Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) δρουν ως μεταγραφικοί ρυθμιστές και να παίξουν καθοριστικό ρόλο στην καρκινογένεση. Σύμφωνα με τις βάσεις δεδομένων στόχο miRNA, ένα miRNA μπορεί να ρυθμίζει πολλά γονίδια όπως τους στόχους της, ενώ ένα γονίδιο μπορεί να στοχεύεται από πολλούς miRNAs. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι σχέσεις μεταξύ miRNAs και τους στόχους τους μπορεί να μην είναι ένα-προς-ένα. Ωστόσο, πολλές εκθέσεις έχουν περιγράψει μόνο ένα-προς-ένα, ένα-προς-πολλαπλά ή πολλαπλών-προς-ένα σχέση μεταξύ miRNA και το γονίδιο-στόχο σε ανθρώπινους καρκίνους. Έτσι, είναι απαραίτητο να καθοριστεί εάν ή όχι ένας συνδυασμός μερικών miRNAs θα ρυθμίζει πολλαπλούς στόχους και να εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Για να βρείτε μερικές ομάδες των miRNAs που μπορεί συνεργικά ρυθμίζουν τους στόχους τους σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο (GC), έχουμε εκ νέου αναλύθηκαν τα δεδομένα του προηγούμενου miRNA σειρά έκφρασή μας και διαπίστωσε ότι το 50 miRNAs ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης σε μια κυτταρική γραμμή GC. Η βάση δεδομένων στόχος miRNA «TargetScan» Προέβλεψε ότι μερικά από αυτά τα miRNAs έχουν κοινά γονίδια-στόχους. Μπορούμε επίσης αναφέρεται στη βάση δεδομένων GEO για την έκφραση αυτών των κοινών γονιδίων-στόχων σε ανθρώπινο GCs, η οποία ενδέχεται να σχετίζονται με γαστρική καρκινογένεση. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε δύο συνδυασμούς miRNA, miR-224 και -452, και miR-181γ και -340. Υπερ-έκφραση και των δύο συνδυασμών miRNA δραματικά προς τα κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια στόχους τους,

DPYSL2

και

KRAS

, και

KRAS

και

MECP2

, αντίστοιχα. Αυτοί οι συνδυασμοί miRNA μειώθηκε συνεργικά πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετά από επιμόλυνση. Επιπλέον, αποκάλυψε ότι αυτά τα miRNAs ήταν κάτω-ρυθμίζονται μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού σε κύτταρα GC. Έτσι, είναι πιθανό ότι οι σχέσεις μεταξύ των miRNAs και οι στόχοι τους δεν είναι ένα-προς-ένα, αλλά πολλαπλές-προς-πολλαπλά σε GCs, και ότι αυτές οι πολύπλοκες σχέσεις μπορεί να σχετίζεται με το γαστρικό καρκινογένεση

Παράθεση:. Hashimoto Υ, Akiyama Υ, Yuasa Υ (2013) Πολλαπλές-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ Τα microRNAs και γονιδίων-στόχων σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 14η Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 24 Μάρτη 2013? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Α3 Προοπτικής Διερεύνησης Πρόγραμμα της Ιαπωνίας Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) (ΥΥ), και την Έρευνα υποτροφίες της JSPs για Νέους επιστήμονες (ΥΗ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

τα microRNAs (miRNAs), μια κατηγορία των μικρών RNAs μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης, έχουν ταυτοποιηθεί ως ένα νέο είδος ρυθμιστή γονιδίου που δεσμεύονται με τις 3′-αμετάφραστες περιοχές (UTRs) του mRNA στόχου, καταλήγοντας έτσι σε αποικοδόμηση mRNA ή τον αποκλεισμό της μετάφρασης του mRNA [1]. Είναι γενικά γνωστό ότι τα miRNA αλλοιώσεις που σχετίζονται με ογκογένεση [1]. Σύμφωνα με τις βάσεις δεδομένων στόχο miRNA, ένα miRNA μπορεί να ρυθμίζει πολλά γονίδια όπως τους στόχους της, ενώ ένα γονίδιο μπορεί να στοχεύεται από πολλούς miRNAs. Ωστόσο, πολλές μελέτες αποκάλυψαν μια σχέση ένα-προς-ένα μεταξύ miRNA και γονιδίου στόχου της. Έχει επίσης αναφερθεί ότι οι πολλαπλές ή ένα σύμπλεγμα miRNAs συνεργατικά ρυθμίζουν ένα γονίδιο, το οποίο σχετίζεται με την καρκινογένεση [2] – [4]. Από την άλλη πλευρά, τα πολλαπλά γονίδια στοχεύονται από ένα miRNA [3], [4]. Ακόμη και πολλαπλές-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ miRNAs και των στόχων έχουν αναφερθεί με χρήση υπολογιστικής ανάλυσης [5], [6]. Ωστόσο, έχουν υπάρξει λίγες μόνο χαρτιά πειραματικά επικύρωση πολλαπλών-to-πολλαπλών σχέσεων σε καρκινικά κύτταρα.

