Αφηρημένο

SIRT3 αποτελεί βασικό NAD

+ – εξαρτώμενη πρωτεϊνική απακετυλάσης στα μιτοχόνδρια των κυττάρων των θηλαστικών, που λειτουργεί για την πρόληψη της γήρανσης των κυττάρων και του μετασχηματισμού μέσω της ρύθμισης της μιτοχονδριακής μεταβολικής ομοιοστασίας. Ωστόσο, SIRT3 βρίσκεται επίσης για να εκφράσει σε ορισμένες ανθρώπινους όγκους? ο ρόλος του σε αυτά τα κύτταρα όγκου SIRT3 εκφράζουν πρέπει να διευκρινιστεί. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η έκφραση του SIRT3 ανυψώθηκε σε μια ομάδα του γαστρικού καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με φυσιολογικά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα. Αν και SIRT3 επίπεδα έκφρασης αυξήθηκαν στα γαστρικά καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς, SIRT3 θετικά καρκινικά κύτταρα ήταν πιο συχνά ανιχνεύονται στο εντερικό τύπο γαστρικών καρκίνων από τη διάχυτη τύπου γαστρικών καρκίνων, υποδεικνύοντας ότι SIRT3 συνδέεται με υποτύπους των γαστρικών Καρκίνος. Η υπερέκφραση του SIRT3 προωθείται πολλαπλασιασμού των κυττάρων και αυξημένη παραγωγή ΑΤΡ, πρόσληψη γλυκόζης, σχηματισμός γλυκογόνο, δραστηριότητα MnSOD και γαλακτικό παραγωγή, οι οποίες αναστέλλονται από SIRT3 knockdown, υποδεικνύοντας ότι SIRT3 παίζει ρόλο στην επαναπρογραμματισμό των βιοενεργητική σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι SIRT3 αλληλεπιδρούν με και απακετυλιωμένος της γαλακτικής αφυδρογονάσης Α (LDHA), μια βασική πρωτεΐνη στη ρύθμιση αναερόβια γλυκόλυση, την ενίσχυση της δραστηριότητας LDHA. Σε συνέπεια, ένα σύμπλεγμα γονιδίων γλυκόλυσης που σχετίζονται ρυθμίζεται αυξητικά στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα SIRT3-υπερεκφράζουν. Έτσι, εκτός από την καλά τεκμηριωμένη SIRT3 μεσολάβηση μιτοχονδριακής ομοιόστασης σε φυσιολογικά κύτταρα, SIRT3 μπορεί να ενισχύσει τη γλυκόλυση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε SIRT3-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν

Παράθεση:. Cui Υ, Qin L, Wu J, Qu Χ, Χου C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Ενισχύει γλυκόλυση και τον πολλαπλασιασμό σε SIRT3-Εκφράζοντας κύτταρα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Επιμέλεια: Xianglin Shi, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 16, Απριλίου, 2015? Αποδεκτές: 13 του Μάη 2015? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, Key Πρόγραμμα (30930105), Εθνικό 12-5 Στήριξης σχέδιο Έργου του Υπουργείου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2012BAH30F03), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31.070.740), το 985 και το 211 έργα του Xi’an Jiaotong University (JKL), και του National Cancer Institute RO1 επιχορήγηση CA152313-01-Α1 (JJL).

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

sirtuins, μια οικογένεια NAD

+ – εξαρτώμενη από αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) σε θηλαστικά κύτταρα, εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα των φυσικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένων κυτταρική επιβίωση, απόπτωση, τον μεταβολισμό, αποκρίσεις στρες, γήρανση και μακροβιότητα [1,2]. Μεταξύ επτά sirtuin μέλη (SIRT1-7), SIRT3 είναι το καλύτερα χαρακτηρισμένο μιτοχονδριακό sirtuin, λειτουργούν για τη ρύθμιση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οξειδωτική φωσφορυλίωση, οξείδωση των λιπαρών οξέων, του κύκλου της ουρίας, και το αντιοξειδωτικό απόκριση [2-9]. Αρκετές μελέτες έχουν αναδείξει το ρόλο των SIRT3 στο μεταβολισμό και την ομοιόσταση σε φυσιολογικά κύτταρα και αποκάλυψε νέους στόχους και υποστρώματα για SIRT3-εξαρτώμενη αποακετυλίωση [10]. Kim et al ανέφεραν ότι SIRT3 αποτελεί βασικό πρωτεΐνη μιτοχόνδρια, και η έλλειψη της έκφρασης SIRT3 συνδέεται με αυξημένο μιτοχονδριακό βλάβης του DNA και τη γήρανση, καθώς και η αυξημένη δυνατότητα να Ras επαγόμενη μεταμόρφωση κυττάρων και την ενεργοποίηση MnSOD SIRT3 μεσολάβηση συμβάλλουν στην μιτοχονδριακή ομοιόσταση [11,12]. Προς στήριξη, κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293 κύτταρα (ΗΕΚ293) επιδεικνύουν μια ενισχυμένη έκφραση SIRT3 υπό οξειδωτικό στρες, που οδηγεί σε αποακετυλίωση και την ενεργοποίηση του MnSOD [13]. SIRT3 πιστεύεται ότι λειτουργεί ως γονίδιο καταστολέας όγκου και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην ενίσχυση της ομοιόστασης των κυττάρων κατά της γήρανσης και την καρκινογένεση.

