Αφηρημένο

Ουριδίνη diphosphoglucuronosyltransferases (UGTs) 1A6 είναι το μόνο UGT1A ισομορφή εκφράζεται στον πνευμονικό ιστό. Είναι υπεύθυνη για την αποτοξίνωση των καρκινογόνων όπως benezo [α] πυρένιο από τον καπνό του τσιγάρου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η συσχέτιση των πολυμορφισμών UGT1A6 και απλότυπους με τον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα και για την αξιολόγηση της λειτουργικής σημασίας των πολυμορφισμών UGT1A6. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τα λευκοκύτταρα. Οκτώ πολυμορφισμοί UGT1A6 αλληλουχήθηκαν σε μια δοκιμή σύνολο 72 ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα κινεζικών και 62 υγιείς μάρτυρες. τροποποιώντας αλληλόμορφα δυνητικό κίνδυνο επικυρώθηκαν σε ένα ξεχωριστό σύνολο 95 ασθενών κινεζική καρκίνο του πνεύμονα και 100 υγιείς μάρτυρες. UGT1A6 19T & gt? G, 541A & gt? G και 552a & gt? C έδειξε σημαντική συσχέτιση με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα, ενώ UGT1A6 105C & gt? T και IVS1 + 130G & gt? T συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. Πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε μια σημαντική συσχέτιση του καρκίνου του πνεύμονα με UGT1A6 541A & gt? G (OR: 3,582, 95% CI: 01.27 – 10.04, p = 0,015), 552a & gt? C (OR: 5,364, 95% CI: 1,92 – 14,96, p = 0,001) και IVS1 + 130G & gt? T (OR: 0,191, 95% CI: 0,09 – 0,36, p & lt? 0.001). Λειτουργική δοκιμή έδειξε ότι UGT1A6 105C & gt? T αυξημένη σταθερότητα του mRNA, παρέχοντας μια εύλογη εξήγηση της σύνδεσής του με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. Έτσι UGT1A6 πολυμορφισμοί μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό των ατόμων με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Κουά L-F, Ross S, Lee S-C, Mimura Κ, Kono Κ, Goh Β-C, et al. (2012) UGT1A6 πολυμορφισμοί Διαμορφωμένη τον Καρκίνο του Πνεύμονα κινδύνου σε ένα κινεζικό πληθυσμό. PLoS ONE 7 (8): e42873. doi: 10.1371 /journal.pone.0042873

Επιμέλεια: Rui Medeiros, IPO, Inst Λιμάνι Ογκολογίας, Πορτογαλία

Ελήφθη: 12 Μάρ, 2012? Αποδεκτές: 12 του Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Αυγούστου του 2012

Copyright: © Κουά et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Εθνική Ομάδα Υγείας (Σιγκαπούρη) μικρές καινοτόμες επιχορήγησης [NHG-SIG /06007]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 85% των πρωτογενών καρκίνων του πνεύμονα και περίπου τα δύο τρίτα των ασθενών με NSCLC διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο. Το κάπνισμα έχει συνδεθεί με τον καρκίνο του πνεύμονα [1] – [4], και πάνω από 60 καρκινογόνα είχε εντοπιστεί στον καπνό των τσιγάρων [5] – [7]. Από αυτά, το βενζο [α] πυρένιο (BaP) και 4- (μεθυλονιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη (ΝΝΚ) είναι η πιο μελετημένη. Μεταβολική ενεργοποίηση της ΒΑΡ και ΝΝΚ από το κυτόχρωμα Ρ450 ένζυμα ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό του πιο αντιδραστικό μεταβολιτών που μπορούν να δεσμεύονται ομοιοπολικά με το DNA, ένα σημαντικό βήμα στην πρόκληση καρκίνου του πνεύμονα [8] – [10].

Οι diphosphoglucuronosyltransferases ουριδίνη ( UGTs) ανήκουν σε μία υπεροικογένεια μεταβολίζουν ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την αποτοξίνωση πολυάριθμες endobiotics και ξενοβιοτικών [11]. UGTs είναι υπεύθυνα για την αποτοξίνωση της ΒΑΡ και ΝΝΚ [12] – [15]. Κάτω δραστηριότητα γλυκουρονιδίωση είχε εμπλακεί στην επιδεκτικότητα καρκίνου του πνεύμονα [16]. Επιπλέον, γενετικούς πολυμορφισμούς των UGTs έχουν συσχετιστεί με τον κίνδυνο και την επίπτωση των διαφόρων μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [12], [17] – [20]. Μεταξύ όλων των ισομορφών UGT1A, UGT1A6 είχε αποδειχθεί ότι είναι η μόνη UGT1A ισομορφή εκφράζεται στον πνευμονικό ιστό [21].