γαστρικός καρκίνος είναι η τέταρτη πιο κοινή ανθρώπινη κακοήθη ασθένεια και η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, με περίπου ένα εκατομμύριο νέες περιπτώσεις ετησίως [7]. Γαστρική καρκίνων ιστολογικά ταξινομούνται σε δύο κύριους τύπους, η εντερική και διάχυτες τύπων [8]. Διάχυτη τύπου GC είναι συχνά δυσεπίλυτα και παρουσιάζει κακή πρόγνωση των ασθενών. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι η απώλεια των λειτουργιών Cdh1 και Trp53 προκαλεί διάχυτη τύπου GC χρησιμοποιώντας μοντέλα ποντικών [9]. Παρά το γεγονός ότι αυτό το εύρημα θα μας βοηθήσει να αναπτύξουμε νέες ανθρώπινο γαστρικό θεραπείες του καρκίνου, περαιτέρω έρευνες σχετικά με το μοριακούς μηχανισμούς υποκείμενη γαστρική καρκινογένεση είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη άλλων προσεγγίσεων για στοχευμένη θεραπεία.

Ανάδοχος CpG νησί υπερμεθυλίωση είναι ένας από τους πιο κοινούς μηχανισμούς με την οποία τα γονίδια καταστολής όγκων αδρανοποιούνται σε ανθρώπινους καρκίνους [10]. Πρόσφατα, έχει γίνει φανερό ότι ορισμένες miRNAs είναι επίσης στόχοι των επιγενετικών σίγηση σε καρκίνους [11]. άλλες ομάδες μας και έχουν δείξει προηγουμένως ότι η φαρμακολογική ή γενετική διαταραχή της μεθυλίωσης του DNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου επάγει αυξητική ρύθμιση του σημαντικού αριθμού των miRNAs [12] – [15]. Αυτά τα δεδομένα οδήγησαν στην ταυτοποίηση υποψήφιων miRNAs ογκο-κατασταλτική του οποίου σίγηση συνδέεται με CpG νησιού μεθυλίωσης. Μέχρι στιγμής, η μεθυλίωση των μελών της οικογένειας miR-124 έχει ταυτοποιηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου και σε όγκους άλλων οργάνων [11]. Επιπλέον, το σύμπλεγμα miR-34b /c έχει ένα τυπικό νησί CpG, και ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω των συχνών μεθυλίωσης σε παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνους [12]. Ομοίως, διαπιστώσαμε ότι το miR-181γ μεθυλίωση συνδέεται με γαστρική καρκινογένεση μέσω της ρύθμισης των ογκογόνων γονιδίων

KRAS

και

NOTCH4

[13]. Down-ρύθμιση πολλών miRNAs μέσω μεθυλίωσης συμβαίνει ταυτόχρονα σε καρκινικά κύτταρα, και μπορεί να ενισχύσει πολλαπλά-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ miRNAs και στόχων.

Σε αυτή τη μελέτη, για την επικύρωση πολλαπλές-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ miRNAs και στόχων σε καρκινικά κύτταρα, αποδείξαμε ότι δύο ζεύγη των πολλαπλών miRNAs, miR-224 και -452, και miR-181γ και -340, είχε πολλαπλά γονίδια-στόχους και συνεργιστικά μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ρύθμισης των στόχων τους σε ανθρώπινα κύτταρα GC.

Αποτελέσματα

50 miRNAs ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε μια γραμμή κυττάρων GC, ΚΑΤΩ-III, μετά από 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης Θεραπεία

Για τον εντοπισμό υποψήφιων miRNAs που επηρεάζουν συνεργικά τους γονίδια-στόχους, έχουμε εκ νέου αναλύθηκαν προηγούμενα δεδομένα μικροσυστοιχιών (ένταξη GEO Νο GSE16006) μας [13]. Θεωρήσαμε ότι τα επίπεδα miRNA ήταν πάνω ρυθμισμένα σε 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-CDR) θεραπεία όταν το καθαρό εντάσεις ιδιαίτερη 3 θέσεις ήταν περισσότερο από 1,5 φορές. Επιπλέον, μπορούμε επίσης να επιλεγεί miRNAs του οποίου βρέθηκαν οι μέσοι όροι που πρέπει να αυξηθεί περισσότερο από 3 φορές σε ανάλυση μικροσυστοιχιών. Με βάση αυτά τα νέα κριτήρια, βρήκαμε ότι 50 miRNAs ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε μια κυτταρική σειρά GC, ΚΑΤΟ-ΙΙΙ (Πίνακας S1). Εμείς επιβεβαίωσε την ανοδική ρύθμιση των 5 από τα 6 αντιπροσωπευτικών προδρόμων miRNAs, δηλαδή, miR-145, -148a, -152, -224 και -340, μετά από 5-αζα-CdR θεραπεία με RT-PCR (Εικόνα 1Α).

(Α) RT-PCR αναλύσεις των προδρόμων miRNAs σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ χωρίς αγωγή (U) ή υποβλήθηκαν σε αγωγή (Α) με 5-αζα-CDR.

GAPDH

έκφραση του mRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) RT-PCR αναλύσεις των προδρόμων miRNAs σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC χωρίς αγωγή (U) ή υποβλήθηκαν σε αγωγή (Α) με 5-αζα-CdR (5 μmol /l), και φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο.

GAPDH

έκφραση του mRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση της έκφρασης ώριμου miR-224 σε 9 κυτταρικές GC γραμμές και ένα CRC κυτταρική γραμμή, HCT116. (D) ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση της ώριμης miR-224 και -452 επίπεδα σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ χωρίς αγωγή (U) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,2 μmol /l 5-αζα-CDR (Α), 0,3 μmol /l TSA (Τ), ή ένας συνδυασμός των δύο φαρμάκων (α /Τ). Μ, μακέτα.

