Αφηρημένο

Παρά τις προόδους στην ανίχνευση και τη θεραπεία, ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη εξακολουθεί να είναι ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα. Η ανώμαλη δραστικότητα των οδών βλαστικών κυττάρων, και η ρύθμισή τους από υποδοχέα ανδρογόνων (AR), έχει τη δυνατότητα να παρέχουν πληροφορίες σε νέους μηχανισμούς και τα μονοπάτια για την πρόληψη και τη θεραπεία του προχωρημένου, ευνουχίζεται ανθεκτικά καρκίνους του προστάτη. Για το σκοπό αυτό, διερευνήσαμε το ρόλο του ρυθμιστή εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων Sox2 [SRY (προσδιορισμού φύλο περιοχή Υ) -κουτί 2] σε φυσιολογικά και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη. Στο φυσιολογικό προστάτη, Sox2 εκφράζεται σε ένα τμήμα των βασικών επιθηλιακών κυττάρων. όγκων του προστάτη ήταν είτε Sox2-θετικά ή Sox2 αρνητικά, με το ποσοστό των Sox2-θετικών όγκων αυξάνεται με Gleason Σχολίων και μεταστάσεις. Στον καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή ευνουχισμό ανθεκτική CWR-R1, ενδογενή έκφραση του Sox2 είχε κατασταλεί από σηματοδότηση AR, και AR χρωματίνης-IP δείχνει ότι η AR συνδέει το στοιχείο ενισχυτή από τον υποψήφιο Sox2. Ομοίως, σε φυσιολογικά κύτταρα επιθηλιακά προστάτη και ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, αυξημένη σηματοδότηση AR μειώνει επίσης την έκφραση Sox2. Αντοχή σε αντι-ανδρογόνο MDV3100 αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη αύξηση στην έκφραση Sox2 εντός κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τρία, και τον ευνουχισμό ευαίσθητη LAPC-4 καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή έκτοπη έκφραση της Sox2 ήταν αρκετή για να προωθήσει το σχηματισμό όγκου ευνουχισμό ανθεκτικά. Απώλεια της έκφρασης Sox2 στην ευνουχισμό ανθεκτικό CWR-R1 καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων. Up-ρύθμιση του Sox2 δεν συσχετίστηκε με αυξημένη έκφραση CD133 αλλά συσχετίστηκε με αυξημένη FGF5 (Αυξητικός Παράγοντας Ινοβλαστών 5) έκφραση. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ένα μοντέλο της αυξημένης έκφρασης Sox2 λόγω της απώλειας του AR-μεσολάβηση καταστολή κατά την διάρκεια ευνουχισμό, και την επακόλουθη ευνουχισμός αντοχής μέσω μηχανισμών που δεν συνεπάγονται διέγερση κανονικών μονοπατιών εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Παράθεση:. Kregel S, Kiriluk KJ , Rosen AM, Cai Υ, Reyes EE, Otto KB, et al. (2013) Sox2 Υπάρχει ανδρογόνων υποδοχέων-Απωθημένα Γονίδιο που προωθεί Ευνουχισμός-Resistant καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (1): e53701. doi: 10.1371 /journal.pone.0053701

