Αφηρημένο

Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η τακτική χρήση μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη (ΜΣΑΦ) φάρμακα συσχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο διαφόρων μορφών καρκίνου. Επιπλέον, in vitro και τα πειράματα σε μοντέλα ποντικών έχουν καταδείξει ότι έναρξης NSAIDs μείωση του όγκου ή /και της εξέλιξης των διαφόρων μορφών καρκίνου. Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες προκλινικές μελέτες που διερευνούν τις επιδράσεις των ΜΣΑΦ στον καρκίνο των ωοθηκών. Εδώ, μελετήσαμε τα αποτελέσματα δύο ΜΣΑΦ, δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Diclofenac και ινδομεθακίνη θεραπεία μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων μέσω επαγωγής διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Επιπλέον, δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη μειωμένο όγκο όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου των ωοθηκών. Για τον προσδιορισμό των πιθανών μοριακών οδών μεσολαβούν τα αποτελέσματα της αγωγής NSAID στον καρκίνο των ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με ινδομεθακίνη ή δικλοφενάκη. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλές από τα γονίδια που βρέθηκαν μειωτικά εξής δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη επεξεργασίας είναι μεταγραφική γονιδίων στόχων του E2F1. E2F1 ήταν μειωτικά στο επίπεδο του mRNA και της πρωτεΐνης κατά την κατεργασία με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη και η υπερέκφραση του E2F1 διασωθεί κυττάρων από τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του diclofenac και ινδομεθακίνη. Συμπερασματικά, ΜΣΑΦ δικλοφαινάκη και ινδομεθακίνη ασκούν μια αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στον καρκίνο των ωοθηκών in vitro και in vivo και οι επιδράσεις των NSAIDs μπορεί να προκαλούνται, εν μέρει, από μειορρύθμιση του E2F1

Παράθεση:. Valle BL, D «Souza T, Becker KG, Ξύλο WH III, Zhang Υ, Wersto RP, et al. (2013) Μη-Στεροειδή Αντιφλεγμονώδη Φάρμακα Μείωση έκφραση E2F1 και αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (4): e61836. doi: 10.1371 /journal.pone.0061836

Επιμέλεια: resham Bhattacharya, Mayo Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιανουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 25 Φλεβάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 24 του Απριλίου του 2013

Copyright: © 2013 Valle et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε πλήρως από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Γήρανσης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικές κακοήθειες. Όταν ανιχνευθεί νωρίς, ο ρυθμός επιβίωσης 5-ετών είναι τόσο υψηλό όπως 90%, αλλά, δυστυχώς, η συντριπτική πλειονότητα των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται ως τελικού σταδίου ασθένεια, η οποία συχνά είναι ανθεκτική στη συμβατική χημειοθεραπεία. Κατά συνέπεια, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών από καρκίνο των ωοθηκών είναι περίπου 30-40%. Είναι, επομένως, επιτακτική ανάγκη να διερευνήσει νέες προσεγγίσεις για τη θεραπεία και τη διαχείριση αυτής της θανάσιμης ασθένειας.

Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η τακτική χρήση μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη (ΜΣΑΦ) φάρμακα συνδέεται με μειωμένο κίνδυνο διαφόρων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, του μαστού, του πνεύμονα και των ωοθηκών [1], [2], [3]. Επιπλέον, in vitro και μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα μπορεί να μειώσει την κίνηση και /ή την εξέλιξη των διαφόρων μορφών καρκίνου [4], [5], [6]. Για παράδειγμα, η ινδομεθακίνη NSAID ανέστειλε την ανάπτυξη των χημικά επαγόμενης καρκίνων του παχέος εντέρου σε αρουραίους [7], [8]. Επιπλέον, η ινδομεθακίνη μείωσε την ανάπτυξη νέων και καθιερωμένων αυθόρμητων όγκων μαστού [9]. Το diclofenac NSAID μείωσε την ανάπτυξη των παγκρεατικών και μη μικροκυτταρικού ξενομοσχεύματα καρκίνου του πνεύμονα [10], [11]. Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες προκλινικές μελέτες που διερευνούν τις επιδράσεις και τους μηχανισμούς δράσης των diclofenac και ινδομεθακίνη στον καρκίνο των ωοθηκών [12], [13]. Από αυτή την άποψη, Ζερμπίνη et. al. ανέφεραν ότι η δικλοφενάκη μείωση του όγκου του όγκου σε ποντικούς SCID με καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών SKOV-3 ξενομοσχεύματα κατά ~ 20% [12]. Ωστόσο, μια άλλη μελέτη ανέφερε ότι η ινδομεθακίνη είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των ωοθηκών δικτυωτού κυττάρου σάρκωμα Μ5076 [13].

Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με τις επιδράσεις της ινδομεθακίνης ειδικά σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, η οποία περιλαμβάνει η πλειονότητα των καρκίνων των ωοθηκών (περίπου 90%). Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τις επιπτώσεις της ΜΣΑΦ δικλοφαινάκη και ινδομεθακίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αναφέρουμε ότι μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών in vitro και in vivo, και, χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών, προσδιορίσαμε τον παράγοντα μεταγραφής E2F1 ως μεσολαβητής αυτού του αποτελέσματος. Είναι σημαντικό βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση E2F1 ανέστρεψε τα ανασταλτική της ανάπτυξης επιδράσεις των ΜΣΑΦ που υποδηλώνει ότι NSAIDs θα μπορούσε να δράσει εν μέρει μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει E2F1 μειορρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθική

Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Εθνικού Ινστιτούτου Γήρανσης. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας.

Αντιδραστήρια

δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis , ΜΟ). Anti-E2F1, αντι-E2F4, αντι-MCM2, και αντι-MCM4 αντισώματα αγοράστηκαν από Proteintech (Chicago, IL). Αντισώματα από Abcam (Cambridge, ΜΑ) που αναγνωρίζονται GAPDH, και τα αντισώματα από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ) που αναγνωρίζονται Rb. πλασμίδια έκφρασης E2F1 και eGFP ήταν από GeneCopoeia (Rockville, MD). Rb siRNA (SC-29468) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

κυτταρικής καλλιέργειας και επιμολύνσεις

Οι ορώδες αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές ωοθηκών HEY, OVCAR5 και ΟΣΕ-101 ήταν ευγενικά παρέχονται ως εξής: Hey κύτταρα από το Δρ Robert C. Σφουγγαράκι [14], OVCAR5 κύτταρα από το Δρ Thomas C. Hamilton [15] και ΟΣΕ-101 κύτταρα από τον Δρ Michael J. Birrer [16]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα 5Α καλλιέργεια McCoy συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και Pen /Strep (100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη), και επωάστηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 . Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε μέσα που περιείχαν ορό

Για επιμολύνσεις, Hey κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα σε 12-φρεατίων και επιμολύνθηκαν παροδικά με E2F1 ή eGFP ως έλεγχο.? ή Rb siRNA ή ελέγχου siRNA για 24 ώρες, με τη χρήση X-treme Gene 9 Αντιδραστήριο DNA Transfection (Roche) ή Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκαν σε πυκνότητες από 5 × 10

3 κύτταρα σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24-48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κύτταρα κατόπιν λύθηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση ή πλυθούν και να χρησιμοποιηθούν σε κλωνογενείς δοκιμασίες.

MTS και κλωνογενείς δοκιμασίες

Για MTS δοκιμασίες βιωσιμότητας (Promega), Hey, OVCAR5 ή ΟΣΕ-101 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 7 χ 10

3 κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντιδραστήρια και απορρόφηση MTS στα 490 nm μετρήθηκε μετά από επώαση 1-4 hr στους 37 ° C. Για δοκιμασίες βιωσιμότητας δοσοεξάρτηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του diclofenac ή ινδομεθακίνη (50, 100, 250, και 500 μΜ). Για κλωνογονική προσδιορισμούς, Hey, OVCAR5 ή ΟΣΕ-101 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη, πλύθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες. Οι αποικίες στη συνέχεια κατέστησαν ορατές με χρώση με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% κρυσταλλικό ιώδες σε 50% μεθανόλη).

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης ανάλυση

και θεραπεία για 24 ή 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη . Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν σε FACS Caliber Κυτταρόμετρο Ροής (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Για την ανάλυση απόπτωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ή 96 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Η απόπτωση και το DNA περιεχόμενο αναλύθηκαν με BrdU και χρώση ιωδιούχου προπιδίου χρησιμοποιώντας ένα κιτ Αρο-BrdU (Systems Phoenix Flow, San Diego, CA) και αναλύθηκαν σε ένα κυτταρομετρητή LSR-ΙΙ Flow (BD Biosciences, San Jose, CA).

μελέτες σε ζώα

Γυναίκα 7-8 εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από Harlan Laboratories (Frederick, MD) και όλα τα πειράματα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την ΝΙΑ IACUC.