Η

TargetScan Προβλεπόμενη Γονίδια κοινός στόχος των υποψήφιων miRNAs

Για να καθοριστεί εάν ή όχι επιγενετικώς οργανωμένη miRNAs έχουν κοινά γονίδια-στόχους, ψάξαμε τη βάση δεδομένων TargetScan (έκδοση 5.1) για την κοινή τους στόχους. Σύμφωνα με TargetScan, 50 miRNAs θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σε 46 ομάδες με βάση τις ακολουθίες τους σπόρους τους. TargetScan έδειξε επίσης ότι αυτές οι 46 ομάδες που μπορούν να στοχεύσουν 6.460 γονίδια. Μεταξύ αυτών των γονιδίων στόχων, επιλέξαμε 13 από τις οποίες η έκφραση αναφέρθηκε να αυξηθεί GC στη βάση δεδομένων GEO (ένταξη GEO Νο GSE2685) ή να σχετίζονται με το γαστρικό καρκινογένεση (Πίνακας S2). Εδώ, έχουμε επικεντρωθεί σε τέσσερις miRNAs, miR-152, -181c, -224 και -340, επειδή έχουμε ήδη αναφέρει ότι το miR-181γ είναι επιγενετικώς κάτω-ρυθμίζονται σε GC [13] και CpG νησιά που βρίσκονται στα ανάντη περιοχές της τρία άλλα miRNAs (Σχήμα 2Α και C, και το Σχήμα S1). Σχήμα 2α αποκαλύπτει επίσης ότι το miR-452 είναι συγκεντρωμένα με miR-224. TargetScan προέβλεψε ότι οι πέντε miRNAs μπορούν να ρυθμίσουν κοινούς στόχους. Για παράδειγμα,

DPYSL2

(dihydropyrimidinase-σαν 2, επίσης γνωστό ως κατάρρευση απάντηση μεσολαβητής πρωτεΐνη 2,

CRMP2

) είναι στοχευμένες με miR-224, -452, και -181c,

KRAS

από miR-224, -452, -181c, -340 και -152 και

MECP2

(πρωτεΐνη δέσμευσης μεθυλο CpG 2) από miR-181γ και -340, αντίστοιχα (Σχήμα 3).

(Α), (C) Σχηματική αναπαράσταση των miRNAs και τα γονίδια που τους φιλοξενούν. Γεμιστά κουτιά αντιπροσωπεύουν τις εξόνια των γονιδίων του ξενιστή και κενό κουτιά παριστάνουν τις αμετάφραστες περιοχές των γονιδίων του ξενιστή. Τα λυγισμένα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις έναρξης μεταγραφής των γονιδίων του ξενιστή. Τα κατακόρυφα βέλη δείχνουν τις θέσεις των miRNAs. Οι κάθετες παχιές γραμμές υποδεικνύουν θέσεις CpG. Βέλη δείχνουν τις περιοχές που εξετάστηκαν για τον ΘΧΣ. (Β), (D) MSP αναλύσεις miR-224 και miR-340, αντίστοιχα, σε κυτταρικές σειρές GC. Οι ζώνες στις διαδρομές του «MT» Τα προϊόντα PCR που αποκτήθηκαν με μεθυλίωσης-ειδικά εναύσματα, και εκείνες στις λωρίδες του «Un ‘λήφθηκαν με unmethylation-ειδικούς εκκινητές? PBL, λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος. Η έκφραση των miRNAs υποδεικνύεται κάτω από τις φωτογραφίες των αποτελεσμάτων MSP

Η

Οι κόκκινες γραμμές, συντηρημένη περιοχή.? μπλε γραμμή, συντηρημένη περιοχή στα θηλαστικά? κίτρινες γραμμές, κακώς συντηρημένη περιοχή.

Η

Η έκφραση του miR-224, -452, -152 και -340 Μειώθηκε στο DNA υπερμεθυλίωση στο GC Γραμμές κυττάρων

Εμείς εξετάζεται η συμμετοχή των επιγενετικών αλλαγές στη ρύθμιση προς τα κάτω των miRNAs. Η έκφραση του miR-224, -340 και -152 αυξήθηκε κατά 5-αζα-CdR θεραπεία σε αρκετές κυτταρικές σειρές GC (Σχήμα 1Β). Εμείς αναλύθηκε ποσοτικά η έκφραση ώριμου miR-224 σε 9 κυτταρικές GC σειρών και μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Αριθ έκφραση του miR-224 ανιχνεύθηκε σε 7 από 10 κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 1 C). Αναλύσαμε επίσης την αλλαγή έκφρασης του συμπλέγματος miR-224 /-452 σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ αγωγή με μια χαμηλή δόση της 5-αζα-CDR (0,2 μmol /l), έναν αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης, τριχοστατίνη Α (TSA, 0,3 μmol /l), ή ένας συνδυασμός αυτών των δύο φαρμάκων. κύτταρα ΚΑΤΩ-ΙΙΙ με τη θεραπεία με χαμηλή δόση 5-αζα-CdR παρουσίασαν ανοδική ρύθμιση του συμπλέγματος miR-224 /-452, ενώ TSA μόνη της δεν προκαλεί ρύθμιση προς τα πάνω. Το σύμπλεγμα miR-224 /-452 είχε συνεργικά πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ με συνδυασμένη 5-αζα-CDR και θεραπεία TSA (σχήμα 1Δ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-224 και miR-452 μπορεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω της μεθυλίωσης του DNA στο κύτταρο GC γραμμές, όπως η ίδια μονάδα μεταγραφής.

