτές αντιπροσωπεύουν διαφορετικές συσχετίσεις μεταξύ φαρμάκου και Ν-DNA (αδύναμη ή ισχυρή συσχέτιση). Οι σταθερές σύνδεσης και των θερμοδυναμικών παραμέτρων που σχετίζονται με κάθε συμβάν παρατίθενται στον Πίνακα 1. Από τον Πίνακα 1, παρατηρείται ότι οι Ν και Μ DNA αλληλεπιδράσεις με φάρμακα που ορίζεται από τέσσερα και τρία γεγονότα, αντίστοιχα. Το επιπλέον εκδήλωση στην αλληλεπίδραση Ν-DNA-φάρμακο χαρακτηρίζεται από χαμηλότερη συγγένεια σύνδεσης με ADR /DNM 6,0 Ε2 /9,7 Ε2 Μ

-1 συνοδεύεται από θετικές τιμές του ΔΗ (6.6 E8 /9.1 Ε7 cal /mol) και ΔS (2,0 Ε6 /3.0 Ε5 cal /mol /Κ) (Σχ. 2a-b). Οι Υψηλότερη συγγένειες δέσμευσης που σχετίζονται με τις αλληλεπιδράσεις M-DNA-DNM, συνεπές με προηγούμενα ευρήματα μας [6].

θερμογράμματα για τη διαδοχική τιτλοδότηση του 0,2-DNA σε 3,5 μΜ (α) ADR, (β) DNM και 0.2 mM Μ-DNA σε 0,17 μΜ (γ) ADR, (δ) DNM σε 50 mM ρυθμιστικό φωσφορικού (ρΗ 6.5) στους 25 ° C.

Η

Raman φασματοσκοπία

φασματοσκοπία Raman έχει πολύ υψηλή χημική ειδικότητα και χρησιμοποιείται συνήθως για τη διαφοροποίηση μεταξύ των διαφορετικών πολύμορφων της ίδιας ένωσης. Raman γραμμές κοντά 682, 668, ή 625 εκατοστά

-1 αντιπροσωπεύει Β (C2′-ενδο, αντι), Α (C3′-ενδο, αντι) ή Ζ (C3′-ενδο, συν) δομές, αντίστοιχα, είναι η περισσότερο χρήσιμες για την ποσοτική ανάλυση [35]. Η κύρια λωρίδες Raman εκπρόσωπος των βάσεων (αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη, θυμίνη), δεοξυριβόζη και το τέντωμα φωσφορικό παρατίθενται στον Πίνακα 2 [36], [37]. Η μορφή Β του DNA χαρακτηρίζεται από C2 ‘-

ενδο

σακχάρου πτύχωση (692 εκατοστά

-1), C2′ –

αντι

γλυκοζύλ στρέψης (728 εκατοστά

-1) και C2′-Η2 (1411 εκατοστά

-1) [24], [36], [38]. Έχει, επίσης, χαρακτηριστικό στρέψεις φωσφοδιεστέρας (828 εκατοστά

-1) και φωσφοδιεστέρος Ο-Ρ-Ο stretching (1091 εκατοστά

-1) [38], [39]. Στα φάσματα Raman του Ν /Μ-ϋΝΑ και αντίστοιχες ADR /σύμπλοκα DNM (Σχ. 3α-ί) τους, όλες οι διαγνωστικές κορυφές άνω Β DNA έχουν ταυτοποιηθεί (μερικά σημειώνονται στο σχήμα) και μετατοπίσεις τους σε ναρκωτικά DNA συγκροτήματα έχουν επίσης καταγραφεί και συνοψίζονται στον πίνακα 2. Οι βασικών διαρθρωτικών δεικτών της Β DNA που προσδιορίζονται στην υποστήριξη Ν-DNA ότι η δομή ραχοκοκαλιά του DNA παρέμεινε ως κανονική μορφή Β. Στα φάσματα του Ν-DNA και ADR /σύμπλοκα DNM γραμμή ώμων εμφανίστηκε στους 673 cm