HEY κύτταρα ( 1,5 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές γυμνών ποντικών. Για τη μελέτη diclofenac, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες: ελέγχου (PBS) ή δικλοφαινάκη (18 mg /kg)? 6 ποντικούς ανά ομάδα. Ποντικοί εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς δύο φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες αρχίζοντας 3 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, αρχίζοντας από την εβδομάδα 1, χρησιμοποιώντας καλίμπρες και W

2L /2 [17] χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του όγκου του όγκου. Για την ινδομεθακίνη μελέτη, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες: έλεγχος (νερό) ή ινδομεθακίνη (2,5 mg /kg)? 5 ποντικοί ανά ομάδα. Η ινδομεθακίνη δόθηκε καθημερινά στο πόσιμο νερό επί 6 εβδομάδες, ξεκινώντας την ημέρα μετά την ένεση των κυττάρων. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, αρχίζοντας από την εβδομάδα 3, χρησιμοποιώντας καλίμπρες και W

2L /2 [17] χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του όγκου του όγκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± πρότυπα σφάλματα. Οι συγκεντρώσεις του diclofenac και ινδομεθακίνη που χρησιμοποιούνται για αυτή τη μελέτη είναι παρόμοια με άλλα που έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική και καλά ανεκτή σε ποντικούς [4], [10], [11], [18].

Microarray ανάλυση

Hey, OVCAR5 και UCI-101 κύτταρα σπάρθηκαν σε τρυβλία 60 mm και υποβάλλονται σε θεραπεία για 24 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία βιοτίνη επισημασμένο cDNA χρησιμοποιώντας την Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Grand Island, Νέα Υόρκη) και αναλύθηκαν με Illumina μικροσυστοιχίες (Illumina του Sentrix HumanRef-8 BeadChips Έκφραση) στη διευκόλυνση μικροσυστοιχιών πυρήνα (Εθνικό Ινστιτούτο για τη Γήρανση). Κάθε BeadChip έχει 24.000 καλά σχολιασμένο μεταγραφές REFSEQ με μέσο όρο 30 φορές απολύσεων. Γονίδια που εκφράζονται διαφορικά 2-φορές ή περισσότερο σε ταυτοποιήθηκαν τρεις κυτταρικές γραμμές και ένα υποσύνολο αυτών των γονιδίων που επιλέγονται για περαιτέρω ανάλυση. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχει υποβληθεί για την Έκφραση NCBI Gene Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (αριθμός προσχώρησης GSE45052).

Real-Time RT-PCR

Γεια σου, OVCAR5, και ΟΣΕ-101 κύτταρα θεραπεία για 24 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy και 1 μg του ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή Taqman Αντιδραστήρια (ΡΕ Applied Biosystems). Για την ενίσχυση PCR και τον ποσοτικό προσδιορισμό, την δοκιμασία SYBR Green Ι και το GeneAmp 7300 Sequence Detection System (ΡΕ Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν. Η συγκριτική μέθοδος CT χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το σχετικό επίπεδο έκφρασης των γονιδίων σε κάθε δείγμα κατεργάζεται NSAID με την αξία του CT μη επεξεργασμένο δείγμα (ΡΕ Applied Biosystems) και οι τιμές GAPDH χρησιμοποιήθηκαν για ομαλοποίηση [19]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι διαθέσιμα από τους συγγραφείς.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα πλύθηκαν και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM Tris-HCl, ρΗ 6,8, 25% γλυκερόλη, και 5% SDS). Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε 4-12 ή 10-20% πηκτώματα Τπδ-Γλυκίνη και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με ΤΒδ-Τ + 5% άπαχο ξηρό γάλα και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντισώματα ειδικά για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. Μετά από πλύση των μεμβρανών, επωάστηκαν με συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα υπεροξειδάσης. ανίχνευση πρωτεΐνης διεξήχθη με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham, Pittsburgh, ΡΑ).

Στατιστικά

Wilcoxon rank test υπογραφεί διεξήχθη για να προσδιοριστεί η σημασία στις μελέτες ποντικού. Για όλες τις άλλες αναλύσεις, μονόδρομη ANOVA και δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett διεξήχθη. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 3 λογισμικό.

Αποτελέσματα

Τα ΜΣΑΦ μειώνουν την βιωσιμότητα των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο

Για να καθοριστεί εάν τα ΜΣΑΦ μπορεί να μειώσουν ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων in vitro, θα αντιμετωπίζονται οι κυτταρικές σειρές ΗΕΥ, OVCAR5, και UCI-101 με το ΜΣΑΦ δικλοφαινάκη και ινδομεθακίνη. Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας, δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη μειωμένους αριθμούς κυττάρων κατά περισσότερο από 50% στα επεξεργασμένα κυτταρικές γραμμές σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα πληθυσμούς σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών (Εικόνα 1Α). Τα αποτελέσματα αυτών των NSAIDs ήταν δοσοεξαρτώμενη, όπως αυξανόμενες συγκεντρώσεις του diclofenac ή indomethacin μείωσε τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων (Σχήμα 1Β) περαιτέρω. Επιπλέον, δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη μείωσε την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1 C).