Ωστόσο, ορισμένα κύτταρα όγκου παρουσιάζουν την έκφραση του SIRT3 και τον πιθανό ρόλο των SIRT3 σε αυτά τα κύτταρα όγκου , ιδιαίτερα το δυναμικό σχέση της με το επιθετικό φαινότυπο, υπήρξε αμφιλεγόμενη [14]. SIRT3 έκφραση είναι χαμηλότερη ή μη ανιχνεύσιμα σε μία συστοιχία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, γλοιοβλάστωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου, και του οστεοσαρκώματος, του προστάτη και των ωοθηκών [11,15,16]. SIRT3 επάγει διακοπή αύξησης και απόπτωση με επιλεκτική αποσιώπηση του Bcl-2 σε κύτταρα HCT116 μέσω διαμόρφωσης JNK2 μονοπάτι σηματοδότησης [17]. Επίσης, SIRT3 φέρεται να συμβάλλει σε αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων ανθρώπινης λευχαιμίας σε χημειοθεραπεία πιθανώς μέσω της επαγωγής των μιτοχονδρίων απόπτωσης που διαμεσολαβείται [18]. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση SIRT3 επίσης βρέθηκε να αυξάνεται σε καρκίνο του στόματος, ο κόμβος-θετικό καρκίνο του μαστού, καρκίνο του οισοφάγου, καρκινώματα του θυρεοειδούς και? και η αυξημένη SIRT3 σχετίζεται με υψηλότερη κακοήθη φαινότυπο και προς τα κάτω ρύθμιση SIRT3 ενισχύει την ευαισθησία του όγκου σε αντικαρκινική θεραπεία [19-23]. Αυτά τα αποτελέσματα ειδοποιεί έναν διαφορετικό ρόλο των SIRT3 σε συγκεκριμένους όγκους που πρέπει να διευκρινιστεί.

Τα καρκινικά κύτταρα είναι μεταβολικά ενεργοί και καταναλώνουν περισσότερο κυτταρικό καύσιμο από τα φυσιολογικά κύτταρα. Ωστόσο καρκινικά κύτταρα ρελέ επί κυρίως στη σύνθεση ΑΤΡ με αερόβια γλυκόλυση, ένα χαρακτηριστικό γνωστό ως Warburg αποτέλεσμα [24]. Μια τέτοια αερόβια γλυκόλυση πιστεύεται ότι προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα σχηματίζουν το οξειδωτικό στρες αφού μιτοχονδριακή αναπνοή είναι η κύρια πηγή των ενδοκυτταρικών ROS [25]. Η γαλακτική αφυδρογονάση A (LDHA) είναι ένα ένζυμο που ελέγχει ενδομετατροπή μεταξύ πυροσταφυλικό και L-γαλακτικού αναστρέψιμα στο τελικό στάδιο της αναερόβια γλυκόλυση [26]. Η αναστολή της LDHA μειώνει την ογκογόνο δυναμικό με αυξημένη μιτοχονδριακό κατανάλωση οξυγόνου και μειωμένο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης [26] και τη συνολική κυτταρική παραγωγή και τη γλυκόλυση [27]. ΑΤΡ

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο των SIRT3 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν SIRT3. Η έκφραση του SIRT3 συνδέθηκε με την επιθετική ανάπτυξη, η οποία διαμεσολαβείται μέσω SIRT3-αποακετυλιωμένη και ενεργοποιούνται LDHA, ενισχύοντας γλυκόλυση και έκφραση μιας ομάδας γονιδίων που γλυκόλυσης που σχετίζονται. Έτσι SIRT3-LDHA-μεταβολισμού μέσω γλυκόλυση μπορεί να είναι ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία των καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν SIRT3.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] και AGS [29] και αθανατοποιημένα ανθρώπινα γαστρικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή GES-1 [30] διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C υπό ατμόσφαιρα 5% CO2.

Ανοσοκαταβύθιση και δυτικές

κηλίδα

Υποσυρρέοντα κύτταρα λύθηκαν και τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν με πρωτεΐνη Α /σφαιρίδια αγαρόζης G συν η συνιστώμενη ποσότητα αντισωμάτων εναντίον είτε SIRT3 (Cell Signaling Technology) ή LDHA (Santa Cruze) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα και ακολούθησε επώαση με δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε RT. Οι πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος έγιναν ορατές με κιτ ανίχνευσης ECL (Thermo Fisher).

Ανοσοϊστοχημεία δοκιμασία

Παθολογική διαφάνειες του γαστρικού καρκίνου με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς αναλύθηκαν με δοκιμασία ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκαν ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κιτ ανίχνευσης πολυμερούς για την ανάλυση ανοσοϊστοχημείας αγοράστηκε από Zhongshan Χρυσή Γέφυρα Βιοτεχνολογίας. Εν συντομία, τομές παραφίνης αποκηρώθηκαν και επανα-ενυδατωμένο σε αιθανόλη (100%, 90% και 75%). Οι τομές επωάστηκαν με 3% Η

2O

2 σε RT για 10 λεπτά και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με μη-άνοσο ορό κατσίκας σε RT για 15 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα να SIRT3 (Cell Signaling Technology) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από επώαση δευτερεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού επί 15 λεπτά σε RT. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με αντιδραστήριο ανίχνευσης DAB για 2 λεπτά η κάθε μία, με αιματοξυλίνη και dehydraded σε αιθανόλη (90% και 100%). Οι τομές στερεώθηκαν και η χρώση αναλύθηκε κάτω από το μικροσκόπιο.