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Kregel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση το έργο αυτό είχε γενναιόδωρα παρέχεται από την: Πανεπιστήμιο του Σικάγου Χειρουργικής, το τμήμα Ουρολογίας? το Πανεπιστήμιο του Σικάγο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου (UCCCC)? Πιλοτικό Βραβείο από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) Ρ50 CA090386 SPORE στον καρκίνο του προστάτη στο Robert H. Lurie Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Northwestern και το Cancer Research Center του Πανεπιστημίου του Σικάγο? η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Θεσμικών Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004)? Καρκίνος Κέντρο Grant Υποστήριξης (P30 CA14599)? Το Ίδρυμα Brinson? ο Alvin Baum Ταμείο Οικογένεια? και το Πανεπιστήμιο του Διοικητικού Συμβουλίου του Σικάγου Cancer Research Foundation Γυναικών. Σ Kregel υποστηρίζεται από ένα HHMI: Med-σε-Grad Fellowship (56006772) και Βιολογία Καρκίνου Κατάρτισης Grant (Τ32-CA09594)? Ε Reyes υποστηρίζεται από ένα Ανοσολογία Εκπαίδευση Grant (AI07090-31). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Υποτροπή της κακοήθους καρκίνου του προστάτη μετά την ορμονοθεραπεία είναι ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα και οι νέες στρατηγικές για την πρόληψη και τη θεραπεία ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνους του προστάτη. Θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) υπήρξε ο στυλοβάτης της θεραπείας του καρκίνου του προστάτη μετά την ανακάλυψη από τον Charles Huggins και Clarence Hodges το 1941 ότι ο ευνουχισμός ασθενείς διευκολύνονται σημαντικά με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [1]. Ωστόσο, υπάρχει αναπόφευκτη εξέλιξη της νόσου λόγω της αύξησης του ευνουχισμού ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Υπάρχει μια σειρά μηχανισμών για την ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικών καρκίνου του προστάτη (CRPC), οι περισσότερες των οποίων επικεντρώνονται στην υποδοχέα ανδρογόνων (AR) [2]. Έτσι, αναστέλλοντας την ενδοκυτταρική σηματοδότηση AR εντός των καρκινικών κυττάρων του προστάτη έχει μια σημαντική εστίαση της έρευνας για τον καρκίνο του προστάτη, με αποτέλεσμα μια ποικιλία χημικών αναστολέων στόχευσης σηματοδότηση AR τα οποία χρησιμοποιούνται στην κλινική [3]. Δυστυχώς, ενώ όλοι από αυτούς τους αναστολείς παράγουν μια αρχική θεραπευτική ανταπόκριση, αυτό συνήθως ακολουθείται από υποτροπή και την εξέλιξη της νόσου.

Οι πρόσφατες ανακαλύψεις σωματικών κυττάρων χρησιμοποιώντας επαναπρογραμματισμού ορίζεται γονίδια για να δημιουργήσουν πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) καταδεικνύει βαθύτατα ότι η έκφραση των γονιδίων από μερικά βλαστικών κυττάρων είναι ικανές να προκαλέσουν μεγάλης κλίμακας αλλαγές στην έκφραση γονιδίων και τη συμπεριφορά των κυττάρων, πολλά από τα οποία είναι ιδιότητες των κακοηθών κυττάρων [4]. Πράγματι, οι εν λόγω παράγοντες των βλαστικών κυττάρων επαναπρογραμματισμό εγκατεστημένος ογκογονιδίων (c-Myc και Klf4) ή εμφανίζονται ως ογκογονίδια (Sox2, Oct4 και Nanog) σε μία ποικιλία καρκίνων [5], [6], [7]. Οι παράγοντες μεταγραφής Sox2, Oct4 και Nanog αποτελούν τον πυρήνα μηχανήματα μεταγραφικός παράγοντας των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και είναι απαραίτητη προς τη διατήρηση pluripotency και την πρόληψη της διαφοροποίησης [8]. Σε μελέτες που χρησιμοποιούν κυτταρικές γραμμές, αυτά τα γονίδια όχι μόνο προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση, αλλά επίσης να βλάψουν τις κανονικές διαδικασίες διαφοροποίησης? δύο από τα οποία είναι το σήμα κατατεθέν της ογκογένεσης και της εξέλιξης της νόσου [5], [7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η έκφραση τέτοιων γονιδίων πιστεύεται ότι σηματοδοτούν σπάνιες στέλεχος του καρκίνου /κύτταρα έναρξης [12], [16]. Έτσι, η λειτουργία αυτών των παραγόντων μεταγραφής σε ενήλικες καρκινικά κύτταρα πιστεύεται ότι αναστέλλει τη διαφοροποίηση και την προώθηση μηχανισμών βλαστοκυττάρων pluripotency και επιβίωση παρόμοια με τη βασική λειτουργία τους σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα.