Α) Hey, OVCAR5 ή ΟΣΕ-101 κύτταρα κατεργάστηκαν για 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντιδραστήρια και απορρόφηση MTS στα 490 nm μετρήθηκε μετά από επώαση 1 ώρας στους 37 ° C. Ο μέσος όρος των 3 πειραμάτων απεικονίζεται. Η στατιστική σημαντικότητα αναπαρίσταται ως εξής: * p & lt? 0,05 και *** ρ & lt? 0.001. Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του diclofenac ή ινδομεθακίνη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία MTS. Ο μέσος όρος των 3 πειραμάτων απεικονίζεται. Η στατιστική σημαντικότητα αναπαρίσταται ως εξής: * p & lt? 0,05 και *** ρ & lt? 0.001. C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη, πλύθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για συνολικά 7 έως 14 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνα που παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπευτικό 3 πειραμάτων.

Η

δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη προώθηση διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης στα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Από δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη μειωμένη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, θελήσαμε να καθορίσει εάν αυτή η μείωση οφείλεται σε μεταβολές στον κυτταρικό κύκλο. Diclofenac και επάγεται ινδομεθακίνη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε όλα τα 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών που εξετάστηκαν, όπως ανιχνεύεται με χρώση ιωδιούχου προπιδίου μετά από 48 ώρες αγωγής (Εικόνα 2Α). Οι δύο NSAIDs είχαν διαφορετικά αποτελέσματα επί του κυτταρικού κύκλου, όπως η δικλοφενάκη προκάλεσε μια συσσώρευση των κυττάρων στο φάσης S και G2, ενώ ινδομεθακίνη επάγεται σύλληψη G1 και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών που εξετάστηκαν. Παρατηρήσαμε επίσης ένα πληθυσμό υπο-G1 των κυττάρων στα κύτταρα UCI-101 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη και ΗΕΥ κύτταρα επεξεργασμένα με ινδομεθακίνη, υποδεικνύοντας αυξημένη απόπτωση. Για να καθοριστεί εάν αυτά τα κύτταρα υφίστανται απόπτωση κατά την κατεργασία με ΜΣΑΦ, υποβάλλαμε σε αγωγή κυττάρων με δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη για 48 ή 96 ώρες και μετρήθηκε κατάτμησης DNA με χρώση Αρο-BrdU. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, UCI-101 κύτταρα υφίστανται απόπτωση κατά την κατεργασία με τα δύο ΜΣΑΦ, ενώ ΗΕΥ κύτταρα υφίστανται απόπτωση μόνο με ινδομεθακίνη (Σχήμα 2Β). OVCAR5 δεν υφίστανται απόπτωση μετά από 4 ημέρες θεραπείας με ΜΣΑΦ. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ΜΣΑΦ μειώνουν την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών κύτταρο επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

Α) Hey, OVCAR5 και UCI-101 κύτταρα κατεργάστηκαν για 24 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο ροής FACS διαμετρήματος. Εικόνα παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπευτικό 4 πειραμάτων. Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ή 96 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Η απόπτωση και το περιεχόμενο DNA αναλύθηκαν με BrdU και ιωδιούχου προπιδίου χρώση χρησιμοποιώντας κιτ Αρο-BrdU. Τα κύτταρα στην ανώτερη κουτί τεταρτημόριο (P3 πύλη) αντιπροσωπεύουν το αποπτωτικό πληθυσμού.

Η

ΜΣΑΦ μειώνουν την ανάπτυξη των HEY ξενομοσχευμάτων σε γυμνά ποντίκια

Για να προσδιορίσετε αν ΜΣΑΦ θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου in vivo, εμείς χρησιμοποίησαν ένα μοντέλο ποντικού των ωοθηκών καρκίνο ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια. ΗΕΥ κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές γυμνών ποντικών και τυχαιοποιήθηκαν σε 2 ομάδες: ελέγχου (PBS) ή δικλοφαινάκη (18 mg /kg), με ένεση ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα, για 4 εβδομάδες. Όπως παρατηρήθηκε, η θεραπεία δικλοφενάκη μείωσε σημαντικά (ρ = 0.016), η ανάπτυξη του HEY ξενομοσχευμάτων σε γυμνούς ποντικούς (Σχήμα 3Α). Ο μέσος όγκος του όγκου στην ομάδα που diclofenac επεξεργασμένο μειώθηκε κατά 33%, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Εναλλακτικά, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ελέγχου (νερό) ή ινδομεθακίνη (2,5 mg /kg) ομάδες, και το φάρμακο χορηγείται καθημερινά σε πόσιμο νερό για 6 εβδομάδες. Όπως παρατηρήθηκε, η ινδομεθακίνη σημαντικά (ρ = 0,031) μείωσε την ανάπτυξη των HEY ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια (Σχήμα 3Β). Ο μέσος όγκος του όγκου μειώθηκε σημαντικά κατά 22% στην ομάδα που έλαβαν θεραπεία με ινδομεθακίνη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, οι ποντικοί στην ομάδα που λάμβανε ινδομεθακίνη ανέπτυξαν λιγότερους όγκους από την ομάδα ελέγχου, 5 και 9 αντίστοιχα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΜΣΑΦ μειώνουν την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων in vivo.