Υποθέσαμε ότι πολυμορφισμοί στο UGT1A6 μπορεί να επηρεάσουν την ικανότητα να αποτοξινώνουν πνεύμονα καρκινογόνους καρκίνου και ρυθμίζουν τον κίνδυνο καρκίνου των πνευμόνων . Εδώ, σας παρουσιάζουμε τα ευρήματα μιας μελέτης ασθενών-μαρτύρων χρησιμοποιώντας 2 διαφορετικές ομάδες και λειτουργικά χαρακτηρίζεται UGT1A6 105C & gt?. Τ πολυμορφισμού

in vitro

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης

Ένα σύνολο από 167 κινεζικές περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και 162 Κινέζοι υγιείς μάρτυρες από 2 ανεξάρτητες ομάδες αναλύθηκαν. Η πρώτη ομάδα αποτελείται από 72 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 62 υγιείς μάρτυρες από το Κέντρο Καρκίνου και το Κέντρο Αιμοδοσίας του Εθνικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου, τη Σιγκαπούρη, αντίστοιχα. Μια δεύτερη ομάδα αποτελούνταν από 95 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 100 μάρτυρες από 4 κλινικές μελέτες και χρησιμοποιήθηκε ως σετ επικύρωσης. Τα υποκείμενα σε αυτή την ομάδα ήταν ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα από δύο μελέτες θεραπευτικής φάσης ΙΙ (n = 44 και 14 αντίστοιχα) και μία μελέτη βιοδείκτες βλαστικής γραμμής (n = 37) και των επιλέξιμων καρκίνος άνευ ελέγχου από μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων της οικογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου σε Σιγκαπούρη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το θεσμικό Ηθική συμβούλιο επιθεώρησης στο Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, τη Σιγκαπούρη, και όλα τα άτομα της μελέτης παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση.

Δεδομένα συλλογή

Στην πρώτη ομάδα, τα υποκείμενα της μελέτης ήταν συνέντευξη στο πρόσωπο από εκπαιδευμένους επαγγελματίες υγείας οι οποίοι χρησιμοποίησαν ένα δομημένο ερωτηματολόγιο. Δημογραφικά στοιχεία όπως η ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, το πακέτο χρόνια του καπνίσματος και ιστολογικού τύπου κυττάρων που συλλέγονται για όλα τα μαθήματα. Ανάλογες πληροφορίες για την δεύτερη ομάδα ανακτήθηκε από τα αρχεία περίπτωση, καθώς και πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση του καπνίσματος για τους ελέγχους δεν επιτεύχθηκε. το κάπνισμα κατηγοριοποιήθηκε σε ποτέ καπνιστής, πρώην καπνιστής και νυν καπνιστή. Ιστολογικών τύπων κυττάρων κατηγοριοποιούνται σε τρεις ομάδες, δηλαδή αδενοκαρκίνωμα, πλακώδες καρκίνωμα και κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα.

πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) του γονότυπου

Οκτώ SNPs που ήταν σχετικά συχνή σε ασιατικό πληθυσμό της με βάση την προηγούμενη βιβλιογραφία αναζήτησης, επιλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη. Από τις τέσσερις παραλλαγές στο εξόνιο 1, τρεις είχαν κωδικοποίησης (cSNPs) με αποτέλεσμα αλλαγές αμινοξέων, UGT1A6 19T & gt? G (S7A), 541A & gt? G (T181A) και 552a & gt? C (R184S), ενώ UGT1A6 105C & gt? T ήταν συνώνυμη παραλαγή. Τα υπόλοιπα τρία ακολουθία παραλλαγές στην ρυθμιστική περιοχή 5 ‘περιλαμβάνονται 2 SNPs, UGT1A6 -556C & gt? T και -427G & gt? C, και μία μετάλλαξη διαγραφής -1310–1306 διαγράψετε (ΑΟΟΑΟ). UGT1A6 ιντρονική παραλλαγή IVS1 + 130G & gt?. Τ μελετήθηκε επίσης

Genomic δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) εξήχθη από τα κλάσματα φλεγμονώδη πλακούντα χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού Puregene DNA (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, ΗΠΑ). Η ποιότητα και η ποσότητα του DNA που αξιολογήθηκαν από NanoDrop (ND-1000 φασματοφωτόμετρο). Όλα DNA έχει μια

