Abstract

CD44 ως ένας από τους δείκτες πιο υποθετικό βλαστικών κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση. Λειτουργική πολυμορφισμών απλού νουκλεοτιδίου (SNPs) του

CD44

μπορούν να ρυθμίσουν το γονίδιο λειτουργίες του και έτσι τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν πολυμορφισμοί στο 3′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) του

CD44

σχετίζονται με αυξημένη ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) διεξάγοντας μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων των 946 ασθενών CRC και 989 χωρίς καρκίνο ελέγχους. Τρεις πολυμορφισμοί (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /Α) στην 3′-UTR του

CD44

γονότυπος. Βρήκαμε ότι οι γονότυπους παραλλαγή (CT και TT) του rs13347 (προσαρμοσμένη αναλογία πιθανοτήτων (OR) = 1,79, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI) = 1,50 έως 2,17) αυξημένη ευαισθησία ενός ατόμου να CRC, σε σύγκριση με rs13347CC ομόζυγο γονότυπους. Βρήκαμε επίσης ότι οι ασθενείς CRC με το γονότυπο CT /ΤΤ είχαν 1,6 φορές αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη προηγμένων (σταδίου III + IV) CRC. Επιπλέον, λειτουργικές δοκιμασίες έδειξαν ότι το C στην αλλαγή βάσης Τ στο rs13347C /T διαταράσσει τη θέση σύνδεσης για τον microRNA HSA-mir-509-3p, αυξάνοντας έτσι

CD44

μεταγραφική δραστηριότητα και το επίπεδο έκφρασης. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η rs13347C /Τ στην θέση πρόσδεσης του microRNA μπορεί να είναι δυναμικό βιοδείκτες για τη γενετική ευαισθησία στις CRC

Παράθεση:. Wu XM, Γιανγκ HG, Zheng BA, Cao HF, Χου ZM, Wu WD (2015) λειτουργική Γενετικές παραλλαγές στο microRNA θέση σύνδεσης στο

CD44

γονιδίου σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου στην κινεζική πληθυσμούς. PLoS ONE 10 (5): e0127557. doi: 10.1371 /journal.pone.0127557

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Yifeng Zhou, Ιατρικό Κολέγιο του Πανεπιστημίου Soochow, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 13 Φεβρουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 16 Απρ 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Zhejiang Provincial Φυσικών Επιστημών (Νο 2013C33106). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται γαστρεντερικό σωλήνα σε όλο τον κόσμο [1], και η συχνότητα και η θνησιμότητα του έχει ραγδαία αύξηση κατά τη διάρκεια των προηγούμενων αρκετών δεκαετιών στην Κίνα [2]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι παράγοντες κινδύνου για το περιβάλλον, καθώς και παράγοντες του τρόπου ζωής που σχετίζονται, όπως η διαιτητική, το κάπνισμα και η κατανάλωση αλκοόλ θεωρείται ως συνεισφέροντες στην αιτιολογία της CRC [3, 4]. Όλο και περισσότερες μελέτες έχουν ήδη αναγνωρίσει ότι οι γενετικοί παράγοντες μπορεί να ρυθμίζουν σημαντικά την ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Ειδικότερα, πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) σε γονίδια μεταβάλλουν έκφραση ή δραστηριότητα του, αλλάζοντας την αλληλουχία αμινοξέων μπορεί να προδιαθέτουν για CRC ογκογένεση [5-7].

Ο καρκίνος είναι μια κατηγορία ασθενειών που χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτη κυτταρική ανάπτυξη και χωρίζουν. Ως ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων εντός ενός όγκου, καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) θα μπορούσαν να συμβάλουν στις πιο επιθετικές μορφές της νόσου με την ικανότητα έναρξης της ανάπτυξης του όγκου και των ιδιοτήτων αντοχής φαρμάκου τους. Συσσωρευμένα μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ύπαρξη του ορθοκολικού καρκίνου βλαστικών κυττάρων στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου [8-10]. Με αυτόν τον τρόπο, τα ακριβή στοιχεία του παχέος εντέρου CSC και τις ιδιότητές τους μπορεί να βοηθήσει να προωθήσει σημαντικά την αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου. Υποθετική του παχέος εντέρου πληθυσμούς CSC μπορούν να αναγνωριστούν από την έκφραση ειδικών δεικτών CSC. CD44 είναι ένα από τα γνωστά δείκτη βλαστικών κυττάρων για CRC [11].