ΗΕΥ κύτταρα (1.5 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές γυμνών ποντικών. Α) Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε 2 ομάδες: ελέγχου ή δικλοφενάκη (18 mg /kg). Η θεραπεία ξεκίνησε τρεις ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων και χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, αρχίζοντας από την εβδομάδα 1. Η ομάδα ελέγχου (μόνο PBS) αποτελούνταν από 6 ποντικούς που αναπτύχθηκαν 12 όγκων σε σύνολο? η ομάδα δικλοφενάκη (18 mg /kg) αποτελούνταν από 6 ποντικούς που αναπτύχθηκαν συνολικά 11 όγκων. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα. Η στατιστική σημαντικότητα παρουσιάζεται ως * ρ & lt? 0,05. Β) Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε 2 ομάδες: ελέγχου ή ινδομεθακίνη (2,5 mg /kg). Η αγωγή ξεκίνησε την ημέρα μετά την ένεση των κυττάρων και δόθηκε καθημερινά σε πόσιμο νερό για 6 εβδομάδες. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, αρχίζοντας από την εβδομάδα 3. Η ομάδα ελέγχου (μόνο νερό) αποτελείτο από 5 ποντίκια που ανέπτυξαν όγκους σε 9 σύνολο? η ινδομεθακίνη ομάδα (2,5 mg /kg) αποτελείτο από 5 ποντίκια που ανέπτυξαν ένα σύνολο 5 όγκων. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα. Η στατιστική σημαντικότητα παριστάνεται ως * ρ & lt?. 0.05

Η

Οι E2F1 και στόχος γονίδια προς τα κάτω σε κύτταρα κατεργασμένα με ΜΣΑΦ

Για να διερευνήσουν τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μετά από θεραπεία με ΜΣΑΦ , θα αντιμετωπίζονται HEY, UCI-101, και τα κύτταρα OVCAR5 με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη για 24 ώρες και πραγματοποιείται ανάλυση μικροσυστοιχιών. Τα mRNAs εκφράζονται διαφορικά (≥2 φορές) στις τρεις κυτταρικές γραμμές δείχνονται (Σχήμα 4Α). Ένα μικρό υποσύνολο των διαφορικά εκφρασμένων mRNAs μοιράστηκε μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών, και ένας μικρός αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων mRNAs μοιράστηκαν από τη θεραπεία με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη και στις τρεις κυτταρικές σειρές.

Γεια σου, OVCAR5 και ΟΣΕ-101 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Α) RNA αναλύθηκε με Illumina μικροσυστοιχίες. Ο αριθμός των mRNA που εκφράζονται διαφορικά 2-φορές ή περισσότερο σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές ενδείκνυται για τη δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη θεραπείες (Με έντονους χαρακτήρες σημειώνονται οι υπερεκφράζεται mRNAs? Δείχνεται στην τακτική γραμματοσειρά είναι τα μειωτικά mRNAs). Β) RNA από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα επίπεδα E2F1 και E2F4 mRNA εκφράζεται ως φορές μεταβολής σε επεξεργασμένα δείγματα σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο, μετά από κανονικοποίηση με GAPDH. Ο μέσος όρος των 3 πειραμάτων απεικονίζεται. Η στατιστική σημαντικότητα αναπαρίσταται ως *** ρ & lt? 0.001. λύματα C) Cell από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές που υποβλήθηκαν σε αγωγή με δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα ειδικά για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης.

Η

Η πλειοψηφία των mRNAs διαφορικά εκφρασμένων κατά την κατεργασία με δικλοφενάκη βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω, ενώ η πλειοψηφία των γονιδίων που επηρεάζονται από ινδομεθακίνη ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω. Δεδομένου ότι η δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, επιλέξαμε για γονίδια επικύρωση πιθανώς εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες. Επιβεβαιώσαμε με ποσοτική RT-PCR, ότι η έκφραση του

MCM2

,

MCM4

, και άλλα mRNAs που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της αντιγραφής του DNA και του κυτταρικού κύκλου ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με δικλοφενάκη (Πίνακας 1), ενώ

GADD45A

και

PPP1R15A

mRNAs, μεταξύ άλλων κωδικοποιούν την απόπτωση-σχετικές πρωτεΐνες, οι απορυθμίζεται με ινδομεθακίνη και με δικλοφενάκη (Πίνακας 1). Επιπλέον, έχουμε επικυρωθεί mRNAs απορυθμίζεται με ινδομεθακίνη κωδικοποιεί πρωτεΐνες φορείς διαλυμένης ουσίας SLC1A5 και SLC7A1 (Πίνακας 1). Ωστόσο, τα mRNA που έδειξαν διαφορική επίπεδα έκφρασης μόνο με δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη στην ανάλυση μικροσυστοιχιών, βρέθηκαν εκφράζονται διαφορικά από τα δύο φάρμακα όταν προσδιορίζεται με RT-qPCR (Πίνακας 1).