Sox2 [SRY (προσδιορισμού φύλο περιοχή Υ) -κουτί 2] είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της επιβίωσης και πλειοδυναμία αδιαφοροποίητων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, και έχει ένα αναδυόμενο ρόλο ως επιγενετική παράγοντας επαναπρογραμματισμό και ογκογονιδίου [5], [17], [18], [19] , [20]. Σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα Sox2 ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων 1259, πολλά από τα οποία συν-ρυθμίζονται με Oct4 ή /και Nanog [21]. Στον προστάτη, η έκφραση Sox2 έχει παρατηρηθεί σε κύτταρα εντός της βασικής-επιθηλιακό κυτταρικό στρώμα της κανονικής αδενικής επιθηλίων [22], και όγκους του προστάτη [22], [23]. Η έκφραση του Sox2 σε όγκους του προστάτη έχει σκεφτεί να προωθήσει μια πιο επιθετική φαινότυπο του όγκου, με την προώθηση μιας «βλαστικών κυττάρων όπως το» φαινότυπο όγκου. Πράγματι, η έκφραση συστοιχίας γονιδίων αναλύσεις έδειξαν ότι ένα κύτταρο-σαν υπογραφή iPS είναι παρούσα μέσα σε ένα τμήμα των καλοήθων και επιθετικών όγκων του προστάτη, και η υπογραφή αυτή προσδίδει χειρότερη πρόγνωση της νόσου [24]. Η ομάδα μας έχει προηγουμένως ταυτοποιηθεί Sox2 ως εντόνως εκφρασμένο σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη σε σύγκριση με τα επιθηλιακά κύτταρα από τα σπερματικά κυστίδια: ένα όργανο με παρόμοια λειτουργία και αναπτυξιακές προέλευσης το οποίο, αντίθετα από τον προστάτη, είναι σπάνια θέση της ογκογένεσης [25]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα προσδίδουν στην υπόθεση ότι Sox2 λειτουργίες σε ενήλικες φυσιολογικών και κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων για τη ρύθμιση της έκφρασης του πολλά από τα ίδια γονίδια στόχοι ρυθμίζεται από Sox2 μέσα στα ανθρώπινα κύτταρα ES, προωθώντας έτσι ένα λιγότερο διαφοροποιημένο φαινότυπο εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων του όγκου? Επιπλέον, η έκφραση Sox2 θα μπορούσε να περιοριστεί σε σπάνιες στέλεχος του καρκίνου /την έναρξη κύτταρα που προσδίδουν μια χειρότερη πρόγνωση της νόσου. Εναλλακτικά, Sox2 θα μπορούσε να έχει μια πολύ διαφορετική λειτουργία στα επιθηλιακά κύτταρα των ενηλίκων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν επίσης ότι Sox2 μπορεί να προάγει τον ευνουχισμό αντοχής μειώνοντας την εξάρτηση του καρκίνου του προστάτη κυττάρων επί AR σηματοδότηση για την ανάπτυξη και την επιβίωσή τους.

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι Sox2 εκφράζεται στην πλειοψηφία των φυσιολογικό προστάτη βασικών επιθηλιακών κυττάρων , και εκφράζεται ομοιόμορφα σε ένα υποσύνολο των όγκων του προστάτη. Επιπλέον, Sox2 εκφράζεται στη συντριπτική πλειοψηφία του ευνουχισμού ανθεκτικών μεταστατικών βλαβών του προστάτη. Σε φυσιολογικά κύτταρα επιθηλιακά προστάτη, ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, και ο ευνουχισμός ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα προστάτη, η ενεργοποίηση του AR προσδέματος προάγει μία μείωση στην έκφραση Sox2, η οποία είναι αποτέλεσμα της άμεσης σύνδεσης του AR στην περιοχή cis-ενισχυτή Sox2. Η έκφραση του Sox2 αυξάνεται επίσης μέσα κυττάρων καρκίνου του προστάτη που είναι ανθεκτικά στο αντι-ανδρογόνο MDV3100. Σε ευνουχισμός ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα προστάτη, η έκφραση Sox2 είναι επαρκής για την προαγωγή του σχηματισμού όγκου ευνουχισμό ανθεκτικά. Η έκφραση του Sox2 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, ωστόσο, δεν έχει ως αποτέλεσμα αλλαγές στην έκφραση διαφοροποίησης-ειδικό PSA, αύξηση των CD133-θετικά υποθετικό στέλεχος του καρκίνου /εναρκτήρια κυττάρων ή την έκφραση των γνωστών ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (hESC) -associated γονιδίων στόχων Sox2. Έτσι, Sox2 φαίνεται να προωθεί την αντίσταση του ευνουχισμού μέσω μηχανισμών που δεν συνεπάγονται την εκ νέου έκφραση των βλαστικών κυττάρων γονιδίων ή αυξήσεις σε σπάνιες στέλεχος του όγκου εμβρυϊκών Sox2-στόχος /έναρξη κυτταρικών πληθυσμών.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και Υλικά |