Έχει αναφερθεί ότι οι εσονικές miRNAs ρυθμίζονται μέσω μεθυλίωσης υποστηρικτής της υποδοχής τους γονίδια [14], [15]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της υπολογιστικής ανάλυσης, το miR-224 /-452 συμπλέγματος και miR-340 βρίσκονται στο ιντρόνιο 6

GABRE

και ιντρόνιο 2

RNF130

, αντίστοιχα, δύο εκ των οποίων περιέχουν πυκνές νησιά CpG μόνο στις περιοχές υποκινητή των γονιδίων ξενιστή τους (Σχήμα 2Α και C). Ερευνήσαμε την σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης αυτών των miRNAs και την κατάσταση μεθυλίωσης των γονιδίων υποδοχής τους σε κυτταρικές σειρές με ανάλυση GC MSP. GC κυτταρικές σειρές χωρίς miR-224 έκφρασης εμφάνισαν μόνο σήματα μεθυλίωση, ενώ η έκφραση-θετικές κυτταρικές σειρές παρουσίασαν ισχυρή μοτίβα unmethylation (Σχήμα 2Β). Μια παρόμοια σχέση ανιχνεύθηκε για miR-340 σε κυτταρικές γραμμές GC (Σχήμα 2D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έκφραση αυτών των miRNAs σε κυτταρικές σειρές GC μπορεί να σιγήσει μέσω μεθυλίωσης υποκινητή των γονιδίων που τους φιλοξενούν.

επιγενετικώς ρυθμισμένων miRNAs μπορεί να σχετίζεται με GC κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Για να προσδιορίσετε αν επιγενετικώς ρυθμίζονται miRNAs είναι ογκο-κατασταλτικά ή όχι, αξιολογήσαμε την επίδραση της 5-αζα-CdR σε siDICER1-επιμολυσμένα ΚΑΤΩ-ΙΙΙ και DICER1 ΚΟ HCT116 (D1KO) κύτταρα (Σχήμα 4Α). Τα μη επεξεργασμένα ΚΑΤΩ-ΙΙΙ και γονικά κύτταρα HCT116 παρουσίασαν επιβράδυνση της πολλαπλασιασμό μετά την αγωγή με 5-αζα-CDR. Από την άλλη πλευρά, σε siDICER1-επιμολυσμένα κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ και D1KO, η επίδραση της 5-αζα-CdR θεραπεία στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων έγινε αδύναμο και στις δύο περιπτώσεις. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επίδραση της 5-αζα-CdR μειώθηκε σε χαμηλό ή μηδενικό κύτταρα DICER1, και ότι επιγενετικώς ρυθμιζόμενη miRNAs να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην GC και τα κύτταρα CRC.

(Α) Οι καμπύλες ανάπτυξης των ΚΑΤΩ -III, HCT116 και DICER1 ΚΟ HCT116 κύτταρα. κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ επιμολύνθηκαν με 20 nmol /l του siDICER1 ή κωδικοποιημένα siRNA. Το paired t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις τιμές για τα δείγματα δοκιμής και ελέγχου. Μια τιμή της P & lt? 0.05 ελήφθη ως σημαντική. (Β) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της έκφρασης του γονιδίου-στόχου για την ανάλυση RT-PCR.

Η

Για να αναλυθεί η σχέση μεταξύ αυτών των miRNAs και 13 γονίδια-στόχους παρουσιάζονται στον Πίνακα S2, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα ΚΑΤΩ-ΙΙΙ με siDICER1 ή /και επεξεργάστηκε με 5-αζα-CDR. Παρά το γεγονός ότι, η έκφραση του 3 (

DPYSL2

,

KRAS

και

MECP2

) από τα 13 γονίδια μειώθηκαν μετά από 5-αζα-CdR θεραπεία, η έκφραση αυτών των γονιδίων έκανε δεν αλλάζουν σε 5-αζα-CdR θεραπεία που ακολουθείται από επιμόλυνση siDICER1 (Εικόνα 4Β).

Συνδυαστική η επιμόλυνση του miR-224 και -452 Απωθημένα διάδοσης GC κυττάρων

επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών GC με miR-224 και /ή -452 μιμείται ως εκπρόσωπος των συστάδων miRNA ή αρνητικό έλεγχο, και στη συνέχεια πραγματοποιείται νερό λυθεί τετραζολίου-8 (WST-8) δοκιμασίες. Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, παρατηρήσαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-224 ή -452 κατέστειλε την ανάπτυξη των δύο κυτταρικών σειρών, ΚΑΤΟ-ΙΙΙ και AGS (Σχήμα 5Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, συνδυαστικά επιμόλυνση της miR-224 και -452 μιμείται μειώθηκε εκτεταμένα την ανάπτυξη των δύο κυτταρικών γραμμών GC (Σχήμα 5Α).

(Α) προσδιορισμό Πολλαπλασιασμός με WST-8. κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ και AGS σπάρθηκαν σε 1 × 10

3 και 1 χ 10

4 κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων, αντίστοιχα, και τα κύτταρα μετρήθηκαν σε 24, 48 και 72 ώρες. Οι καλλιέργειες διεξήχθησαν εις τριπλούν? μπαρ, SD. Τα αναφερόμενα miRNAs επιμολύνθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. (Β) RT-PCR ανάλυση μετά από επιμόλυνση με miR-224 ή /και miR-452. Η έκφραση των γονιδίων στόχων αναλύθηκε 48 ώρες αργότερα με RT-PCR. (Γ) DPYSL2 έκφρασης πρωτεΐνης μετά έκτοπη έκφραση της miRNA μιμείται σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ και AGS. Η πρωτεΐνη DPYSL2 αναλύθηκε 72 ώρες αργότερα με κηλίδωση Western. (Δ) RT-PCR ανάλυση των

DPYSL2

έκφρασης ΚΑΤΩ-III και AGS κύτταρα αντιμετωπίζονται είτε με ομελέτα ή

DPYSL2

siRNA. προσδιορισμό (Ε) Πολλαπλασιασμός μετά από επιμόλυνση με siDPYSL2 ή Ομελέτα στα κύτταρα ΚΑΤΩ-III και AGS.