Η

Για να προσδιοριστούν οι παράγοντες μεταγραφής που θα μπορούσε να ρυθμίζουν την διαφορική έκφραση αυτών των mRNAs, ανάλυση στόχος παράγοντα μεταγραφής διεξήχθη χρησιμοποιώντας WebGestalt. WebGestalt (Web-based γονίδιο SET ανάλυση Toolkit) είναι ένα online εργαλείο (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) για την ανάλυση του γονιδίου σύνολα και το πρόγραμμα ανάλυσης στόχος του μεταγραφικού παράγοντα της WebGestalt προβλέπει παραγόντων μεταγραφής πιθανόν εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτά τα γονίδια. Ο πίνακας δείχνει τα S1 πιο ιδιαίτερα σημαντικούς παράγοντες μεταγραφής προβλεφθεί, μαζί με τα αντίστοιχα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά προσδιορίζονται από μικροσυστοιχίας. E2F1, πυρηνικός παράγοντας Υ και E2F4 ήταν οι κορυφαίοι παράγοντες μεταγραφής αναμένεται να ρυθμίσει τα γονίδια εκφράζονται διαφορικά με κατεργασία με δικλοφενάκη, και τα αντίστοιχα mRNAs ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. ΕΚΚΖΣ και ΑΡ1 ήταν οι δύο κορυφαίοι παράγοντες μεταγραφής αναμένεται να ρυθμίζουν τα γονίδια που επηρεάζονται από την ινδομεθακίνη, και τα mRNA που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεΐνες ήταν ως επί το πλείστον ρυθμίζεται προς τα πάνω.

Για να προσδιορίσετε αν ΜΣΑΦ είχε επίδραση στην έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων που αναφέρονται παραπάνω , εξετάσαμε τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης των παραγόντων μεταγραφής E2F1, NFY, E2F4, NFAT και ΑΡ1. Σε συμφωνία με την τάση που αναφέρθηκε ανωτέρω,

E2F1

πιΚΝΑ κατιούσα ρύθμιση και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών μετά από θεραπεία για 24 ώρες με δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη, και ειδικότερα στο ΗΕΥ κύτταρα (Σχήμα 4Β). E2F1 πρωτεΐνη επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω, καθώς επίσης και πρωτεΐνες MCM2 και MCM4 (Σχήμα 4C).

ΕΚΚΖΣ

και

ΑΡ1

mRNAs ήταν ως επί το πλείστον ρυθμίζεται προς τα πάνω (Πίνακας S2), όπως και οι στόχοι της μεταγραφής τους. Ωστόσο, ΕΚΚΖΣ και ΑΡ1 πρωτεΐνη αφθονία ήταν χαμηλότερη (Σχήμα S1), παρά δείχνουν υψηλότερα επίπεδα mRNA. Τα επίπεδα του

NFY

και

E2F4

mRNAs δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά (Σχήμα 4Β και Πίνακας S2).

E2F1 υπερέκφραση αυξάνει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών NSAID επεξεργασμένα

Δεδομένου ότι η έκφραση και των δύο E2F1 και γονιδίων-στόχων του ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά την επεξεργασία με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη, θελήσαμε να καθοριστεί αν E2F1 συμμετείχε στην ανάπτυξη ανασταλτικές επιδράσεις των ΜΣΑΦ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Εμείς υπερεκφράζεται E2F1 σε ΗΕΥ κύτταρα (Σχήμα 5Α) και παρατηρείται μια αυξημένη επιβίωση μετά από αγωγή με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη (Σχήμα 5Β). Αυτό το πείραμα δείχνει ότι προς τα κάτω ρύθμιση του E2F1 μπορεί να εμπλέκεται σε αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων από τα ΜΣΑΦ.

Α) ΗΕΥ κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με E2F1 ή eGFP ως έλεγχος και υποβάλλεται σε επεξεργασία για 24 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Β) ΗΕΥ κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με E2F1 ή eGFP ως έλεγχος και υποβάλλεται σε επεξεργασία για 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνα παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπευτικό 2 πειράματα. Γ) ΗΕΥ κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Δ) ΗΕΥ κύτταρα επιμολύνθηκαν με Rb siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Ε) ΗΕΥ κύτταρα επιμολύνθηκαν με Rb siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 48 ώρες με 300 μΜ δικλοφενάκη ή ινδομεθακίνη, τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνα παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπευτικό από 3 πειράματα.

