Αφηρημένο

Ιστορικό

Κατ ‘αναλογία με την κανονική διαφοροποίηση βλαστικών κυττάρων, η τρέχουσα κυττάρων (CSC) μοντέλο καρκινικά βλαστικά προϋποθέτει μια ιεραρχική οργάνωση και μια μη αναστρέψιμη διαφοροποίηση στον ιστό του όγκου. Κατά συνέπεια, θα πρέπει να περιλαμβάνει ΚΕΠ μόνο ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων του όγκου, η οποία τροφοδοτεί την ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, ορισμένα πρόσφατα ευρήματα εγείρει αμφιβολίες σχετικά με τη γενική εφαρμοσιμότητα του μοντέλου CSC και ζήτησε την φινέτσα του.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Στην παρούσα μελέτη αναλύονται οι ιδιότητες CSC των καρκινικών κυττάρων του μαστού που προέρχεται από διαγονιδιακά (WAP-T) ποντίκια. Έχουμε δημιουργήσει μια πολύ ογκογόνο WAP-Τ κυτταρική σειρά (κύτταρα G-2) που εμφανίζει χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως. κύτταρα G-2, καθώς επίσης και κλωνική παράγωγά τους, είναι στενά συνδεδεμένα με πρωτογενείς όγκους που αφορούν τα προφίλ ιστολογία και γονιδιακής έκφρασης, και αντανακλούν ετερογένεια όσον αφορά τη διαφοροποίηση μελών τους. G-2 καλλιέργειες περιλαμβάνουν κυτταρικούς πληθυσμούς σε διακριτές καταστάσεις διαφοροποίησης που προσδιορίζονται από συν-έκφραση πρωτεϊνών κυτταροσκελετικών (κυτοκερατίνες και βιμεντίνης), ένας συνδυασμός δεικτών κυτταρικής επιφάνειας και ένα σύνολο παραγόντων μεταγραφής. Cellular υποσύνολα ταξινομημένα σύμφωνα με την έκφραση του CD24a, CD49f, CD61, EpCAM, Sca1, και πρωτεΐνες επιφάνειας Thy1 κυττάρων, ή μεταβολικούς δείκτες (π.χ. δραστηριότητα ALDH) είναι αρμόδια για την ανασύσταση της αρχικής κυτταρική σύνθεση. αποδοτικότητα Ανασύσταση ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των επιμέρους υποσύνολα και επηρεάζεται από αλληλεπιδράσεις με το αντίστοιχο συμπληρωματικό G-2 κυτταρική υποσύνολο. Η ισορροπία μεταξύ των κρατών διαφοροποίηση ρυθμίζεται εν μέρει από τον παράγοντα μεταγραφής Sox10, όπως εξάντληση των Sox10 οδήγησε σε πάνω ρύθμιση των Twist2 και αύξησε το ποσοστό της Thy1-κυττάρων που εκφράζουν αντιπροσωπεύουν κύτταρα σε μια αυτο-ανανεώσιμη, αναστρέψιμη, οιονεί μεσεγχυματικά κατάσταση διαφοροποίησης .

Συμπεράσματα /Σημασία

κύτταρα G-2 αποτελεί μια αυτο-αναπαραγωγή του συστήματος των καρκινικών κυττάρων, διατηρείται από διμερείς και μονής κατεύθυνσης μετατροπή των συμπληρωματικών κυτταρικών υποσυνόλων. Το έργο μας συμβάλλει στην τρέχουσα αμφιλεγόμενη συζήτηση σχετικά με την ύπαρξη και τη φύση της CSC και παρέχει μια βάση για την ενσωμάτωση των εναλλακτικών υποθέσεων στο μοντέλο CSC

Παράθεση:. Wegwitz F, Kluth MA, Manz C, Otto Β, Gruner Κ, Heinlein C, et al. (2010) Ογκογονικά WAP-T μαστού ποντικού Καρκίνωμα Κυττάρων: Ένα μοντέλο για ένα σύστημα κυψελών Αυτο-ανατύπωση Ομοιοστατική Καρκίνου. PLoS ONE 5 (8): e12103. doi: 10.1371 /journal.pone.0012103

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7, Απρίλη 2010? Αποδεκτές: 14 Ιουλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2010

Copyright: © 2010 Wegwitz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (De 212 /23-1-3 με WD και GT), η Deutsche Krebshilfe (Forschungsverbund «Tumorstammzellen») για να WD και GT, το VFK Krebsforschung gGmbH στο WD, και το Fonds der Chemischen Industrie . Ο Heinrich-Pette-Institute υποστηρίζεται οικονομικά από το Freie und Χανσεατική πόλη του Αμβούργου και το Ομοσπονδιακό Υπουργείο Gesundheit. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορισμός από Rollin Hotchkiss της ζώσας ύλης », όπως την επαναλαμβανόμενη παραγωγή διέταξε ετερογένειας» εφαρμόζεται στην κανονική καθώς και σε καρκινικό ιστό [1]. Η κυτταρική ετερογένεια που παρατηρείται σε πολλούς συμπαγείς όγκους σε λειτουργικό και δομικό επίπεδο θυμίζει στο σύμπλεγμα κυτταρική οργάνωση των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών. Αυτή η ομοιότητα του όγκου στο φυσιολογικό ιστό νομιμοποιεί την επίσημη εφαρμογή των αρχών και εννοιών στην αναπτυξιακή βιολογία για την έρευνα του καρκίνου. Το μοντέλο των καρκινικών βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ) [2], [3] περιγράφει ένα όγκο ως ιεραρχικά οργανωμένο σύστημα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και διαφοροποιημένους απογόνους τους. Όπως υποτίθεται από το μοντέλο CSC, ένα μικρό υποσύνολο κυττάρων οδηγεί την ανάπτυξη του όγκου και είναι υπεύθυνη για υποτροπή του όγκου μετά από μια φαινομενικά επιτυχής θεραπεία. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα, που αναφέρονται ως ΚΕΠ, ογκογενή ή ογκογόνων κυττάρων, διακρίνονται από έναν συνδυασμό λειτουργικά ορίζεται συνδέονται δείκτες επιφάνειας κοινά ή μοναδικά κύτταρο και την ικανότητα να καθορίσει τη νόσο σε ποντίκια κατάλληλο δέκτη [4]. Σε αντίθεση με το στοχαστικό μοντέλο της κλωνικής εξέλιξης, η οποία αποδίδει κυττάρου όγκου ετερογένεια σε γενετικές διαφορές στην πισίνα κυττάρου όγκου [5], το μοντέλο CSC υποθέτει ότι επιγενετικές παρά οι γενετικές διαφορές διακρίνουν ογκογόνα από μη ογκογόνα κύτταρα, παρέχοντας έτσι τη βάση για οι ιεραρχικές σχέσεις μέσα στον πληθυσμό των κυττάρων του όγκου [6].