Η

Το miR-224 /-452 συνεργατικά Cluster μειωμένη έκφραση του

DPYSL2

και

KRAS

η

για να ερευνηθεί κατά πόσον ή όχι το σύμπλεγμα miR-224 /-452 είναι στην πραγματικότητα σχετίζονται με τη ρύθμιση του

DPYSL2

και

KRAS

, εμείς ανέλυσε την έκφραση του

DPYSL2

μετά την επιμόλυνση των κυττάρων ΚΑΤΩ-III και AGS με το σύμπλεγμα miR-224 /-452 μόνο του ή από κοινού. Πραγματοποιήσαμε RT-PCR και αναλύσεις κηλίδος Western. Η

DPYSL2

και

KRAS

επίπεδα mRNA μειώθηκαν μετά από επιμόλυνση με το miR-224 ή miR-452 μιμούνται (Εικόνα 5Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, στην περίπτωση των συνδυαστικών επιμόλυνση με miR-224 και -452, η έκφραση αυτών των γονιδίων στόχων ήταν πιο κάτω ρυθμισμένα (Σχήμα 5Β). Η προς τα κάτω ρύθμιση των DPYSL2 παρατηρήθηκε επίσης στο επίπεδο πρωτεΐνης στα δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5C). Εξετάσαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης των άλλων πέντε γονίδια,

MECP2, MYC, JunB, MUC1

και

SETDB1

, οι οποίες δεν εμφανίζονται ως στόχοι για το miR-224 ή -452 από TargetScan. Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν εκφραστική μεταβολές αυτών των πέντε γονίδια βρέθηκαν σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ μετά την επιμόλυνση με miR-224 ή -452 (Εικόνα S2). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το miR-224 και -452 ειδικά κάτω-ρυθμίζονται

DPYSL2

και

KRAS

.

DPYSL2

συνδέθηκε με GC κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Εξετάσαμε την επίδραση της knockdown του

DPYSL2

, η οποία δείχθηκε να είναι ένας στόχος του συμπλέγματος miR-224 /-452, επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η επιμόλυνση του

DPYSL2

siRNA μείωσε σαφώς τα επίπεδα του

DPYSL2

μεταγραφές (Σχήμα 5D), και ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων AGS και ΚΑΤΩ-III 72 ώρες μετά το νοκ ντάουν του

DPYSL2

(Σχήμα 5Ε), υποδεικνύοντας ότι DPYSL2 έχει ογκογόνο δράση.

Συνδυαστική επιμόλυνση των miR-340 και -181c Απωθημένα GC κυτταρικού πολλαπλασιασμού, και προκάλεσε τα κάτω ρύθμιση του

KRAS

και

MECP2

Έκφραση

Ως δεύτερο παράδειγμα πολλαπλών-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ microRNAs και γονιδίων στόχων, αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ miR-340 /-181c και

KRAS /MECP2 .

Όταν miR-340 και miR-181γ διαμολύνθηκαν σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ, πολλαπλασιασμός ήταν συνεργικά κάτω-ρυθμίζεται από δύο miRNAs (Σχήμα 6Α). Για να καθοριστεί εάν ή όχι επιγενετικώς ρυθμίζονται miR-340 και συνεργατικά miR-181γ επηρεάζουν τους στόχους τους, αναλύσαμε τα επίπεδα του mRNA της

KRAS

και

MECP2.

Κατά την ανάλυση RT-PCR,

KRAS

και

MECP2

βρέθηκαν να είναι κάτω-ρυθμίζονται από miR-340 και miR-181γ μόνοι, ή συνδυαστικά επιμόλυνση σε κύτταρα ΚΑΤΩ-III (Εικόνα 6Β). Όσο για τα τέσσερα γονίδια,

MYC, JunB, MUC1

και

SETDB1

, χωρίς να εμφανίζει προβλεπόμενες θέσεις για τις δύο αυτές miRNAs με TargetScan, τα επίπεδα έκφρασης δεν έχει αλλάξει σε αυτή τη μελέτη. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται στην Εικόνα 6Β. Έτσι, τα αποτελέσματα των miR-340 και -181c μπορεί να είναι ειδικά για κοινά γονίδια στόχους τους, καθώς και miR-224 και -452.

προσδιορισμό (Α) Πολλαπλασιασμός μετά από επιμόλυνση με miR-340 ή /και miR -181c μιμείται σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ. (Β) Οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μετά την έκτοπη έκφραση των miR-340 ή /και miR-181γ.

Η

Έκφραση και μεθυλίωση Κατάσταση του miR-224 και -340 στην Πρωτοβάθμια GC υποθέσεις

Εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του miR-224 και -340 σε περιπτώσεις πρωτογενούς GC. Μεθυλιωμένος πρότυπα miR-224 ανιχνεύθηκαν σε 15 από 26 (57,7%) πρωτογενείς ιστούς GC (Σχήμα 7Α και Πίνακας 1). Αξιόπιστες μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου μετά βίας εμφάνισαν ένα πρότυπο μεθυλίωσης του miR-224. Στη συνέχεια, θα εξεταστεί ποσοτικά τα επίπεδα miR-224 σε πρωτογενείς ιστούς GC και τα αντίστοιχα μη-καρκινικές βλεννογόνων με TaqMan RT-PCR. Μια σημαντική μείωση του miR-224 έκφρασης σε ιστούς GC παρατηρήθηκε στη μεθυλίωση-θετικών κρουσμάτων καρκίνου σε σύγκριση με το μεθυλίωση-αρνητικές και μη-καρκινικές γαστρικού βλεννογόνου (Σχήμα 7C).