CD44

γονίδιο κωδικοποιούσε μία γλυκοπρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας που εμπλέκονται σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων, αιματοποίηση, παλιννόστησης και την ανάπτυξη του εμβρύου [12]. Εν τω μεταξύ,

CD44

παίζει ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, διαφοροποίηση, εισβολή και κινητικότητα σε απόκριση σε ένα κυτταρικό μικροπεριβάλλον, ενισχύοντας έτσι την κυτταρική συσσωμάτωση και να συμβάλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων [13-15]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η σημαντική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου του

έκφρασης και του μαστού CD44

καρκινικό κύτταρο υψηλότερη ογκογονικότητα και μεταστατικό δυναμικό [13, 16], υπογραμμίζοντας με τον τρόπο αυτό ένα σημαντικό ρόλο του

CD44

στην πρόοδο του όγκου και μετάσταση. Αντίστοιχα, νοκ ντάουν του

CD44

με ειδικά siRNA (μικρά παρεμβαλλόμενα RNA) σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου θα μπορούσαν δραματικά suppresse την κυτταρική ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

, υποδηλώνοντας έντονα ένα ισχυρό ρυθμιστή της

CD44

στην εξέλιξη της CRC [17, 18]. Επιπλέον, περαιτέρω μελέτες έχουν επίσης δηλώσει ότι γενετικές παραλλαγές στο

CD44

γονίδιο που σχετίζεται με τον κίνδυνο καρκίνου και την πρόγνωση [19, 20]. Οι 3′-UTRs (αμετάφραστες περιοχές) των γονιδίων είναι οι κύριες περιφέρειες που καλύπτονται από microRNAs και να έχουν κεντρικό ρόλο ρόλο στη σταθερότητα του mRNA του γονιδίου και την ενδεχόμενη διαμορφώνουν τη ρύθμιση των σχετικών πρωτεϊνών. SNPs που βρίσκονται στις θέσεις microRNA-σύνδεσης μπορεί να επηρεάσουν την δεσμευτική ικανότητα των microRNA και θεωρητικά διαταράξουν την έκφραση του

CD44

και έτσι μπορεί να predisposite στην επιδεκτικότητα ασθένειας. Υποθέτουμε ότι SNPs στο

CD44

3′-UTR συνδέονται με CRC κίνδυνο επηρεάζοντας την έκφραση γονιδίου.

Στην παρούσα μελέτη ασθενών-μαρτύρων νοσοκομείο με βάση, είμαστε ο γονότυπος τρεις πολυμορφισμούς (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /Α) στην 3′-UTR του

CD44

και ανέλυσε τη σχέση μεταξύ των γενετικών παραλλαγών και τον κίνδυνο CRC. Στη συνέχεια λειτουργικές δοκιμασίες περαιτέρω εκτελείται για να διερευνήσει τη σημασία και βιολογικές λειτουργίες αυτών των SNPs.

Υλικά και Μέθοδοι

πληθυσμός Μελέτη

Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελείτο από 946 Han-κινεζική CRC ασθενείς και 989 εθνικά συμφωνημένα καρκίνο χωρίς ελέγχους. Στη μελέτη, ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο ή υγιείς μάρτυρες οι οποίοι είχαν πρόσφατα μεταγγίσεις αίματος αποκλείστηκαν. Οι ασθενείς με καρκίνο με ιστοπαθολογικές επιβεβαίωσε CRC διαδοχικά προσληφθεί στο Νοσοκομείο Zhejiang Provincial Λαϊκού (Hangzhou). Επιπλέον, δεν υπήρχαν ηλικία, το στάδιο και ιστολογία περιορισμού για τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Εν τω μεταξύ, όλα τα υγιή άτομα που προσλαμβάνονται τυχαία στη μελέτη δεν είχε καμία τεκμηριωμένη ιστορία του καρκίνου και το φύλο συχνότητα ταιριαστό καρκίνο χωρίς ελέγχους με βάση την ηλικία τους (± 5 έτη). Είχαν, επίσης, τυχαία προσληφθεί από 3500 ατομικές διατροφικές έρευνα που πραγματοποιήθηκε στην επαρχία Zhejiang στην σχεδόν ίδια περίοδο, κατά την οποία συλλέχθηκαν δείγματα αίματος των ασθενών με καρκίνο, με ποσοστό ανταπόκρισης 90%. Ο όγκος, κόμβος, μετάσταση (TNM) ταξινόμηση και όγκου στάσης αξιολογήθηκε σύμφωνα με το 2002 αμερικανική μεικτής επιτροπής για το σύστημα Καρκίνος στάσης. Ενημερωμένη συγκατάθεση υπεγράφη από τον κάθε συμμετέχοντα για την ανάλυση των μοριακών συσχετισμούς, και κάθε συμμετέχων είχε προγραμματιστεί για μια συνέντευξη με επιλεγμένες πληροφορίες όπως την κατάσταση του καπνού, η κατανάλωση αλκοόλ, το οικογενειακό ιστορικό και άλλους πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες. Οι κατανομές των επιλεγμένων κλινικών χαρακτηριστικών της κατάστασης case-control συνοψίζονται στον Πίνακα 1. 5ml δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε εγγραφή για κάθε ένα από τα υποκείμενα. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή ιατρικής δεοντολογίας του νοσοκομείου Zhejiang Provincial Λαϊκού Κόμματος.