Πρόσφατα ευρήματα ότι ογκογόνων κυττάρων μπορεί να περιλαμβάνει ένα σημαντικό μέρος της μάζας του όγκου [7] αμφισβητούν την αυστηρή ιεραρχική οργάνωση του ιστού του όγκου [8], και μάλλον υποστηρίζουν για «φαινοτυπική πλαστικότητα» του όγκου των κυττάρων [9], συντηρείται από ομοιοστατικοί μηχανισμοί [10]. Ως εκ τούτου, ΚΕΠ δεν υπάρχουν ως μοναδικό πληθυσμό που ορίζεται από διακριτές μοριακές ιδιότητες, αλλά μαζί με διαφοροποιημένη απογόνους τους αποτελούν μια αυτο-αναπαραγωγής «σύστημα βλαστικών κυττάρων», όπου η κυτταρική σύνθεση ρυθμίζεται από αλληλομετατροπή των διαφόρων κρατών διαφοροποίησης [9]. Όγκων επιθηλιακής προέλευσης (καρκινώματα) εμφανίζουν συνήθως υψηλή ιστολογική ανομοιογένεια που αντανακλούν διάφορες καταστάσεις διαφοροποίηση των μεμονωμένων κυττάρων. Με βάση τις τρεις φαινοτυπικά κριτήρια – πόλωση κύτταρο, κύτταρο συνεκτικότητα και πρότυπο έκφρασης των κυτταροπλασματικών ενδιάμεσου νήματος πρωτεΐνες (CIF) – έχει προταθεί να ορίσει τέσσερα φαινοτύπους, που κυμαίνονται από καθαρά επιθηλιακά σε εντελώς μεσεγχυματικά [11]. Κατά συνέπεια, η κατάσταση διαφοροποίηση των μεμονωμένων κυττάρων σε καρκινώματα αντιστοιχεί σε επιθηλιακά, ένα μεσεγχυματικά και ένα ενδιάμεσο φαινότυπο. Αυτές οι καταστάσεις διαφοροποίηση μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε σταθερή και παροδική υποτύπους, οι οποίες συνολικά συναρμολογούνται σε ένα δυναμικό «οικοσύστημα». Η διαδικασία ονομάζεται επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) και τον ομόλογό του, που ονομάζονται μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) [12], [13], περιγράφουν τη μετατροπή των απέναντι μελών διαφοροποίησης. Αυτές οι μεταβάσεις έχουν πρόσφατα συνδεθεί με κύτταρο βλαστική ικανότητα από την παρατήρηση ότι η επαγωγή του ΕΜΤ σε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων ανθρώπινων επιθηλιακών μαστού δημιουργεί ένα υποσύνολο των κυττάρων υψηλώς εμπλουτισμένο σε ΚΕΠ [14], [15]. Το μοντέλο που αναδύεται από τις μελέτες αυτές προτείνει ότι σε καρκινώματα ΕΜΤ και λογαριασμό ΜΕΤ για την παραγωγή ενός υποσυνόλου των κυττάρων που βρίσκονται σε ισορροπία με το διαμέρισμα επιθηλιακών όγκων και είναι σε θέση να αναγεννηθούν το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων του όγκου [9].

διαγονιδιακών και knockout ποντικοί παρέχουν συγγενή (ή συγγενείς) μοντέλα για την έρευνα CSC, καθώς επιτρέπουν τη δημιουργία ασθενειών του καρκίνου σε ανοσο-ικανά ζώα που μιμούνται το αντίστοιχο ανθρώπινο κατάσταση, και είναι μια πηγή για κυτταρικές σειρές που επιτρέπει μελέτες των ιδιοτήτων CSC. Ωστόσο, η καταλληλότητα των μοντέλων ποντικού συχνά περιορίζεται από το γεγονός ότι τα αποτελέσματα της έκφρασης ενός ογκογονιδίου ή απώλεια ενός ογκοκατασταλτικού, ασκούνται ήδη στο στάδιο του εμβρύου και κατά την ανάπτυξη του ιστού, ενώ στη συντριπτική πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων γενετικών μεταβολές που οδηγούν σε καρκίνο θα συμβεί σε κύτταρα ενήλικων ιστών. WAP-T διαγονιδιακά ποντίκια [16] – [19] έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα χρήσιμο μοντέλο για την ανάλυση των ογκογονίδιο που προκαλείται μαστικού καρκινογένεση σε ενήλικα ποντίκια. Σε γυναίκες ενεργοποίηση WAP-T ποντικούς του διαγονιδίου, ο ιός πιθήκου 40 (SV40) περιοχή πρώιμου γονιδίου πλευρίζεται από ένα περίπου 1.4 kb ανοδική περιοχή του γονιδίου που κωδικοποιεί για την όξινη πρωτεΐνη ορού γάλακτος ποντικού (WAP) [20], ξεκινά κατά τα τέλη κύτταρα εγκυμοσύνη σε μαστικά επιθηλιακά (ME) συμφωνούν με το ενδογενές

Wap

γονίδιο [21]. Έκφραση των SV40 πρώιμο γονίδια που κωδικοποιούν για μεγάλο Τ-αντιγόνο (LT) και μικρό t-αντιγόνο (st) κινεί μαστικού καρκινογένεση μιμούμενο μία ποικιλία γενετικών αλλοιώσεων που συνήθως παρατηρείται σε ανθρώπινα καρκινώματα του μαστού, όπως και κατάργηση της pRB-ελεγχόμενη G1-σημείου ελέγχου [ ,,,0],22], και η αδρανοποίηση του καταστολέα όγκου ρ53 [23]. Ως συνέπεια της έκφρασης πρώιμου γονιδίου SV40, parous ποντίκια WAP-T ανάπτυξη πολλαπλών κυψελιδικά βλάβες – πολυεστιακή ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΜΙΝ). Ορισμένες από αυτές τις εστιακών βλαβών προχωρήσουν περαιτέρω προς επεμβατική, αλλά σπάνια μεταστατικά καρκινώματα του μαστού [19]. Μορφολογικά, οι όγκοι αναπτύσσονται σε WAP-Τ ποντίκια είναι αδενοκαρκινώματα, που κυμαίνονται από ένα καλά σε μια κακώς διαφοροποιημένο φαινότυπο [16]. Η σημασία αυτού του μοντέλου τονίζεται από τη στενή ομοιότητα στην ιστολογία των όγκων ποντικών με τους αντίστοιχους ανθρώπινους όγκους [19].