κατασκευή πλασμιδίου και την επιμόλυνση των κυττάρων

SIRT3 ολόκληρο μήκους cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR με συνολικό RNA που εκχυλίζεται από GES-1 κύτταρα ως πρότυπο (εκκινητές: 5 ‘CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3’ και 5 ‘CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3’). Το cDNA στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε φορέα pcDNA3.1 + έκφρασης (Invitrogen). Η pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA πλασμίδιο στόχευσης των ανθρωπίνων SIRT3 (5 ‘CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3’) και τον έλεγχο shRNA πλασμίδιο ελήφθησαν από GenePharma. Για τη δημιουργία σταθερών επιμολύνσεων, AGS και SGC-7901 κύτταρα μορφομετατράπηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen) και τα σταθερά διαμολυνθέντα επιλέχθηκαν με 400ug /ml G418 (Gibco).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και προσδιορισμού κλωνογονικότητας

Για την ανίχνευση πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων στα 2 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων υπολογίστηκε τις ημέρες 2, 4, 6, και 8 μετά την επίστρωση. Για την δοκιμασία ικανότητας κλωνισμού, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων με ποικίλες κυτταρικές αριθμούς και καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες και οι αποικίες στη συνέχεια βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, και ο αριθμός των αποικιών (& gt? 50 κύτταρα /αποικία) μετρήθηκε σύμφωνα με τις καθιερωμένες μεθόδους [31].

Μέτρηση της γλυκόζης, γαλακτικού και γλυκογόνο

Η άνευ ερυθρού φαινόλης μέσο χρησιμοποιήθηκε για καλλιέργεια κυττάρων σε 6-φρεατίων για 24 ώρες και τα επίπεδα πρόσληψης γλυκόζης και γαλακτικού γενιάς μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία γλυκόζης Kit και γαλακτικό οξύ Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). Οι σχετικές τιμές κανονικοποιήθηκαν προς τον αριθμό των κυττάρων του κάθε φρεάτιο. Cellular επίπεδα γλυκογόνου ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το γλυκογόνο Assay Kit (Biovision). Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε 200 μΐ νερό σε πάγο, και τα ομογενοποιημένα έβρασαν για 5 λεπτά για την απενεργοποίηση ενζύμων και φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο υλικό. Η παραγωγή γλυκογόνου μετρήθηκε με την τιμή OD στα 570 nm.

Μέτρηση της παραγωγής ΑΤΡ

μετρήθηκαν τα επίπεδα

Cellular ΑΤΡ και ROS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων μετά από διάφορες θεραπείες, λύθηκαν και τα κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν με ΑΤΡ βιοφωταύγεια Assay Kit (Sigma). Για τη μέτρηση της παραγωγής ΑΤΡ γλυκόλυση μεσολάβηση, κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ ροτενόνη για 24 ώρες πριν από τις μετρήσεις.

Μέτρηση της γενιάς ROS

γενιάς Cellular ROS προσδιορίστηκε με 5- (και 6-) καρβοξυ-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFDA) μέθοδος με χρήση φασματόμετρου μικροπλάκας (Thermo Fisher) στα 488 nm /530 nm μήκος κύματος.

δραστικότητα MnSOD

κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε ένα 6-φρεατίων πλάκα λύθηκαν και η δραστικότητα MnSOD προσδιορίστηκε με WST-8 μεθόδους χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας MnSOD (Beyotime) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασίες ογκογονικότητας σε γυμνούς ποντικούς

SGC7901 κύτταρα (7,5 χ 10

6) με SIRT3 υπερέκφραση ή knockdown αιωρήθηκαν σε 0.1 ml PBS και ενοφθαλμίστηκαν σε δύο πτέρυγες 5 εβδομάδων αρσενικούς BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια, και κατά τη 28

ου ημέρα μετά τον εμβολιασμό, όταν ο μέγιστος όγκος του όγκου (~ 1500 mm

3) που επιτεύχθηκε στην ομάδα ελέγχου, τερματίστηκαν τα πειράματα και όλα όγκων από κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε εκτομή και ζυγίστηκαν. Η πειραματική διαδικασία που περιλαμβάνει δοκιμές σε ζώα διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος? η Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) σε Xian Πανεπιστήμιο Jiao Tong εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη (Πρωτόκολλο # 120181).

Γαλακτική αφυδρογονάση δοκιμασία

Η γαλακτικής αφυδρογονάσης δραστικότητα προσδιορίστηκε μετά το καθιερωμένο πρωτόκολλο με μέτρηση του ρυθμού μείωσης της απορρόφησης σε μήκος κύματος 340 nm που προκύπτει από την οξείδωση του NADH [27]. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε δίσκους των 10 cm και ομογενοποιείται σε PBS επί πάγου. Τα ομογενοποιήματα προστέθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 6,6 mM NADH, 30 mM πυρουβικό νάτριο και 0,2 Μ Tris-HCI, ρΗ 7.3 και αναμίχθηκαν. Επωάστε το μείγμα για 5 λεπτά για να επιτευχθεί εξισορρόπηση της θερμοκρασίας και στη συνέχεια καταγράφει το ρυθμό μείωσης της απορρόφησης στα 340 nm.

SIRT3

in vitro

αποακετυλίωσης προσδιορισμού

Ανθρώπινο SIRT3 ανασυνδυασμένο ένζυμο ( BPS) επωάστηκε με L-γαλακτική αφυδρογονάση από την καρδιά βοδιού (Sigma) σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (50 mM NaCl, 4 mM MgCl

2, 10 mM NAD

+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, ρΗ 8.0) με /χωρίς αναστολέα SIRT3 νικοτιναμιδίου (ΝΑΜ, 10 mM) στους 37 ° C για 1,5 ώρες, και στη συνέχεια οι αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία δραστικότητας LDHA περιγράφονται ως ανωτέρω.