280 αναλογία 1.7-1.9 A

260 /A. Γονοτυπική διεξήχθη χρησιμοποιώντας Pyrosequencing. Για Pyrosequencing προσδιορισμούς, ένα θετικό και ένα αρνητικό μάρτυρα συμπεριελήφθησαν σε κάθε πλάκα 96 φρεατίων. Εν συντομία, σχεδιάστηκαν εκκινητές με βάση την αλληλουχία UGT1A6. Οι εκκινητές PCR και εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας σχεδιάσθηκαν με τη χρήση Pyrosequencing Δοκιμασία Σχεδιασμός Λογισμικού (έκδοση 1.0.6: Biotage ΑΒ, Uppsala, Σουηδία). ανάλυση BLAST διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα των εκκινητών για κάθε εξόνιο. Λεπτομέρειες των αλληλουχιών εκκινητή και τις συνθήκες της PCR που παρατίθενται στον Πίνακα S1. 250 ng γονιδιωματικού DNA σε 50 ng /μl χρησιμοποιήθηκε για κάθε αντίδραση PCR και τα προϊόντα PCR στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε Pyrosequencing με συσκευή ID PyroMark ™ (Pyrosequencing, Uppsala, Σουηδία). στάδια επικύρωσης διεξήχθησαν από τις αντιδράσεις άμεσης ακολουθίας χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ PRISM® BigDye ™ τερματισμού κατά 3,1 κύκλο χημεία αλληλουχίας

πλασμίδιο κατασκευάζει

Λειτουργικές μελέτες για nonsynonymous πολυμορφισμούς (UGT1A6 19T & gt?. G, 541A & gt? G και 552a & gt? C) έχουν γίνει, ενώ IVS1 + 130G & gt? T είναι μια ιντρονική SNP, ως εκ τούτου, επιλέξαμε UGT1A6 105C & gt? Τ, το οποίο είναι ένα συνώνυμο πολυμορφισμός για τις λειτουργικές δοκιμές μας. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον UGT1A6 105C & gt? T έχει καμία επίπτωση στη δραστηριότητα UGT1A6, η παραλλαγή 105TT δημιουργήθηκε. Εν συντομία, το πλασμίδιο φορέα που κωδικοποιεί UGT1A6 * 1 ακολουθία πλήρους μήκους παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Michael H. Δικαστηρίου (Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts). Η περιοχή κωδικοποίησης UGT1A6 υποκλωνοποιήθηκε εντός pcDNA 3.1 V5 /έκφραση Τορο φορέα πλασμιδίου His (Invitrogen). ανάλυση BLAST διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η αλληλουχία UGT1A6 του πλασμιδίου. Το πλασμίδιο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την δημιουργία υποκατάσταση στο νουκλεοτίδιο 105, χρησιμοποιώντας το GeneEditor

in vitro

τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση σύστημα (Promega) με την υποδεικνυόμενη εκκινητή 105CT (5′-5Phos /CCC TCA GGA TGG AAG CCA c-3 ‘) και εκκινητή Strand Κάτω (παρέχεται). Όλα τα κατασκευάσματα DNA επαληθεύτηκαν με ανάλυση προσδιορισμού αλληλουχίας. Εν συντομία, κύτταρα ΗΕΚ293 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 50 U /ml πενικιλίνη (Gibco) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% διοξειδίου του άνθρακα στους 37 ° C. Σταθερές επιμολύνσεις του πλασμιδίου σε κύτταρα ΗΕΚ293 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σε ένα αντιδραστήριο σε αναλογία 3:01 DNA του σε Opti-MEM® Ι μειωμένου ορού Medium (Gibco). Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

σταθερότητας RNA δοκιμασία

Εξετάσαμε επόμενο την πιθανή επίδραση της παραλλαγής UGT1A6 105TT για τη σταθερότητα του mRNA. 10 μg /ml ακτινομυκίνη D (Sigma) εφαρμόστηκε στις κυτταρικές καλλιέργειες αναπτύχθηκαν για μια νύχτα και τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε επιλεγμένα χρονικά διαστήματα μέχρι και 24 ώρες. Η Rneasy Plus Mini Kit (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση ολικού RNA από επιμολυσμένα κύτταρα, πριν και μετά την επώαση με ακτινομυκίνη D.