R1881 και ακτινομυκίνη D αγοράσθηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ), και MDV3100 αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals (Houston, ΤΧ), και αποθηκεύονται στους -20 σε αιθανόλη . Όλες οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], [27]. Όλες οι καλλιέργειες ρουτίνας σε διαλογή για την απουσία μόλυνσης από μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας την ATCC καθολική Mycoplasma Detection Kit (Manassas, VA). PC-3, κυτταρικές σειρές VCAP, και NCCIT αγοράστηκαν από την ATCC, και την Du145, LNCaP, LAPC-4, C4-2, CWR22Rv1, CWR-R1, MDA-PCa2B, και κυτταρικές γραμμές E006AA είχαν γενναιόδωρα από τον Dr. John Isaacs στο Πανεπιστήμιο Johns Hopkins και έχουν προηγουμένως χαρακτηριστεί [28]. Η ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων γραμμή WA01 (Η1) αποκτήθηκε από WiCell (Madison, WI) και καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο τροφοδότη ανεξάρτητη χρήση mTeSR1 μέσων (Stem τεχνολογίες κυψελών? Βανκούβερ, π.Χ.). ES κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν μέσα σε δέκα περάσματα της απόψυξης. Εκκρίνεται συνολικό PSA και η τεστοστερόνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Roche Elecsys Σύνολο προστάτη ειδικό αντιγόνο (PSA) και τεστοστερόνη (Τ) Δοκιμασίες. Η ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του Vybrant ΜΤΤ κιτ προσδιορισμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Invitrogen /Molecular Probes? Eugene, OR).

λεντοϊών Sox2, φορείς AR, και Ελέγχου (pReceiver-Lv105) αγοράστηκαν από GeneCopoeia (Rockville, MD ). Λεντοϊού μετενεργοποιητής τετρακυκλίνη (LV-rtTA) και επαγώγιμου φορέα λεντοϊού Sox2 από το εργαστήριο Hochedlinger αγοράσθηκαν μέσω Addgene [29]. Όταν είναι απαραίτητο, Sox2 προκλήθηκε έκφραση χρησιμοποιώντας 1 ug /mL δοξυκυκλίνη (Sigma). Knockdown έκφρασης Sox2 χρησιμοποιώντας έκφραση shRNA επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το σετ γονίδιο αντι-ανθρώπινο Sox2 shRNA, το οποίο αποτελείται από 4 διαφορετικά στόχευσης φακοϊικών ακολουθιών έναντι Sox2 και μη φίμωση ελέγχου [HSH017628-HIVH1 (Sox2) και CSHCTR001-HIVH1 (έλεγχος) διανύσματα περιείχε GFP και πουρομυκίνη αντίσταση συστατικά? Genecopoeia]. High-τίτλος lentivirus έγινε με συν-επιμόλυνση με ViraPower Lentivrial μείγμα συσκευασίας (Invitrogen? Grand Island, Νέα Υόρκη) και Lenti-X συγκεντρωτή. (Clontech? Mountain View, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Μη-κακοήθεις επιθηλιακά καλλιέργειες καθιερώθηκαν από φρέσκο ​​ανθρώπινους ιστούς προστάτη αποκτήθηκαν από χειρουργικά δείγματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Οι ιστοί αυτοί αποκτήθηκαν με ταχεία πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Chicago Board κριτική Θεσμική (IRB). δείγματα ιστού που διαχειρίζεται το Πανεπιστήμιο του Σικάγο Ανθρωπίνων Ιστών Κέντρο πόρων πυρήνα εγκατάσταση? η ανάγκη για συγκατάθεση του ασθενούς είχε παραιτηθεί ως αποκτήθηκαν δείγματα de-εντοπίστηκαν. 4 mm βιοψία διατρήσεις του μη καρκινικό ιστό ελήφθησαν από προστάτη και των σπερματοδόχων κυστιδίων ιστούς των ασθενών που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή? ήμισυ αυτού του ιστού στερεώθηκε και αναλύθηκε με έναν παθολόγο για την επιβεβαίωση της απουσίας του όγκου. Ο διαχωρισμός του ιστού του προστάτη και την ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων έχει περιγραφεί προηγουμένως [30], [31], και οι ίδιες μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό συμφωνημένα προστάτη (PrEC) και των σπερματοδόχων κυστιδίων (SVEC) επιθηλιακών κυτταρικών καλλιεργειών. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας Keratinoctye Serum-Free ορίζεται μέσα συμπληρωμένα με αυξητικούς παράγοντες (GFs) (πρότυπο K-SFM, Invitrogen Life Technologies) και μπορούν να καλλιεργηθούν μέχρι 8 περάσματα πριν αξιοσημείωτη κυτταρική γήρανση [32]. Για τα πειράματα μας, όλες οι καλλιέργειες αναλύθηκαν πριν ή κατά την τέταρτη δίοδο τους.