Η

Γονοτυπικές αναλύσεις

Το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από κάθε δείγμα αίματος που λαμβάνεται από όλους τους συμμετέχοντες με τη χρήση ενός Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Τρεις πολυμορφισμοί (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /Α) στην 3′-UTR του

CD44 επιλέχθηκαν

και ο γονότυπος με αλληλόμορφων-ειδική ανάλυση φασματομετρία μάζας MALDI-TOF, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Αστάρια ζεύγη και πολλαπλές αντιδράσεις έχουν σχεδιαστεί από ρεάλια NP.com ιστοσελίδα. Περίπου το 10% MALDI-TOF φασματομετρία μάζας αναλύθηκαν δείγματα επιλέχθηκαν τυχαία για ένα τυφλό επανάληψης. Για σκοπούς ελέγχου της ποιότητας, 50 δείγματα αναλύονται πάλι με άμεση αλληλούχιση και τα αποτελέσματα ήταν σε συμφωνία 100%.

Κατασκευή λουσιφεράσης δημοσιογράφους

Γονοτυπικές για

CD44

SNPs έδειξε ότι rs13347C /T συσχετίστηκε σημαντικά με CRC κίνδυνο. Με βάση την ανάλυση βιοπληροφορικής (SNPinfo διακομιστή Web: https://snpinfo.niehs.nih.gov/), η rs13347C τη μετάβαση rs13347T αποκτήσει μια νέα δέσμευση του microRNA HSA-mir-509-3p. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι το SNP rs13347C /Τ στις θέσεις microRNA-δέσμευσης μπορεί να επηρεάσει την ικανότητα δέσμευσης της HSA-mir-509-3p, και ως εκ τούτου είχε καμία επίδραση στην

CD44

έκφρασης. Για να δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση, ο 358bp 3′-UTR θραύσμα του ανθρώπινου

CD44

γονίδιο που πλευρίζουν την rs13347C ή rs13347T αλληλόμορφο συντέθηκε με τη Genewiz Company (Suzhou, Κίνα), και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα βασική psiCHECK2 (Promega, Madison, WI, USA) με renilla και αλληλουχίες λουσιφεράση πυγολαμπίδας γονίδιο (Σχήμα 1Α). Τα δύο κατασκευάσματα αλληλουχήθηκαν για να επιβεβαιωθεί το αλληλόμορφο και την ακεραιότητα του κάθε ενθέματος.

(Α) Εκπρόσωπος (

CD44

-rs13347C και psiCHECK2-

CD44

-rs13347T psiCHECK2-) γραφική παράσταση της λουσιφεράσης δραστικότητας παραλλαγής αλληλόμορφου επί λουσιφεράσης γονίδια αναφοράς που φέρει το 358bp 3′-UTR θραύσμα του ανθρώπινου

CD44

γονίδιο που πλευρίζουν την rs13347C /T πολυμορφισμό. Σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης της psiCHECK2-

CD44

-rs13347C και psiCHECK2-

CD44

κατασκευάσματα -rs13347T συνεπιμολύνθηκαν με ή χωρίς 40pmol HSA-mir-509-3p ή 40pmol HSA-mir-509-3p αναστολέα, αντίστοιχα πραγματοποιήθηκε σε SW260 κύτταρα (Β) και κύτταρα SW116 (C). Έξι αντίγραφα διεξήχθησαν για κάθε ομάδα, και το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Αστερίσκος υποδεικνύει μια σημαντική μεταβολή (

P

& lt? 0,05). Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. (D)

CD44

επίπεδο έκφρασης σε 37 ιστούς CRC από άτομα με διαφορετικές rs13347C /T γονότυπους (15 rs13347CC, 16 rs13347CT και 6 rs13347TT)?