-1 και 803 cm

-1, που είναι ζώνες δείκτη ενός DNA που σχετίζονται με την C3′-ενδο, αντι μαζί με το δόνηση των ΟΡΟ φωσφοδιεστερικού pucker και glycosyltorsion [40] από αυτές τις κορυφές σε συγκροτήματα Ν-DNA και τα ναρκωτικά, μια μερική μετάβαση σε μια μορφή αναγνωρίζεται. Αυτές οι δύο ζώνες δείκτη ενός DNA επίσης εντοπιστεί στα φάσματα των M-DNA (Σχ. 3d) λόγω των μεταλλάξεων, με μικρή μετατοπίσεις στα σύμπλοκα φαρμάκου (Σχ. 3e-f). Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τα προηγούμενα ευρήματα μας [6]

λειαίνονται Raman φάσματα (α) 2 μΜ φυσικής Ν-DNA και συμπλοκών του με ισομοριακή (β) ADR και (γ) DNM.? (Δ) 2 μΜ φυσικής Μ-DNA και τα σύμπλοκα της με ισομοριακή (ε) ρυθμιστικό φωσφορικού ADR και (στ) DNM σε 50 mM (ρΗ 6,5) στους 25 ° C.

Η

Η αντίστοιχων νουκλεϊκών οξέων Raman δονήσεις έχουν επίσης εντοπιστεί στα φάσματα Raman και βάρδιες τους καταγράφονται και αναφέρονται στον πίνακα 2. Ανώτατη συμμετοχή της γουανίνη, κυτοσίνη και τη λειτουργία του δακτυλίου G, Α σε N-DNA υποστηρίζεται από τις υψηλότερες αλλαγές στις γραμμές Raman σε σύγκριση με το Μ -DNA. Οι υψηλότερες βάρδιες για δεοξυριβόζη (951 εκατοστά

-1) καταγράφονται για Ν- DNA που υποδηλώνει πιο ραχοκοκαλιά διαμορφωτικές αλλαγές μετά την παρεμβολή και παρόμοιες αλλαγές στην M-DNA οφείλονται σε κοντινή απόσταση από τα φάρμακα για να φωσφορικών ομάδων που συμμετέχουν στις εξωτερικές δέσμευσης. Άλλες μπάντες εκπρόσωπος της φωσφορικής δεοξυριβόζης εκτείνεται επίσης δείξει παρόμοιες τάσεις, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Τα αποτελέσματα δείχνουν υψηλότερα παρεμβολής σε μορφή Β του Ν-DNA και υψηλότερες εξωτερικές δεσμευτικός ως προς μια μορφή M-DNA.

Υδροδυναμική χαρακτηρισμός φάρμακο-DNA αλληλεπίδραση

Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) έχει χρησιμοποιηθεί για να μελετηθεί η μετάβαση μέγεθος του DNA N /M για σχηματισμό συμπλοκών με ADR /ϋΝΜ σε διάλυμα. Τα συμπλέγματα φάρμακα-Ν-DNA παρουσίασαν μειωμένο μέγεθος σε σύγκριση με το ελεύθερο DNA. Το Ζ διάμετρος

av Ν-DNA μειώθηκε από 877,7 nm έως 649,4 nm και 783,1 nm για ADR και συγκροτήματα DNM αντίστοιχα (Σχ. 4α-γ). Το Ζ

διάμετρος av του M-DNA παρατηρήθηκε να είναι πολύ χαμηλότερη (457,2 nm) από Ν-DNA και συμπλοκών του με φάρμακα καταγράφεται σημαντική αύξηση σε μέγεθος με 586,1 nm και 588,9 nm για ADR και DNM αντίστοιχα (Σχ. 4d -φά). Εδώ παρατηρείται ότι προκαλείται από μετάλλαξη μερική μετάβαση σε μια μορφή είναι πιο συμπαγής από ό, τι μορφή Β του DNA. Ν-DNA σε σύμπλεξη με ADR /DNM υφίσταται μερική Β σε μια μετάβαση με αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους. M-DNA από την άλλη πλευρά ευνοεί εξωτερικά δέσμευσης που οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους.

συναρτήσεις κατανομής Ένταση σταθμίζονται από (α) 2 μΜ φυσικής Ν-DNA και συμπλοκών του με ισομοριακή (β) ADR και (γ) DNM ? (Δ) 2 μΜ φυσικής Μ-DNA και τα σύμπλοκα της με ισομοριακή (ε) ρυθμιστικό φωσφορικού ADR και (στ) DNM σε 50 mM (ρΗ 6,5) στους 25 ° C.