Εκπρόσωπος αποτελέσματα του miR-224 ( Α) και miR-340 (Β) MSP αναλύσεις σε πρωτογενείς ιστούς GC. Οι ζώνες στις διαδρομές του «MT» είναι προϊόντα PCR που αποκτήθηκαν με μεθυλίωσης-ειδικά εναύσματα, και εκείνες στις λωρίδες του «Un ‘λήφθηκαν με unmethylation-ειδικούς εκκινητές. «Ca» και «Ν» δηλώνουν πρωτογενή ΔΘ και αντιστοιχισμένο μη καρκινικούς ιστούς, αντίστοιχα. «F» και δηλώνουν, άνδρες και γυναίκες «Μ». Μαύρα αστέρια δείχνουν δείγματα στα οποία ανιχνεύθηκε η παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων. (Γ) Η σύγκριση της κατάστασης μεθυλίωσης miR-224 και miR-224 επίπεδα σε γαστρικό ιστούς. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-224 στο γαστρικό ιστούς προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και στη συνέχεια συγκρίνεται με την κατάσταση μεθυλίωσης miR-224 στο γαστρικό ιστούς: Ν miR-224 Un (μη καρκινικά χωρίς miR-224 μεθυλίωση? Ν = 20), Ca miR-224 Un (ιστοί GC χωρίς να miR-224 μεθυλίωση? n = 10), και Ca miR-224 Mt (ιστοί GC με miR-224 μεθυλίωση? n = 15). Το t-test δύο δειγμάτων πραγματοποιήθηκε για να εξεταστεί η διαφορά μεταξύ δύο ομάδων. (D) Σύγκριση του miR-224 κατάσταση μεθυλίωσης και

DPYSL2

επίπεδα mRNA σε ιστούς GC. Τα σχετικά επίπεδα του

DPYSL2

έκφραση σε γαστρικό ιστούς προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR, κανονικοποιημένη ως προς

GAPDH

, και στη συνέχεια σε σύγκριση με την κατάσταση μεθυλίωσης miR-224 σε γαστρικό ιστούς: Ν miR-224 Un (μη-καρκινική χωρίς να miR-224 μεθυλίωση, n = 6), Ca miR-224 Un (ιστοί GC χωρίς να miR-224 μεθυλίωση, n = 8), και Ca miR-224 Mt (ιστού GC με miR -224 μεθυλίωση, η = 7). Τα κουτιά δείχνουν τις 25η και 75η εκατοστιαία, οι οριζόντιες γραμμές μέσα στα πλαίσια δείχνουν τις διαμέσους και οι μπάρες δείχνουν τα 10ο και 90ο εκατοστημόριο. NS, μη σημαντικό

Η

Εμείς αναλύεται η

DPYSL2

επίπεδα mRNA σε σύγκριση με την κατάσταση μεθυλίωσης του miR-224 σε ιστούς GC:. GCs με miR-224 μεθυλίωσης (Ca miR-224 Mt), ΔΘ με miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), και μη-καρκινικούς ιστούς με unmethylation (Ν miR-224 Un). Η

DPYSL2

επίπεδο mRNA στην ομάδα «Ca miR-224 Mt» ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στο «Ν miR-224 Un» και «Ca miR-224 Un» ομάδων, p = 0,049 και p = 0,035, αντίστοιχα (Σχήμα 7D). Έτσι, υπάρχει ένας συσχετισμός μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης του miR-224 και

DPYSL2

έκφραση σε ιστούς GC.

Η συχνότητα της μεθυλίωσης miR-340 ήταν σχετικά χαμηλή στους ιστούς πρωτογενών GC δοκιμαστεί (4 26, 15.4%) (Σχήμα 7Β και Πίνακας 1), ενώ κανένα από 26 ζεύγη μη καρκινικών γαστρικού βλεννογόνου εμφάνισαν προφανή μοτίβα μεθυλίωσης του miR-340. Όσο για miR-152 ανάλυση μεθυλίωσης, προσπαθήσαμε τρία σύνολα εκκινητών σχεδιάζονται στην ανάντη περιοχή του miR-152 που περιείχε CpG νησίδες (Σχήμα S1), αλλά κανένα από αυτά δεν ταιριάζουν εντελώς miR-152 έκφρασης στο MSP αναλύσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Αν και έχει αναφερθεί ότι η έκφραση ορισμένων miRNAs μειώνεται σε αρκετούς καρκίνους μέσω μεθυλίωσης του DNA, οι περισσότερες από τις αναφορές περιέγραψαν ότι η σχέση μεταξύ ανώμαλη έκφραση των miRNAs και γονιδίων στόχων ήταν ένα-προς-ένα, ένα-προς-πολλαπλά ή πολλαπλών-προς-ένα. Να εξετάσει τη δυνατότητα πολλαπλών-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ των miRNAs και στόχων στα καρκινικά κύτταρα, επικεντρωθήκαμε σε δύο συνδυασμούς των miRNAs στα κύτταρα GC, το miR-224 /-452 συμπλέγματος, και miR-181γ και -340, σε αυτή τη μελέτη . Βρήκαμε ότι τα δύο σύνολα των miRNAs, miR-224 και -452, και miR-181γ και -340, είχε πολλαπλά γονίδια-στόχους,