Σε αυτή τη μελέτη ρωτήσαμε αν τα WAP-Τ όγκων περιγράφεται καλύτερα από τον κλασσικό μοντέλο CSC ή από εναλλακτικές υποθέσεις. Βρήκαμε ότι ογκογόνα κύτταρα είναι σχετικά συχνή σε WAP-Τ όγκων (έως 1/10) και είναι σε θέση να ανακεφαλαιώσουμε το φαινότυπο των αντίστοιχων πρωτογενών όγκων τους μετά ορθοτοπική μεταμόσχευση σε συγγενή ποντίκια. Για τη μελέτη ογκογόνων ιδιοτήτων τους με περισσότερες λεπτομέρειες, ιδρύσαμε από ένα WAP-Τ όγκων μιας κυτταρικής γραμμής (G-2 κύτταρα). G-2 κυττάρων με μορφή όγκους υψηλή απόδοση σε συγγενή ποντίκια που από τη γονιδιακή έκφραση αναλύσεις και φαινοτυπική είναι στενά συνδεδεμένα με πρωτογενείς όγκους. Οι καλλιέργειες G-2 κυττάρων χαρακτηρίζεται από μια υπογραφή έκφρασης γονιδίου βασικής /αυλού, ετερογένεια των μελών διαφοροποίησης και η παρουσία συμπληρωματικών κυτταρικών υποομάδων που μπορεί να διαχωριστούν σύμφωνα με διαφορές στην έκφραση ορισμένων δεικτών κυτταρικής επιφάνειας που σχετίζονται με βλαστική ικανότητα. Δείχνουμε ότι αυστηρά FACS διαχωρισμένα υποσύνολα των κυττάρων G-2 είναι αρμόδια για την ανασύσταση της αρχικής κυτταρική σύνθεση της κυτταρικής καλλιέργειας όταν μεμονωμένα καλλιεργείται. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν μια αυτο-αναπαραγωγή ομοιοστατική «σύστημα των καρκινικών κυττάρων», όπου η ισορροπία στηρίζεται στην αλληλομετατροπή των συμπληρωματικών κυτταρικών υποσύνολα, τις αλληλεπιδράσεις τους και μεταγραφική αρμοδιότητα. Προς στήριξη του μοντέλου EMT-CSC [9], που προσδιορίζονται στον πολιτισμό G-2 μια αυτο-ανανέωση του πληθυσμού των κυττάρων που χαρακτηρίζεται από την έκφραση των Thy1 και εμφάνιση αυθόρμητη αναστρεψιμότητα ενός οιονεί μεσεγχυματικά κατάσταση διαφοροποίησης.

αποτελέσματα

WAP-T όγκοι περιέχουν ένα υψηλό ποσοστό των ογκογόνων κυττάρων

ένα αποφασιστικό κριτήριο για την ΚΕΠ είναι η ικανότητά τους να κινήσουν την ανάπτυξη του όγκου μετά τη μεταμόσχευση σε κατάλληλα ποντίκια λήπτη και να ανακεφαλαιώσουμε το φαινότυπο του αρχικού όγκος. Ορθοτοπική μεταμόσχευση σειριακά αραιωμένο καρκινικών κυττάρων WAP-Τ αποκάλυψε ότι τόσο χαμηλά όσο 10

2 κύτταρα από καλά έως μετρίως διαφοροποιημένων (χαμηλού βαθμού) όγκους, και τόσο χαμηλά όσο 10

1 κύτταρα από φτωχά διαφοροποιημένα (υψηλής ποιότητας ) όγκοι ήταν σε θέση να επάγουν των καρκινωμάτων του μαστού σε συγγενή ποντίκια (Σχήμα 1Α). Μεταμοσχευμένων όγκων αντανακλάται συνήθως τον φαινότυπο των γονικών όγκων (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, η μεταμόσχευση κυττάρων από ένα χαμηλού βαθμού όγκου ενίοτε προκάλεσε επίσης όγκους υψηλού βαθμού. Όπως έχει κατά καιρούς παρατηρηθεί pauci-κλωνικότητας του WAP-Τ όγκων [17], η απόφυση των κυττάρων από μια πισίνα καρκινικών κυττάρων υψηλής ποιότητας δεν μπορεί να αποκλειστεί.

(Α) Κύτταρα από υψηλής ποιότητας WAP-T όγκοι είναι πιο ογκογόνο από τα κύτταρα από όγκους χαμηλής ποιότητας. Αραιώνονται σε σειρά (10

1, 10

2, 10

3, 10

4) προσφάτως απομονωμένα κύτταρα όγκου WAP-T εγχύθηκαν μέσα στην αριστερή κοιλιακή μαστικό αδένα όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Η &? Ε χρώση των χαμηλής ποιότητας και υψηλής ποιότητας, αντίστοιχα, WAP-T πρωτογενή και τα αντίστοιχα μεταμοσχεύονται όγκου τους. Τα μεταμοσχευμένα όγκοι αυξήθηκαν μετά την ένεση των 10

4 ή 10

2 κύτταρα, αντίστοιχα, από χαμηλής ποιότητας και υψηλής ποιότητας όγκους. μπαρ κλίμακα:. 100 μm

Η

Χαρακτηρισμός των κυττάρων G-2 και κλωνική παράγωγά τους

Για να αποφευχθούν οι επιπλοκές που σχετίζονται με την ανάλυση των πρωτογενών καρκινικών κυττάρων, έχουμε δημιουργήσει μια κυτταρική γραμμή από ένα WAP-T όγκου (G-2 κύτταρα) που θα επιτρέπουν την ανάλυση των μαστικών όγκων έναρξη και ιδιότητες βλαστοκυττάρων κάτω από το

in vitro

και

in vivo

ρυθμίσεις (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες) .