Real-time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen) ακολουθούμενη από κατεργασία με φαινόλη /χλωροφόρμιο και καθίζηση με 2-προπανόλη. Ολικό RNA σφαιρίδιο στη συνέχεια πλύθηκε με 75% αιθανόλη και επαναιωρήθηκε σε νερό. Το RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή με Kit PrimeScript RT-PCR (Takara) και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση των γονιδίων που ενδιαφέρουν διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ SYBR PremixExTaq II (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο του γ-τουμπουλίνης.

ανοσοφθορισμού

AGS κύτταρα σπάρθηκαν στην καλυπτρίδα σε μια πλάκα 6 φρεατίων σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν σε 1% BSA για 1 ώρα σε RT. Τα κύτταρα επωάζονται με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια SIRT3 και LDHA στους 4 ° C όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με φθορισμό για 1 ώρα σε RT. Αντιχρωματισμός διεξήχθη με DAPI χρησιμοποιώντας κιτ ανοσοφθορισμού (Beyotime). Τα κύτταρα τοποθετούνται και απεικονίστηκαν με σάρωση με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με t test unpaired two-tailed Student, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.

P

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

έκφραση SIRT3 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

SIRT3 είναι καλά καθορισμένη στη ρύθμιση της ομοιόστασης των μιτοχονδρίων στην αντι-γήρανση και αντι-μετασχηματισμού. Πρόσφατα, τα διαφορετικά αποτελέσματα που αναφέρθηκαν σχετικά με την αναστολή κύτταρο SIRT3 μεσολάβηση και τον πολλαπλασιασμό, που οδηγεί στην αντιπαράθεση από τους ρόλους της σε καρκίνους [19,20]. Για να προσδιοριστεί ο πιθανός ρόλος των SIRT3 σε γαστρικό καρκίνο, η έκφραση του SIRT3 ανιχνεύθηκε σε 4 γαστρικού γραμμές AGS καρκινικού κυττάρου, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 και μία ομάδα του γαστρικού ιστών όγκου του καρκίνου. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT3 ήταν αυξημένα σε όλες τις 4 γαστρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου σε σύγκριση με τα αθανατοποιημένα γαστρικού επιθηλίου GES-1 κύτταρα (AGS, 1,9 φορές? SGC-7901, 1,5 φορές? MGC-803, 2.0 φορές? Και HGC -27, 1,8 φορές σε σύγκριση με GES-1 κύτταρα) (Σχήμα 1Α). Σύμφωνα, τα επίπεδα mRNA του SIRT3 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές αυξήθηκαν επίσης (AGS, 2,6-φορές? SGC-7901, 1,7 φορές? MGC-803, 2.5 φορές? HGC-27, 2,2 φορές) σε σύγκριση με GES- 1 κύτταρα (Σχήμα 1Β).

Α, τα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT3 προσδιορίστηκαν με κηλίδα western σε 4 γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και μια κανονική αθανατοποιημένα γαστρικό επιθήλιο κυτταρική γραμμή GES-1 (άνω πάνελ). SIRT3 έκφραση πρωτεΐνης δοκιμάστηκαν σε τρεις χωριστές κηλίδες Western εκτιμήθηκε με μέτρηση της έντασης ζώνη χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό και κανονικοποιημένο με β-ακτίνης (κάτω πάνελ). Β, τα επίπεδα mRNA SIRT3 ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR σε 4 γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε αθανατοποιημένα φυσιολογικό γαστρικό κύτταρα επιθηλίου. Στο (Α, Β), τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± S.E. (N = 3? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01). C, η έκφραση SIRT3 σε ανθρώπινο γαστρικό ιστούς όγκου (n = 29) και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου (n = 14) ανιχνεύθηκε με χρώση ανοσοϊστοχημείας. SIRT3 επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν με σάρωση πυκνότητας χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό και βαθμολογείται ως αρνητικό, ασθενές θετικό και ισχυρό θετικό. μπαρ κλίμακα, 50 μm. D, η έκφραση SIRT3 στον όγκο και παρακείμενων ιστών μη-όγκου παρουσιάστηκε ως ποσοστό των δειγμάτων των ασθενών. E, έκφραση SIRT3 σε εντερικό (n = 18) και διάχυτη (n = 11) τύπους των γαστρικών ιστών όγκου παρουσιάστηκε ως ποσοστό των δειγμάτων των ασθενών.

Η

ανάλυση Ανοσοϊστοχημεία στον όγκο και τις παρακείμενες μη-όγκου κανονική ιστοί από μία ομάδα ασθενών με γαστρικό καρκίνο έδειξαν ότι SIRT3-θετικά κύτταρα ήταν πιο συχνά ανιχνεύσιμα σε καρκινικούς ιστούς από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 55,1% των καρκινικών ιστών (7% των φυσιολογικών ιστών) εμφάνισαν υψηλό επίπεδο (ισχυρή θετική), 41,4% των καρκινικών ιστών (28% των φυσιολογικών ιστών) εμφάνισαν μέσο υψηλής στάθμης (ασθενώς θετικό), ενώ 3,5% του όγκου ιστών και 64% των φυσιολογικών ιστών ήταν αρνητική έκφραση SIRT3 (Σχ 1C και 1D, S1A Σχ). Είναι ενδιαφέρον ότι, SIRT3 έκφραση σε εντερικό είδος των ιστών όγκου (15 περιπτώσεις? 93,3% ισχυρό θετικό και 6,6% ασθενώς θετικών) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε διάχυτη τύπου ιστών όγκου (14 περιπτώσεις? 14,3% ισχυρό θετικό, 78,6% ασθενή θετικό και 7.1 % αρνητική) (εικ 1C και 1Ε, S1B σχήμα). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση SIRT3 είναι αυξημένη σε μερικούς όγκους σε σύγκριση με σχετικές φυσιολογικούς ιστούς και SIRT3 έκφραση μπορεί να ποικίλει σε επιμέρους όγκους, οι οποίες πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω.