Ποσοτικοποίηση των μεταγραφών

RNA απομονώθηκε από 5 × 10

5 κυττάρων στους χρόνους που υποδεικνύονται (0, 2, 4, 8 και 24 ώρες) μετά την αγωγή με ActD και μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript III (Invitrogen). Η αντίδραση PCR στη συνέχεια διεξάγεται η οποία περιλαμβάνει τα εξής: 1 cDNA μΐ, 10 μΜ από κάθε εκκινητές (UGT1A6: 5′-cagctgtcctcaagagagatgtgga-3 ‘και 5′-ccaatgaagaccatgttgggc-3′, GAPDH: 5’-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3 ‘και 5 «-catgtgggccatgaggtccaccac-3 ‘) και 2 χ Ισχύς SYBR Green Master Mix (τα οποία περιλαμβάνουν SYBR Green χρωστική, Taq Polymearse, ROX, και dNTP) σε τελικό όγκο 20 μΙ. Άδειο φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος, με δεδομένα κανονικοποιούνται με έκφραση GAPDH. Όλες οι PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν.

κηλίδωση Western

Εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της παραλλαγής UGT1A6 105TT για τη σταθερότητα της πρωτεΐνης. Τα επεξεργασμένα κύτταρα λύθηκαν και μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης. Πρωτεΐνες (7,5 μg /φρεάτιο) αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 4 έως 15% κλίση SDS-πολυακρυλαμιδίου (Invitrogen) που ακολουθείται από μεταφέρθηκε σε μία πολυβινυλιδενίου φθορίδιο (PVDF) μικροπορώδη μεμβράνη (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) μπλοκαρίστηκαν σε PBS με 5% γάλα. Μετά τον αποκλεισμό, η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με χρήση κουνελιού αντι-ανθρώπινης UGT1A6 πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:1000 (WB-UGT1A6? BD Gentest, Woburn, ΜΑ) και ένα αντι-κουνελιού κρένου δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας (1:10,000 αραιωμένο) . Οι κηλίδες απεικονίστηκαν με αντιδραστήρια ECL (ECL πρωθυπουργός, Amersham Pharmacia Biotech ΑΒ, Ουψάλα, Σουηδία) και από τον επεξεργαστή ταινία (Konica SRX 101). Τα αποτελέσματα είναι από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Ένζυμο δοκιμασία

Η σεροτονίνη χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα όπως αποδεικνύεται εξειδίκευση υποστρώματος για UGT1A6 [22], [23], ωστόσο, μια διαφορετική μεθοδολογία πλατφόρμα χρησιμοποιήθηκε σε αυτή η μελέτη. 0,01 mg πρωτεϊνών υποβλήθηκε σε 384-φρεατίων μαύρη πλάκα (Corning, ΝΥ) με Transcreener ® HTS έντασης φθορισμού (FI) κιτ δοκιμασίας (BELLBROOK Labs, Madison, WI). Κάθε αντίδραση ενζύμου διεξήχθη περιλαμβάνει τα ακόλουθα: 50 mM HEPES (ρΗ 7.5), που περιέχει NaCl (100 mM), MgCl

2 (4 mM), EGTA (2 mM), 0,01% Brij-35, διθειοθρεϊτόλη (DTT ? 2 mM), DMSO (1%), UDPGA (5 mM) και με διάφορες συγκεντρώσεις της σεροτονίνης (Sigma) 0,5-30 mM σε τελικό όγκο 25 μΙ. Η πλάκα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά και οι αντιδράσεις διακόπηκαν με την προσθήκη 25 μΙ παγωμένης μεθανόλης. Η πλάκα στη συνέχεια αναγνώστηκε σε αναγνώστη πλάκας Tecan Άπειρο M200. Όλες οι ενζυμικές αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι αρχικές αναγνώσεις μετατράπηκαν με το ποσό της UDP σχηματίζονται χρησιμοποιώντας GraphPad Prism να παρεμβάλει αυτές τις τιμές από τις πρότυπες καμπύλες UDPGA /UDP. καμπύλες Michaelis-Menten παρήχθησαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism. Τα δεδομένα που απεικονίζονται είναι από δύο ανεξάρτητα πειράματα και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως το μέσο ± S.D. του τριπλούν.

Στατιστικές Αναλύσεις

διαφορές υπόθεση-ελέγχου αρχικά χαρακτηριστικά αξιολογήθηκαν με τη χρήση t-τεστ (για συνεχείς μεταβλητές) και Chi-square τεστ (για τις κατηγορικές μεταβλητές). αναλογίες πιθανοτήτων (OR) προήλθαν από Chi-square test, και τους δόθηκε διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) του OR. Η συσχέτιση μεταξύ των SNPs με την ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα και τα στάδια ΤΝΜ δοκιμάστηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square. Όλα στατιστική ανάλυση συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 11.5 (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA). δοκιμή ισορροπία Hardy-Weineberg, ανάλυση ανισορροπίας σύνδεσης (συμβολίζεται ως D ‘) και ανάλυση απλοτύπου-μαρτύρων (δοκιμή μετάθεση) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας SNPAlyze Εκδ.7.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά των ασθενών και έλεγχοι