Η

Το ζήτα δυναμικό είναι ένα μετρούν από το ηλεκτρικό φορτίο της επιφάνειας των σωματιδίων. Τιμές της ζήτα-δυναμικό των φαρμάκου /DNA αντανακλά έμμεσα καθαρό φορτίο επιφανείας των συμπλοκών και μπορούν συνεπώς να χρησιμοποιηθούν για να αξιολογηθεί η έκταση της αλληλεπίδρασης του φαρμάκου με το DNA [41]. Μέτρηση του ζήτα δυναμικού της ροπινιρόλης συμπλοκών υδροχλωρικό και ασπιρίνη με ανθρώπινο ολο-τρανσφερρίνης αποκάλυψε την ύπαρξη των ηλεκτροστατικών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων στο σύμπλοκο [42]. Αυτές οι επιβαρύνσεις και με τη σειρά τους αναμένεται οι δεσμευτικές δυνάμεις που πρέπει να διαμορφώνεται σε σύμπλοκα φαρμάκου-DNA, ως εκ τούτου τιμές ζήτα δυναμικού τους προσδιορίστηκαν μαζί με τις αντίστοιχες ελεύθερες μορφές τους. Οι καταγεγραμμένες ζήτα δυναμικά των Ν και Μ DNA ήταν -22,5 ± 0,9 mV και -29,1 ± 0,7 mV, αντίστοιχα (Εικ. 5). Από αυτές τις τιμές είναι συναχθεί ότι στην Μ-DNA οι φωσφορικές ομάδες που φέρουν αρνητικό φορτίο είναι περισσότερο εκτεθειμένες από ό, τι στο Ν-DNA. Αυτό αποδίδεται στην διαμορφωτική διαφορά σε Ν-DNA και Μ-ϋΝΑ, όπου το Μ-ϋΝΑ υιοθετεί μια μερική μετάβαση σε μια μορφή του DNA που προκύπτει σε μεγαλύτερες στροφές και έκθεσης μεγαλύτερο φωσφορικών ομάδων. Σχηματισμός Ν-DNA, συγκροτήματα της ΕΕΔ και DNM οδήγησε σε αύξηση του δυναμικού σε -20,2 ± 1,1 mV και -19,1 ± 1,0 mV, αντίστοιχα. Στο Μ-DNA-φαρμάκου σύμπλοκα το δυναμικό αυξήθηκε σε -12,8 ± 1,2 mV και -8,9 ± 1,3 mV για ADR για DNM, αντίστοιχα (Εικ. 5). Η μεγαλύτερη αύξηση σε ζήτα δυναμικό της M-DNA επιβεβαίωσε ότι ηλεκτροστατικές δυνάμεις (backbone δεσμευτική) ήταν μεγάλες δεσμευτικές δυνάμεις τους με συνεισφορά από υδρόφοβες δυνάμεις (παρεμβολή). Λιγότερο αύξηση του ίδιου σε Ν-DNA δείχνει ότι υπάρχει ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση, αλλά υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις όπως παρεμβολή είναι κυρίαρχες δυνάμεις δεσμευτικές.