Τα επίπεδα SIRT3 συνδέονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

Στη συνέχεια, ιδρύσαμε SIRT3 υπερέκφραση και νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας AGS και SGC-7901 κύτταρα. Η έκφραση του SIRT3 σε σταθερά επιμολυσμένα επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western. Η υπερέκφραση του SIRT3 αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη, ενώ SIRT3 knockdown ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη και των δύο κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (Σχήμα 2Α). Περαιτέρω, η υπερέκφραση του SIRT3 ενεργοποιείται περισσότερο το σχηματισμό αποικιών από έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα που ήταν σε αντίθεση με μόνο λιγότερες αποικίες που σχηματίζονται στα SIRT3 knockdown κυττάρων (Σχήμα 2Β).

Α, την ανάπτυξη των κυττάρων του AGS και SGC-7901 κυττάρων με SIRT3 υπερέκφραση ή knockdown υπολογίστηκε τις ημέρες 2, 4, 6 και 8 μετά κυττάρων επιμετάλλωσης. έκφραση SIRT3 σε σταθερά επιμολυσμένα επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western. Β, κλωνογονικότητας του AGS και SGC-7901 κυττάρων με SIRT3 υπερέκφραση ή knockdown μετρήθηκε και παρουσιάζεται ως το κλάσμα των επιμολύνσεων ελέγχου (NC ή SCR). C, η υπερέκφραση του SIRT3 προωθούνται φορτίου όγκου in vivo. SGC-7901 κυττάρων με SIRT3 υπερέκφραση (αριστερό πάνελ) ή knockdown (δεξί πάνελ) εγχύθηκαν υποδορίως σε δεξί πλευρό της γυμνών ποντικών με τις σχετικές κύτταρα ελέγχου (NC ή SCR) στο αριστερό πλευρό. Ξενομοσχεύματος όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν στο 28

ης ημέρας μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων. Εικόνες δεξιά πάνελ έδειξαν όγκους ξενομοσχεύματος in vivo κατά το τέλος του πειράματος. Εικόνες μέχρι δεξιά γωνία έδειξε τα τεμαχίζεται όγκοι από κάθε ομάδα. Οι περιοχές και τα μέσα βάρη των όγκων από κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε δεξιά πάνελ όπως σημαίνουν ± S.E. (N = 5? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01). SIRT3, SIRT3 υπερέκφραση? shSIRT3, SIRT3 νοκ ντάουν? NC (αρνητικός μάρτυρας? Άδειο pcDNA3.1) και SCR (αγωνίζομαι shRNA? PGPH1 /GFP /Neo-shRNA) χρησιμεύουν ως μάρτυρες για pcDNA3.1-SIRT3 και pGPH1 /GFP /Neo-shSIRT3 αντίστοιχα

Η

για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος των SIRT3 στην ικανότητά σχηματισμό όγκου, ενέθηκε SIRT3 υπερέκφραση και knockdown SGC-7901 κύτταρα σε λαγόνες γυμνών ποντικών και η ανάπτυξη του όγκου αφέθηκε για 28 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων (S2 Εικ). Το μέσο βάρος των όγκων που προέρχονται από κύτταρα που υπερεκφράζουν SIRT3 ήταν 0.7079g, σημαντικά μεγαλύτερο από το μέσο βάρος όγκου του ελέγχου (NC),

σ

= 0.015, (Σχήμα 2C, αριστερό πάνελ). Αντίθετα, το μέσο βάρος των όγκων που προέρχονται από SIRT3 νοκ ντάουν κύτταρα ήταν 0.0588g, σημαντικά μικρότερο από εκείνο από αγωνίζομαι κύτταρα ελέγχου shRNA (SCR) (0.2033g?

σ

= 0,009) (Εικόνα 2C, δεξιά πλευρά) . Ο μέσος όγκος των όγκων που προέρχονται από κύτταρα που υπερεκφράζουν SIRT3 αυξήθηκε από εκείνη από κύτταρα ελέγχου (NC) (Σχ 2C, αριστερό πάνελ επάνω δεξιά γωνία). Αντίθετα, ο μέσος όγκος των όγκων που αναπτύσσονται από SIRT3 knockdown κυττάρων ήταν δραματικά μικρή σε σύγκριση με εκείνη από κύτταρα ελέγχου (SCR) (Σχήμα 2C, δεξιός πίνακας επάνω δεξιά γωνία).