α)

In vitro

.

Ξεκινώντας από τα πρώτα περάσματα G-2 καλλιέργειες κυττάρων εμφάνισαν ένα ανομοιογενές πρότυπο ανάπτυξης, χαρακτηρίστηκε από πυκνά αποικίες ενσωματωμένα σε πλακόστρωτα-όπως περιοχές (Σχήμα 2Α). Σε μεταγενέστερες περάσματα κύτταρα G-2 διατήρησαν την ικανότητα να σχηματίζουν πολλαπλές συστάδες κυττάρων και τρισδιάστατα αναπτυσσόμενες αποικίες, αλλά απέκτησε μια πιο ινοβλαστική μορφολογία παρόμοια (Σχήμα 2Β, C). κύτταρα G-2 εμφανίζουν σταθερό, αν και ετερογενείς έκφραση της SV40-LT, η οποία σε σύμπλοκο με την ενδογενή ρ53 άγριου τύπου συσσωρευτεί στους πυρήνες της πλειονότητας των κυττάρων (Εικόνα 2D), αντανακλώντας έτσι την έκφραση SV40-LT

in vivo

. Έκφραση της SV40-LT συσχετίζεται με ενδογενή

Wap

γονίδιο δραστηριότητας (Σχήμα 2Ε), υποδεικνύοντας ότι οι ρυθμιστικές αρχές υπεύθυνες για τη μεταγραφή του

Wap

γονίδιο είναι συστατικά ενεργός στα κύτταρα G-2. Στην υποστήριξη, λεντοϊού μεταγωγή της G-2 κύτταρα με έναν δημοσιογράφο GFP κατασκευάσει υπό τον έλεγχο ενός περίπου 1.4 kb

Wap

θραύσμα υποκινητή έδειξαν ότι ακόμη και μετά από 2 εβδομάδες σε καλλιέργεια ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού της FACS-εμπλουτισμένη eGFP

+ – κύτταρα παρέμειναν eGFP-θετικό (Σχήμα 2F). Αυτά τα κύτταρα ενίοτε σχηματίζονται πυκνές εστίες άκρως eGFP εκφράζοντα κύτταρα.

(Α-Γ) εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων G-2 σε ένα πρώιμο (Ρ9) και αργότερα (Ρ29) πέρασμα. (D) Ομοεστιακή εικόνα των κυττάρων G-2 χρώση με αντι-SV40-LT (πράσινη) και αντι-ρ53 (κόκκινο) αντισώματα. Εικόνες συγχωνεύθηκαν με αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC) μικρογραφία. (Ε) ομοεστιακή εικόνα των κυττάρων G-2 χρώση με αντι-Wap (πράσινο) αντίσωμα. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με χρώση DRAQ5 (μπλε). (F) Ζωντανή-κυττάρων φθορισμού εικόνα της G-2 κύτταρα μετά από μεταγωγή λεντοϊού με ένα δημοσιογράφο eGFP κατασκευάσει υπό τον έλεγχο του

Wap

προαγωγέα. FACS εμπλουτισμένο eGFP

+ – κύτταρα διατηρούνται σε καλλιέργεια για 2 εβδομάδες. (G και H) Κερατίνη 14 (κόκκινο) και της κερατίνης 18 (πράσινο) ανοσοχρώση καλλιεργημένα κύτταρα G-2. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με χρώση ϋΑΡΙ (μπλε). (Ι) βασιζόμενη σε FACS ποσοτικοποίηση της κερατίνης 18 έκφραση σε κύτταρα G-2 σε δίοδο 20. (J και Κ) βιμεντίνης (πράσινο) και SV40-LT (κόκκινο) /κερατίνη 18 (κόκκινο) συν-χρώση των καλλιεργημένων G-2 κύτταρα στο πέρασμα 10. βέλη σήμα κύτταρα G-2 χωρίς ανιχνεύσιμη έκφραση SV40-LT. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με χρώση ϋΑΡΙ (μπλε). (L) βασιζόμενη σε FACS ποσοτικοποίηση της έκφρασης βιμεντίνης σε κύτταρα G-2 σε δίοδο 20. Ράβδοι κλίμακας: Α: 150 μm? Β και C: 200μm? Δ και Ε: 20 μm? F, G, Η και J: 100 μm? Κ:. 50μm

Η

Από συστατική

Wap

γονίδιο δραστηριότητα έχει συνδεθεί με διαπράχθηκαν σε δύο τύπους κυττάρων κυψελιδικά προγόνους και CD61