τα βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και τους ελέγχους των δύο ομάδες συνοψίζονται στον πίνακα 1. υπήρχε μια στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και υγιείς μάρτυρες, με περισσότερα αρσενικά (p = 0,003) και οι καπνιστές (ρ & lt? 0.001) στην ομάδα του καρκίνου του πνεύμονα. Σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες, ασθενείς με καρκίνους του πνεύμονα, ήταν γενικά μεγαλύτερα (ρ = 0.04). Αδενοκαρκίνωμα ήταν η πιο συχνή ιστολογική υποτύπου, αντιπροσωπεύοντας το 60% σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα αρχικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και υγιών ελέγχων μεταξύ των κοορτών δοκιμών και επικύρωσης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Η

γονότυπος και οι συχνότητες αλληλίου πολυμορφισμών UGT1A6 (Πίνακας 2)

από τις οκτώ γονότυπου SNPs, πέντε είχαν σημαντική συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του πνεύμονα, όταν δοκιμάστηκαν στην πρώτη ομάδα αποτελείται από 72 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 62 ελέγχους. UGT1A6 19T & gt? G, 541A & gt? G και 552a & gt? C συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα, ενώ UGT1A6 105C & gt? T και IVS1 + 130G & gt? T ήταν αντιστρόφως σχετική με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του πνεύμονα. UGT1A6 19T & gt? G, 541A & gt? G και 552a & gt? C ήταν συχνή σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με μικρές συχνότητες αλληλόμορφο του 38%, 45% και 48% αντίστοιχα

Αυτά τα 5 SNPs αξιολογήθηκαν περαιτέρω στη δεύτερη ομάδα αποτελείται. των 95 ασθενών κινεζική καρκίνο του πνεύμονα και 100 Κινέζοι απαράμιλλη ελέγχους. UGT1A6 19T & gt? G, 541A & gt? G και 552a & gt? C παρέμεινε σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα, και UGT1A6 105C & gt? T και IVS1 + 130G & gt? T παρέμεινε σημαντικά σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα

Προσδιορισμός των παραγόντων που σχετίζονται. ανεξάρτητα με καρκίνο του πνεύμονα: μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση

Για να προσδιοριστούν οι παράγοντες που σχετίζονται με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του πνεύμονα, που χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά μονοπαραγοντική ανάλυση και προσδιόρισε τους ακόλουθους παράγοντες: την ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, και πέντε SNPs (Πίνακας 3). Μετά από προσαρμογή για covariables προσδιορίζονται από μονοπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιώντας πολυπαραγοντική ανάλυση βρήκαμε καπνιστών κατάσταση μόνο (OR: 3,385, 95% CI: 1,86 – 6,15, p & lt? 0.001), UGT1A6 541A & gt? G (OR: 3,582, 95% CI: 01/27 – 10/04 , p = 0,015), 552a & gt? C (OR: 5,364, 95% CI: 1,92 – 14,96, p = 0,001) και IVS1 + 130G & gt? T (OR: 0,191, 95% CI: 0,09 – 0,36, p & lt? 0.001) ήταν ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα.

η

Hardy-Weinberg ισορροπία, ανισορροπία σύνδεσης (LD) και απλότυπος ανάλυση

η περαιτέρω ανάλυση του συνόλου των πολυμορφισμών DNA που κληρονομούνται μαζί, επίσης, γνωστό ως απλότυποι διεξήχθη με την ακόλουθη results.UGT1A6 19T & gt? G και IVS1 + 130G & gt? Τ έδειξε σημαντική απόκλιση από ισορροπία Hardy-Weinberg ισορροπία μεταξύ ελέγχων. UGT1A6 552a & gt? C ήταν σε στενή LD με UGT1A6 541A & gt? G (D ‘= 0,9706, r

2 = 0,7795) σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. UGT1A6 105C αλληλόμορφο ήταν άρρηκτα συνδεδεμένη με την UGT1A6 541 g και αλληλόμορφο 552a τον έλεγχο (Πίνακας 4). Ο πίνακας 5 συνοψίζει τις συχνότητες απλοτύπων των συγκρίσεων περίπτωση ελέγχου από τις δοκιμές μετάθεση. UGT1A6 541A & gt? G εξαιρέθηκαν από την ανάλυση αυτή, επειδή ήταν σε στενή LD με 552a & gt? C. Δέκα μοναδικές απλοτύπων θα μπορούσε να συναχθεί χρησιμοποιώντας 4 κίνδυνο τροποποίησης αλληλόμορφα, με τα δεδομένα που λογοκρίνονται σε συχνότητα 1%.