Η

ρετινοβλάστωμα πρωτεΐνη (Rb) μπλοκάρει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω αναστολής E2F1 και κλείδωμα επακόλουθη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων σημαντικών για την είσοδο στην S φάση. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου Rb μειώθηκαν κατά την κατεργασία με ΜΣΑΦ (Σχήμα 5C), ενδεικτικό της Rb ενεργοποίησης. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του Rb να διερευνηθεί περαιτέρω η E2F1 συμμετείχε στις ενέργειες των ΜΣΑΦ (Σχήμα 5D), όπως φίμωση Rb χρησιμοποιώντας μικρές παρεμβολές (SI) RNA θα πρέπει να μιμούνται την ενεργοποίηση του E2F1. Η θεραπεία με Rb siRNA αύξησε την επιβίωση των ΗΕΥ κύτταρα επεξεργασμένα με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη (Σχήμα 5Ε), υποδηλώνοντας ότι η αναστολή E2F1 ή προς τα κάτω ρύθμιση θα μπορούσαν να συμμετέχουν στις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις των ΜΣΑΦ σε αυτά τα κύτταρα.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, έχουμε αξιολογήσει τις επιπτώσεις της ΜΣΑΦ δικλοφαινάκη και ινδομεθακίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με τα αποτελέσματα της ινδομεθακίνης in vivo σε επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. Εδώ αναφέρουμε ότι η ινδομεθακίνη μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων HEY κατά 22% σε γυμνούς ποντικούς, υποδηλώνοντας ότι η ινδομεθακίνη μπορεί να μειώσει την πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών σε βιολογικό περιβάλλον. Επιπλέον, αναφέρουμε ότι η δικλοφενάκη μείωσε σημαντικά την αύξηση του HEY ξενομοσχεύματα. Αυτό είναι σύμφωνο με μια πρόσφατη μελέτη αναφέρει ότι η δικλοφενάκη μείωσε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών SKOV-3 ξενομοσχεύματα [12]. Αν και τα αποτελέσματα μας είναι σε συμφωνία, στην μελέτη μας βρήκαμε μια ελαφρώς καλύτερη επίδραση του diclofenac (33% έναντι 20%) και τα αποτελέσματα ήταν εμφανή νωρίτερα (μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας vs 8 εβδομάδες). Αυτό μπορεί να οφείλεται εν μέρει σε διαφορές στη λειτουργία παράδοσης (ενδοπεριτοναϊκή vs στη διατροφή). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας αποδεικνύει ότι αυτά τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα έχουν ανασταλτική επί της ανάπτυξης επιδράσεις in vivo.

ινδομεθακίνη και diclofenac έχουν δειχθεί να επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [12], [20], [21 ], [22], [23], [24]. Στη μελέτη μας, η ινδομεθακίνη και η δικλοφενάκη μειωμένη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, τουλάχιστον εν μέρει μέσω της επαγωγής διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών που εξετάστηκαν. Diclofenac και η ινδομεθακίνη είχε διαφορετικά αποτελέσματα επί του κυτταρικού κύκλου, ενώ ινδομεθακίνη προκάλεσε μία σύλληψη G1, δικλοφενάκη προκάλεσε μια συσσώρευση των κυττάρων στο φάσης S και G2 σύλληψης. Τα αποτελέσματα της ινδομεθακίνης είναι συνεπή με προηγούμενες μελέτες στις οποίες η ινδομεθακίνη έχει επίσης αναφερθεί ότι επάγει G1 σύλληψη σε μία ποικιλία κυττάρων [20], [21], [22], [25]. Ωστόσο, μόνο δύο προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει επιδράσεις του diclofenac στον κυτταρικό κύκλο: σε λεία μυϊκά κύτταρα, που προκαλείται από δικλοφενάκη G1 σύλληψης [22], ενώ σε κύτταρα γλοιώματος ποντικού diclofenac επάγεται G2 σύλληψης [26]. Στη μελέτη μας, η δικλοφενάκη που προκαλείται από τη συσσώρευση των κυττάρων σε φάση S και G2 σύλληψη.

Για να αντιμετωπιστεί η διαφορά που παρατηρείται ως προς τις επιπτώσεις του κυτταρικού κύκλου μεταξύ δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη, προσπαθήσαμε να εντοπίσει διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μετά από θεραπεία με κάθε φάρμακο. Μεταξύ των mRNAs επικυρωθεί από RT-qPCR, βρήκαμε ότι η πλειονότητα των γονιδίων μεταβάλλεται από κατεργασία δικλοφενάκη επίσης εκφράζονται διαφορικά στα κύτταρα ινδομεθακίνη φάρμακο. Ως εκ τούτου, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες των γονιδίων αυτών δικαιολογείται να καθορίσει τι προκαλεί τις διαφορές ως προς τις επιπτώσεις του κυτταρικού κύκλου από δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη.