+ αυλού-περιορισμένη προγόνους, τα οποία είναι τεκμηρίων στόχοι της δραστηριότητας ογκογονιδίου [24], πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση κυτταρική γραμμή με ανοσοφθορισμό χρώση (IF) για την επιθηλίου του αυλού κερατίνη δείκτη κυττάρων 18 (Krt18), οι /δείκτες μυοεπιθηλιακά κυττάρων της βασικής κερατίνη 5 (Krt5) και της κερατίνης 14 (Krt14). Στις αρχές περάσματα η πλειονότητα των κυττάρων G-2 εκφράζεται τόσο Krt14 (Σχήμα 2G) και πρωτεΐνες ενδιάμεσων νηματίων Krt18 (Σχήμα 2Η)? Ωστόσο, η συνήθης εταίρος συν-πολυμερισμό Krt14, πρωτεΐνης Krt5, δεν ήταν ανιχνεύσιμη από ένα ειδικό αντίσωμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε μεταγενέστερες χωρία ελαφρές παραλλαγές στα επιμέρους επίπεδα έκφρασης Krt14 και Krt18 (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και παρατηρήθηκε μια σημαντική διακύμανση του αριθμού των κυττάρων που εκφράζουν κυτοκερατίνη-που κυμαίνονται από 40 έως 70%. Σχήμα 2Θ δείχνει ως παράδειγμα τη βασιζόμενη σε FACS ποσοτικοποίηση της έκφρασης σε κύτταρα Krt18 G-2 σε δίοδο 20, υποδεικνύοντας μετάβαση σε μια κατάσταση μεσεγχυματικά διαφοροποίησης. Ως εκ τούτου, η έκφραση της πρωτεΐνης ενδιάμεσων νηματίων βιμεντίνης αναλύθηκε ως ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη μεσεγχυματικών κυττάρων και κυττάρων καρκινώματος που υφίστανται μετάβαση μεταξύ επιθηλιακών και μεσεγχυματικών μέλη διαφοροποίηση [25], [26]. Ανεξάρτητα από τον αριθμό πέρασμα σχεδόν όλα τα κύτταρα G-2 εκφράζουν βιμεντίνη, σύμφωνα με την οποία η ένταση της έκφρασης βιμεντίνης κυμαίνεται από μια διάχυτη κυτταροπλασματική κατανομή και εξασθενημένο νηματοειδών δομών σε μια άφθονη νηματοειδή δίκτυο (Σχήμα 2J-K δείχνουν βιμεντίνη /SV40-LT και βιμεντίνης /Krt18 συνεργασία -χρώση στο πέρασμα 10). Το σχήμα 2L δείχνει ως παράδειγμα τη βασιζόμενη σε FACS ποσοτικοποίηση της βιμεντίνης έκφραση σε κύτταρα G-2 σε δίοδο 20. έκφραση SV40-LT ανιχνεύθηκε σχεδόν πάντα επίσης σε κύτταρα που εκφράζουν έντονα βιμεντίνη (Σχήμα 2J). Ωστόσο, μερικά κύτταρα στερούνται SV40-LT ήταν πάντα παρούσα στο G-2 καλλιέργειες (Σχήμα 2J, επισημαίνονται με βέλη). Εν περιλήψει, με ανοσοχρώση ανάλυση παρατηρήσαμε πρώτον, ότι η πλειοψηφία των κυττάρων G-2 διακρίνονται από μία κατάσταση διαφοροποίησης που χαρακτηρίζεται από την συν-έκφραση της βιμεντίνης και κυτοκερατίνες, δεύτερον, ότι ο αριθμός των κυττάρων άνευ κυτοκερατίνες κυμαίνεται μεταξύ διόδων, και τρίτον ότι ένα ανήλικος πληθυσμός των κυττάρων που εκφράζουν κερατίνες, αλλά παντελή έλλειψη vimentin είναι πάντα παρούσα.

μια τέτοια ετερογένεια στα κράτη διαφοροποίηση μπορεί να αντανακλά μια πολυκλωνικού προέλευση της κυτταρικής καλλιέργειας G-2, όπως αυτός ο πολιτισμός προήλθε από σύνολο όγκων. Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, τα κύτταρα G-2 κλωνοποιήθηκαν σε μαλακό άγαρ, και δέκα αποικίες επεκτάθηκαν σε σταθερές κυτταρικές σειρές. Όπως ορατές με IF-χρώση, το πρότυπο G-2 κυττάρων της κυτοκερατίνης έκφρασης αναπαράγεται στο G-2 που προέρχεται κυτταρικούς κλώνους (Σχήμα S1 Α-Β? Παρουσιάζεται ως παράδειγμα για κλώνους G-2C9 και G-2C11), αν και σύμφωνα με την ανάλυση qPCR τα σχετικά επίπεδα του

Krt14

και

Krt18

έκφραση του γονιδίου ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των κλώνων (Εικόνα S1c-D). Επίσης στις δευτερεύουσες κλώνους, που προέρχονται από κλωνοποίηση άγαρ από G-2C9 και G-2C11 κλώνους, μια 2-3 φορές μεταβολή στην μεταγραφή του

Krt14

και

Krt18

γονίδια μπορούσε να αποδειχθεί ( Εικόνα S1E-F). Παρόμοια με την γονική καλλιέργεια, ετερογενής έκφραση της βιμεντίνης παρατηρήθηκε σε G-2 κυτταρικών κλώνων (Εικόνα S1G). Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η παρουσία των κυτταρικών πληθυσμών σε επιθηλιακά, μεσεγχυματικά και ενδιάμεσες καταστάσεις διαφοροποίηση είναι μια εγγενής ιδιότητα του G-2 πολιτισμούς.

β)

In vivo

.

Δοκιμάσαμε τον όγκο έναρξη δυναμικό των κυττάρων G-2 από ορθοτοπική μεταμόσχευση στο αριστερό κοιλιακό μαστικού αδένα άτοκα ποντίκια παραλήπτη WAP-T. 10

6 G-2 κύτταρα σχηματίζονται ταχέως ψηλαφητών όγκων (υψηλού βαθμού αδενοκαρκινώματα) σε όλους τους ποντικούς λήπτη (Πίνακας 1). Τα λιγότερα κύτταρα που μεταμοσχεύονται, όσο μεγαλύτερη ήταν η περίοδος υστέρησης και η υψηλότερη διακύμανση της (Πίνακας 1). Ακόμα και από 10 εγχυθεί κύτταρα G-2 σε 10 από τους 12 ποντικούς δέκτες έκφυση του όγκου ανιχνεύθηκε (Πίνακας 1), υποδεικνύοντας μία μεγάλη συχνότητα ογκογόνων κυττάρων στην καλλιέργεια G-2. Η ανοσοχρώση ανάλυση βιμεντίνη και Krt8 /18 έκφραση σε όγκους που προέρχονται G-2 κυττάρων (Σχήμα 3Α) αποκάλυψε στενή ομοιότητα τους σε ελάχιστα διαφοροποιημένα (G3 βαθμού) WAP-T όγκους (Σχήμα 3Β). Ενώ σε χαμηλού βαθμού WAP-Τ όγκων χρώση βιμεντίνης ήταν ως επί το πλείστον περιορίζονται σε διαφράγματα και στο διαμέρισμα όπου στρωματικά (Σχήμα 3C), μεταβλητή έκφραση της βιμεντίνης ήταν επίσης ανιχνεύσιμη στο επιθηλιακό διαμέρισμα (εκπρόσωπος Krt8 /18) σε υψηλής ποιότητας WAP-T όγκοι (Σχήμα 3Β), δεικνύοντας μια ενδιάμεση κατάσταση διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων σε G-2 που προέρχεται και υψηλής ποιότητας WAP-T όγκων και ένα επιθηλιακό κατάσταση διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων σε χαμηλού βαθμού WAP-T όγκους. Co-χρώση για βιμεντίνη και SV40-LT (έκφραση του SV40-LT περιορίζεται σε καρκινικά κύτταρα), επιτρέπει να γίνεται διάκριση μεταξύ μεσεγχυματικών κυττάρων στρωματικά προσληφθεί εντός των όγκων και καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν ένα μεσεγχυματικά ή ένα ενδιάμεσο φαινότυπο. Σε μεταμοσχευμένα G-2 όγκους (Σχήμα 4Α) και υψηλής ποιότητας WAP-T όγκους (Σχήμα 4Β) παρατηρήθηκε εκτός από την αναμενόμενη έκφραση της βιμεντίνης στο διαμέρισμα στρωματικά επίσης την συν-έκφραση της βιμεντίνης και SV40-LT σε επιμέρους όγκων κύτταρα. Αντίθετα, σε χαμηλής ποιότητας WAP-T όγκους (Σχήμα 4C) βιμεντίνη και SV40-LT έκφραση περιορίζεται σε στρωματικά και επιθηλιακά καρκινικά διαμερίσματα, αντίστοιχα. Οι όγκοι που προέρχονται από τα μεταμοσχευμένα κύτταρα G-2 (Σχήμα 5Α) ανακεφαλαιώνει τα διακριτικά χαρακτηριστικά της υψηλής ποιότητας όγκους WAP-T (Σχήμα 5Β), δηλαδή ένα μέτριο ποσοστό των κυττάρων που συν-εκφράζουν Krt14 και Krt8 /18. Αντίθετα, σε χαμηλής ποιότητας WAP-T όγκων Krt8 /Krt18 και Krt14 είναι συχνά συν-εκφράζονται (Σχήμα 5C).