Η

Μεταξύ αυτών, πέντε απλοτύπων παρουσίασαν σημαντική p-value στη δοκιμή μετάθεση, εκ των οποίων , τρεις είχαν σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. Απλότυπος # 2 που περιέχει δύο αλληλόμορφα κίνδυνο UGT1A6 19G και 552C είχαν μια υψηλότερη ή της 13.57 (95% CI: 6,15 – 29,93) σε σύγκριση με απλότυπος # 4 (OR: 2,65, 95% CI: 1,26 – 5,59) που περιέχουν ένα αλληλόμορφο κινδύνου UGT1A6 552a και απλότυπος # 6 (OR: 2,35, 95% CI: 1,23 – 4,48) που περιέχει δύο αλληλόμορφα κίνδυνο UGT1A6 19G και 552C, και ένα «προστατευτικό» αλληλόμορφο UGT1A6 ιντρονίου 1 + 130σ. Δύο απλοτύπων συσχετίστηκαν με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων απλότυπος # 3 (OR: 0,23, 95% CI: 0,12 – 0,43) και απλότυπος # 7 (OR: 0,13, 95% CI: 0,04 – 0,44).

In vitro λειτουργικό χαρακτηρισμό της παραλλαγής UGT1A6 105TT

In vitro

, mRNA σταθερότητα δοκιμάστηκε μετά το κλείδωμα της μεταγραφής με κατεργασία των κυττάρων με ακτινομυκίνη D (ActD). Παραλλαγή UGT1A6 105TT mRNA ήταν πιο σταθερό από άγριου τύπου με σημαντικά υψηλότερο επίπεδο του mRNA που παρατηρήθηκε στις 4 ώρες (p = 0.039), και 8 ώρες (ρ = 0,004) μετά από αγωγή με ActD (Σχήμα 1Α). Αυξημένη σταθερότητα παραλλαγής UGT1A6 105TT mRNA οδήγησε σε υψηλότερη έκφραση της πρωτεΐνης και η δραστικότητα του ενζύμου σε σύγκριση με το αγρίου τύπου στις 48 ώρες μετά την αγωγή με ActD (Σχήμα 1Β, C και D).

UGT1A6 * 1 και UGT1A6 105TT κατασκευάσματα ήσαν διαμολύνθηκαν σταθερά σε ΗΕΚ293 κύτταρα. (Α) Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με κατεργασία με ActD σε διαφορετικά χρονικό σημείο μέχρι και 24 ώρες. Τα δεδομένα που απεικονίζονται είναι οι αλλαγές πορεία του χρόνου στον υπόλοιπο ποσό των UGT1A6 mRNA μετά τη θεραπεία ActD. Υπήρξε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο mRNA σε UGT1A6 105TT από UGT1A6 * 1 επιμολυσμένα κύτταρα σε 4 ώρες (ρ = 0,039) και 8 ώρες (ρ = 0,004) μετά από αγωγή με ActD. (Β) Ανάλυση Western blot. Κυτταρόλυμα χρησιμοποιήθηκε ήταν από 5 × 10

5 κυττάρων στους χρόνους που υποδεικνύονται (0, 8, 24 και 48 ώρες) μετά την αγωγή με ActD. Υπήρξε μια προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης σε UGT1A6 * 1 σε σύγκριση με την παραλλαγή UGT1A6 στις 48 ώρες μετά την αγωγή με ActD. δραστηριότητα UGT1A6 εκτιμήθηκε αξιολογώντας την παραγωγή του γλυκουρονιδίου σεροτονίνης χρησιμοποιώντας λύμα από παραλλαγή UGT1A6 (VT) και UGT1A6 * 1 (WT) σε 0 ώρα (C) και 48 ώρες (D) μετά τη θεραπεία ActD, με συγκεντρώσεις υποστρώματος κυμαινόταν από 0,5 έως 30 mM σεροτονίνη. Οι δραστηριότητες εκφράζονται ως η ταχύτητα αντίδρασης (νανομόρια γλυκουρονίδιο σεροτονίνης που σχηματίζεται ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης).