Το ζήτα δυναμικό των 2 μΜ μητρική Ν-DNA και Μ-DNA και συμπλέγματα τους περιέχουν ισομοριακή ναρκωτικών στην 50 mM φωσφορικό ρυθμιστικό (ρΗ 6,5) στους 25 ° C. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα (SE) για Ν = 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Οι λειτουργικές συνέπειες των μεταλλάξεων στο γονιδίωμά του καρκίνου και την πιθανή συγγένεια τους σε αντικαρκινικά φάρμακα σε σύγκριση με φυσιολογικά γονιδιώματος έχουν μεγάλη επίπτωση στην ορθολογική σχεδιασμό ή την τροποποίηση των ναρκωτικών και έπρεπε να διερευνηθούν. Η γνώση της σωστής πειραματικό σχεδιασμό και την επιλογή των κατάλληλων δεσμευτικών προτύπων δεν μπορεί να αγνοηθεί. ITC είναι μια ισχυρή τεχνική για την ακριβή και ακριβή μέτρηση της συνάφειας των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων και καθορίζει μηχανισμό δεσμευτική και έχει εφαρμογή σε ορθολογικό σχεδιασμό φαρμάκων. Είναι σημαντικό να συνειδητοποιήσουμε ότι ΔG και ΔΗ και Δδ συστατικών εξαρτάται από διαφορές μεταξύ ελεύθερου και δεσμευμένου καταστάσεις για τα δύο από τα οποία αλληλεπιδρούν εταίρων (φάρμακο και DNA). Η ITC θερμογραφήματα φαίνεται στο Σχ. 2a-b αντιπροσωπεύουν ανταλλαγής θερμότητας κατά την ογκομέτρηση της ΕΕΔ και DNM αντίστοιχα με Ν-DNA. Αυτά τα θερμογραφήματα για Ν-DNA και αλληλεπίδραση ADR /DNM για την παγκόσμια ανάλυση χρησιμοποιώντας διαδοχική μοντέλο αποδείξεις τέσσερις πιθανές συσχετίσεις μεταξύ DNA και ναρκωτικών και κάθε μπορούν να διακριθούν από τις αντιπροσωπευτικές σταθερές δέσμευσης και θερμοδυναμική συστατικών (Πίνακας 1). Τα θερμογράμματα τιτλοποίηση του φαρμάκου M-DNA (Σχήμα 2γ-δ) είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ενώσεων. Και οι δύο Ν /Μ αλληλεπιδράσεις DNA των ναρκωτικών που συνδέονται με τρία μέλη, τα οποία χαρακτηρίζονται από κη ΔΗ και κη ΔS, διάγνωση σχηματισμό ισχυρών ενώσεων με υψηλή συγγένεια δέσμευσης. Οι ενώσεις αυτές μπορεί να εκληφθεί ως φάρμακο συνδέεται προς τα ελάσσονα αύλακες του DNA και επακόλουθη επαναπροσανατολισμό του φαρμάκου στο σύμπλοκο και παρεμβολής οι οποίες σταθεροποιούνται κυρίως από δυνάμεις van der Waals και δεσμούς υδρογόνου όπως απεικονίζεται στο Σχ. 6. Η χαρακτηριστική + ve ΔΗ και + ve ΔS κατάσταση στο Ν-DNA είναι μια enthalpically δυσμενής διαδικασία, οδηγείται από εντροπίας. Σε τέτοιες διεργασίες δεσμοί διασπώνται για να φέρει υψηλότερα διαταραχή ή ανοίγματος (Β για τη μετάβαση) στη δομή, ώστε να φιλοξενήσει μια μάλλον πολύπλοκη παρεμβολή με δεσμευτικές ογκώδη ομάδα στη μικρή αύλακα με την απελευθέρωση του νερού από τη σύνδεση διεπαφής με τον κύριο όγκο και σταθεροποιείται με υδρόφοβες δυνάμεις [13], [43]. Αυτή η κατάσταση (+ ve ΔΗ και + ve ΔS) δεν παρατηρείται σε M-DNA και το DNA προσαρμόζεται μερική Β για τη μετάβαση οφείλεται σε μετάλλαξη και περαιτέρω παρεμβολή δεν επιφέρει σημαντικές αλλαγές διαμόρφωσης. Αυτές οι δομικές αλλαγές αποδεικνύεται από την εμφάνιση νέων κορυφών σε φάσματα Raman σε συμπλοκών φαρμάκου Ν-DNA, το οποίο είναι αντιπροσωπευτικό μιας μορφής DNA (Πίνακας 2). M-DNA από μόνη φυσική μορφή έχει υπογραφές ενός DNA μορφή που έχει επίσης παγιωθεί νωρίτερα με FTIR και CD [6]. Υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με την αλληλεπίδραση του DNA ναρκωτικών θεωρητικές προβλέψεις έχουν γίνει για την ύπαρξη άλλων μορφών ενώσεων πριν από την τελική παρεμβολή [44]. Δεδομένου ότι δεν ομοιοπολικούς δεσμούς που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια αυτών των αλληλεπιδράσεων υποτίθεται εδώ ότι υπάρχουν όλες οι μορφές σε ισορροπία και η ισορροπία μετατοπίζεται από τις εξωτερικές συνθήκες.

Πιθανά γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης του (α) Ν-DNA και (β ) Μ-DNA με ADR /DNM.