(Α-Ο) Αντιπροσωπευτικές εικόνες συνεστιακού του όγκου-κρυοτομές ενός κυττάρου G-2 προερχόμενο όγκου (α), και ένα υψηλής ποιότητας (Β) και ένα χαμηλού βαθμού (C) ενδογενές όγκου WAP-T χρώση με αντι-βιμεντίνη (πράσινο) και αντι-κερατίνης 8/18 (κόκκινο) αντισώματα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DRAQ5 (μπλε). Τα ένθετα ισχύος που χρησιμοποιούνται για την εμφάνιση συν-έκφραση βιμεντίνη και κερατίνη 8/18 σε G-2 και υψηλής ποιότητας WAP-T όγκους. Οι λευκές διακεκομμένες γραμμές σηματοδοτούν στρωματικών δομών. Οι ομοεστιακό 3D-stacks είχαν αποσυσπειρωμένο χρησιμοποιώντας Huygens Essential λογισμικού και ανακατασκευάστηκε με το λογισμικό Imaris. bar Κλίμακα: κύρια εικόνα: 30 μm? μεγέθυνση: 3 μm

Η

(Α-Γ) Αντιπροσωπευτική ομοεστιακή εικόνες των όγκων κρυοτομές ενός G-2 που προέρχεται από κύτταρα όγκου (Α), μια υψηλού βαθμού (Β) και ένα χαμηλής. βαθμός (C) ενδογενές όγκου WAP-T χρώση με αντι-βιμεντίνη (πράσινο) και αντι-SV40-LT (κόκκινο) αντισώματα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DRAQ5 (μπλε). Τα ένθετα ισχύος που χρησιμοποιούνται για την εμφάνιση συν-έκφραση βιμεντίνη και SV40-LT σε G-2 και υψηλής ποιότητας WAP-T όγκους. Οι λευκές διακεκομμένες γραμμές σηματοδοτούν στρωματικών δομών. Οι ομοεστιακό 3D-stacks είχαν αποσυσπειρωμένο χρησιμοποιώντας Huygens Essential λογισμικού και ανακατασκευάστηκε με το λογισμικό Imaris. bar Κλίμακα: κύρια εικόνα: 50 μm? μεγέθυνση: 6 μm

Η

(Α-Γ) Αντιπροσωπευτική ομοεστιακή εικόνες των όγκων κρυοτομές ενός G-2 που προέρχεται από κύτταρα όγκου (Α), μια υψηλού βαθμού (Β) και ένα χαμηλής. βαθμός (C) όγκο ενδογενούς WAP-T χρώση με αντι-κερατίνης 8/18 (πράσινο) και αντι-κερατίνης 14 (κόκκινο) αντισώματα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DRAQ5 (μπλε). Τα ένθετα ενέργειας που χρησιμοποιείται για την εμφάνιση συν-έκφραση της κερατίνης 8/18 και της κερατίνης 14 στη G-2, υψηλής ποιότητας και χαμηλού βαθμού WAP-Τ όγκων. Οι ομοεστιακό 3D-stacks είχαν αποσυσπειρωμένο χρησιμοποιώντας Huygens Essential λογισμικού και ανακατασκευάστηκε με το λογισμικό Imaris. bar Κλίμακα: κύρια εικόνα: 50 μm? μεγέθυνση:. 6 μm

Η

Σε ένα επιπλέον πείραμα, 10

6 κύτταρα G-2 μεταμοσχεύθηκαν σε μαξιλάρια μανία των δύο μη διαγονιδιακά ποντίκια BALB /c. Και στις δύο ποντίκια μεγάλες, συμπαγείς όγκοι αναπτύχθηκαν μετά από 4-6 εβδομάδες. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα καρκινικά κύτταρα ήταν σε μεγάλο βαθμό άνευ επιθηλιακών δεικτών, EpCAM (Σχήμα S2A) και κυτοκερατίνες (Σχήμα S2B, D), αλλά εκφράζεται ισχυρά βιμεντίνη (Εικόνα S2B, C), υποδεικνύοντας ότι σε μη διαγονιδιακά μετάβαση ποντικούς σε κατάσταση μεσεγχυματικών είναι ευνοούνται, πιθανώς ως συνέπεια της αλληλεπίδρασης με το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα εξακολουθούν να εκφράζουν WAP-υποκινητή SV40 οδηγείται-LT (Σχήμα S2C), είναι πιθανό ότι η διαφοροποίηση μεσεγχυματικών σε αυτά τα κύτταρα ήταν ατελής.

γ) δημιουργία προφίλ γονιδιακής έκφρασης.