Η

Συζήτηση

Αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να περιγράψει τη σχέση μεταξύ πολυμορφισμών UGT1A6 και των πνευμόνων Καρκίνος. Το γονίδιο UGT1A6 είναι υπεύθυνη για την αποτοξίνωση των καρκινογόνων όπως BaP από τον καπνό του τσιγάρου [13] – [15]. Ποσοτικές ή ποιοτικές μεταβολές στην έκφραση UGT1A6 μπορεί να επηρεάσει το ρυθμό της γλυκουρονιδίωσης, τροποποιώντας έτσι τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα.

Αρκετές πολυμορφισμοί έχουν αναφερθεί στο 5′-ρυθμιστική περιοχή, εξόνιο 1 και εσώνια του UGT1A6 [24 ], [25]. Μεταξύ αυτών, τρεις μη συνώνυμες πολυμορφισμών στα κωδικόνια 7, 181 και 184 (UGT1A6 19T & gt? G, 541A & gt? G και 552a & gt? C, αντίστοιχα), που συλλογικά αναφέρονται ως UGT1A6 * 2, ήταν η πιο συχνά μελετηθεί. Κατατάσσεται ως παραλλαγή «χαμηλής δραστηριότητας» για αρκετές φαινολικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένης της ασπιρίνης [26] και σχετίζεται με μειωμένη ορθοκολικού αδενώματος σε άτομα που λαμβάνουν μακροχρόνια ασπιρίνη [27].

Σε αυτή τη μελέτη, είχαμε απέδειξαν ότι τα άτομα με UGT1A6 * 2 (απλότυπος # 2 και 6) είχαν αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. Το εύρημά μας ήταν συνεπής με την έκθεση της μειωμένης δραστηριότητας γλυκουρονιδίωσης σε άτομα με το UGT1A6 * 2 αλληλόμορφο σε σύγκριση με το αγρίου τύπου [26]. Krishnaswamy

et al

αποδεικνύεται επίσης 50% χαμηλότερα επίπεδα UGT1A6 mRNA (p = 0,026) σε φορείς του UGT1A6 19T & gt?. G πολυμορφισμό σε σύγκριση με μη φορείς, αλλά χωρίς σημαντική επίδραση στην περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες UGT1A6 ή δραστηριότητες γλυκουρονιδίωσης [24]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπήρξαν αντιφατικές εκθέσεις από τουλάχιστον 2 μελέτες, γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη ενζυμική δραστηριότητα στην UGT1A6 * 2 ισοενζύμων [28], [29]. Ωστόσο, η αυξημένη δραστηριότητα στην αλλοενζυμικών παραλλαγή UGT1A6 δεν μεταφράζεται σε αυξημένη κάθαρση του υποστρώματος στην παραλλαγή ηπατικά μιτοχόνδρια του ανθρώπου [29]. Είναι πιθανό ότι εκτός από την ενζυμική δραστηριότητα, η υποβάθμιση του mRNA μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη μεταβλητότητα της δραστηριότητας UGT1A6

Δύο πολυμορφισμοί UGT1A6 105C & gt?. Τ και IVS1 + 130G & gt? T βρέθηκαν να συνδέονται με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα . Το UGT1A6 105C & gt? Τ είναι ένα συνώνυμο SNP που βρίσκεται στο εξόνιο 1 του γονιδίου UGT1A6. Παρά το γεγονός ότι ο πολυμορφισμός δεν έχει σαν αποτέλεσμα την ποιοτική τροποποίηση του UGT1A6, μας

in vitro

αποτελέσματα έδειξαν ότι η Τ αλληλόμορφο σχετίζεται με αυξημένη σταθερότητα του mRNA και υψηλή δραστικότητα UGT1A6 σε παραλλαγή πρωτεΐνης σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου. Αυτό μπορεί να εξηγήσει την προστατευτική δράση του UGT1A6 105 Τ αλληλίου στη μείωση του κινδύνου καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, η προστατευτική επίδραση του UGT1A6 105C & gt? T μπορεί να οφείλεται σε αντίστροφη σύνδεση της με UGT1A6 * 2 (UGT1A6 541A & gt? G και 552a & gt? C).