Ενισχυμένη γλυκόλυση σε SIRT3 εκφράζουν γαστρικό καρκίνο κύτταρα

στη συνέχεια αναρωτιούνται πώς κυτταρική βιοενεργειακό θα μπορούσε να μεταβληθεί σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα SIRT3-υπερεκφράζουν. SIRT3 υπερέκφραση αυξήθηκε δραματικά πρόσληψη γλυκόζης (1,4 φορές σε AGS και 1,9-φορές σε SGC-7901), ενώ SIRT3 knockdown μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης (περίπου 40% και στις δύο AGS και SGC-7901) (Σχ 3Α και 3Β). Συνεπής με το μοτίβο της χρήσης της γλυκόζης, SIRT3 υπερεκφράζουν κύτταρα είχαν αυξημένα επίπεδα γαλακτικού έκκρισης (1,2-φορές σε AGS και 1,3-φορές σε SGC-7901), ενώ SIRT3 knockdown κύτταρα είχαν μειωμένα επίπεδα γαλακτικού έκκριση (55% σε AGS και 45 % σε SGC-7901) (Σχ 3C και 3D). Βρήκαμε επίσης ότι ο σχηματισμός του γλυκογόνου αυξήθηκε σημαντικά από την SIRT3 υπερέκφραση (1,5-φορές σε AGS και 1,3-φορές σε SGC-7901), ένα χαρακτηριστικό της ταχείας αύξησης των κυττάρων του όγκου [33], ενώ μειώνεται κατά SIRT3 knockdown (40% σε AGS και 70% σε SGC-7901) (Σχήμα 3Ε και 3F).

Η πρόσληψη γλυκόζης, γαλακτικού σχηματισμό παραγωγή και γλυκογόνου μετρήθηκαν σε AGS (A, C, E) και SGC-7901 (B, D, F ) κυττάρων με SIRT3 υπερέκφραση ή knockdown. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.E. (N = 3? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01).

Η

SIRT3 έχει αποδειχθεί συμμετέχουν στην αποακετυλίωση της παγκόσμιας ενζύμων του μεταβολισμού και τη συντήρηση των βασικών επιπέδων ΑΤΡ στα κύτταρα, τόσο σε κανονική κατάσταση και σε ασθένειες [1,2]. Σύνολο ATP και γλυκόλυση ATP γενιά κυτταρική ανιχνεύθηκαν στο AGS και SGC-7901 κύτταρα είτε με SIRT3 υπερέκφραση ή SIRT3 νοκ ντάουν. Τα συνολικά κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ ήταν αυξημένα σε SIRT3 υπερεκφράζουν κύτταρα (περίπου 1,3 φορές σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές), αλλά μειώθηκε σε SIRT3 knockdown κυττάρων (περίπου 75% και στις δύο κυτταρικές σειρές) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου NC ή SCR (Σχ 4Α και 4Β) . Στη συνέχεια, αντιμετωπίζονται κύτταρα με ροτενόνη να αναστέλλει την οξειδωτική φωσφορυλίωση, και δοκιμάζεται ΑΤΡ γενιάς από την γλυκόλυση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ και 4Δ, SIRT3 υπερέκφραση οδήγησε σε αύξηση της παραγωγής γλυκόλυση ΑΤΡ (1,4 φορές σε AGS και 1,6-φορές σε SGC-7901), ενώ SIRT3 knockdown οδήγησε σε σημαντική μείωση της παραγωγής γλυκόλυση ΑΤΡ (20% σε AGS και 40% στις SGC-7901) σε σύγκριση με NC ή Scr ελέγχου.

Α και Β, το ολικό κυτταρικό επίπεδα ΑΤΡ δοκιμάστηκαν σε AGS (Α) και SGC-7901 (Β κύτταρα) με SIRT3 υπερέκφραση ή ρίχνω κάτω. Γ και Δ, AGS (C) και SGC-7901 (D) κύτταρα με υπερέκφραση SIRT3 ή knockdown υποβλήθηκαν σε αγωγή με ροτενόνη (2 μΜ, 24 ώρες) για να αναστείλουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση και στη συνέχεια κυτταρόπλασμα μετρήθηκαν τα επίπεδα ΑΤΡ. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν από τον έλεγχο των κυττάρων (NC ή SCR) και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. (N = 3? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01)

Η

SIRT3 ρυθμίζει την ομοιόσταση των ROS στη γαστρική. καρκινικά κύτταρα

ένα σώμα της στοιχεία υποστηρίζουν ότι το αυξημένο επίπεδο των ROS είναι ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία καθιστούν τα καρκινικά κύτταρα πιο ευαίσθητα στην πρόσθετη πίεση ROS [34]. Εδώ βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του SIRT3 μειωμένα επίπεδα ROS σε 70% και 80% σε AGS και SGC-7901 κύτταρα, ενώ η αναστολή της έκφρασης SIRT3 αυξημένα επίπεδα ROS (1,4 φορές σε AGS κύτταρα και 1,6-φορές σε SGC-7901 κύτταρα) αντίστοιχα (Σχήμα 5Α και 5Β). Σε συμφωνία με την βιβλιογραφία που δείχνουν αποακετυλιωμένα άλατα SIRT3 και ενεργοποιεί MnSOD (11, 12), γαστρικό καρκίνο κύτταρα, η δραστικότητα MnSOD ενισχύθηκε με SIRT3 υπερέκφραση (1,4 φορές σε AGS κύτταρα και 1,2-φορές σε SGC-7901 κύτταρα), αλλά μειώνεται κατά knockdown SIRT3 (50% σε κύτταρα AGS και 65% σε SGC-7901 κύτταρα) (Σχήμα 5C και 5D), προτείνοντας ότι SIRT3 μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από βλάβη με την επανεξισορρόπηση ενδοκυτταρική ROS μέσω ενίσχυσης της δραστηριότητας MnSOD σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα.