Η ιστομορφολογική ομοιότητα μεταξύ G-2 κυττάρων μεταμοσχεύονται και WAP-Τ όγκων υποδεικνύει ότι αυτοί οι όγκοι μπορεί επίσης να σχετίζονται στενά σε μοριακό επίπεδο. Με βάση την αντίστοιχη έκφραση των πρωτεϊνών CIF, περιμέναμε επίσης μια στενή σχέση μεταξύ των κυττάρων G-2 στον πολιτισμό και στο G-2 όγκους. Για να ελέγξετε αυτές τις υποθέσεις, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών προφίλ έκφρασης. Ολικό RNA από G-2, G-2C9 και G-2C11 κύτταρα, από δύο G-2 μεταμοσχευμένων όγκων, καθώς και από τέσσερις όγκους WAP-T-NP8 αντιπροσωπεύουν τέσσερα ιστολογικές τάξεων (G1-G4) αναλύθηκε σε μια μικροσυστοιχία Affymetrix πλατφόρμα (MOE430 2.0). Εφαρμόζοντας τα κριτήρια σημαντικότητας το διορθ. P-value (Benjamini-Hochberg) & lt? = 0.05, και μια πολλαπλή μεταβολή-αποκοπής 3, εντοπίσαμε 250 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ κυτταρική καλλιέργεια και δείγματα όγκου (Πίνακας S1). Σφίξιμο των στατιστικών κριτηρίων σε διορθ. P-value & lt? = 0.01, μόνο 24 γονίδια που ικανοποίησε αυτά τα αυστηρά κριτήρια. Οι 250 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων αναλύθηκαν περαιτέρω από το πρόγραμμα EXPANDER προκειμένου να εντοπιστούν υπερεκπροσωπούνται GO (γονίδιο οντολογία) κατηγορίες και TF (παράγοντας μεταγραφής) θέσεις πρόσδεσης στο

cis-ρυθμιστικών

περιοχές τους [27]. Η ανάλυση GO-εμπλουτισμός συνδυάστηκε με ιεραρχική συσταδοποίηση, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον χάρτη θερμότητα που φαίνεται στο Σχήμα 6Α. Ένας σημαντικός αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων εμπίπτει στην κατηγορία του ανοσοποιητικού γονιδίων άμυνας, αντανακλώντας το γεγονός ότι οι όγκοι περιέχουν ένα ορισμένο ενδεχόμενο των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, το οποίο λείπει στην καλλιέργεια των κυττάρων. Ο εμπλουτισμός των γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό διεργασίες συσχετίζεται καλά με την υπερ-αντιπροσώπευση των χώρων για Elf1 δέσμευσης, ένας παράγοντας μεταγραφής εντόνως εκφρασμένο σε λεμφοειδή κύτταρα [28], στις περιοχές υποκινητή των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (Ρ-τιμή & lt? 0.001) . Από την άλλη πλευρά, τα δείγματα κυτταρικής καλλιέργειας διακρίνεται από μια υψηλότερη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με μεταγραφική ρύθμιση, π.χ.

Foxa2

,

FOXM1

,

Gata6

,

Hoxb2

,

Jmjd2c

,

Ppargc1a

, και

Tle1

και αναπτυξιακών διαδικασιών, π.χ.

ΒΜΡ4

η οποία εμπλέκεται στη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων. Αυτή η παρατήρηση μπορεί να εξηγηθεί από την προσαρμογή του μεταγραφικού δικτύου και των μονοπατιών σηματοδότησης σε κυτταρικές συνθήκες καλλιέργειας. Στο σύνολό τους, η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι G-2 κυττάρων και όγκων εμφανίζουν περισσότερες ομοιότητες παρά διαφορές στο πρόγραμμα γονιδιακή έκφραση τους? οι διαφορές που σχετίζονται κυρίως με διαφορετικά βιολογικά πλαίσιό τους.

(Α) 250 γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε καλλιεργημένα κύτταρα G-2 και της ενδογενούς WAP-T ή 2 G-όγκους που προέρχονται κυττάρων (Πίνακας S1) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ένας χάρτης θερμότητας. εμπλουτίζονται κατηγορίες GO εμφανίζεται ως μπάρα διαγράμματα που αντιστοιχούν σε υψηλότερες ή χαμηλότερες εκφράζονται συστάδων γονιδίων στην αντίστοιχη ομάδα δείγματος. Χρωματική κωδικοποίηση και το ύψος ενός ράβδος αντιπροσωπεύει τη στατιστική σημασία (-log

10 (p-value)) της παρατηρούμενης εμπλουτισμό των αντίστοιχων κατηγοριών GO. (Β) Genes χαρακτηριστική για αυλού-ER

+, του αυλού-ER

-, και βασικά /μυοεπιθηλιακά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή χαρτών θερμότητα. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης λαμβάνονται για καλλιέργεια κυττάρων (G-2, G-2C9 και G-2C11 κύτταρα) και τα δείγματα όγκου (δύο μεταμοσχευμένων όγκων G-2 και τέσσερις όγκους WAP-T-NP8 αντιπροσωπεύουν τέσσερα ιστολογική τάξεων) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση αυτή. εντάσεις έκφραση γονιδίου ενός μαστικού αδένα ενός parous ποντικού BALB /c (50 ημέρες μετά τον απογαλακτισμό) χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά. Ευδιάκριτη συστάδες γονιδίων (

Krt14

,

Vim

,

Krt5

,

Krt18

, και

ESR1

) τονίζονται από κίτρινα κουτιά . Οι τιμές έκφρασης είναι χρωματικά κωδικοποιημένες: κόκκινο – υψηλή έκφραση, μπλε – χαμηλή έκφραση

Η

Εμείς υπολογίζεται ότι η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης θα πρέπει να βοηθήσει να εντοπίσετε τα κύτταρα G-2 εντός του μαστικού ιεραρχία των επιθηλιακών κυττάρων.. Χρησιμοποιώντας μια λίστα γονιδίων χαρακτηριστικό αυλού-ER

+, του αυλού-ER

-, και βασικά /μυοεπιθηλιακά κύτταρα [29] (Πίνακας S1), και το προφίλ γονιδιακής έκφρασης του μαστικού αδένα ενός parous BALB /γ ποντίκι (50 ημέρες μετά τον απογαλακτισμό) ως σημείο αναφοράς, ιεραρχική ανάλυση συστάδων αποκάλυψε και πάλι ομοιότητα μεταξύ κυτταρικής καλλιέργειας και δείγματα όγκου (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, ένα σύνθετο πρόγραμμα μεταγραφικό περιλαμβάνει πολλά γονίδια από τις τρεις καταγωγές έγινε φανερό. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

ESR1

(που κωδικοποιεί για άλφα υποδοχέων οιστρογόνων) είναι μέσα σε ένα σύμπλεγμα κάτω-ρυθμίζονται «αυλού-ER

+» γονίδια,

Vim

(κωδικοποίηση για vimentin) στο σύμπλεγμα των μη ρυθμιζόμενων γονιδίων,

Krt14

βρίσκεται στο σύμπλεγμα των up-ρυθμιζόμενων γονιδίων «βασική», ενώ

Krt5

μαζί με μια σειρά άλλων γονιδίων που σχηματίζει ένα σύμπλεγμα κάτω-ρυθμίζονται » γονίδια βασικά «, σύμφωνα με την απουσία έκφρασης Krt5 σε G-2 κυτταρικές καλλιέργειες και της σπάνιας εμφάνισης Krt5-postive κύτταρα σε WAP-Τ όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Με βάση αυτή την ανάλυση, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το μεταγραφικό κυτταρική G-2 πιθανόν σχετίζεται με κύτταρα δεσμευτεί για αυλού-ER

– διαφοροποίηση. Αυτά τα κύτταρα θα μπορούσαν να είναι πρόγονοι των αυλού-ER

– κυττάρων, τα οποία κατά τη διάρκεια της δέσμευσης χάσει την έκφραση επιφανών δεικτών, όπως

ESR1

και

Krt5

– γονίδια που συνδέονται λειτουργικά με αυλού-ER

+ και βασικών κυτταρικών σειρών, και έγινε απαθανατίστηκε από πρωτεΐνες SV40. Ωστόσο, η τελική αποσαφήνιση της ταυτότητάς τους απαιτεί περαιτέρω μελέτες.

βλαστική ικανότητα των κυττάρων G-2 και κλωνική παράγωγά τους

Το υψηλό ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων G-2 μας ώθησε να μελετήσουμε τις ιδιότητές τους CSC στην περισσότερες λεπτομέρειες. Πραγματοποιήσαμε μια σειρά προτύπων δοκιμασιών για να μετρηθεί η έκφραση ενός συνόλου δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, αυτο-ανανέωση, και την παραγωγή των φαινοτυπικά διαφορετικά απογόνων (συλλογικά ονομάζονται δραστηριότητα εμπλουτισμού πληθυσμών), δραστικότητα δεϋδρογενασών αλδεΰδης, και το δυναμικό σχηματισμού αποικιών.

α) δείκτες κυτταρικής επιφάνειας.

έκφραση ορισμένων κυτταρικής επιφάνειας που σχετίζονται πρωτεΐνες, όπως ιντεγκρίνες και ΟΡΙ-αγκιστρωμένες πρωτεΐνες, είναι διαγνωστική για την κανονική μαστικών βλαστικών κυττάρων και βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού. Με FACS παρατηρήσαμε ότι σχεδόν όλα τα κύτταρα G-2 εκφράζουν το CD29 βλαστική ικανότητα που σχετίζονται με δείκτες (ιντεγκρίνης βήτα 1) [30] (Εικόνα 7Α) και CD44 (υποδοχέας υαλουρονικό) [31] (Εικόνα 7Β). Ένα μεγάλο κλάσμα των κυττάρων G-2 είναι θετικό για EpCAM (επιθηλιακό μόριο κυτταρικής προσκόλλησης) [31], [32] (Σχήμα 7C, αριστερά), η οποία είναι συν-εκφράζεται με CD24a και CD49f (ιντεγκρίνης άλφα 6) πρωτεΐνες [30] [33] – [35] (Σχήμα 7C, δεξιά). Ένα άλλο μαστικού προγονικά-σχετικό δείκτη του, CD61 (ιντεγκρίνη βήτα 3) [36], ανιχνεύθηκε σε ένα μεγάλο κλάσμα του G-2 κύτταρα (Σχήμα 7D, αριστερά) και είναι επίσης συν-εκφράζεται με CD24a και CD49f (Σχήμα 7D, δεξιά) . Ως εκ τούτου, εμείς συλλογικά ονομάζονται το κλάσμα των κυττάρων G-2 συν-εκφράζουν αυτές τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με κυτταρική μεμβράνη όπως η υψηλή υποσύνολο CD24a

. Παραλλαγές που κυμαίνεται από -30% έως -90% του απόλυτου αριθμού των κυττάρων σε αυτήν την υποομάδα παρατηρήθηκαν μεταξύ των γονικών κυττάρων G-2 και οι κλώνοι (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, παρατήρησε ότι ο ομόλογός του CD24a

υψηλή υποσύνολο (Σχήμα 7Ε, αριστερά) χαρακτηρίζεται από την έκφραση του Sca1 δείκτη βλαστικών κυττάρων [37] (Σχήμα 7Ε, δεξιά). Στο σύνολό τους, η κουλτούρα G-2 περιλαμβάνει δύο μεγάλα διακριτά υποσύνολα, CD24a

υψηλή /Sca1

χαμηλή και CD24a

χαμηλή /Sca1

υψηλή. SV40 διαγονίδιο εξίσου μεταγράφεται σε δύο υποσύνολα, αλλά η μεταγραφή του Krt14 και Krt18 γονιδίων είναι υψηλότερη σε CD24a

υψηλή /Sca1

χαμηλή κύτταρα (Σχήμα S3A, Β). Παρατηρήσαμε επίσης με ανάλυση qPCR που

Cd24a

,

CD49f

και

Sca1

γονίδια μεταγράφονται σε δύο υποσύνολα (Σχήμα S3C).

(Α, Β) Αντιπροσωπευτικά FACS dot οικόπεδα που δείχνει την έκφραση του CD29 (Α) και CD44 (Β) σε G-2 καλλιεργημένα κύτταρα. (C) Αντιπροσωπευτική FACS dot οικόπεδα που δείχνει την έκφραση του EpCAM (C, αριστερά) σε καλλιεργημένα κύτταρα G-2 και την κατανομή των CD24a και CD49f (C, δεξιά) εντός του EpCAM

πληθυσμό υψηλού κυττάρων.