Western Blotting, ανοσοϊστοχημεία, και ανοσοφθορισμού

λύματα ολόκληρων κυττάρων που συλλέγονται από 100.000 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ανά λωρίδα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-AR (Ν-20, Santa Cruz? Santa Cruz, CA)? αντι-βήτα ακτίνης (Sigma-Aldrich)? αντι-ΔNp63 (4A4, Santa Cruz)? αντι-Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology? Beverly, ΜΑ)? αντι-Nanog (D73G4 XP, Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου)? αντι-Oct4 (C30A3, Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου)? και αφυδρογονάση αντι-αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH, Cell Signaling Technology). συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα Δευτερεύουσα χρένο ήταν από τη Cell Signaling Technologies, και HRP ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας SuperSignal West Femto Χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Πιρς /Thermo Scientific? Rockford, IL). Εναλλακτικά, χρησιμοποιήθηκαν δευτερογενή αντισώματα από Ρόκλαντ (Gilbertsville, PA) και τα δεδομένα που συλλαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Odyssey Licor (Lincoln, NE)

Η ανοσοχρώση για Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology? Μονοκλωνικό κουνέλι). Πραγματοποιήθηκε σε φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) τμήματα διαχειρίζονται είτε από το Πανεπιστήμιο του Σικάγο Ανθρωπίνων εγκατάσταση πυρήνα Tissue Resource ή το Northwestern University /Πανεπιστήμιο του προγράμματος Σικάγο προστάτη SPORE και το πρόγραμμα δειγμάτων για τις δημόσιες συμβάσεις τους. Μετά αποπαραφίνωση και την επανυδάτωση, οι ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα ανάκτησης αντιγόνου (S1699 από ϋΑΚΟ? Glostrup, Denmark) σε ατμιστή για 20 λεπτά. Αντι-Sox2 αντίσωμα (αραίωση 1:25) εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε θάλαμο υγρασίας. Μετά TBS πλύσιμο, η σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύτηκε με το σύστημα Οραματιστείτε + (DAKO, K4001 για την πρωτογενή αντισώματα ποντικού) και DAB + Χρωμογόνο (DAKO, K3468). τομές ιστών βυθίζεται για λίγο σε αιματοξυλίνη για αντικηλίδωση και ήταν συγκάλυψη γλίστρησε. Οι ιστοί αναλύθηκαν από ένα εκπαιδευμένο Ουρογεννητικό Παθολογοανατόμος και σκόραρε στο ποσοστό των κυττάρων με θετική πυρηνική χρώση (0 = καμία χρώση? 1 = 1-10% θετικά κύτταρα? 2 = 11-50% θετικά κύτταρα? Και 3 = Warrington, ΡΑ). Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με FXCycle Violet (Invitrogen, 1:1000 αραίωση). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε ένα Becton Dickinson LSR ΙΙ, και τουλάχιστον 250.000 μετρήσεις αποκτήθηκε για κάθε πειραματική συνθήκη. FACSDiVa λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση δεδομένων και το λογισμικό FlowJo χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

Floating σφαιροειδές Δοκιμασία Πολιτισμού

In vitro

κυμαινόμενο σφαιροειδή αναπτύχθηκαν από 1 × 10

5 LAPC-4 και LNCaP κύτταρα μεταδιεγείρονται με είτε λεντοϊού SOx και φορείς GFP ConFtrol [pReceiver-Lv105? GeneCopoeia (Rockville, MD)]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί Ultra-Low προσάρτησης 25 cm

2 φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας (Corning? Corning, ΝΥ) και αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα για 5 ημέρες. Τα σφαιροειδή που σχηματίζονται μετά από 5 ημέρες, μεταφέρθηκαν 10 cm

2 πιάτα (Corning? Corning, ΝΥ) για 24 ώρες ώστε να επιτραπεί προσκόλληση. Τα σφαιροειδή στη συνέχεια χρωματίστηκαν με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (Sigma-Aldrich), ξεπλύθηκαν, και μετρήθηκαν. σχηματισμό Σφαίρα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Στατιστικές Αναλύσεις

Σε όλα τα δεδομένα περιπτώσεις είχε αναπαραχθεί με τη χρήση πολλαπλών βιολογικών και τεχνικών επαναλήψεις. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση SigmaPlot 11.0 λογισμικού χρησιμοποιώντας ένα one way ANOVA με Pair-σοφός διαδικασίες πολλαπλής σύγκρισης (μέθοδος Holm-Sidak).

Αποτελέσματα

Sox2 εκφράζεται σε φυσιολογικό προστάτη βασικοκυτταρικό επιθηλιακά κύτταρα και σε ένα υποσύνολο των προστάτη όγκοι

Για την αξιολόγηση του επιπολασμού και το μοτίβο της έκφρασης πρωτεΐνης Sox2 στον προστάτη, πραγματοποιήσαμε μια ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση μιας σειράς ανθρώπινων ιστών του προστάτη και των όγκων. Αυτές οι αναλύσεις δείχνουν ότι σε φυσιολογικά και καλοήθη υπερπλασίας (ΒΡΗ) ιστούς του προστάτη Sox2 έκφραση περιορίζεται σε βασικά επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 1Α). Αναλύσεις των όγκων του προστάτη αποδεικνύει ότι Sox2 είναι είτε ομοιόμορφα εκφράζεται είτε ομοιόμορφα απών (Εικόνα 1Α). Η πλειονότητα (12 από 14) του ευνουχισμού ανθεκτικά μεταστάσεις αναλύθηκαν επίσης εκφράζουν Sox2 (Εικόνα 1Β και Γ). Το ποσοστό των Sox2-θετικών όγκων αυξάνει με Gleason Score, με ένα μικρό υποσύνολο των ευνοϊκών-πρόγνωση Gleason Σχολίων 6 όγκων και η πλειονότητα των φτωχών-πρόγνωση Gleason Σχολίων 10 και ευνουχισμός ανθεκτικά μεταστάσεις θετικά (Σχήμα 1 C). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι αναλύσεις των προ-κακοηθών προστατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (ΡΙΝ) βλάβες τεκμηριώνεται μια μικτή βασική και αυλική χρώση επιθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 1C). Αυτά τα δεδομένα όγκου είναι συνεπείς με την παρατήρηση που έγινε από Jia et al. χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό αντίσωμα Sox2 που δείχνουν ότι η έκφραση συσχετίζεται με Gleason βαθμό [23]. Τα δεδομένα μας έρχεται σε αντίθεση με την έκθεση αυτή, όμως, όπως παρατηρούμε ισχυρή βασική-επιθηλιακών χρώσης σε μη-κακοήθεις ιστούς, καθώς και η ομοιόμορφη ισχυρή έκφραση Sox2 σε ένα μικρό ποσοστό των όγκων, όχι μια διαβαθμισμένη αύξηση στην ένταση χρώσης [23]. Αυτά τα δεδομένα τεκμηριώνουν ότι Sox2 εκφράζεται ομοιόμορφα σε ένα υποσύνολο των όγκων του προστάτη, και υποδεικνύει ότι Sox2 έκφραση προσδίδει ένα υπο-τύπο μοναδικό όγκου που δεν φαίνεται να περιορίζεται σπάνια μορφή καρκίνου έναρξη /βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε όγκους του προστάτη.

Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση Sox2 αποδεικνύοντας εκπροσώπου της πυρηνικής βασικά επιθηλιακά χρώση (σκούρο κόκκινο) σε κανονικούς αδένες (περιοχή 3) #, και δύο διακριτές περιοχές του όγκου που είναι είτε ομοιόμορφα Sox2-positve (Περιοχή # 2) ή Sox2 αρνητικά ( περιοχή # 1). Β) Η έκφραση της Sox2 σε αντιπροσωπευτικές ευνουχισμό ανθεκτικά μεταστατικές βλάβες. Το κουτί στο 8 × μεγέθυνση αντιστοιχεί στην περιοχή που εμφανίζεται στην 40 × εικόνα. Γ) Ποσοστό και κατανομή του Sox2 έκφρασης μεταξύ των κρατών της νόσου του προστάτη. Στην κανονική, ΒΡΗ, και τους ιστούς HGPIN, Sox2 εκφράζεται σε βασικά-επιθηλιακά κύτταρα (γκρι Bars). Θετική έκφραση ορίζεται από περισσότερο από 50% των καρκινικών κυττάρων που είναι θετικά με σχετική ένταση 1 ή περισσότερο σε μια κλίμακα 0-3. Στους ιστούς και μεταστάσεις καρκίνου, Sox2 είτε ομοιόμορφα εκφράζεται ή απουσιάζει, και το ποσοστό των Sox2-θετικούς όγκους αυξάνει με Gleason Score (μαύρες μπάρες). BPH: Καλοήθης Υπερπλασία του Προστάτη? HGPIN: υψηλού βαθμού προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία? GS: Gleason Score (Ν = αριθμός μεμονωμένων δειγμάτων ασθενών που αναλύθηκαν)

Η

Sox2 συν-εκφράζεται μέσα σε ένα τμήμα του p63-Θετική βασική επιθηλιακά κύτταρα

Η έκφραση του Sox2 in. AR-αρνητικών βασικά-επιθηλιακών κυττάρων συνεπάγεται ότι Sox2 μπορεί να λειτουργήσει για την προώθηση της επιβίωσης των βλαστικών προστάτη και βασικών κυττάρων παροδική-ενίσχυση, ή τη διατήρησή τους σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση. Στο φυσιολογικό προστάτη, ο παρακρινής αλληλεπίδραση μεταξύ στρωματικών και επιθηλιακών κυττάρων εξαρτάται από ανδρογόνα, όπου AR-θετικών στρωματικά κύτταρα παράγουν μια σειρά από παράγοντες ανάπτυξης, συλλογικά ονομάζονται «andromedins» που σηματοδοτούν στα κοντινά επιθηλιακά κύτταρα για την προαγωγή του πολλαπλασιασμού των AR-αρνητικό, -θετικό αυλού επιθηλιακά κύτταρα p63-θετικά βασικά επιθηλιακά κύτταρα και η επιβίωση των AR-θετικών /ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) [34]. Να καθορίσει τι ποσοστό των βασικών-επιθηλιακών κυττάρων ήταν Sox2-θετικά, πραγματοποιήσαμε συν-ανοσοφθορισμού χρώση Sox2 και ρ63. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το 75% των επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη βασική βρίσκεται στην προστατική περιφερειακή ζώνη εκφράζουν τόσο Sox2 και ρ63, ενώ το υπόλοιπο 25% των κυττάρων εκφράζουν ρ63 αλλά όχι Sox2 (Σχήμα 2Α). Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι Sox2 έκφραση σκιαγραφεί δύο δυνητικά πληθυσμούς των βασικών επιθηλιακών κυττάρων? Αυτά τα κύτταρα μπορούν επίσης να έχουν μοναδικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και είναι δυνατόν να οφείλεται διακριτούς όγκους [35].