CD44

έκφραση ομαλοποιήθηκε με την

GAPDH

γονιδίων και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) Το επίπεδο έκφρασης της HSA-miR-509-3p σε 37 ιστούς CRC ομαδοποιούνται ανά rs13347C /T γονότυπους. Η έκφραση του mRNA της HSA-miR-509-3p υπολογίστηκε σε σχέση με την έκφραση του

U6

mRNA με υπολογισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SEM,

P

= 0,579. Οι διαφορές στα επίπεδα έκφρασης αναλύθηκαν με μονόδρομη δοκιμή ANOVA.

Η

παροδικές επιμολύνσεις και προσδιορισμούς λουσιφεράσης

δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ορθοκολικού SW116 και SW620 διατηρήθηκαν σε μέσον L-15 (Gibco, Λος Άντζελες, Καλιφόρνια, ΗΠΑ) με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Sigma-Aldrich, ΜΟ) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (BD Bio επιστήμες, Bedford, ΜΑ, USA) πριν από την επιμόλυνση. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν παροδικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22, 23] με πλασμίδια 1.5μg ανταποκριτή (rs13347C ή αλλήλιο rs13347T) με ή χωρίς 40pmol έχει-mir-509-3p μιμείται ή 40pmol αναστολέων με Lipofectamine 2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο (Invitrogen, Carlsbad, CA). Για τις δοκιμασίες λουσιφεράσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από διαμόλυνση για 24 ώρες, και η δραστικότητα της λουσιφεράσης της Renilla ποσοτικοποιήθηκε με το Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI).

Real-time PCR

RNAs από 37 CRC ιστούς με διαφορετική rs13347C /T γονότυποι εκχυλίστηκαν και μεταγράφτηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ εκκινητή. Αλληλόμορφες διάκριση των πολυμορφισμών rs13347 του

CD44

γονιδίου έγινε με το σύστημα ανίχνευσης 7500 ακολουθίας ΑΒΙ Prism να αξιολογήσει

CD44

και

GAPDH

επίπεδα mRNA με βάση το SYBR-Πράσινο μέθοδος. Al l ποσοτικοί προσδιορισμοί έγιναν με

GAPDH

ως εσωτερικό πρότυπο. Επιπλέον, η TaqMan microRNA δοκιμασίες (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης του φόντου έχει-mir-509-3p σε ιστούς CRC σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Έκφραση της γενικής εξέφρασε

U6

μικρό πυρηνικό RNA χρησιμοποιήθηκε επίσης για τον εσωτερικό έλεγχο. Η σχετική ποσοτικοποίηση των

CD44

έκφραση αναλύθηκε από το 2

-ΔΔCT μέθοδο. Κάθε δοκιμασία έγινε εις τριπλούν.

Η στατιστική ανάλυση

Δύο όψεων τεστ chi-square χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τις διαφορές στις κατανομές των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά μεταξύ των περιπτώσεων και του καρκίνου χωρίς ελέγχους. Για τη μελέτη ασθενών-μαρτύρων, η ισορροπία Hardy-Weinberg (HWE) ελέγχθηκε για να συγκρίνουν τις αναμενόμενες συχνότητες γονοτύπου με παρατηρούμενες συχνότητες γονοτύπου σε ελέγχους από chi-square test καλοσύνη-of-fit. Η συσχέτιση μεταξύ των γενετικών παραλλαγών και κλινικές παραμέτρους εξετάστηκε χρησιμοποιώντας την τετραγωνική τεστ Chi ανάλογα με την περίπτωση. Οι αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΠΙ) εκτιμήθηκαν για την αξιολόγηση της συσχέτισης μεταξύ rs13347C /Τ πολυμορφισμού και του κινδύνου CRC χρησιμοποιώντας μια άνευ όρων μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης. Στρωματοποιημένη ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης να αξιολογηθεί η πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ

CD44

πολυμορφισμών και επιλεγμένων μεταβλητών για CRC κίνδυνο. Στατιστικές συγκρίσεις περισσοτέρων των δύο ομάδων αξιολογήθηκαν από δοκιμές ANOVA μονόδρομη. Η στατιστική ισχύς υπολογίστηκε με τη χρήση του λογισμικού PS (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSample-Size). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού STATA λογισμικού (έκδοση 10? STATA Corporation). Η ένωση θεωρήθηκε σημαντική όταν

P

-τιμή ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

γονότυποι και τον κίνδυνο της CRC

Ένα σύνολο από 946 περιπτώσεις CRC και 989 υγιείς μάρτυρες είχαν προσληφθεί στην ανάλυσή μας και ο γονότυπος για την αξιολόγηση της συσχέτισης ανάμεσα

CD44

rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /Α και του κινδύνου CRC. Οι κατανομές γονότυπου των τριών πολυμορφισμών μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Οι παρατηρούμενες συχνότητες γονοτύπου αυτών SNPs μελετήθηκε σε υγιείς μάρτυρες βρέθηκαν να είναι συνεπής με HWE. αποτελέσματα γονοτυπική έδειξε ότι μόνο rs13347 ήταν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με CRC κίνδυνο, δεν υπάρχουν σημαντικές ενώσεις σημειώθηκαν σε άλλες SNPs. Οι ασθενείς με το

CD44

πολυμορφισμού rs13347TT γονότυπων συσχετίστηκε με τον αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων. Επιπλέον, φορέα με τη συνδυασμένη παραλλαγή γονότυπο CT /ΤΤ παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο CRC (OR = 1,79, 95% (CI) = 1,50 – 2,17),

P

& lt? 10

-4) , σε σύγκριση με τον CC γονότυπο.

η

Πραγματοποιήσαμε περαιτέρω την στρωματοποιημένη ανάλυση για rs13347C /T από την κλινική ή παθολογική χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, η κατανάλωση αλκοόλ και το οικογενειακό ιστορικό καρκίνου. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, υπήρχε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ του πολυμορφισμού rs13347C /Τ και το στάδιο του όγκου. Παρατηρήσαμε ότι σε σύγκριση με το γονότυπο rs13347CC, οι ασθενείς με το γονότυπο CT /ΤΤ είχε πάνω από 1,6 φορές αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη προηγμένων (σταδίου III + IV) CRC (

P

= 0,004). Ωστόσο, υπάρχουν διαφορές σε άλλες υποομάδες δεν βρέθηκε.

Η

Επίδραση του SNP rs13347C /T σχετικά με τη δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς της

Δύο λουσιφεράσης κατασκευάσματα ανταποκριτή που περιέχει rs13347C ή αλληλόμορφο rs13347T παροδικά ήταν συν-επιμολυσμένα με μιμούνται ή αναστολέα της HSA-mir-509-3p που στηρίζεται σύνδεση με rs13347C /πολυμορφική θέση Τ με ανάλυση βιοπληροφορικής για να διερευνήσει την επίδραση της SNP rs13347C /T

CD44

δραστηριότητα μεταγραφή 3′-UTR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β και 1C, τα microRNA HSA-mir-509-3p μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα CRC θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την δραστικότητα λουσιφεράσης του γονιδίου αναφοράς με το αλληλόμορφο rs2735383C σύγκριση με αλληλόμορφο rs2735383T (

P

= 0,007 για SW620 και

P

= 0,02 για SW116). Σε αντίθεση, η δραστικότητα του γονιδίου αναφοράς με το αλληλόμορφο rs13347C trended σημαντικά για να αντιστραφεί μετά από παροδική επιμόλυνση των κυττάρων με HSA-mir-509-3p μιμούνται και τα αντίστοιχα αναστολέα της. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε οποιαδήποτε σημαντικά αποτελέσματα επί των γονιδίων ρεπόρτερ με το αλληλόμορφο rs2735383T με κατεργασία της HSA-mir-509-3p μιμούνται και αναστολέα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το C στην αλλαγή βάσης Τ του rs13347C /T διαταράσσει τη θέση δέσμευσης για HSA-mir-509-3p, αύξησε έτσι τη μεταγραφική δραστηριότητα της

CD44

γονίδιο.