WebGestalt Μεταγραφή Factor ανάλυση των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά από δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη προέβλεψε ότι πολλά από τα γονίδια μειωτικά από δικλοφενάκη είναι γονιδίων στόχων του E2F1. E2F1 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ελέγχει τον κυτταρικό κύκλο, με την ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων που απαιτούνται για την είσοδο στην S φάση. E2F1 υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό καρκίνων, και η υπερέκφραση της έχει γενικά συνδέεται με κακή πρόγνωση [27], [28], [29], [30]. Στις γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών, η υπερέκφραση του E2F1 έχει συσχετιστεί με μειωμένη επιβίωση ελεύθερη νόσου και μειωμένη συνολική επιβίωση [31], [32]. Σε προηγούμενες μελέτες, η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ή /και της δραστηριότητας των E2F1 από ΜΣΑΦ θεωρήθηκε για να συμβάλει στις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις των ΜΣΑΦ [20], [33], [34], [35], [36], [37 ]. Έχει αναφερθεί ότι η δραστηριότητα του E2F1 ρυθμίζεται προς τα κάτω από τα ΜΣΑΦ celecoxib και σουλινδάκη [20]. Στην ίδια μελέτη, η ινδομεθακίνη δεν μειώνουν τη δραστικότητα του E2F1 στην κυτταρική γραμμή κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκινώματος UM-SCC-1. Εδώ, αναφέρουμε ότι E2F1 ήταν μειωτικά στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης στα τρεις κυτταρικές γραμμές ωοθηκών εξετάζονται από θεραπεία με δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη. Η υπερέκφραση του E2F1 σε κύτταρα ΗΕΥ διασωθεί κύτταρα από τα anti-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα των NSAIDs που οδηγεί σε αυξημένη επιβίωση, υποδεικνύοντας ότι E2F1 μεσολαβεί εν μέρει τις επιδράσεις των ΜΣΑΦ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η χρήση των NSAIDs θα μπορούσε να είναι θεραπευτικά σχετικές, ιδίως για ένα υποσύνολο των καρκίνων των ωοθηκών που υπερεκφράζουν E2F1, και τα οποία προβλέπεται να έχουν φτωχή πρόγνωση.

Μεταξύ των μεταγραφές εκφράζονται διαφορικά σε diclofenac- και ινδομεθακίνη κατεργασμένα κύτταρα ήταν

MCM2

,

MCM4

,

PCNA

και

RRM2

mRNAs, όλοι τους στόχους της E2F1 και σημαντικό για την αντιγραφή και του κυτταρικού κύκλου προχώρηση. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι RRM2, PCNA και MCM2 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω κατά την κατεργασία με το NSAID NS-398 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [38]. Προς τα κάτω ρύθμιση του MCM2, και άλλες πρωτεΐνες MCM είχε αναφερθεί ότι επάγει G1 και G2 συλλήψεις [39], [40] που συμβάλλουν στην κυτταρική αναστολή της ανάπτυξης. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι προς τα κάτω ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών θα μπορούσε να συμβάλει στην αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα των NSAIDs σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών στη μελέτη μας.

Εν κατακλείδι, δείχνουμε ότι η δικλοφενάκη και ινδομεθακίνη αναστέλλουν την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων in vitro και σε ένα ζωικό μοντέλο, επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του diclofenac και ινδομεθακίνη διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει μειορύθμιση του E2F1. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την άποψη ότι η χρήση των ΜΣΑΦ μπορεί να είναι θεραπευτικά ευεργετική για τον καρκίνο των ωοθηκών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

επίπεδα πρωτεΐνης των παραγόντων μεταγραφής NFAT και ΑΡ1. Hey, OVCAR5 και UCI-101 κύτταρα κατεργάστηκαν για 24 ώρες με δικλοφενάκη (300 μΜ) ή ινδομεθακίνης (300 μΜ). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα ειδικά για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061836.s001

(TIF)

Πίνακα S1.

παράγοντες μεταγραφής που προβλέπεται από WebGestalt να ρυθμίζουν διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε δικλοφενάκη και τα κύτταρα έλαβαν ινδομεθακίνη. Μεταγραφή συντελεστή εστίασης Ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων σύνολα γονιδίου διεξήχθη χρησιμοποιώντας WebGestalt (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) για τον εντοπισμό των παραγόντων μεταγραφής πιθανόν εμπλέκονται στη ρύθμιση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων.