Αφηρημένο

Η ιντερλευκίνη-11 (IL-11) είναι μία πλειοτροπική κυτοκίνη που έχει εγκριθεί από την FDA κατά που προκαλείται από χημειοθεραπεία θρομβοκυτταροπενίας. Από μια συνδυαστική επιλογή σε έναν ασθενή με καρκίνο, απομονώσαμε ένα χαρτογράφηση πεπτιδίου IL-11 που μοιάζει με τον τομέα Ι της IL-11 (αλληλουχία CGRRAGGSC). Αν και αυτό το μοτίβο έχει πρόσδεμα ιδιότητες, δεν είναι εντός των προηγουμένως χαρακτηριζόμενη αλληλεπιδρώντας sites. Εδώ έχουμε σχεδιάσει και επικύρωση-tandem δοκιμασίες πρόσδεσης, τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση και φασματοσκοπία NMR για να δείξει (i) τα πεπτιδικά μιμητικά ένας υποδοχέας-θέση δέσμευσης εντός IL-11, (ii) η σύνδεση του CGRRAGGSC στην IL-11Rα είναι λειτουργικά σχετική, (iii) Arg

4 και Ser

8 είναι τα βασικά κατάλοιπα μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης, και (iv) το IL-11-σαν μοτίβο επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης STAT3. Αυτά τα δομικά και λειτουργικά αποτελέσματα αποκαλύψει μια ακόμη μη αναγνωρισμένο θέση σύνδεσης υποδοχέα στην ανθρώπινη IL-11. Δεδομένου ότι η IL-11Rα έχει προταθεί ως στόχος στον καρκίνο του ανθρώπου, τα αποτελέσματά μας παρέχουν ενδείξεις για τον ορθολογικό σχεδιασμό στοχευμένων φαρμάκων

Παράθεση:. Cardo-Vila Μ, Zurita AJ, Giordano RJ, Sun J, Rangel R, Guzman-Rojas L, et al. (2008) ένας συνδετήρας Peptide Motif Επιλεγμένα από έναν ασθενή με καρκίνο είναι ένας υποδοχέας που αλληλεπιδρά Ιστοσελίδας εντός ανθρώπινης ιντερλευκίνης-11. PLoS ONE 3 (10): e3452. doi: 10.1371 /journal.pone.0003452

Επιμέλεια: Maxim Antopolsky, Πανεπιστήμιο του Ελσίνκι, Φινλανδία

Ελήφθη: 23, Ιουλίου, 2008? Αποδεκτές: 24 Σεπτεμβρίου, 2008? Δημοσιεύθηκε: 20 Οκτωβρίου, 2008

Copyright: © 2008 Cardo-Vila et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Πρόγραμμα εξειδικεύεται στην έρευνα αριστείας (SPORE) του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο (σε WA και RP), από το Υπουργείο άμυνας των ΗΠΑ (στο MGK, WA, και RP), και με βραβεία από το Ίδρυμα Καρκίνος του προστάτη , το Ίδρυμα Marcus και το Ίδρυμα Gillson-Longenbaugh (σε WA και RP). MCV έλαβε μεταδιδακτορικός υπότροφος του Μαστού Susan G. Komen Ιδρύματος Καρκίνου. AJZ έλαβε μεταδιδακτορική υποτροφία από το Instituto de Salud Carlos III (Ισπανία)? RR είναι ένα Μελετητή από το Πρόγραμμα Οδύσσεια του Πανεπιστημίου του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. CDA έλαβε predoctoral υποτροφία από το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας (Βραζιλία). FCLA και APV έλαβαν στήριξη από το Ίδρυμα Στήριξης Ρίο ντε Τζανέιρο Ερευνών και το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας (Βραζιλία). Οι οργανισμοί χρηματοδότησης είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

απεικόνιση φάγου επιτρέπει ταυτοποίηση των ιστο-ειδικών ή σχετίζονται με αγγειογένεση μοριακό υπογραφών σε αιμοφόρα αγγεία και έτσι επιτρέπει την παράδοση συνδέτη-κατευθυνόμενη [1] – [10]. Προηγουμένως δείξαμε, μέσω της άμεσης διαλογή μίας συνδυαστικής βιβλιοθήκης πεπτιδίων σε έναν ασθενή με καρκίνο, ότι οι εκλεκτικοί πεπτίδια παλιννόστησης εντοπισμένη μη-τυχαία σε συγκεκριμένα όργανα [1]? μπορούμε επίσης εντόπισαν κυκλικό πεπτίδιο (αλληλουχία CGRRAGGSC) στόχευσης αγγειακού συστήματος του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη ως ιντερλευκίνη-11 (IL-11) μιμούνται [1], [2]. Σε μια διαφορετική γραμμή της έρευνας, Kang et al. [11] προτείνει ένα κεντρικό ρόλο για την οδό IL-11 στη γενετική εξέλιξη των κακοήθων όγκων με μεταστάσεις στα οστά. Η ενεργοποίηση των μελών της μεταγωγής σήματος και ενεργοποίησης μεταγραφής (STAT) οικογένεια, ιδιαίτερα STAT3, αποκαλύφθηκε κατάντη ως συνέπεια της πρόσδεσης της IL-11 στον αντίστοιχο υποδοχέα [12].

Αν και IL- 11 αρχικά χαρακτηρίστηκε ως κυτοκίνη με θρομβοποιητική δραστηριότητα, βρέθηκε αργότερα να έχουν πλειοτροπικές επιδράσεις σε πολλαπλούς ιστούς [13]. Η ανασυνδυασμένη IL-11 είναι ένα FDA-εγκεκριμένο φάρμακο (oprelvekin? Neumega®) που χρησιμοποιείται κατά τη χημειοθεραπεία που προκαλείται από θρομβοπενία (https://www.fda.gov/cder/biologics/products/opregen112597.htm) [14]. Μαζί με περισσότερα από 10 άλλες κυτοκίνες δέσμης τεσσάρων ελίκων, συμπεριλαμβανομένης της ιντερλευκίνης-6 (IL-6), ανασταλτικό παράγοντα λευχαιμίας (LIF), ακτινωτό νευροτροφικό παράγοντα (CNTF), ογκοστατίνη-M (OSM), και καρδιοτροφίνη-1 (CT- 1), IL-11 ανήκει στην gp130 ή IL-6-τύπου [15], [16]. Αυτές οι κυτταροκίνες προκαλούν αντιδράσεις από τη συνέλευση των συγκροτημάτων ολιγομερών σηματοδότησης που περιέχουν την gp130 διαμεμβρανικό υποδοχέα. Η δομή της IL-11 ήταν το αντικείμενο μελετών μοριακής μοντελοποίησης και μεταλλαξογένεσης [17] – [21]. Η έρευνα αποκάλυψε ότι η IL-11 περιέχει τρεις γνωστές θέσεις σύνδεσης υποδοχέα (I, II και III). Ιστοσελίδα Ι της IL-11 συνδέεται με την περιοχή ομολογίας κυτοκίνης-υποδοχέα (CHR) σε τομείς 2 και 3 (D2-D3) της IL-11Rα, ενώ περιοχές ΙΙ και ΙΙΙ αλληλεπιδρούν με δύο ξεχωριστές περιοχές του ομοδιμερούς gp130: η CHR ( D2-D3, θέση II) και η ομοιάζουσα της Ig επικράτεια (D1, θέση III) [22] – [24]. Ωστόσο, καμία άμεση δομική ανάλυση είναι διαθέσιμη είτε για IL-11 ή το συγκρότημα σηματοδότησης. Στην πραγματικότητα, ενώ η δομή με ακτίνες Χ του συμπλόκου υποδοχέα της IL-6 ως μία εξαμερής IL-6 /IL-6Rα /gp130 τριαδικό σύμπλοκο έχει εισαχθεί ως ένα μοντέλο για την IL-11 [25] – [27], την ακρίβεια της αυτή η προέκταση έχει πράγματι προσβληθεί, επειδή η IL-11 και IL-6 μερίδιο καμία σημαντική ομοιότητα στην πρωτογενή δομή και να αλληλεπιδρούν με διαφορετικούς υποδοχείς πιθανώς μέσω διαφόρων μηχανισμών [28]. Μια μετάβαση που επάγεται με συνδέτη από ένα ενεργό σύμπλοκο τετραμερή (συμπεριλαμβανομένου ενός διμερούς της gp130) προς ένα ανενεργό εξαμερικού συγκρότημα έχει προταθεί για την IL-11 [28], [29]. Ανταπόκριση σε IL-11 περιορίζεται στα κύτταρα που εκφράζουν IL-11Rα εκτός από gp130. Σε αναλογία με την α υποδοχέα της IL-6 (IL-6Rα) και IL-6, έχει υποτεθεί ότι η IL-11Rα «παρουσιάζει» IL-11 για gp130, το οποίο έχει προσληφθεί ως ομοδιμερές και οδηγεί στην παραγωγή ενός ούτως -που ονομάζεται υψηλής συγγένειας σύμπλοκο υποδοχέα IL-11. Αυτό το δραστικό σύμπλεγμα αποτελεί την έναρξη στην ενεργοποίηση της Janus κινάση (JAK) /Tyk κινάσες τυροσίνης, η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει υπολείμματα τυροσίνης στην κυτταροπλασματική περιοχή του gp130? αυτά εξυπηρετούν στη συνέχεια ως περιοχές υποδοχής για τα μέλη της οικογένειας STAT μεταγραφικών παραγόντων, π.χ., STAT3 [12], [13], [17].

Αν και η in vivo-επιλεγμένα παλιννόστησης μοτίβο CGRRAGGSC είχε ορισμένες ειδικοί της συγκεκριμένα χαρακτηριστικά [1], [2], η αντίστοιχη θέση εντός της φυσικής κυτοκίνης δεν είναι σε μια καθιερωμένη αλληλεπιδρώντας θέση μεταξύ IL-11 και IL-11Rα [17] – [28]. Υποθέσαμε και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε ότι αυτό το πεπτίδιο μοτίβο λειτουργεί ως μια νέα θέση δέσμευσης εντός IL-11. Tandem τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση, δοκιμασίες δέσμευσης, πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), και μεταγωγή σήματος ανάλυση υποστηρίζουν σθεναρά το συμπέρασμα ότι αυτή η πεπτιδική αλληλουχία είναι πράγματι ένα προηγουμένως μη αναγνωρισμένα θέση υποδοχέα που αλληλεπιδρά εντός ανθρώπινη IL-11.

αποτελέσματα

Επιλεγμένα ακολουθία-σύνδεση με το σύμπλοκο υποδοχέα IL-11 είναι ειδική και δεν περιλαμβάνει gp130

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι φάγος εμφανίζει το CGRRAGGSC μοτίβο αλληλεπιδρά ειδικά με IL-11Rα? Αυτή η αλληλεπίδραση ανεστάλη με ανασυνδυασμένη IL-11 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, αλλά όχι από την IL-1β [1], [2]. Επειδή το λειτουργικό σύμπλοκο υποδοχέα της IL-11 φαίνεται να είναι ένα πολυ-ετεροδιμερές που αποτελείται από IL-11, IL-11Rα και gp130 [15], αξιολογήσαμε πρώτα αν το επιλεγμένο IL-11-σαν μοτίβο [1], [2] θα δεσμεύονται με IL-11Rα, για gp130, ή και στα δύο. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε επικαλυμμένες πλάκες με την ακόλουθη πρωτεΐνη: IL-11Rα, gp130, ή τον υποδοχέα λεπτίνης (ένα άσχετο gp130 εταίρος). αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος για την δοκιμασία δέσμευσης (Σχήμα 1Α). CGRRAGGSC-φάγος δεν δεσμεύτηκε πάνω από τα επίπεδα υποβάθρου σε ακινητοποιημένη gp130, σε σύγκριση με σημαντική σύνδεση του με τα ανθρώπινα IL-11Rα (Σχήμα 1Α), δεδομένα που δείχνουν καμία δέσμευση σε μόνο gp130 φάγου. Επιπλέον, η σύνδεση με τον υποδοχέα λεπτίνης ή με BSA CGRRAGGSC-φάγου ήταν χωρίς να ξεχωρίζουν από εκείνη των μη στοχευμένων φάγου ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το πεπτίδιο CGRRAGGSC προσδένεται μόνο σε IL-11Rα στο σύμπλοκο υποδοχέα όταν οι μεμονωμένες υπομονάδες που αναλύθηκαν. Εμείς επόμενη έδειξαν ότι η πρόσδεση στην IL-11Rα CGRRAGGSC-φάγου διαμεσολαβείται από την IL-11-σαν μοτίβο, επειδή τα συνθετικά CGRRAGGSC ανέστειλε την πρόσδεση του συγγενούς φάγου σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 1Β).

( IL-11Rα και gp130: Α) σύνδεση προς τα μεμονωμένα συστατικά του υποδοχέα του συμπλόκου υποδοχέα της IL-11 CGRRAGGSC-φάγου. υποδοχέα της λεπτίνης και BSA χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι για δέσμευση. (Β) εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή πρόσδεσης του CGRRAGGSC-φάγων σε IL-11Rα από το συγγενές συνθετικό πεπτίδιο. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM).

Η

φασματοσκοπία NMR του στοχευόμενου αλληλεπίδραση πεπτιδίου-υποδοχέα

NMR είναι μια ιδιαίτερα κατάλληλη μεθοδολογία για τη μελέτη μέσου-προς-χαμηλή δεσμευτική συγγένεια [30], [31], η οποία είναι συχνά η περίπτωση για την αλληλεπίδραση μεταξύ πεπτιδικών συνδετών που προσδιορίζονται με εμφάνιση φάγου (όπως πεπτίδιο CGRRAGGSC και IL-11Rα). Με τη μέτρηση ανεπαίσθητες αλλαγές στις παραμέτρους NMR του υποκαταστάτη (όπως χημικές μετατοπίσεις και οι χρόνοι χαλάρωσης) μπορεί κανείς να ανιχνεύσει δεσμευτικές γεγονότα που συμβαίνουν στο μΜ έως mM περιοχή συγκέντρωσης λόγω της ταχείας ανταλλαγής μεταξύ της διαμόρφωσης σύνδεσης και ελεύθερη μορφή του συνδετήρα. Μόλις το σύνταγμα γρήγορη ανταλλαγή επιτυγχάνεται μία περίσσεια συνδέτη (mM) έναντι του υποδοχέα (μΜ) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τις μετρήσεις. Fast κατάσταση ανταλλαγής είναι συχνά παρούσα σε μελέτες σύνδεσης που περιλαμβάνουν πεπτίδια που επιλέγονται από βιβλιοθήκες έκθεσης φάγων λόγω της εγγενούς μέσου τους στην γκάμα χαμηλής συγγένειας [30] – [32]. Έτσι, για να χαρακτηριστεί η δομική βάση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του πεπτιδίου CGRRAGGSC και IL-11Rα, εφαρμόσαμε NMR-φασματοσκοπία [30], [32]. Ξεκινήσαμε με την ανάλυση της δομικής συμπεριφοράς του ελεύθερου συνθετικού πεπτιδίου CGRRAGGSC με NMR πρωτονίων. Η μονοδιάστατη (1D-

1Η-NMR) φάσμα εμφανίζεται σε γενικές γραμμές στους 25 ° C (Σχήμα S1A) υποδεικνύει την παρουσία διαμορφωτική ανταλλαγή μεταξύ πολλαπλών διαμορφομερή CGRRAGGSC. Αν και η γραμμή συντονισμού έγινε πιο ορίζεται στους 5 ° C, διαμορφωτική ανταλλαγή επέμεινε σε χαμηλές θερμοκρασίες (Σχήμα S1A)? Πράγματι, η εμφάνιση των πολλαπλών διαμορφομερών δεν είναι ασυνήθιστο σε αυτή τη ρύθμιση και δεν αποκλείεται η μελέτη του συνδέτη αλληλεπιδράσεις υποδοχέα [30]. Στην περίπτωση του πεπτιδίου CGRRAGGSC σχεδόν όλες οι συντονισμοί στα φάσματα σαφώς ανατεθεί στα επιμέρους υπόλοιπα του πεπτιδίου βασίζεται σε δύο διαστάσεων φάσματα πρωτονίου (2D-

1Η-NMR) TOCSY και NOESY (Πίνακας S1 και S2).

Αφού χαρακτήρισε την δομική συμπεριφορά του πεπτιδίου CGRRAGGSC σε διάλυμα και αποδίδεται συντονισμών του στα φάσματα NMR, έχουμε την επόμενη δημιουργήσει δοκιμασίες σύνδεσης [30] για να κατανοηθεί καλύτερα η βάση για σύνδεση με το πεπτίδιο συνδέτη υποδοχέα. Το φάσμα του ελεύθερου CGRRAGGSC συγκρίθηκε με εκείνες του CGRRAGGSC παρουσία IL-11Rα (υπό μια μοριακή περίσσεια του πεπτιδίου του ~16-, 33- και 66-πλάσια), και μεταβολές στη χημική μετατόπιση (Δδ) αναλύθηκαν (Εικόνα 2Α). Αν και η ακριβής χαρτογράφηση των υπολειμμάτων στην CGRRAGGSC δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί από την 1D-

φάσματα 1H-NMR λόγω αιχμή επικάλυψη υποδοχέα, η αλληλεπίδραση μεταξύ CGRRAGGSC και IL-11Rα οδήγησε σε αλλαγές χημική μετατόπιση και νέα συστήματα σπιν (Σχήματα 2Α -ΝΤΟ). Τέτοιες αλλαγές είναι ενδεικτικά της πρόσδεσης και υποδηλώνουν ότι πολλαπλά υπολείμματα συμβάλλουν στην αλληλεπίδραση. Επιπλέον, η ισορροπία δέσμευσης εξαρτιόταν από τη συγκέντρωση του πεπτιδίου και συνεπή με ένα γρήγορο ισοτιμία (μs εύρος) λόγω των συντονισμών του ελεύθερου και δεσμευμένου μορφές του πεπτιδίου ανιχνεύθηκαν ως μέσος όρος λωρίδες (Εικόνα 2Α).

( Α) Επίδραση της συγκέντρωσης του πεπτιδίου CGRRAGGSC κατά την πλειοδοτική δημοπρασία για την IL-11Rα. Αμίδιο περιοχή του 1D-

φάσματα 1H-NMR αυξανόμενων μοριακών συγκεντρώσεων του πεπτιδίου CGRRAGGSC σύνδεση προς IL-11Rα (6 μΜ) δείχνεται (μπλε). πεπτίδιο CGRRAGGSC μόνη της (400 μΜ) και το φάσμα της IL-11Rα μόνος παρουσιάζονται επίσης (σε κόκκινο και μαύρο, αντίστοιχα). Η εμφάνιση της αργινίνης συντονισμών πλευρικής αλυσίδας (που δεν φαίνεται στο φάσμα του πεπτιδίου μόνο) υποδεικνύεται (*). αλλαγές (Β) Χημική μετατόπιση που προκαλείται επί των συντονισμών CGRRAGGSC με σύνδεση προς IL-11Rα. Η 2D-

1H-NMR φάσματα TOCSY CGRRAGGSC (400 μΜ) είτε μόνο του (μαύρο) ή με την παρουσία 6 μΜ IL-11Rα (κόκκινη) δείχνονται. Μονοκέφαλου και δικέφαλο βέλη δείχνουν τις αλλαγές χημική μετατόπιση και την εμφάνιση νέων spin-συστήματα, αντίστοιχα. (C) Σύνθεση της περιοχής αμιδίου 1D-

1H-NMR και τα αντίστοιχα 2D-

1H-NMR φάσματα TOCSY του πεπτιδίου CGRRAGGSC στους 5 ° C (αριστερά), στους 25 ° C (μέση) και στους 25 ° C υπό την παρουσία IL-11Rα (δεξιά). Οι κύκλοι με διακεκομμένες γραμμές και το βέλος υποδεικνύει αργινίνη αντηχήσεις.

Η

Για τον υπολογισμό των επιμέρους αλλαγές χημική μετατόπιση (Δδ) που προκαλείται από την IL-11Rα σε κάθε έναν από τα άτομα υδρογόνου της CGRRAGGSC, συγκρίναμε το άτομο 2D –

1H-NMR TOCSY φάσματα που λαμβάνονται εν απουσία και παρουσία της IL-11Rα (μοριακή περίσσεια του πεπτιδίου ~66-πλάσια) (Σχήμα 2Β και Πίνακας 1). Αυτά τα φάσματα χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την ανάλυση των νέων συστημάτων σπιν (Σχήματα 2Β και 2C). Στην 2D-

1H-NMR TOCSY το σήμα του υποδοχέα NMR διηθείται κατά την διάρκεια της κλειδαριάς περιστροφής 80 ms, με αποτέλεσμα μια καθαρότερη ανάλυση όχλησης χημική μετατόπιση. Παρατηρήσαμε ότι οι περισσότεροι επιμέρους συντονισμών σε CGRRAGGSC εμφάνισαν σημαντική Δδ στην δέσμευση με IL-11Rα (Σχήμα 2Β και Πίνακας 1), με αποτέλεσμα δείχνει ότι σχεδόν όλα τα υπολείμματα μέσα CGRRAGGSC συμμετάσχουν στην σύνδεση με τον υποδοχέα με άμεσο ή έμμεσο τρόπο. Το πιο σημαντικό Δδ (& gt? 10 Hz) που συμμετέχουν τα άτομα α-υδρογόνου της Gly

7 και των καταλοίπων Cys (η οποία δεν θα μπορούσε να αποδοθεί με σαφήνεια και εδώ αναφέρεται ως Cys

1/9). Ωστόσο, Δδ & gt? 5 Hz για τα κατάλοιπα Cys

1, Gly

2, Gly

6, Ser

8, και Cys

9 ήταν επίσης αξιοσημείωτη. Τα νέα συστήματα σπιν παρατηρήθηκε στην 1D-

1H-NMR φάσματα (Εικόνα 2Α) εμφανίστηκε επίσης στο φάσμα TOCSY, και αποδόθηκαν σε Cys

1/9, Arg

3/4, και Ala

5 (Σχήμα 2Β, δικέφαλος βέλη). Αυτά τα νέα συστήματα περιστροφή χάρτη στην περιοχή του πεπτιδίου που υφίσταται μια πολύπλοκη διαμορφωτική ισορροπία σε ελεύθερη κατάσταση. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι, μετά τη σύνδεση με την IL-11Rα, το τμήμα Cys-SS-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala σε CGRRAGGSC γίνεται διαμορφωτικώς περιορίζεται, με αποτέλεσμα την αύξηση του-δομή και τα αντίστοιχα απώλειας ελευθερίας για CGRRAGGSC στη δεσμευμένη κατάσταση. Σταθερά, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τη σύγκριση της 1D-

1H-NMR και το 2D-

1H-NMR φάσματα TOCSY CGRRAGGSC στους 5 ° C και 25 ° C (Σχήμα 2C). Arg

3, Arg

4 και Ala

5 συντονισμούς μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο στα φάσματα στους 5 ° C (Σχήμα 2C, αριστερό πάνελ), αλλά όχι στα φάσματα στους 25 ° C (Σχήμα 2C, μεσαίο πίνακα), και πάλι ενδεικτικό ότι διαμορφωτική μεταβλητότητα παίζει κάποιο ρόλο κατά την ανίχνευση αυτών των συστημάτων γύρισμα το οποίο έχει πρόσφατα αναφερθεί [31], [33] – [35]. Ωστόσο, κατά τη σύνδεση σε IL-11Rα, συντονισμοί που αντιστοιχούν σε Arg

3, Arg

4 και Ala

5 παρατηρήθηκαν επίσης στα φάσματα στους 25 ° C (Σχήμα 2C, δεξιό πλαίσιο).

στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η NMR διαμορφωτική μεταβλητότητα παίζει δομικό ρόλο στη CGRRAGGSC πεπτίδιο αλληλεπίδραση με IL-11Rα και δείχνουν ότι: (i) πιο κατάλοιπα σε CGRRAGGSC αλλάξουν τη διαμόρφωσή τους κατά την πρόσδεση στην IL-11Rα, ( ii) η περιοχή Cys-SS-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala του πεπτιδίου υποβάλλεται ένας υποδοχέας-εξαρτώμενη αύξηση του κύκλου δομή, (iii) το μοτίβο Gly-Gly-Ser-Cys-SS-Cys περιλαμβάνει έναν υποψήφιο το site για άμεση αλληλεπίδραση του πεπτιδίου με IL-11Rα, και (iv) ότι τα κατάλοιπα Gly

7 και Ser

8, σε συμφωνία με τις μελέτες μετάλλαξης (περιγράφονται παρακάτω), είναι επίσης σημαντικές για τη σύνδεση.

λειτουργική ανάλυση του άγριου τύπου και τοποκατευθυνόμενη IL-11 μεταλλάγματα

σε προηγούμενη εργασία, άλλοι ερευνητές έχουν παραχθεί ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που περιέχουν μεταλλάξεις σημείου να αποκαλύψει λειτουργικές ιδιότητες της φυσικής IL-11? κυρίως, μεταλλάξεις σημείου εντός του τόπου που περιέχει την αλληλουχία CGRRAGGSC δεν έχουν αναφερθεί [17] – [21]. Έτσι, για να αποδειχθεί περαιτέρω ότι τα υπολείμματα 112-117 αντιπροσωπεύουν μια τοποθεσία πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με, πρώτα προσπάθησε να δημιουργήσει μια σειρά ανασυνδυασμένων μεταλλαγμάτων αλανίνης σάρωση τοποκατευθυνόμενη των RRAGGS μοτίβου εντός ανθρώπινη IL-11.

ότι της αλληλουχίας του DNA (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και η ανάλυση SDS-PAGE (Σχήμα 3Α) έδειξε ότι η αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων IL-11 ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρήχθησαν με το αναμενόμενο μοριακό βάρος, μια σειρά από IL-11 μεταλλάκτες παρουσιάζονται στερεοχημική παρεμπόδιση και εσφαλμένη αναδίπλωση aberrances . Τέτοια εγγενής τεχνικός περιορισμός οποιασδήποτε μεταλλάξεως μελέτης είναι εμφανές από την έλλειψη επιτόπου προσβασιμότητας παρατηρήθηκε σε μελέτες με αντισώματα αντι-IL11 (Σχήμα 3Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρά αυτά τα πιθανά ζητήματα, χρησιμοποιήσαμε την επόμενη ELISA για την εκτίμηση των χαρακτηριστικών της IL-11 σημείο μεταλλάγματα (υπολείμματα 112-117) για την ικανότητά τους να συνδέονται με IL-11Rα. Μετάλλαξη των καταλοίπων Arg

113 (R113A), Gly

115 (G115A) και Ser

117 (S117A) σημαντικά μειωμένη σύνδεση της IL-11 στον υποδοχέα, σε σχέση με την αλληλουχία άγριου τύπου ( αναστολή 86, 71, και 86% δεσμευτικές, αντίστοιχα), ενώ η μετάλλαξη των υπολειμμάτων Arg

112 (R112A) και Gly

116 (G116A) παράγεται μόνο μια μέτρια επίδραση (αναστολή πρόσδεσης 43 και 29%, αντίστοιχα) ( Εικόνα 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα περισσότερα από τα υπολείμματα εντός του μοτίβου RRAGGS συμμετέχουν στην πρόσδεση στην IL-11Rα? Ωστόσο, Gly

115 και Ser

117 είναι πιθανό τα βασικά κατάλοιπα που μεσολαβούν την αλληλεπίδραση συνδέτη-υποδοχέα. Έτσι, σύμφωνα με υπόθεση εργασίας μας, τα μεταλλάγματα αλανίνης σάρωση δεν δείχνουν μειωμένη, αν και συγκεκριμένες, σύνδεση προς τον αντίστοιχο υποδοχέα, IL-11Rα (Σχήμα 3C).

(Α) καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτείνες αναλύθηκαν με Coomassie χρώση. (Β) Κηλίδα Western αναλύσεις με πολυκλωνικό αντι-IL-11 και αντισώματα αντι-GST. (Γ) Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης GST (μεταλλάξεις σάρωση αλανίνης των υπολειμμάτων 112-117 της IL-11, άγριου-τύπου IL-11, GST μόνο ή rhIL-11) επικαλύφθηκαν όλη τη νύκτα εις τριπλούν και επωάστηκαν με IL-11Rα. Η δέσμευση ανιχνεύθηκε με αντι-Ρο αντίσωμα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM).

Η

Ο ρόλος του υπολείμματος Arg

113 είναι κάπως προβληματική για την αξιολόγηση από ELISA, επειδή η μετάλλαξη αυτή επηρέασε την αντιδραστικότητα του αντι-ΙL -11 αντισώματα. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η παρατηρούμενη μείωση στην πρόσδεση της IL-11 μεταλλάγματα με την IL-11Rα ήταν δευτερεύουσα σε κακή αναδίπλωση της πρωτεΐνης πλήρους μήκους ή /και στερεοχημική παρεμπόδιση, επινοήσαμε μια εναλλακτική δοκιμασία συνδετήρα-υποδοχέα με βάση ιστότοπο- κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση του πεπτιδίου με στόχευση του φάγου. Single-υπολειμμάτων μεταλλαξιγένεση σάρωσης αλανίνης του φάγου CGRRAGGSC παρήχθησαν και σύνδεση του κάθε φάγου σε ακινητοποιημένο IL-11Rα ελέγχθηκε σε μία λειτουργική ανίχνευση (Πίνακας 2). Μετάλλαξη Arg

4, Gly

7 και Ser

8 υπολείμματα σε CGRRAGGSC φάγων καταργηθεί σύνδεση με τον υποδοχέα (Πίνακας 2), ενώ η μετάλλαξη των υπολειμμάτων Arg

3 και Gly

6 λένε το αντίθετο αναστέλλει δέσμευση αλλά μείωσε την αλληλεπίδραση CGRRAGGSC-υποδοχέα με πάνω από 70%. Τα δεδομένα αυτά είναι σε συμφωνία με την NMR και IL-11 μελέτες τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης και δείχνουν ότι τα περισσότερα κατάλοιπα εντός της μοτίβο RRAGGS συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση με την IL-11Rα. Επιπλέον, τα δεδομένα εντοπίζουν έναν κεντρικό ρόλο για την Ser

8 υπόλειμμα σε CGRRAGGSC (που αντιστοιχεί στο Ser

117 της IL-11) σε σύνδεση με τον υποδοχέα και δείχνουν ότι αμφότερα τα υπολείμματα γλυκίνης είναι σημαντικά για την αλληλεπίδραση με IL- 11Rα. Εν κατακλείδι, τα υπολείμματα 112-117 στην ανθρώπινη IL-11 περιλαμβάνουν ένα δομικό και λειτουργικό χώρο για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με τον υποδοχέα του.

Η

Το συνθετικό πεπτίδιο CGRRAGGSC επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Έχοντας δείξει ότι το μοτίβο RRAGGS αντιπροσωπεύει μία σχετική θέση εντός ανθρώπινη IL-11, προχωρήσαμε για να προσδιοριστεί αν η αντίστοιχη συνθετικό πεπτίδιο είναι βιολογικά ενεργό. IL-11 επάγει εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση του πολλαπλασιασμού όταν επωάζεται με ανθρώπινα κύτταρα TF-1 λευχαιμίας ([36]? Και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, εκτιμάται εάν το αντίστοιχες συνθετικές CGRRAGGSC πεπτίδιο μιμείται IL-11 σε διέγερση του αυτών των κυττάρων κατά τη δέσμευση στον IL-11Rα. Πρέπει πρώτα εκτεθειμένες TF-1 κυττάρων στο πεπτίδιο CGRRAGGSC παρουσία ή απουσία είτε IL-11 ή GM-CSF (θετικός έλεγχος) υπό προκαθορισμένη συνθήκες στις οποίες η IL-11 επάγει τη βέλτιστη πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Διαλυτό πεπτίδιο CGRRAGGSC προκάλεσε μία ισχυρή ανάπτυξη-διεγερτικό αποτέλεσμα επί TF-1 κύτταρα, μόνα τους και σε παρουσία IL-11 (Σχήμα 4Α, αριστερός πίνακας) ή GM-CSF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), ενώ καμία επίδραση δεν παρατηρήθηκε για τον έλεγχο ( ) κύτταρα-IL-11Rα εκφράζουν μη (Εικόνα 4Α, δεξιά πάνελ) [2]. Αυτό το πεπτίδιο που προκαλείται πολλαπλασιαστική επίδραση ήταν εντονότερη για CGRRAGGSC συν IL-11 ή CGRRAGGSC μόνος ό, τι για CGRRAGGSC συν GM-CSF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)? ένα άσχετο πεπτίδιο κυκλικός έλεγχος δεν έδειξε ανιχνεύσιμες επιδράσεις από μόνη της ή σε συνδυασμό με IL-11. Στη συνέχεια, για να αξιολογηθεί κατά πόσο CGRRAGGSC-επαγόμενο πολλαπλασιασμό εξαρτάται από την κυτταρική επιφάνεια IL-11Rα, χρησιμοποιήσαμε το αντίστοιχο διαλυτό υποδοχέα, sIL-11Rα, ως μοριακός δόλωμα για τη δέσμευση του πεπτιδίου. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός που επάγεται από CGRRAGGSC ήταν χαμηλότερη στην παρουσία του slL-11Rα (t-test, Ρ & lt? 0.005), αλλά όχι με την παρουσία ενός ελέγχου διαλυτού υποδοχέα (Σχήμα 4Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι λιγότερο αναστολή παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με CGRRAGGSC, sIL-11Rα και IL-11, τα δεδομένα δείχνουν ότι CGRRAGGSC μπορεί να αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο IL-11-sIL-11Rα (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το συνθετικό πεπτίδιο CGRRAGGSC μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από μόνη της, πιθανώς ενεργεί ως IL-11Rα-διεγερτικών συνδετήρα.

(Α) εξαρτάται από τη συγκέντρωση πολλαπλασιαστική απόκριση προς CGRRAGGSC εμφανίζεται στην IL-11Rα εκφράζουν ανθρώπινο TF-1 κύτταρα λευχαιμίας απουσία ή παρουσία IL-11 (αριστερό πάνελ). Καμία απόκριση παρατηρείται σε μη-IL-11Rα-κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο (δεξί πάνελ). (Β) Οι διαλυτές IL-11Rα μεσολάβηση αναστολή της πολλαπλασιαστικής επίδρασης που προκαλείται από 150 μΜ CGRRAGGSC πεπτιδίου (και από την IL-11). * T-test, P & lt? 0.005. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM).

Η

φωσφορυλίωση STAT3 μεσολαβεί πολλαπλασιασμός CGRRAGGSC επαγόμενη κύτταρο

IL-11 πρόσδεση σε IL-11Rα και γλυκοπρωτεΐνη 130 (gp130) μεσολαβεί μεταγωγής σήματος μέσω της ενεργοποίησης STAT3? Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη αξιολογηθεί αν το πεπτίδιο CGRRAGGSC μπορούσε να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με ενεργοποίηση του ίδιου μονοπατιού. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε συνδέτη-μεσολαβητική ενεργοποίηση STAT3 σε TF-1 κύτταρα στερούνται ορού επωάζονται παρουσία της IL-11, πεπτίδιο CGRRAGGSC, ή ένα άσχετο πεπτίδιο κυκλικού ελέγχου. Παρά ασιτία ορού, ενεργοποίηση STAT3 βασικής γραμμής αδύναμος (Ρ-ΤγΓ

705) ανιχνεύθηκε σε μη διεγερμένα κύτταρα TF-1 (Σχήμα 5). Είκοσι λεπτά επώαση με είτε CGRRAGGSC ή IL-11 (θετικός έλεγχος) οδήγησε σε φωσφορυλίωση STAT3 (σχήμα 5Α), το οποίο αυξήθηκε σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για την IL-11 σε συνδυασμό με CGRRAGGSC ή ένα άσχετο κυκλικό πεπτίδιο (αλλά όχι μόνο για το πεπτίδιο ελέγχου) (Σχήμα 5Α). Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ένα δυναμικό μοριακός μηχανισμός υποκείμενα CGRRAGGSC-επαγόμενο πολλαπλασιασμό μέσω ενεργοποίησης του συμπλέγματος υποδοχέα IL-11 μέσω της STAT3 και υποδεικνύουν ότι αυτή η περιοχή εντός της IL-11 είναι λειτουργικά ενεργό για την σύνδεση και την μεταγωγή σήματος.

(Α) Ο πολλαπλασιασμός των ανθρώπινων TF-1 κύτταρα λευχαιμίας που επάγονται από CGRRAGGSC σχετίζεται με φωσφορυλίωση STAT3, όπως εκτιμήθηκε με ένα αντι-STAT3-Ρ-ΤγΓ

705 αντίσωμα. (Β) CGRRAGGSC πεπτίδιο επαγόμενη ενεργοποίηση STAT3 είναι εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση. Καμία επίδραση παρατηρείται με ένα πεπτίδιο μάρτυρα. Για να αποφευχθεί η διακύμανση μεταξύ των πειραμάτων, το λύμα διαιρείται σε δύο: το ήμισυ του προϊόντος λύσης ανοσοκηλιδώθηκαν με ένα αντι-STAT3-Ρ-ΤγΓ

705 αντίσωμα ενώ το άλλο ήμισυ χρησίμευσε για να καθοριστεί το συνολικό ποσό της STAT3 (όπως ένα υποκατάστατο για την πρωτεΐνη φόρτωσης) με ένα ειδικό αντι-STAT3 αντισώματα. Σημειώστε ότι οι εμπορικές εκχυλίσματα κυττάρων HeLa που υπηρετούν ως μάρτυρες εμφανίζουν μόνο τη ζώνη α-STAT3.

Η

Συζήτηση

Μέσα από την άμεση επιλογή των βιβλιοθηκών πεπτιδίων σε ασθενείς [1], [37], [38], απομονώσαμε ένα πεπτίδιο συνδέτη που μιμείται IL-11 από το αγγειακό σύστημα του προστάτη [1] και πρότεινε την IL-11Rα ως στόχο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [2]. Εδώ εκλεγεί για να διερευνήσει τις δομικές και λειτουργικές ιδιότητες αυτού του υποτιθέμενου αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, επειδή προς το παρόν γνωστών θέσεων δέσμευσης εντός ανθρώπινης IL-11 [22] – [24] δεν περιλαμβάνουν την επιλεγμένη πεπτιδική αλληλουχία εντός της φυσικής πρωτεΐνης (Σχήμα 6) .

Αιχμές βελών δείχνουν την ανθρώπινη IL-11 υπολείμματα που προβλέπεται (μέσω τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης) να είναι θέσεις σύνδεσης συνδέτη-υποδοχέα? στερεά χρώματα προσδιορίζουν τα υπολείμματα που είναι κρίσιμα για τη σύνδεση [17] – [21]. Τα υπολείμματα 112-117 που αντιστοιχεί στην IL-11-σαν μοτίβο [1], [2] που περιγράφεται στην παρούσα εργασία επισημαίνονται με κίτρινο χρώμα. Το βασικό σχήμα της ανθρώπινης IL-11, όπως φαίνεται εδώ, έχει τροποποιηθεί από την αναφορά [47].

Η

Χρησιμοποιήσαμε συμπληρωματικές στρατηγικές, όπως η κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση και μελέτες NMR που βασίζεται για να αποδείξει ότι όλοι έξι υπολείμματα του μοτίβου RRAGGS είναι πιθανό απαιτούνται για πρόσδεση στην IL-11Rα. Επειδή ανάλυση NMR δεν αναμφίβολα αποκαλύπτουν ποιο από τα υπολείμματα αργινίνης (Arg

3 ή Arg

4) συμμετέχει στην πρόσδεση του υποδοχέα, μελέτες που βασίζονται σε σάρωση αλανίνης στοχευμένες φάγων και IL-11 τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση υποδείχθηκαν. Και στις δύο περιπτώσεις, Arg

4 κατέληξε να είναι το κλειδί υπόλειμμα. Και οι τρεις μέθοδοι που προτείνονται επίσης ότι Gly και Ser υπολείμματα συμβάλλουν στο επίπεδο της IL-11Rα δέσμευσης από τους συνδετήρες. Πράγματι, η Ser

8 μετάλλαξη κατήργησε τη δέσμευση της CGRRAGGSC στην IL-11Rα? η Δδ παρατηρήθηκε σε Ser

8 προκαλείται από την πρόσδεση στην IL-11Rα επιβεβαιώνεται αυτό το αποτέλεσμα.

Έχουμε προσπαθήσει να δημιουργήσει και να ερμηνεύσει μοριακά μοντέλα της IL-11 βασίζεται σε υψηλής ανάλυσης δομικές μελέτες για άλλες gp130 -τύπος κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των IL-6 [21], [39] και CNTF [21], [40] και για μεταλλαξογένεση IL-6, CNTF και LIF [41] – [43]. Στην περίπτωση της θέσης πρόσδεσης για IL-11Rα ή θέση Ι, κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση ειδικών υπολειμμάτων στο Ο-άκρο της έλικας D και του βρόχου ΑΒ αποδειχθεί ότι οι περιοχές αυτές συμμετέχουν σε σύνδεση υποδοχέα και κυτοκίνης με μεσολάβηση βιοδραστικότητα [17] – [ ,,,0],21], ανάλογο με IL-6 [39]. Και οι δύο θέσεις είναι τοποθετημένες κοντά η μία στην άλλη σε αυτά τα μοντέλα και καταλαμβάνουν την Ο-άκρο της δομής δέσμης τεσσάρων ελίκων, το οποίο βρίσκεται απέναντι από το BC κύκλωμα. Παρόμοιες δομικές και μεταλλαξογένεση που βασίζεται σε μελέτες κυτοκίνες gp130-τύπου (vIL-6, CNTF και LIF) εμπλέκονται κατάλοιπα εντός του βρόχου π.Χ. στην αναγνώριση υποδοχέα και βιοδραστικότητας [44] – [46]. Ωστόσο, τα κατάλοιπα αυτά ήταν μέρος του θέση II ή της θέσεως III (για την αλληλεπίδραση με gp130 ή gp130 /υποδοχέα LIF), και όχι θέση I. Συγκεκριμένα, η κρυσταλλική δομή του υποδοχέα IL-6 εξαμερές σύμπλοκο καταδειχθεί κανένα ρόλο στην IL-6 υποδοχέας δεσμευτική για τον βρόχο BC, η οποία είναι στραμμένη προς τη Ν-τερματική περιοχή του D2 στο δεύτερο μόριο gp130 [47]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η CGRRAGGSC είναι ένα πεπτίδιο μιμητικό του IL-11, και ως τέτοιο είναι ικανό να αναγνωρίζει και να προσδένεται με την IL-11Rα για την ενεργοποίηση των κυττάρων σηματοδότηση και τον πολλαπλασιασμό. Αν και είναι γενικά παραδεκτό ότι το μοντέλο για το σύμπλοκο υποδοχέα κυττάρου δεσμευμένο σε μεμβράνη IL-11 θα ήταν παρόμοια με εκείνη για την IL-6 [26], [47], ορισμένα δομικά χαρακτηριστικά και στις πολύπλοκες υπομονάδες μπορεί στην πραγματικότητα να διαφέρουν σημαντικά. Για παράδειγμα, έχουμε παρατηρήσει την ύπαρξη τεσσάρων λαθραίας λευκίνης φερμουάρ εντός IL-11 (τρία από αυτά εκτείνεται από το BC κύκλωμα, μέσω της έλικας C, Σχήμα 6). Δεν έχουν καμία σαφής παραλληλισμός ανάμεσα περισσότερες άλλες κυτοκίνες gp130-τύπου (μόνο OSM και CT-1 φαίνεται να περιέχει μία από αυτές τις περιοχές). Επιπλέον, υπάρχουν δύο ισομορφές δεσμευμένο σε μεμβράνη IL-11Rα που διαφέρουν από την παρουσία ή απουσία μιας κυτταροπλασματικής περιοχής, ενώ η IL-6Rα έχει μόνο μία μορφή με μεγαλύτερη κυτταροπλασματική ουρά [48]. Τέτοιες ισομορφές θα μπορούσαν να συμμετέχουν στο σχηματισμό ενός συμπλόκου υποδοχέα σε αντίθεση με εκείνες που παρατηρούνται σε σχηματισμό συμπλόκου IL-6Rα. Μελλοντικές κρυσταλλογραφία λεπτομερής ακτίνων Χ του συμπλόκου υποδοχέα της IL-11 θα αποσαφηνίσει περαιτέρω αυτές πρόστιμο δομικά χαρακτηριστικά.

Λειτουργικά, η IL-11 μιμητικό πεπτίδιο CGRRAGGSC έδειξε βιολογικές επιδράσεις που προκαλούνται από την IL-11Rα (συγκέντρωση-εξαρτώμενη διέγερση του τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων), τόσο με την παρουσία και απουσία της IL-11. Επιπλέον, CGRRAGGSC μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με την παρουσία του slL-11Rα μειώθηκε, και σε μεγαλύτερο βαθμό με την παρουσία της φυσικής IL-11, αλλά δεν επηρεάστηκε από μη συνδεδεμένο υποδοχέα ελέγχου. Με βάση αυτά τα ευρήματα, θα μπορούσε κανείς να υποθέσει σχετικά με την αλληλεπίδραση μεταξύ του πεπτιδίου CGRRAGGSC και το σύμπλοκο IL-11 /IL-11Rα. Πράγματι, το διαλυτό πεπτίδιο CGRRAGGSC βρέθηκε να επάγει φωσφορυλίωση STAT3 με τον ίδιο τρόπο όπως η IL-11 φυσικής κυτοκίνης. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν βιολογική προηγούμενο σε άλλα συστήματα. Wrighton et al. [49] που απομονώνονται πεπτίδια που δεσμεύονται και ενεργοποιούν τον υποδοχέα ερυθροποιητίνης (EPOR)? κρυσταλλογραφική ανάλυση του συμπλόκου υποδοχέα απεκάλυψε ένα πεπτίδιο που δημιουργείται ένα λειτουργικό συμμετρική διάταξη του EPOR [50]. Cwirla et al. [51] που επιλέγονται αγωνιστές πεπτιδίου για τον υποδοχέα θρομβοποιητίνης και πρότεινε ένα μηχανισμό ενεργοποίησης. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι ο χρόνος προσανατολισμό και παραμονής του συνδέτη-υποδοχέων θα πρέπει να θεωρούνται για ενεργοποίηση [52], [53]. Επιπλέον, τα πεπτίδια που επιλέγονται για πρόσδεση σε ορισμένους υποδοχείς προσδένονται σε διάφορες θέσεις επί του υποδοχέα και ενεργοποίηση μπορεί να συμβεί μέσω διαμορφωτικές αλλαγές παρά πολυμερισμό [54].

Από υπερμοριακής άποψη, ο σχηματισμός συμπλόκου IL-11 υποδοχέας είναι κατά πάσα πιθανότητα περίπλοκα: την κυτοκίνη συνδέτη (IL-11) μπορεί να χρειαστεί να δεσμεύεται πρώτα σε μια υπομονάδα υποδοχέα παριστάμενο (IL-11Rα) και ακολούθως προσλάβει ένα διμερές υπομονάδων σηματοδότησης (δηλαδή, gp130). Μελέτες του σχετικού υποδοχέα IL-6 συγκρότημα στήριξη του ισχυρισμού ότι προσχηματισμένα ανενεργά διμερή των υπομονάδων του υποδοχέα υπάρχουν στις κυτταρικές μεμβράνες [28], [55], [56]. Προηγούμενες εκθέσεις προσδιορίστηκε ότι gp130-διμερισμός δεν είναι επαρκής για την ενεργοποίηση του υποδοχέα και ότι η ενεργός διαμορφωτική προσαρμογή απαιτείται για μια βιολογική απόκριση [14], [57] – [59]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι η διαλυτή πεπτίδιο CGRRAGGSC σε σύμπλοκο με την IL-11Rα θα μπορούσε να ενισχύσει gp130-διμερισμό και /ή την πρόκληση μιας σηματοδότηση-ικανά διαμόρφωση.

Η ισχύς του συνδυασμού διαφόρων λειτουργικές δοκιμασίες (τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση του φυσικές πρωτεΐνες σε συνδυασμό με ELISA συν πεπτίδιο-αλανίνης σάρωσης σε συνδυασμό με προσδιορισμούς δέσμευσης στοχευμένες φάγου) με δομικές μελέτες (NMR-based φασματοσκοπία της αλληλεπίδρασης πεπτιδίου-υποδοχέα) μπορεί να ξεπεράσει ορισμένα από τα όρια του μελέτες μετάλλαξης στον προσδιορισμό των θέσεων πρόσδεσης του αλληλεπιδράσεων συνδετήρα-υποδοχέα (όπως δυσμενές γονίδιο /την πρωτεϊνική έκφραση, και μεταλλαγμένη πρωτεΐνη εσφαλμένη αναδίπλωση ή στερεοχημική παρεμπόδιση).

Περιληπτικά, έχουμε δείξει ότι (i) την αλληλουχία RRAGGS (που αντιστοιχεί σε μία θέση μέσα στην ανθρώπινη IL-