Association μεταξύ rs13347C /Τ γονότυπους και

CD44

έκφραση

Πραγματοποιήσαμε PCR πραγματικού χρόνου για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της rs13347C /T

CD44

έκφραση χρησιμοποιώντας 37 καρκινικούς ιστούς από μη επεξεργασμένο ασθενείς CRC με διαφορετικούς γονότυπους. Όπως απεικονίζεται φαίνεται στο Σχ 1Δ, τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι οι ασθενείς με γονότυπους rs13347T (CT και TT) στέγαζε ένα σημαντικά υψηλότερο

επίπεδα CD44

mRNA (μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM): 0.565 ± 0.057), σε σύγκριση με φορείς των γονότυπων rs13347CC (μέση τιμή ± SEM: 0.305 ± 0.050? τεστ ANOVA:

P

= 0,003). Και εμείς, στη συνέχεια, ανέλυσε τη σχέση μεταξύ HSA-mir-509-3p έκφρασης και

CD44

rs13347C /T γονότυπους. Η HSA-Mir-509-3p εκφράζεται ιδιοσυστατικά στα 37 καρκινικούς ιστούς από χωρίς θεραπεία ασθενών με CRC διαφορετικούς γονότυπους? Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης φόντο της HSA-mir-509-3p και το

CD44

rs13347C /T γονότυπους (0.037 ± 0.008 για CC? 0,027 ± 0,005 για CT και 0,029 ± 0,011 για το ΤΤ ? ANOVA test:.

P

= 0,579) (Σχήμα 1 Ε)

Συζήτηση

στην παρούσα μοριακή επιδημιολογική μελέτη, ερευνήσαμε τις ενώσεις των τριών SNPs στο 3 ‘ -UTR του

CD44

γονίδιο με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου σε κινεζικού πληθυσμού και διαπίστωσε ότι η rs13347C /Τ ήταν σημαντικά σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο CRC. Παρατηρήσαμε επίσης μία σημαντική αυξημένο κίνδυνο στάδιο του όγκου CRC που συνδέονται με την παραλλαγή rs13347T σε έναν τρόπο αλληλο-δόσης. Περαιτέρω λειτουργικά πειράματα έδειξαν ότι η παραλλαγή rs13347T μπορεί να αλλάξει σημαντικά την HSA-mir-509-3p μεσολάβηση

CD44

μεταγραφική δραστηριότητα και τη δραστηριότητα της έκφρασης. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι παραλλαγές στο

CD44

γονίδιο μπορεί να είναι πολύτιμη για την αξιολόγηση του κινδύνου, τη διάγνωση και τη γενετική επιδημιολογική ανάλυση της CRC.

Το

CD44

γονίδιο βρίσκεται σε χρωμοσωμική θέση 11p13 και κωδικοποιεί ένα ευρέως εκφραζόμενο επιφανείας κυττάρου διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων. Η πρωτεΐνη περιλαμβάνει κυρίως με Ν άκρο (υπολείμματα 38-46) και Ο-τερματικό τμήμα της εξωκυτταρικής περιοχής (υπολείμματα 150-162), το οποίο είναι γνωστό ότι είναι αναγκαία για την πρόσδεση ένα ποικίλο ρεπερτόριο προσδεμάτων όπως το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), οστεοποντίνη και μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης [24]. Υπάρχουν αρκετές γραμμές πειραματικές αποδείξεις που υποστηρίζουν έναν ρόλο για

CD44

συμμετέχουν σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διαδικασιών συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων, την απόπτωση, την αιμοποίηση, ανακυκλοφορίας και παλιννόστησης [25-27].

CD44

έχει μια καλά τεκμηριωμένη δράση προαγωγής όγκων που περιλαμβάνει την προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, τη διαφοροποίηση και τη μετάσταση [28]. Πολλές μελέτες μοριακής βιολογίας έχουν προσδιορίσει ότι

CD44

έκφραση είναι στενά συνδεδεμένη με τις διάφορες κακοήθειες εμφάνιση, την εξέλιξη και την πρόγνωση [29-32]. Ανεξαιρέτως,

CD44

βρέθηκε επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη CRC. Μια πρόσφατη μελέτη που βασίστηκε σε 234 ασθενείς CRC απέδειξαν ότι η αυξημένη

CD44

έκφραση σε CRC συσχετίζεται με μετάσταση, αυξημένη επανεμφάνιση όγκων σε πρώιμο στάδιο και χημειοαντίσταση [33]. Πρόσφατες πειραματικές αποδείξεις τόσο από

in vitro

κλωνογονικού και

in vivo

ογκογόνο δοκιμασία αποκάλυψε ότι τα κύτταρα CD44 (+) CRC εμφανίσετε τις ιδιότητες των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [18], γεγονός που υποδηλώνει λειτουργική σημασία της

CD44

στην έναρξη και την ανάπτυξη CRC. Με συνέπεια, έχουμε δημιουργήσει γενετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του

CD44

και τον κίνδυνο της CRC. Επιπλέον, οι λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν ότι το

CD44

rs13347C /T SNP μπορεί να επηρεάσει

CD44

έκφραση τροποποιώντας δέσμευση στο 3′-UTR του

CD44 HSA-mir-509-3p

γονίδιο. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι HSA-mir-509-3p μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο κατά τον σχηματισμό του καρκίνου [34, 35]. Και δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης φόντο της HSA-mir-509-3p και το

CD44

rs13347C /T γονότυποι παρατηρήθηκε στη μελέτη, που δείχνει ότι ορισμένα μη αναγνωρισμένα μηχανισμούς διαμόρφωσης του αποτελέσματος της HSA-mir-509- 3p για γονότυπους rs13347T μπορεί να υπάρχουν. Το αποτέλεσμά μας έδειξε ότι η C στην αλλαγή βάσης Τ του rs13347C /T πιθανώς διαταράσσουν τη θέση δέσμευσης για HSA-mir-509-3p, αυξάνει την μεταγραφική δραστικότητα του

CD44

γονίδιο και έτσι ήταν πιο επιρρεπή σε CRC.

στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε πρώτα ότι

CD44

rs13347C /παραλλαγή Τ συμβάλλει στην αύξηση του κινδύνου CRC. Η τρέχουσα μελέτη βασίζεται σε ένα σχετικά μεγάλο, τυχαία, εθνικά ομοιογενούς δείγματος, πράγμα που σημαίνει ότι είναι δυνατόν να αποφευχθεί οποιαδήποτε σύγχυση προκατάληψη. Αξίζει να σημειωθεί ότι η στατιστική ισχύς αυξήθηκε για να είναι 0,91 (δύο όψεων δοκιμής, α = 0.05) σε ανίχνευση ενός OR Ν για τους γονότυπους rs13347CT + ΤΤ (που συμβαίνουν σε συχνότητα 41,56% μεταξύ των ελέγχων) σε σύγκριση με το γονότυπο rs13347CC . Επιπλέον, η ένωση είναι βιολογικά αληθοφανής, γεγονός που υποδηλώνει αυτό το εύρημα είναι αξιοσημείωτο.

Εν κατακλείδι, αυτή είναι η πρώτη έκθεση να βρει συσχέτιση μεταξύ του πολυμορφισμού rs13347C /Τ που βρίσκεται στην HSA-mir-509-3p θέση πρόσδεσης, η οποία μπορεί να επηρεάσει

CD44

επίπεδο έκφρασης του mRNA και ο κίνδυνος της CRC. Επιπλέον, η μελέτη μας έδειξε ότι σε σύγκριση με το γονότυπο CD44 rs13347CC, οι γενότυποι παραλλαγή (CT + ΤΤ) προσδίδει αυξημένο κίνδυνο πληθυσμούς CRC. Επιπλέον, το αποτέλεσμα κίνδυνος αυτού του πολυμορφισμού είναι πιο εμφανής σε στάδιο του όγκου (III + IV) των ασθενών CRC. Μεγαλύτερο, κατά προτίμηση μελέτες ασθενών-μαρτύρων με βάση τον πληθυσμό είναι απαραίτητες για να επιβεβαιώσετε τις συσχετίσεις μεταξύ

CD44

πολυμορφισμοί με διαφορετικές ανθρώπινες κακοήθειες σε διαφορετικές εθνοτικές ομάδες.

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη ήταν υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Zhejiang Provincial Φυσικών Επιστημών (Νο 2013C33106).