DPYSL2

και

KRAS

, και

KRAS

και

MECP2

, μειώθηκαν αντιστοίχως, και συνεργιστικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC. Είναι αξιοσημείωτο ότι ένα ογκογονίδιο,

KRAS

[16], βρέθηκε να απευθύνονται από τέσσερις miRNAs, αν και θέσεις πρόσδεσης υποψήφιος των τεσσάρων miRNAs είναι διαφορετικά στην 3′-UTR του

KRAS

(TargetScan). Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι το miR-181γ κάτω-ρυθμίζονται

NOTCH4

πάρα πολύ [13]. Έτσι, πολλαπλές-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ των miRNAs και στόχοι υποδεικνύεται όχι μόνο από τη βάση δεδομένων αναλύσεις, αλλά και από τα πειράματα επιμόλυνσης που αφορούν τα ανθρώπινα κύτταρα.

κυτταρικές GC γραμμές miR-224- ή /και -340-έκφραση αρνητικών εμφάνισε σήματα υπερμεθυλίωση στην ανάλυση MSP και την έκφραση του miR-224 και -340 αποκατασταθεί σε αγωγή με τον παράγοντα απομεθυλίωσης. Επιπλέον, υπερμεθυλίωση του miR-224 και -340 παρατηρήθηκε συχνότερα στην πρωτοβάθμια GCs από τις αντίστοιχες noncancerous βλεννογόνων. Σε miR-224 μεθυλίωσης-θετικές περιπτώσεις, η έκφραση του miR-224 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στη μεθυλίωση-αρνητικές. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν σθεναρά ότι η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA είναι ένας από τους βασικούς μηχανισμούς που διέπουν τα κάτω ρύθμιση του miR-224 και -340 στα κύτταρα GC.

Δείξαμε ότι η αναστολή της επεξεργασίας miRNA από siDICER1 επιμόλυνση ή χρησιμοποιώντας DICER1 νοκ-άουτ κύτταρα μείωσε την επίδραση της 5-αζα-CdR, δηλαδή, μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων στόχων, GC και τα κύτταρα CRC. Έχει αναφερθεί ότι η αφθονία του DICER1, το ένζυμο που καταλύει το τελικό στάδιο της ωρίμανσης miRNA, συνδέεται άμεσα με την εξέλιξη του όγκου [17]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι παρεκκλίνουσα ρύθμιση των miRNA ωρίμανση συμβάλλει στην GC και το σχηματισμό CRC.

Βρήκαμε ότι το σύμπλεγμα miR-224 /-452 ήταν έκτροπα κάτω-ρυθμίζονται σε GCs μέσω υπερμεθυλίωση. Η ανώμαλη έκφραση του miR-224 έχει επίσης αναφερθεί σε άλλους όγκους. Η έκφραση του miR-224, ας-7f και miR-516α μειώνεται στον καρκίνο των ωοθηκών, και συνεργικά ρυθμίζουν την έκφραση του καλλικρεϊνης που σχετίζονται πεπτιδάσης 10 (KLK10) [18]. miR-224 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μεθοτρεξάτη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές CRC έναντι σε ευαίσθητα κύτταρα [19]. Εδώ αποκάλυψε επίσης ότι η κατάσταση μεθυλίωσης του miR-224 συσχετίστηκε με το

DPYSL2

επίπεδο στην ανθρώπινη GCs. Στο σύνολό τους, miR-224 παίζει σημαντικό ρόλο ως ογκο-κατασταλτική miRNA σε GC καθώς και σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου. Σε αντίθεση, miR-224 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ηπατοκυτταρικά καρκινώματα [20] και μυελοβλαστώματα [21] σε σύγκριση με στους φυσιολογικούς ιστούς. Έτσι, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί ο ρόλος του miR-224 στην καρκινογένεση.

Ερευνήσαμε με τους κοινούς στόχους των επιγενετικώς κάτω-ρυθμίζονται miRNAs.

DPYSL2

φάνηκε να είναι κάτω-ρυθμίζονται από miR-224 και -452. DPYSL2 παίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία των νευρωνικών πολικότητας [22]. DPYSL2 εμπλέκεται επίσης σε οδούς που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των μη νευρωνικών κυττάρων μέσω φωσφορυλίωσης της από ρυθμιστικές πρωτεΐνες. DPYSL2 υφίσταται δυναμικές αλλαγές φωσφορυλίωση σε απόκριση σε επαφή αναστολή επαγόμενης ηρεμία και υπερφωσφορυλίωση του DPYSL2 συμβαίνει σε έναν όγκο [22]. Αν και ο ρόλος του DPYSL2 σε GCs δεν είναι σαφής, siRNA που βασίζεται knockdown μας έκφρασης DPYSL2 προκάλεσε μια μείωση του πολλαπλασιασμού στις δύο κυτταρικές σειρές GC, υποδηλώνοντας ογκογόνο δραστικότητα της DPYSL2.

Εν περιλήψει, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι πολλαπλών-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ των miRNAs και γονιδίων-στόχων υπάρχουν πραγματικά στο GC. Είναι πιθανό ότι παρεκκλίνουσα μεθυλίωση μειώνει την έκφραση πολλαπλών miRNAs όγκου καταστολής, όπως miR-224, -452, -340 και -181c, το οποίο στη συνέχεια επάγουν υπερ-έκφραση πολλαπλών γονιδίων ογκογόνου, όπως

KRAS

,

DPYSL2

, και

MECP2

. Αυτά τα ανώμαλα πολλαπλών-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ των miRNAs και οι στόχοι θα είναι ένα από τα σημαντικά μηχανισμών που διέπουν τη γαστρική καρκινογένεση. Είναι, ως εκ τούτου, πολύ πιθανό ότι επιγενετικές φάρμακα μπορούν ομαλοποιούν την έκφραση όχι μόνο τον όγκο κατασταλτική γονιδίων αλλά επίσης πολλαπλά miRNAs όγκου καταστολής, με αποτέλεσμα μειώσεις των μη φυσιολογικών πολλαπλών-to-πολλαπλών σχέσεων μεταξύ miRNAs και στόχων, και έτσι μπορεί να γίνει άριστη θεραπευτικά φάρμακα κατά του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα, και η επιτροπή δεοντολογίας του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Ιατρική ενέκρινε την εν λόγω έρευνα.

γραμμές κυττάρων και δείγματα ιστών

Μελετήσαμε 9 κυτταρικές σειρές GC (ΚΑΤΩ-III, ΜΚΝ45, AGS, ΜΚΝ74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 και GCIY), 2 κυτταρικές σειρές CRC (HCT116 και

DICER1

νοκ-άουτ HCT116 [23]), και 26 πρωτοβάθμια περιπτώσεις GC. ΜΚΝ45, ΜΚΝ74, TGBC11TKB και GCIY αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων RIKEN, και ΚΑΤΩ-III και AGS ήταν από την ATCC (American Type Collection κυττάρων). HSC59, HSC43 και HSC58 ελήφθησαν από τον Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. ΚΑΤΩ-ΙΙΙ, ΜΚΝ45, ΜΚΝ74, HSC59, HSC43 και HSC58 αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640, και AGS, TGBC11TKB, GCIY και οι δύο κυτταρικές σειρές CRC σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle, ελάχιστο ουσιαστικό μέσο ή McCoy 5Α, συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορρός. Χειρουργικά δείγματα από 26 ασθενείς με πρωτοπαθή GC επιλέχθηκαν τυχαία που λαμβάνεται από το Ενταγμένο Νοσοκομείο της Ιατρικής Σχολής, το Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου.

in silico ανάλυση

Εμείς που αναφέρονται στη βάση δεδομένων GEO για miRNA και προφίλ γονιδιακής έκφρασης (ένταξη GEO Νο GSE16006 και GSE2685). Χρησιμοποιήσαμε επίσης miRNA βάση δεδομένων στόχου «TargetScan».

Drug Θεραπεία των κυττάρων και RNA Εκχύλιση

Για μελέτες απομεθυλίωση, τα κύτταρα καθημερινή αγωγή με 5 μmol /l 5-αζα-CDR (Sigma- Aldrich, St Louis, ΜΟ) για 72 ώρες. Μπορούμε επίσης κατεργασμένα κύτταρα με 0,3 μmol /l TSA και μόνο, και με συνδυασμό 0,2 μmol /l 5-αζα-CDR και TSA. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA) ή ένα κιτ miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Germany).

ποσοτική πραγματικού χρόνου Reverse Transcription-πολυμεράση

αλυσιδωτή αντίδραση

Real-time αλυσίδα ανάστροφη μεταγραφή-αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα StepOne πραγματικού χρόνου PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq κύριο Μείγμα με ROX (Roche, Mannheim, Germany), ένα TaqMan Reverse Transcription kit (Applied Biosystems), και προσδιορισμούς TaqMan miRNA (Applied Biosystems), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Τα επίπεδα έκφρασης του miRNA υπολογίστηκαν με βάση από το ποσό του στόχου miRNA σε σχέση με εκείνη του RNU6B ως μάρτυρας για την κανονικοποίηση της αρχικής εισόδου του ολικού RNA.

Ανάλυση μεθυλίωσης

κατεργασία όξινου θειώδους του DNA ήταν εκτελείται με Methylamp (Epigentek, Μπρούκλιν, Νέα Υόρκη). αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (MSP) αναλύσεις μεθυλίωσης-ειδικά διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Οι αλληλουχίες εκκινητών και τα μεγέθη PCR προϊόντος φαίνονται στον Πίνακα S3.

Συνθετικό miRNA Επιμόλυνση

κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ και AGS επιμολύνθηκαν με ένα πρόδρομο μόριο που μιμείται miR-224, -452, -340 ή -181c, ή ομελέτα αλληλουχία miRNA (Sigma) για να δώσει μια τελική συγκέντρωση 25-50 nmol /l με τη χρήση ενός ηλεκτροδιατρητή, νέον (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε 24-72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για RT-PCR ή ανάλυση στυπώματος Western.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

κύτταρα

miR-μιμητικό-επιμολυσμένα ΚΑΤΩ-ΙΙΙ και AGS απλώθηκαν σε 1 × 10

3 ή 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αξιολογήθηκε τις ημέρες 1-4 μετά την επιμόλυνση με τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων με το αντιδραστήριο πολλαπλασιασμό κυττάρου WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japan), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

miRNA Πρόβλεψη στόχου και κηλίδωση Western

Οι προβλεπόμενες στόχοι των miRNAs και sites στόχο τους αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας TargetScan. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των προβλεπόμενων στόχων σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα αναλύθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με RT-PCR. αναλύσεις κηλίδος Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Το πρωτεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντι-DPYSL2 (1:500? # 9393, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Χρησιμοποιήσαμε αντι-α-τουμπουλίνης του ποντικιού (1:1000? Sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) ως εσωτερικό έλεγχο για την κηλίδωση Western. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση αντι-κουνελιού IgG και IgG αντι-ποντικού (1:2000? Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).