Α και Β, κυτταρικά επίπεδα ROS σε AGS (Α) και τα κύτταρα SGC-7901 (Β) που φιλοξενούν SIRT3 υπερέκφραση και knockdown ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο χρώσης DCFH2 και παριστάνεται ως σχετικό επίπεδο κανονικοποιήθηκαν με έλεγχο (NC ή SCR). Γ και Δ, δραστικότητα MnSOD μετρήθηκε σε κύτταρα που αναφέρονται στο (Α και Β) και παριστάνεται ως σχετική δραστικότητα κανονικοποιήθηκε με μάρτυρα (NC ή SCR). Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.E. (N = 3? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01).

Η

αποακετυλιωμένα άλατα SIRT3 και ενεργοποιεί LDHA

LDHA διαδραματίζει καίριο ρόλο στην έναρξη του όγκου, τη συντήρηση και την εξέλιξη. Η αναστολή της δραστηριότητας LDHA μπλοκ ογκογονικότητα και την εξέλιξη του όγκου [26,27] και η δραστικότητα LDHA μπορεί να ρυθμίζεται με τροποποίηση ακετυλίωση /αποακετυλίωσης [35]. Αναρωτιόμασταν αν SIRT3 εμπλέκεται στη ρύθμιση της δραστηριότητας LDHA. Βρήκαμε ότι, σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, η δραστικότητα LDHA ήταν σημαντικά αυξημένη σε SIRT3 υπερεκφράζουν κύτταρα, ενώ μειώθηκε σε SIRT3 knockdown κυττάρων σε σύγκριση με NC ή τον έλεγχο Scr κύτταρα χωριστά, χωρίς ανιχνεύσιμη αλλαγή στο επίπεδο της πρωτεΐνης LDHA στα σταθερά επιμολυσμένα (Σχήμα 6Α). Η ανοσοχρώση αποτελέσματα έδειξαν ότι LDHA και SIRT3 συν-εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 6Β), και την ανάλυση συν-IP είτε με LDHA ή αντίσωμα SIRT3 αποκάλυψε ότι SIRT3 είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με LDHA (Σχήμα 6C). Επιπλέον, το επίπεδο της ακετυλίωσης LDHA ήταν μειωμένη σε SIRT3 υπερεκφράζουν κύτταρα, αλλά αυξήθηκε το SIRT3 knockdown κυττάρων (Σχήμα 6D). Περαιτέρω,

in vitro

LDHA δοκιμασία δραστικότητας διεξάγεται με τη χρήση εμπορικών ανθρώπινο ανασυνδυασμένο SIRT3 και καρδιά βοδιού L-γαλακτική δεϋδρογενάση έδειξε ότι η δραστικότητα LDHA αυξήθηκε με την παρουσία του SIRT3 στην αντίδραση, η οποία αντιστράφηκε με την προσθήκη του αναστολέα SIRT3 , νικοτιναμίδη (6Ε σχήμα). Για τον εντοπισμό δυνητικών ιστοσελίδα (ες) SIRT3 αποακετυλίωση για LDHA, ψάξαμε βάση δεδομένων και διαπίστωσε ότι Κ5, Κ14, Κ57, Κ81, K118, K126, K222 και K318 είναι πιθανές θέσεις ακετυλίωση της LDHA και η προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι Κ5 ακετυλίωση /αποακετυλίωση ήταν εμπλέκεται στη ρύθμιση της δραστηριότητας LDHA [35]. Στη συνέχεια κάναμε δοκιμασία δραστηριότητας LDHA χρησιμοποιώντας λυσίνη 5 και λυσίνη 318 ακετυλίωση μιμούνται (K5Q /K318Q) ή αποακετυλίωσης μιμούνται (K5R /K318R) μεταλλαγμένο LDHA, και διαπίστωσε ότι ούτε Κ5 ούτε K318 ήταν απαραίτητη για την ενεργοποίηση SIRT3 μεσολάβηση LDHA (S3 Εικ). Περαιτέρω ταυτοποίηση των SIRT3 μεσολάβηση LDHA απακετυλίωση έχει ανάγκη.

Α, δραστηριότητα LDHA μετρήθηκε στο AGS και SGC-7901 κύτταρα με SIRT3 υπερέκφραση ή νοκ ντάουν και εκπροσωπήθηκαν ως σχετική δραστηριότητα κανονικοποιούνται με έλεγχο (NC ή SCR). έκφραση LDHA σε SIRT3 υπερέκφραση και knockdown AGS κύτταρα αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Β, συν-εντοπισμό των SIRT3 και LDHA ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση σε AGS κύτταρα με αντι-SIRT3 (πράσινο) και αντι-LDHA (κόκκινο) αντισώματα. Πυρήνες conterstained με DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακα, 5 μm. C, LDHA ανοσοκατακρημνίστηκε (IP) που ακολουθείται από κηλίδα western (WB) του LDHA ή SIRT3, ή να αντιστρέψει, στο AGS γαστρικά καρκινικά κύτταρα. ΙΡ με μη-άνοσο IgG αίγας χρησιμεύει ως αρνητικός έλεγχος, και ανοσοστύπωση της συνολικής κυτταρολυμάτων (εισόδου) χρησιμεύει ως μάρτυρας ίση φόρτωση ΠΕ. D, SIRT3 ενισχυμένη αποακετυλίωση LDHA σε AGS κύτταρα ανιχνεύθηκε με ΙΡ με αντι-LDHA ακολουθούμενη από στύπωμα western με αντι-LDHA και αντι-ακετυλο-λυσίνη αντισώματα. Western blot του συνολικά κυτταρολύματα με αντίσωμα SIRT3 να δείξει την έκφραση των επιμολυσμένων πρωτεΐνης. Ε, LDHA ενζυματική δραστικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας εμπορική καρδιά βοοειδών L-γαλακτική αφυδρογονάση και ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ένζυμο SIRT3 με /χωρίς αναστολέα SIRT3 νικοτιναμιδίου. F, LDHA ενζυματική δραστικότητα μετρήθηκε με τη χρήση εμπορικών ανασυνδυασμένου ενζύμου ανθρώπινης SIRT3 και ανοσοκατακρημνίσθηκαν LDHA από κύτταρα AGS επιμολυσμένα με K5Q /R ή K318Q /R μεταλλαγμένο LDHA με /χωρίς αναστολέα SIRT3 νικοτιναμιδίου και παρουσιάζονται ως σχετική ενζυμική δραστικότητα κανονικοποιήθηκε με άγριου τύπου LDHA χωρίς αναστολέα SIRT3 . Στο Α, Ε και F, τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± S.E. (N = 5? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01).