UGT1A6 IVS1 + 130G & gt? T βρέθηκε να είναι η μόνο SNP σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Δεν είναι σαφές πώς UGT1A6 IVS1 + 130G & gt? T ρυθμίζει τον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα, καθώς βρίσκεται στην πρώτη ιντρονική περιοχή του γονιδίου UGT1A6. In-silico ανάλυση χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Human Συγκόλληση Finder (https://www.umd.be/HSF/) πρότεινε ότι αυτό το SNP δεν επηρεάζει οποιαδήποτε συντηρημένα νουκλεοτίδια της θέσης διακλάδωσης στην ιντρονική περιοχή (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και θα ήταν απίθανο να επηρεάσει την δραστηριότητα μάτισμα

Παρά το γεγονός ότι βρήκαμε UGT1A6 IVS1 + 130G & gt?. Τ να είναι σε μέτρια ανισορροπία σύνδεσης με UGT1A6 541A & gt? G (συμβολίζεται ως UGT1A6 * 5), δεν μπορεί να εξηγήσει την προστατευτική δράση που παρατηρείται. Ενώ UGT1A6 είναι η κύρια ισομορφή UGT1A εκφράζονται στον πνεύμονα, άλλες ισομορφές UGT1A (UGT1A1 και 1Α9) που εκφράζεται στο ήπαρ μπορεί ακόμα να επηρεάσει συστηματική κάθαρση των καρκινογόνων ουσιών που σχετίζονται με το κάπνισμα τσιγάρων [30], [31].

Είναι πιθανό ότι IVS1 + 130G & gt? Τ μπορεί να είναι σε ανισορροπία σύνδεσης με τους πολυμορφισμούς σε άλλες ισομορφές UGT1A που παίζουν ένα «προστατευτικό» ρόλο στο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. . Για παράδειγμα, Saeki

κ.ά.

[32] έδειξε ότι UGT1A6 IVS1 + 130G & gt? Τ είναι σε στενή LD με UGT1A9 * 22, υψηλή ενζυματική δραστηριότητα αλληλόμορφο το οποίο είναι γνωστό ότι αυξάνει μεταγραφή. Επιπλέον, UGT1A6 έχει αποδειχθεί ότι είναι σε ανισορροπία σύνδεσης με UGT1A1 και UGT1A7 [33] – [36]. Αν και δεν εκφράζονται στον πνεύμονα, αυτές οι UGT ισομορφές έχουν αποδειχθεί ότι είναι σημαντικό για την εκκαθάριση των BaP [30], [31].

Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της μελέτης είναι η διαπίστωση μας ελέγχθηκε σε μια ανεξάρτητη ομάδα. Η ανάλυση περιορίστηκε σε μία εθνική ομάδα να ελαχιστοποιείται η πιθανότητα ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω ετερογένεια του πληθυσμού. Υπάρχουν, ωστόσο, αρκετοί περιορισμοί στη μελέτη μας που αναγνωρίζουμε. Πρώτον, οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και υγιών μαρτύρων δεν ταιριάζουν ως προς την ηλικία, το φύλο και το ιστορικό καπνίσματος. Δεύτερον, δύο SNPs, UGT1A6 19T & gt? G και IVS1 + 130G & gt? T παρέκκλινε από την εξίσωση Hardy Weinberg. Απόκλιση από την εξίσωση Hardy Weinberg μπορεί να προκληθεί από τα λάθη του γονότυπου [37], [38]. Είχαμε λάβει μέτρα για να αποκλείσει το σφάλμα του γονότυπου με τη χρήση τόσο Pyrosequencing και άμεση μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας για τον εντοπισμό των SNPs παραλλαγή σε θέματα μελέτης μας.

Εν κατακλείδι, η μελέτη αυτή δείχνει ότι οι πολυμορφισμοί UGT1A6 μπορούν να ρυθμίσουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του πνεύμονα. UGT1A6 105C & gt? T αποδείχθηκε να αυξηθεί η σταθερότητα του mRNA, παρέχοντας μια εύλογη εξήγηση της σύνδεσής του με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. Η μελέτη μας δείχνει ότι UGT1A6 του γονότυπου μπορεί να ενσωματωθεί στη στρατηγική προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα για να βοηθήσει στον εντοπισμό των ευπαθών πληθυσμών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Λίστα PCR και εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας. Κατάλογος όλων των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση και τη σειρά καθένα από τα οκτώ UGT1A6 SNPs παρουσιάζεται, με πληροφορίες σχετικά με SNP rsid και τον εντοπισμό τους παρέχονται. Το μέγεθος των προϊόντων PCR και η θερμοκρασία ανόπτησης για κάθε αντίδραση PCR παρουσιάζονται επίσης. Τα βιοτινυλιωμένα εναύσματα για Pyrosequencing δοκιμής που αναφέρεται με την §

doi:. 10.1371 /journal.pone.0042873.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Dr.Michael H. Δικαστήριο (Σχολή του Πανεπιστημίου Tufts της Ιατρικής, Βοστόνη, Μασαχουσέτη) για την παροχή μας πλασμιδιακό φορέα κωδικοποίησης UGT1A6 * 1 ακολουθία πλήρους μήκους.