Α) ανοσοφθορισμού συν-χρώση Sox2 (πράσινο) με την ρ63 δείκτη βασικής-ειδική (κόκκινο), δείχνοντας ότι το 75% του κανονικό βασικό-επιθηλιακά κύτταρα είναι θετικά τόσο για Sox2 και ρ63 (κίτρινο) ενώ το υπόλοιπο 25% είναι Sox2-αρνητικά (κόκκινο). DAPI highlights χρώση των πυρήνων (εκπρόσωπος εικόνες του φυσιολογικού επιθηλίου του προστάτη που αποκτήθηκαν από τρία διαφορετικά μεμονωμένα δείγματα ασθενών). Β) Κηλίδωση Western από μία σειρά προστάτη ασθενούς που προέρχεται από (PrEC) και των σπερματοδόχων κυστιδίων (SVEC) επιθηλιακά πώλησης (PrEC) τις καλλιέργειες αποδεικνύει ότι ένα μέρος αυτών των καλλιεργειών εκφράζουν ανιχνεύσιμα Sox2, ενώ άλλες PrEC και όλες οι καλλιέργειες SVEC δεν το κάνουν. Γ) Ανοσοκυτοχημική χρώση Sox2 δείχνει ομοιόμορφη έκφραση της πυρηνικής Sox2 σε Sox2 θετικά PRECs και η έλλειψη Sox2-θετικών κυττάρων εντός Sox2 αρνητικά PRECs (εκπρόσωπος εικόνες τριών ανεξάρτητων πειραμάτων).

Η

Με βάση αυτό, έχουμε δημιουργήσει μια σειρά από μη-κακοήθων επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη (PrEC) καλλιέργειες από φρέσκα διαχωριστεί προστατικό ιστό και να τους αναλύθηκαν για Sox2 έκφρασης. Τέτοιες καλλιέργειες PrEC δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμο επίπεδο AR πρωτεΐνης, καθώς αποτελούνται κυρίως από ρ63-θετικών παροδική ενισχύει κύτταρα, μαζί με μικρές πληθυσμούς CD133-θετικών βλαστικά κύτταρα, ενδιάμεσους κύτταρα PSCA θετικών και χρωμογρανίνης Α-θετικών νευροενδοκρινών κυττάρων [ ,,,0],26], [31]. Ως επιπρόσθετος έλεγχος, απομονώσαμε καλλιέργειες ασθενής αντιστοίχιση των σπερματοδόχων κυστιδίων επιθηλιακών κυττάρων (SVEC) χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους. Οι αναλύσεις Western blotting τεκμηριωμένο ότι PrEC καλλιέργειες ήταν είτε Sox2-θετικά ή αρνητικά Sox2, και ταιριάζουν καλλιέργειες SVEC ήταν σταθερά αρνητικά (Σχήμα 2Β) [25]. Οι ετερογενείς πληθυσμοί κυττάρων μέσα τέτοιες καλλιέργειες PrEC πρότεινε ότι Sox2 μπορεί να είναι άκρως εκφρασμένη σε ένα μικρό υποσύνολο κυττάρων. Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση της έκφρασης Sox2, ωστόσο, έγγραφα, ότι η πλειονότητα των κυττάρων εντός Sox2-θετικές καλλιέργειες PrEC εκφράζουν Sox2? ενώ υπάρχουν λίγα, εάν υπάρχουν, ανιχνεύσιμα κύτταρα Sox2 εκφράζουν σε Sox2-αρνητικές καλλιέργειες PrEC (Σχήμα 2C). Έτσι, σε μη κακοήθεις πολιτισμών PrEC, η έκφραση Sox2 δεν περιορίζεται σε ένα μοναδικό πληθυσμό κυττάρων όπως CD133-θετικά βλαστικά κύτταρα του προστάτη.

Αυξημένη ανδρογόνων υποδοχέων (AR) Σηματοδοσίας Μειώνει Sox2 έκφραση σε φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα ( PRECs) και ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (βλαστοκύτταρα)

έχει ήδη αποδειχθεί πειραματικά ότι η ενεργοποίηση της σηματοδότησης AR από ανδρογόνων δεσμευτικός ως προς προστάτη επιθηλιακά κύτταρα προκαλεί την ανάπτυξη σύλληψή τους και την ενδεχόμενη διαφοροποίηση τερματικό σε εκκριτικά-αυλού κύτταρα [36] , [37], [38]. Η έκφραση του Sox2 στα βασικά επιθηλιακά κύτταρα και η έλλειψη έκφρασης Sox2 σε επιθηλιακά κύτταρα αυλού μη κακοήθη AR-θετικό πρότεινε ότι AR μπορεί καταστέλλουν έκφραση Sox2. Χρησιμοποιώντας Sox2-θετικές καλλιέργειες PrEC, η απόκριση της έκφρασης Sox2 σε εξωγενή έκφραση και επαγωγή συνδέτη του άγριου τύπου AR αξιολογήθηκε.