Η

SIRT3 απορυθμίζει γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό μεταβολισμό

Για να χαρακτηρισθεί η μοριακή υπογραφή του SIRT3-LDHA μεσολάβηση βιοενεργητική στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, μετρήθηκε η έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τη μεταφορά της γλυκόζης και γλυκόλυσης. Τα δεδομένα στο Σχήμα 7Α και 7Β έδειξε ότι η υπερέκφραση του SIRT3 σε AGS ή SGC-7901 που προκαλείται από την έκφραση της πρωτείνης hK2 (1,47-φορές σε AGS κύτταρα, 1,3-φορές σε SGC-7901 κύτταρα), MCT4 (2,3-φορές σε AGS κύτταρα, 1,34 φορές σε σε SGC-7901 κύτταρα) και GLUT1 (1,55-φορές σε AGS κύτταρα, 1,38-φορές σε SGC-7901 κύτταρα) στο επίπεδο του mRNA εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Αντιθέτως, SIRT3 knockdown μείωσε την έκφραση του γονιδίου HK2 έως 76%, MCT4 έως 73% και GLUT1 σε 62% το AGS κύτταρα, ενώ HK2 έως 80%, MCT4 έως 62% και GLUT1 σε 74% το SGC-7901 κύτταρα. Επιπλέον, όταν SIRT3 υπερεκφράστηκε, επίπεδο MCT1 mRNA ήταν αυξημένη σε AGS κύτταρα κατά 1,6 φορές, αλλά όχι σε SGC-7901 κύτταρα, και όταν SIRT3 ήταν knockdown, MCT1 μειώθηκε στο 59% το AGS και 65% στις SGC-7901 κύτταρα , αντίστοιχα.

Σχετικά επίπεδα mRNA του GLUT1, HK2, MCT1 και MCT4 μετρήθηκαν με qRT-PCR σε AGS (Α) και τα κύτταρα SGC-7901 (Β) με SIRT3 υπερέκφραση ή knockdown. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E. (N = 3? *,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01). (C) Σχηματική παρουσίαση των δυνατοτήτων μηχανισμό με τον οποίο SIRT3 ενεργοποιεί την κυτταρική ανάπτυξη. αποακετυλιωμένα άλατα SIRT3 και ενεργοποιεί LDHA προκαλώντας αυξημένη δραστηριότητα LDHA και κυτταρικών Βιοενέργεια, η οποία μαζί με την ενεργοποίηση MnSOD SIRT3 μεσολάβηση ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη παρέχει τα στοιχεία δείχνουν ότι SIRT3 εξέφρασε σε μερικά καρκινικά κύτταρα, όπως γαστρικό καρκινικά κύτταρα, μπορεί να συνδέεται με την αυξημένη επιθετικότητα με SIRT3 μεσολάβηση βιοενεργητική μέσω αποακετυλίωσης και ενεργοποίηση των LADH. Αν και συσσώρευση αποδείξεις δείχνουν ότι SIRT3 παίζει καθοριστικό ρόλο στην προστασία των φυσιολογικών κυττάρων κατά της γήρανσης και κακοήθη μετασχηματισμό, η λειτουργία του σε ήδη μετασχηματισμένα κύτταρα όπως καρκινικά κύτταρα τα οποία εκφράζουν SIRT3 πρέπει να διερευνηθεί [19]. Έλλειψη SIRT3 σε ΠΜΑ οδηγεί σε γενωμική αστάθεια και υψηλή συχνότητα μετασχηματισμού κυττάρου που προκαλείται από Ras με αυξημένο ρυθμό σχηματισμού όγκων και της γήρανσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι SIRT3 είναι αναγκαία η πρόληψη της κυτταρικής γήρανσης και καρκινογένεση [11,15]. Επιπλέον, η έλλειψη ή χαμηλότερη έκφραση του SIRT3 ανιχνεύεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και επίπεδο SIRT3 συνδέεται με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων προς χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία [11,15,16]. Ωστόσο, SIRT3 δείχνεται επίσης ότι υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους και σχετίζονται με αντοχή θεραπεία [19,21,36]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SIRT3 μπορούν να στοχεύουν διαφορετικές πρωτεΐνες μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, και ότι η έκφραση SIRT3 μπορεί να μεταβάλλεται σε διάφορους τύπους καρκίνου, όπως είναι τα τρέχοντα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εντερική τύπος του καρκίνου του στομάχου εκφράζει ένα υψηλότερο επίπεδο SIRT3 από τη διάχυτη