η

κατά τη διαδικασία της παρεμβολής, αλλαγή στις ξετύλιγμα γωνίες των δύο ζεύγη βάσεων στρεβλώνει τη σπονδυλική στήλη με αποτέλεσμα σε συμπιεσμένη δομή του DNA, όπως επιβεβαιώθηκε από DLS ευρήματα. Το φάρμακο σε σύμπλοκο Ν-DNA έχει μειωμένο μέγεθος λόγω της μετάβασης από Β σε Α κατά την παρεμβολή που κάνει το σουβλάκι έλικα και παραμορφωμένη. Υπάρχει μια αύξηση στο μέγεθος για συμπλοκών φαρμάκου-M-DNA λόγω εξωτερικών πρόσδεση επηρεάζεται από την έκθεση σκελετό εις DNA, που υποστηρίζεται από την αύξηση στο δυναμικό ζήτα λόγω εξουδετέρωση επιβάρυνση στα σύμπλοκα του φαρμάκου (Εικ. 4-5). Λιγότερο αύξηση του δυναμικού ζήτα σε συγκροτήματα Ν DNA-φάρμακο δείχνουν ότι παρεμβολή είναι πιο ευνοϊκό τρόπο δεσμευτικό να εξαλείψει το πλεόνασμα δεσμευτική σπονδυλική στήλη.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματα από όλες τις τρεις τεχνικές με αποκορύφωμα να νομίζω ότι οι διαρθρωτικές υπάρχει διαφορά μεταξύ Ν-DNA και Μ-ϋΝΑ, το οποίο αναγνωρίζεται από τα φάρμακα ADR /ϋΝΜ. Αυτή η διαφορά μπορεί να αξιοποιηθεί στον σχεδιασμό πιο εξειδικευμένα φάρμακα για τα καρκινικά κύτταρα. Σε σύμπλοκα Ν-DNA και DNM μια μείωση στην δομή του DNA Β-μορφής υπέρ της Α-μορφής DNA παρατηρήθηκε. Προτείνεται ότι στοίβαγμα δύναμη και ο δεσμός υδρογόνου μεταξύ των ζευγών βάσεων ήταν καταστραφεί και ένα μέρος του Β-μορφής DNA έγινε μονόκλωνο. Περαιτέρω το μέγεθος και το φορτίο αποζημίωση των συμπλοκών φαρμάκου-DNA ασπάζονται την παραπάνω αναλογία. Η εφαρμογή της διαδοχικής μοντέλο δέσμευσης είναι πιο ευνοϊκό και ρίχνει φως στις υποβάλλονται σε μηχανιστικές κράτη της αλληλεπίδρασης φαρμάκου-DNA. Η θερμοδυναμική ανάλυση είναι συμβατό με προηγούμενες θεωρητικές προβλέψεις. Τα αποτελέσματα αυτά εξηγούν υψηλότερη τοξικότητα του ADR /ϋΝΜ σε κύτταρα Κ562 σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [15] και τονίζουν την ανάγκη να σχεδιαστούν φάρμακα τα οποία μπορούν να αναγνωρίζουν επιλεκτικά διαμορφωτικές αλλαγές του DNA σε καρκινικά κύτταρα με αποτέλεσμα αυξημένη θεραπευτική αναλογία των φαρμάκων. Περαιτέρω μελέτες που αφορούν διαρθρωτικές αλλαγές στη χρωματίνη των καρκινικών κυττάρων είναι σε εξέλιξη για την αξιολόγηση αυτών των ευρημάτων για εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες στον Δρ Abhijit Saha σε UGC-DAE ( Πανεπιστήμιο Επιχορήγηση της Επιτροπής-Τμήμα Ατομικής Ενέργειας) Κέντρο Επιστημονικών Ερευνών που μας παρέχει τη δυνατότητα όργανο και συνεχή συνεργασία του κατά τη διάρκεια του έργου. Ευχαριστώ, επίσης, επεκταθεί και σε Δρ Aparna Dutta στο UGC-DAE Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας για την τεχνική υποστήριξη και τη συνεργασία της κατά τη διάρκεια του πειράματος DLS χωρίς την οποία δεν θα ήταν δυνατή αυτή η δουλειά.