Abstract

Κλινικά στοιχεία δείχνουν ότι λεμφαγγειογένεση και του λεμφικού μετάσταση είναι σημαντικές διαδικασίες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) -C δείχθηκε να είναι ένας ρυθμιστής κλειδί σε αυτές τις διαδικασίες. Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA), ένα χαμηλού μοριακού βάρους παράγοντα ανάπτυξης λιπίδιο, ενισχύει την έκφραση VEGF-C σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι ο υποδοχέας Ι_ΡΑ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του λεμφικού σε έμβρυα ψαριού zebra. Ωστόσο, οι επιδράσεις του LPA επί της έκφρασης VEGF-C στον καρκίνο του προστάτη δεν είναι γνωστή. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι LPA επάνω ρυθμισμένη έκφραση VEGF-C σε τρεις διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Στο PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα, τα ενισχυτικά αποτελέσματα του ΙΡΑ διαμεσολαβούνται μέσω τόσο LPA1 και LPA3. Επιπλέον, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) επιθήλιο αυξητικός παράγοντας (LEDGF) έκφραση της παραγωγής και του φακού ενεπλάκησαν σε LPA

1/3-εξαρτώμενη έκφραση VEGF-C. Επιπλέον, αυτοταξίνη (ΑΤΧ), ένα ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση LPA, συμμετέχει επίσης στη ρύθμιση της έκφρασης του VEGF-C. Διακόπτοντας LPA

1/3 του PC-3, ρυθμισμένο μέσο (CM) προκληθείσα ανθρώπινων ομφάλιων φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVEC) λεμφικό δείκτες έκφραση επίσης μπλοκαριστεί. Περιληπτικά, βρήκαμε ότι το ΙΡΑ ενισχύει την έκφραση VEGF-C μέσω ενεργοποίησης LPA

1 /3-, ROS-, και LEDGF-dependent pathways. Αυτά τα νέα ευρήματα θα μπορούσαν δυνητικά να ρίξει φως στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών για την πρόληψη του λεμφικού μετάσταση του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Lin C-E, Chen S-U, Lin C-C, Chang C-H, Λιν Υ-C, Tai Y-L, et al. (2012) Λυσοφωσφατιδικό οξύ ενισχύει αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού Παράγοντα-C Εκφραση σε Ανθρώπινα Καρκίνος του προστάτη PC-3 κύτταρα. PLoS ONE 7 (7): e41096. doi: 10.1371 /journal.pone.0041096

Επιμέλεια: Masuko Ushio-Fukai, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9η Απριλίου 2011? Αποδεκτές: 21 του Ιουνίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιούλη 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις (NSC97-2311-B-002-002-my3, NSC 99 έως 2120-M-002-004 και NHRI 101-EX101-10130BI) από το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης και Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα της Δημοκρατίας της Κίνας . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο συχνά εμφανιζόμενους καρκίνους σε άνδρες. Η εξέλιξη της εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του προστάτη περιλαμβάνει διεργασίες όπως η απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης, αυξημένη τοπική εισβολή, την αγγειογένεση, και λεμφαγγειογένεση [1]. Λεμφαγγειογένεση βρέθηκε πρόσφατα να παίξουν ένα σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη, και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) -C είναι μια σημαντική lymphangiogenic ρυθμιστή. VEGF-C συνδέεται με τον υποδοχέα VEGF (VEGFR) -3 και ενεργοποιεί οδούς σήματος λεμφαγγειογένεσης που σχετίζεται [2]. Πολλά κλινικά στοιχεία αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης VEGF-C και περιφερειακές μετάσταση λεμφαδένα σε καρκίνο του προστάτη [3], [4]. Υπερεκφράζουν VEGF-C σε καρκινικά κύτταρα LAPC-9 του προστάτη ενισχυμένη όγκου λεμφικού μετάσταση [5]. Στην προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή CWR22Rv-1, κύτταρα που υπερεκφράζουν VEGF-C συχνότερα μεταστάσεις στους λεμφαδένες και τους πνεύμονες. Ωστόσο, ο ρυθμός της ανάπτυξης του όγκου και αγγειογόνων συμπεριφορά δεν επηρεάστηκαν από την υπερ-έκφραση του VEGF-C [6]. Wu et al. το 2008 έδειξε επίσης ότι ένα παγίδα συνδέτη VEGF-C και το αντίσωμα VEGFR-3 μείωσε σημαντικά λεμφαγγειογένεση καρκίνου του προστάτη και μετάσταση στους λεμφαδένες και άπω όργανα. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι λεμφαγγειογένεση μεσολαβεί μετάσταση του καρκίνου του προστάτη.

Λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) είναι ένα χαμηλού μοριακού βάρους αύξηση των λιπιδίων παράγοντας που δεσμεύεται με Edg οικογένεια G-πρωτεΐνη υποδοχέων (GPCRs) και ρυθμίζει πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες [7], [8]. LPA συντίθεται με ενζυματική διάσπαση της μεμβράνης φωσφατιδικό οξύ. Μόλις μία φλεγμονώδης απόκριση ενεργοποιείται, ΙΡΑ απελευθερώνεται από αιμοπετάλια και επάγει πολλαπλές κυτταρικές αποκρίσεις όπως είναι η μετανάστευση κυττάρων, πολλαπλασιασμό, και την επούλωση τραυμάτων [9]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα υπερεκφράζουν υποδοχείς Ι_ΡΑ επίσης παρουσίασαν αυξημένη εισβολή και μετάσταση όγκου [10]. Η έκφραση μεταγωγής του LPA

1 και LPA

3 υποδοχέων βρέθηκε να σχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη [11]. Σε προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή, LPA διεγείρει PC-3 κύτταρα κινητικότητα μέσω LPA

1 [12]. Επιπλέον, LPA προστατεύει PC-3 από την πείνα προερχόμενο απόπτωση μέσω ενός πυρηνικού παράγοντα (NF) -κB εξαρτώμενη οδό [13]. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το ΙΡΑ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

αυτοταξίνης (ΑΤΧ) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη 125-kDa που ανήκει στην οικογένεια ectonucleotide πυροφωσφατάσης /φωσφοδιεστεράσης (ENPP) το οποίο έχει την ικανότητα να υδρολύει δεσμούς φωσφοδιεστέρα

in vitro

. Επιπλέον, ATX επίσης αναφερθεί ότι κατέχουν λυσοφωσφολιπάση D (LysoPLD) ενζυματική λειτουργία, η οποία υδρολύει λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC) για να δημιουργήσει LPA [14], [15]. Σε ΑΤΧ-υπερεκφράζουν διαγονιδιακά ποντίκια, μαστικό επιθήλιο είναι επαρκής για να κινήσει την ογκογένεση και να παράγουν υψηλά μεταστατικού καρκίνου [16]. Επιπλέον, σε κλινικές μελέτες του καρκίνου του προστάτη, υψηλά επίπεδα έκφρασης της ΑΤΧ συνδέθηκαν τόσο με κακοήθη δυναμικά και φτωχών αποτελεσμάτων [17].

Έχει αναφερθεί ότι μετά από στέρηση ορού, VEGF-C αγγελιοφόρος (m) έκφραση RNA καρκινικών κυττάρων ενισχύθηκε με επεξεργασία με 10% ορό. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχει ένας παράγοντας ορού που ρυθμίζουν την έκφραση του VEGF-C [18]. Επιπλέον, μετά από να χτυπήσει κάτω zLPA

1 στο zebrafish, εμβρυϊκή ανάπτυξη θωρακικού πόρου ήταν ελαττωματικό [19]. Στην ανθρώπινη ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs), LPA μπορεί να επάγει τον σχηματισμό σωλήνα και έκφραση του λεμφικού δείκτη μέσω LPA

1/3 [20], [21]

. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το ΙΡΑ προερχόμενα σήματα είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη του λεμφικού αγγείου. Ωστόσο, οι ρόλοι των ΙΡΑ στο λεμφαγγειογένεση που επάγεται από τα καρκινικά κύτταρα παραμένουν αβέβαιες.

τρέχοντα αποτελέσματα μας, δείχνουμε ότι LPA πάνω ρυθμισμένα VEGF-C mRNA σε διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Με τη χρήση ενός LPA

1/3 ανταγωνιστής, αποδείξαμε ότι αυτά τα ενισχυτικές επιδράσεις σε PC-3 κύτταρα LPA

1 και LPA

3 εξαρτάται. Επιπλέον, η παραγωγή ROS και ο παράγοντας μεταγραφής, φακός επιθήλιο-αυξητικός παράγοντας (LEDGF), συμμετείχαν σε ρύθμιση LPA της έκφρασης VEGF-C. ATX, ένα ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή LPA, επίσης ρυθμισμένη έκφραση VEGF-C και έκκριση. Χρησιμοποιώντας HUVECs, έχουμε αποδείξει ότι ρυθμισμένα μέσα (CM) από κύτταρα PC-3 ενίσχυσε την έκφραση του λεμφικού δεικτών όπως Prox-1 και LYVE-1. Επιπλέον, προεπεξεργασία με Ki16425, LPA

1/3 ανταγωνιστή μπλοκάρει τα ενισχυτικά αποτελέσματα αυτών των CM. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ΙΡΑ και ΑΤΧ ρυθμίζουν την έκφραση VEGF-C σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και θα μπορούσε να οδηγήσει σε λεμφικό μετάσταση. Ως εκ τούτου, ο αποκλεισμός του ΙΡΑ και σηματοδότησης VEGF-C μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη.

Αποτελέσματα

LPA διεγείρει την έκφραση του VEGF-C σε διαφορετικές γραμμές κυττάρων του καρκίνου του προστάτη

για να διερευνηθεί εάν το ΙΡΑ είναι ένα διεγερτικό για την έκφραση VEGF-C σε καρκίνο του προστάτη, έχουμε επιλέξει το LNCaP, DU145, και PC-3 κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη για να δοκιμαστεί η δυνατότητα. LNCaP είναι ένα ανδρογόνο-εξαρτώμενη και χαμηλού μεταστατικού καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή. Σε αντίθεση, DU145 και PC-3 είναι αμφότερα ανεξάρτητου από ανδρογόνο και άκρως μεταστατική. Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές κατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις LPA, και τα δείγματα RNA συλλέχθηκαν. Από την ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου, βρήκαμε ότι LPA διεγείρεται μεταγραφή VEGF-C σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη τρία (Εικ. 1Α-C). Χρησιμοποιήσαμε PC-3 κύτταρα για να αναλύσει περαιτέρω εάν το ΙΡΑ ενισχύει την έκφραση της πρωτεΐνης VEGF-C και επακόλουθη έκκριση. Για τον προσδιορισμό της μεταφραστικό επίπεδο του VEGF-C, κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΙΡΑ, και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα VEGF-C. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα πρωτεΐνης VEGF-C ενισχύθηκαν από 1 και 5 θεραπείες μΜ LPA (Σχ. 1D). Για τον προσδιορισμό VEGF-C έκκριση, PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 5 μΜ LPA για 12 ώρες, και ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν. Το ρυθμισμένο μέσο αναλύθηκε με ένα κιτ VEGF-C ELISA. Βρήκαμε ότι το ΙΡΑ διεγείρει επίσης την έκκριση VEGF-C (Σχ. 1Ε).

LPA-ενισχυμένη έκφραση VEGF-C προκαλείται μέσω LPA

1 και LPA

3 σε κύτταρα PC-3

Στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, LPA υποδοχείς 1-3 προφίλ έκφρασης είναι καλά μελετηθεί και πιστεύεται να συνδέσει με την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, σε διάφορες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές, τα προφίλ των διαφορετικών υποδοχέων Ι_ΡΑ είναι διαφορετικά. PC-3 κύτταρα εκφράζουν την υψηλότερη

1 επίπεδο έκφρασης ΙΡΑ και το χαμηλότερο

επίπεδο 3 έκφρασης LPA, ενώ σε σύγκριση με LNCaP και DU145. Σε αντίθεση, τα κύτταρα LNCaP εκφράζουν το υψηλότερο επίπεδο του ΙΡΑ

3 και το χαμηλότερο επίπεδο του ΙΡΑ

1 μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη τρία [11]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, LPA

1/3 είναι υπεύθυνη για LPA αυξημένη έκφραση VEGF-C σε κύτταρα HUVEC [20]. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά Ki16425, έναν ανταγωνιστή για LPA

1 και LPA

3, για να καθοριστεί εάν αυτές οι δύο λυσοφωσφατιδικό υποδοχείς είναι υπεύθυνοι για LPA επίδραση στην έκφραση VEGF-C σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Σε προηγούμενη μελέτη, Ki16425 έχει ήδη αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να εμποδίσει ATX προκαλούμενη κινητικότητα σε PC-3 κύτταρα [12]. Μετά την επεξεργασία Ki16425, το ενισχυτικό αποτέλεσμα του LPA επί της έκφρασης VEGF-C μειώθηκε σημαντικά σε LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα (Σχ. 2Α). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η παρατήρηση, PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με Ι_ΡΑ

1 ή LPA

3 siRNA. LPA1-3 προφίλ έκφρασης δοκιμάστηκε σε LPA1 και LPA3 παροδικά νοκ ντάουν κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε την αλληλουχία siRNA επιλέξαμε μπορούσαμε συγκεκριμένο στόχο LPA

1 και LPA

3 υποδοχέα χωρίς να διακόπτουν τους άλλους δύο υποδοχείς (Εικ. 2Β). Κάτω από 10% FBS σε καλλιέργεια RPMI, τα βασικά επίπεδα mRNA του VEGF-C στο LPA

1 ή LPA

3 κύτταρα knockdown και οι δύο μειώθηκαν κατά 51% και 37% ξεχωριστά. Σε RPMI μόνο καλλιέργεια, τα βασικά επίπεδα mRNA του VEGF-C στο LPA

1 ή LPA

3 κύτταρα knockdown και οι δύο μειώθηκαν κατά 58% και 36% αντίστοιχα σε σχέση με κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου siRNA διαμόλυνση (Σχ. 2C). Αυτό συνεπάγεται ότι το ΙΡΑ είναι μια σημαντική επαγωγέας του VEGF-C στον ορό. Επιπλέον, προερχόμενο κύτταρο το ΙΡΑ θα μπορούσε επίσης να είναι ένας ρυθμιστής για τον VEGF-C σε κύτταρα PC-3. Με απευθείας κατεργασία με LPA, παρατηρήσαμε επίσης ότι το ΙΡΑ αυξημένη έκφραση VEGF-C ελαττώθηκε σε PC-3 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με είτε Ι_ΡΑ

1 ή LPA

3 siRNA (Σχ. 2D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο LPA

1 και LPA εμπλέκονται

3 και κρίσιμη για τον έλεγχο της έκφρασης VEGF-C

. Εκτός αυτού, υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ του ρυθμού αύξησης του ΙΡΑ

1, LPA

3 κύτταρα νοκ ντάουν και τα κύτταρα ελέγχου στο πλαίσιο του ΙΡΑ και τη θεραπεία του ορού (Εικ. S1).

(Α, Β και Γ ) Το LNCaP, DU145, και PC-3 κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη στον άνθρωπο υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές δοσολογίες LPA για 2 ώρες. Το mRNA μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Το σχετικό επίπεδο της VEGF-C κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH δείχνεται. (D) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις LPA για 4 ώρες. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με 12% SDS-PAGE και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-VEGF-C. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ LPA για 12 ώρες. Το ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και μετρήθηκε με ένα κιτ VEGF-C ELISA. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με το δείγμα του οχήματος-επωάζονται σε επεξεργασία με ΙΡΑ (*

σ

& lt? 0,05).

Η

(Α) LNCaP, DU-145 και τα κύτταρα PC-3 ήταν επεξεργασία με 10 μΜ Ki16425, ένας ανταγωνιστής του LPA

1 και LPA

3, ακολουθούμενη από 5 μΜ LPA για 2 ώρες (L5: 5 μΜ LPA). Μετρήθηκαν Σχετικά επίπεδα VEGF-C mRNA. (Β) κύτταρα PC-3 διαμολύνθηκαν παροδικά με Ι_ΡΑ

1 και LPA

3 siRNA. (Γ) Η βασική έκφραση VEGF-C mRNA PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με Ι_ΡΑ

1 ή LPA

3 siRNA μετρήθηκε σε FBS 10% και όχι κυτταρικής καλλιέργειας ρυθμισμένο ορό. (D) κύτταρα PC-3 που μορφομετατρέπονται με Ι_ΡΑ

1 και LPA

3 siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΙΡΑ, και VEGF-C mRNA μετρήθηκε. Το mRNA μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα σχετικά επίπεδα του VEGF-C κανονικοποιημένη προς GAPDH και β-ακτίνης παρουσιάζεται. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με το δείγμα του οχήματος-επωάζονται σε επεξεργασία με ΙΡΑ (*

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt ? 0.001)

η

LPA

1/3 ενισχυμένη έκφραση VEGF-C ROS εξαρτημένων

Μετά την αναγνώριση ότι LPA

1 και LPA

3 είναι. που εμπλέκονται στην έκφραση του VEGF-C σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, ερευνήσαμε περαιτέρω τα πιθανά μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στα κατάντη. Δεδομένου ότι ROS είναι γνωστό ότι είναι ένας επαγωγέας VEGF-C [22], [23], υποθέσαμε ότι το Ι_ΡΑ επαγόμενη παραγωγή ROS τελικά στη μεταγραφή VEGF-C σε κύτταρα PC-3. Χρησιμοποιώντας DCFDA ως ένα ενδοκυτταρικό ανιχνευτής ROS, παρατηρήσαμε ότι LPA ενισχυμένη παραγωγή ROS σε κύτταρα PC-3, και η απάντηση θα μπορούσε να καταργείται δια προκατεργασίας με Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), μια θεραπεία που είναι γνωστό ότι μειώνουν τις συγκεντρώσεις ROS (Εικ. 3Α). Εκτός NAC, δύο αντιοξειδωτικά, Tempol και Tiron χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να επιβεβαιώσει το ΙΡΑ επαγόμενη παραγωγή ROS (Σχ. 3Β). Περαιτέρω, το Ι_ΡΑ επαγόμενη ROS αποκλείστηκαν δια προκατεργασίας με Ki16425 (Σχ. 3C), γεγονός που υποδηλώνει ότι το ΙΡΑ

1/3 είναι υπεύθυνη για την παραγωγή ROS και την παραγωγή ROS δεν προέρχεται από ενδοκυτταρική οξείδωση LPA. Παρατηρήσαμε επίσης ότι το Ι_ΡΑ επαγόμενη VEGF-C καταργήθηκε με NAC (Σχ. 3D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή ROS εμπλέκεται στην LPA

1/3-επαγόμενη έκφραση VEGF-C.

PC-3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2,5 μΜ DCFDA για 10 λεπτά. Ακολουθούμενο από 10 min του LPA διέγερση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Α) 10 mM NAC, (Β) 1 mM Tiron και 1 mM Tempol χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία των κυττάρων πριν LPA διέγερση. (C) Ki16425 (10 μΜ) χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει την LPA

1/3 οδό σήματος πριν LPA διέγερση. (D) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM NAC, ένα αντιοξειδωτικό που ακολουθείται από 5 μΜ LPA για 2 ώρες (L5: 5 μΜ LPA). Η έκφραση σχετική mRNA VEGF-C μετρήθηκε. Το mRNA μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Το σχετικό επίπεδο της VEGF-C κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH δείχνεται. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με το δείγμα του οχήματος-επωάζονται σε επεξεργασία με ΙΡΑ (*

σ

& lt? 0,05)

Η

LPA

1/3 διαμεσολαβεί για την έκφραση του VEGF-C μέσω επαγωγής. LEDGF

Lens επιθήλιο-αυξητικός παράγοντας (LEDGF /ρ75) αναγνωρίστηκε ως μια πρωτεΐνη στρες-απόκρισης που προκαλείται από στέρηση ορού στερηθεί, θερμική καταπόνηση, και το οξειδωτικό στρες [24], [25]. Στον καρκίνο του προστάτη, LEDGF περαιτέρω ταυτοποιήθηκε ως ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε φάρμακα για την εξασθένηση που προκαλείται από Docetaxel κασπάσης και λυσοσωμικών οδών [26]. Πρόσφατα, Οξειδωτική και το άγχος που προκαλείται από μεταγραφή θερμική VEGF-C βρέθηκε να διαμεσολαβείται από LEDGF σε καρκίνωμα πνεύμονα [22]. Επιπλέον, γοναδοτροπίνη ρυθμιζόμενων λεμφαγγειογένεση επίσης διαμεσολαβείται από LEDGF επαγόμενη έκφραση VEGF-C σε καρκίνο των ωοθηκών [27]. Έτσι, υποθέσαμε ότι η έκφραση επαγόμενων από το ΙΡΑ VEGF-C προκαλείται μέσω της LEDGF. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το Ι_ΡΑ επάγεται LEDGF mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Σχ. 4Α, 4Β). Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το ΙΡΑ που προκαλείται LEDGF mRNA είναι παροδικό και γρήγορα υποχώρησαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν έντονα ότι ένας μηχανισμός μετα-μεταγραφής μπορεί επίσης να συμμετέχει στην διατήρηση επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης LEDGF επάγεται LPA. Προεπεξεργασία με Ki16425 και NAC μπλοκάρει πλήρως τις ενισχυτικές επιδράσεις του LPA επί της έκφρασης LEDGF (Σχ. 4C, 4D), υποδεικνύοντας την εμπλοκή του Ι_ΡΑ

1/3 υποδοχείς και ROS. Επιπλέον, LEDGF siRNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα PC-3 για να επιβεβαιώσουν εάν LEDGF εμπλέκεται σε Ι_ΡΑ-επαγόμενη έκφραση VEGF-C (Σχ. 4Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι LEDGF απαιτείται για την επίδραση ενίσχυση της LPA επί της έκφρασης VEGF-C (Σχ. 4F).

κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΙΡΑ και mRNA (Α) και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Β) της LEDGF προσδιορίστηκαν. LEDGF proteinm συλλέχθηκε μετά από αγωγή LPA 2 ώρες. Προεπεξεργασία με 10 μΜ Ki16425 και 10 mM NAC για 1 ώρα κατέστειλε τις επιδράσεις του LPA (L5: 5 μΜ LPA) επί της έκφρασης LEDGF (C και D). LEDGF siRNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα PC-3 (Ε) και κατέστειλε επιδράσεις LPA για έκφραση VEGF-C (F). Το mRNA μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα σχετικά επίπεδα LEDGF και VEGF-C κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH απεικονίζεται. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τα δείγματα του οχήματος-επωάζονται σε επεξεργασία με ΙΡΑ (*

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0.001).

η

Απόφραξη LPA

1/3 υποδοχέα και Knockdown της ΑΤΧ έκφρασης Μείωση VEGF-C η μεταγραφή και έκκριση από κύτταρα PC-3

LPA είναι πολύ εμπλουτισμένο σε ορού και τα αιμοπετάλια? Ωστόσο, πολλές εκθέσεις έδειξαν ότι ο καρκίνος του μαστού, γλοίωμα, και ο καρκίνος του προστάτη μπορεί να αυτο-συνθέσουν LPA και προωθούν την εξέλιξη του όγκου [28], [29], [30]. ATX είναι ένα LPC lysoPLD-υδρόλυσης η οποία παράγει LPA. LPA εκκρίνεται από ATX αυξάνει την διεισδυτικότητα και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού. Σε γλοιώματα, δραστηριότητα lysoPLD της ATX προωθεί επίσης την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και εισβολής. Με βάση αυτές τις προηγούμενες εκθέσεις, είχαμε επίσης την προσπάθεια να καθοριστεί εάν κύτταρα καρκίνου του προστάτη συντεθούν ATX θα μπορούσε αυτο-ρύθμιση της έκφρασης του VEGF-C. Ως εκ τούτου, PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640-μόνο μέσο για να αποφευχθεί το φαινόμενο του ορού. Αποκλείοντας LPA

1/3 με Ki16425, βασική VEGF-C mRNA (σχ. 5Α) και την έκκριση (εικ. 5Β) σε κύτταρα PC-3 ήταν σημαντικά μειωμένα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το ΙΡΑ που εκκρίνεται από κύτταρα PC-3 ενεργοποιείται LPA

1/3 και ως εκ τούτου ρυθμίζεται η έκφραση του VEGF-C. Επιπλέον, ATX siRNA και ο αναστολέας της, S32826 [31] (Εικ. 5C, 5D), χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν ATX εμπλέκεται στη ρύθμιση VEGF-C. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου ATX και δραστηριότητες μειώθηκαν VEGF-C mRNA (Εικ. 5C, 5D) και έκκριση (εικ. 5Ε). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATX εμπλέκεται στην αυτο-ρύθμιση της έκφρασης του VEGF-C σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Μετά από 16 ώρες από την πείνα, τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ Ki16425 σε RPMI1640 με 0,005% λιπαρό οξύ BSA για 8, 12, 24, και 48 ώρες. προσδιορίστηκαν Το σχετικό επίπεδο (Α) και συγκέντρωση έκκριση του VEGF-C mRNA (Β) σε δείγματα. Επιπλέον, PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ATX siRNA για 24 ώρες για να χτυπήσει κάτω το γονίδιο ATX. PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 0,005% BSA χωρίς λιπαρά οξέα για άλλες 24 ώρες, και το RNA δείγμα συλλέχθηκε. Επιπλέον, ο αναστολέας, S32826, χρησιμοποιήθηκε επίσης για την απενεργοποίηση δραστηριότητα ATX για 12 ώρες. Μετρήθηκαν ATX και VEGF-C mRNA εκφράσεις (C και D). Ακολουθώντας το ίδιο πρωτόκολλο, PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με ATX siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με S32826 στερήθηκαν τροφής και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 0,005% BSA χωρίς λιπαρά οξέα επί 48 ώρες. Προσδιορίστηκαν συγκεντρώσεις έκκριση VEGF-C (Ε) των δειγμάτων. mRNA Δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα σχετικά επίπεδα γονιδίων ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη απεικονίζεται. Οι συγκεντρώσεις έκκριση VEGF-C μετρήθηκαν με ELISA. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με το δείγμα του οχήματος-επωάζεται θεραπεία και επιμολυσμένα με Ki16425 και ATX siRNA (*

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001)

η

διακόπτοντας LPA

1/3 του PC-3, ρυθμισμένο μέσο (CM) προκληθείσα HUVEC λεμφικού δείκτης έκφρασης μπλοκαρίστηκε

για να μιμηθεί το μικροπεριβάλλον μεταξύ καρκινικών κυττάρων προστάτη και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε HUVECs ως πρότυπο για τη διερεύνηση των μηχανισμών με τους οποίους ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα επάγουν λεμφαγγειογένεση. HUVECs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αραιώσεις PC-3 CM. Τα επίπεδα έκφρασης του λεμφικού δεικτών, συμπεριλαμβανομένων Prox-1 και LYVE-1 ρυθμίζεται προς τα πάνω σε HUVECs (Σχ. 6Α) μετά από θεραπεία CM. Για να καθοριστεί εάν ο VEGF-C που εκκρίνεται από κύτταρα καρκίνου του προστάτη απαιτείται για την τόνωση του λεμφικού δείκτες, PC-3 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με VEGF-C shRNA επιλέχθηκαν (Εικ. 6Β). Χρησιμοποιώντας CM από PC-3 κύτταρα VEGF-C knockdown για τη θεραπεία HUVECs, η έκφραση του λεμφικού δείκτη σε HUVECs ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα CM (Εικ. 6C). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι ο VEGF-C είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της έκφρασης του λεμφικού δείκτη από το PC-3 κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με προηγούμενα ευρήματα ότι ο VEGF-C παίζει ένα ρόλο κλειδί σε καρκίνο του προστάτη που προκαλείται από λεμφαγγειογένεση. Επιπλέον, προεπεξεργασμένων PC-3 κύτταρα με Ki16425 πριν από τη συλλογή του ΚΕ (Σχ. 6D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με τη διακοπή της LPA

1/3, η ικανότητα των PC-3 CM για να επάγει την έκφραση του λεμφικού δείκτης μειώθηκε κατά 32% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, προκατεργασία των HUVECs με Ki16425 δεν επηρέασε την επαγωγή της έκφρασης του λεμφικού δείκτη (Εικ. 6D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ικανότητα επαγωγής σε CM είναι πιθανό να οφείλεται στην VEGF-C. Για περαιτέρω αποσαφήνιση των ρόλων της LPA

1 και LPA

3 σε PC-3

, συλλέξαμε ρυθμισμένο μέσο από το ΙΡΑ

1 ή LPA

3 παροδικά νοκ ντάουν κυττάρων για τη θεραπεία των κυττάρων HUVEC. Στα αποτελέσματα μας, προσαρμοσμένα μέσα από LPA

1 ή LPA

3 κύτταρα knockdown είχαν περιορισμένη ικανότητα να επάγει την έκφραση του λεμφικού δείκτη σε HUVEC (Σχ. 6Ε).

(Α) PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-μόνο μέσο για 24 ώρες μετά από 16 ώρες από την πείνα. Το 24 h CM συλλέχτηκε και αραιώθηκε για τη θεραπεία HUVECs για 4 ώρες. Μετά τη θεραπεία, παρατηρήθηκε HUVEC έκφραση του λεμφικού δείκτη. (Β) κύτταρα PC-3 σταθερά επιμολυσμένα με VEGF-C shRNA ελέγχθηκαν για VEGF-C mRNA και της έκφρασης έκκρισης. (C) VEGF-C knockdown PC-3 CM είχε χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία HUVECs ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω. (D) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ Ki16425 ενώ είναι καλλιεργήθηκαν σε RPMI-μόνο μέσο για 24 ώρες πριν από την CM χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία HUVECs. Ki16425 χρησιμοποιήθηκε επίσης για να ελεγχθεί εάν το ΙΡΑ υπάρχουσες σε PC-3 CM είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση του λεμφικού δείκτη HUVEC. Ki16425 (10 μΜ) προκατεργάστηκε για 1 ώρα πριν PC-3 CM θεραπεία του HUVECs. (Ε) CM από PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με Ι_ΡΑ

1 ή LPA

3 siRNA χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κύτταρα HUVEC όπως διαδικασίες που περιγράφονται ανωτέρω. mRNA Δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα σχετικά επίπεδα γονιδίων κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH και β-ακτίνης παρουσιάζεται. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τα δείγματα του οχήματος-επωάζονται και τα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με PC-3 CM (*

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

p

& lt?. 0.001)

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τους ρόλους της LPA στη ρύθμιση της έκφρασης του VEGF-C στον καρκίνο του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σαφώς ότι το ΙΡΑ επαγόμενη έκφραση VEGF-C σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. LPA

1 και LPA

3 και οι δύο προσδιορίζονται ως εμπλεκόμενο στην LPA προκαλούμενη οδό σηματοδότησης VEGF-C. Για τους μεταγενέστερους σήματα, το Ι_ΡΑ-προκαλούμενη παραγωγή ROS και έκφραση LEDGF ταυτοποιήθηκαν ως συμμετέχοντες στη ρύθμιση της VEGF-C. Επιπλέον, ATX γονίδιο knockdown μειωμένη βασική έκφραση VEGF-C. Αυτό δείχνει ότι το ΙΡΑ και ΑΤΧ είναι αμφότερα απαραίτητα για την ρύθμιση της έκφρασης του VEGF-C σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Τα λυσοφωσφολιπίδια προτάθηκαν για την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. LPA επάγει τη μετανάστευση PC3 κυττάρων μέσω της LPA

1, Ρ42, και τα μονοπάτια της p38 άλφα και επίσης προωθεί Matrigel εισβολής [32]. Πρόσφατα, δείχνουν επίσης ότι CD97 ετεροδιμεριστεί και λειτουργικά synergized με LPA

1 εμπλέκουν στην εξέλιξη του καρκίνου [33]. Εκτός αυτού, το Ι_ΡΑ επαγόμενη επιβίωση του καρκίνου του προστάτη και εισβολή έχει δειχθεί να συνδέσουν με καλπαΐνη μεσολάβηση πρωτεόλυση FAK [34]. Επιπλέον, η έκφραση του VEGF ενεργοποιείται από το ΙΡΑ μέσω παράγοντα ενεργοποίησης υποξία επαγωγής (HIF) -1α έκφραση σε PC-3 κύτταρα [35]. Ωστόσο, ο ρόλος του ΙΡΑ σε καρκίνο του προστάτη που προκαλείται από λεμφαγγειογένεση είναι ακόμη πλήρως κατανοητό.

VEGF-C θεωρείται βασικό lymphangiogenic παράγοντας στην έναρξη λεμφαγγειογένεση και του λεμφικού μετάστασης σε καρκίνους του προστάτη. Σε κύτταρα LNCaP, VEGF-C ταυτοποιήθηκε να ρυθμίζεται αρνητικά από ανδρογόνων μέσω του υποδοχέα ινσουλινοειδούς αυξητικού παράγοντα 1 (IGF-IR) και FOXO μονοπάτι [36]. Επιπλέον, με ανδρογόνων, Rala διεγείρει τη σύνθεση VEGF-C, αυξάνοντας ROS γενιάς [23]. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση Rala ενεργοποιείται από το ΙΡΑ

1 στα κύτταρα ΗΕΚ293 [37], η σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης του υποδοχέα LPA και τις επιπτώσεις των ανδρογόνων για τη ρύθμιση των VEGF-C είναι άξιο περαιτέρω έρευνα. Τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι τόσο LPA

1 και LPA

3, ευθύνονται για την έκφραση που προκαλείται από το Ι_ΡΑ-VEGF-C. Επιπλέον, σε LPA

1 και LPA

3 σταθερώς νοκ-κάτω PC-3 κύτταρα, βασική έκφραση του γονιδίου VEGF-C δείχθηκε ότι έχουν μειωθεί. Σε μελέτη που δημοσιεύθηκε πρόσφατα μας, επαγόμενων από το ΙΡΑ VEGF-C και λεμφαγγειογένεση σε HUVECs ήταν επίσης LPA

1 και LPA

3 εξαρτώμενη [38]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του LPA

1 και LPA

3 ρυθμίζει την έκφραση VEGF-C και στα δύο καρκίνο και ενδοθηλιακά κύτταρα.

καρκίνο του προστάτη, VEGF-C ανοδική ρύθμιση δείχθηκε να συνδέεται με την παραγωγή ROS [22], [23]. Τα αποτελέσματα πρότειναν έναν ρόλο των ROS στην έκφραση επαγόμενων από το ΙΡΑ VEGF-C. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η παραγωγή ROS προκλήθηκε με ΙΡΑ και συμμετέχει σε Ι_ΡΑ επαγόμενη μεταγραφή VEGF-C. Επιπλέον, LEDGF, ένας μεταγραφικός παράγοντας που ενεργοποιείται από ROS, εμπλέκεται στην έκφραση επαγόμενων από το ΙΡΑ VEGF-C. Στην κλινική έρευνα, η έκφραση LEDGF ανυψώθηκε στο 93% των κλινικά δείγματα όγκο του προστάτη, και εξασθενημένα docetaxal κυτταρικό θάνατο που επάγεται [39]. Εδώ, δείξαμε ότι η έκφραση LEDGF προκλήθηκε με αγωγή LPA σε LPA

1/3-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω LPA είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της προόδου σε καρκίνο του προστάτη.

Τα επίπεδα έκφρασης της ΑΤΧ, μια Ι_ΡΑ-ένζυμο που παράγει, είναι υψηλότερα σε ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη κύτταρα [40]. Επιπλέον, τα κλινικά δεδομένα αποκάλυψαν ότι το 50% περίπου των ασθενών με καρκίνο του προστάτη έδειξαν ισχυρή έκφραση της ΑΤΧ. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης ATX συσχετίστηκε σημαντικά με την πρωτογενή βαθμό Gleason εστιών καρκίνου και την παρουσία του καψικού προστάτη εισβολή [17]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο VEGF-C ρυθμίζεται από την έκφραση ATX σε PC-3 κύτταρα. Ως εκ τούτου, ο καρκίνος του προστάτη που συνθέτουν LPA μπορούν να σχηματίσουν ένα αυτοκρινή βρόχο για την τόνωση της έκφρασης VEGF-C και την περαιτέρω προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου. Με βάση αυτά τα ευρήματα, ένας αναστολέας ATX θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός υποψήφιος για την πρόληψη της λεμφαγγειογένεση που επάγεται μετάσταση του καρκίνου του προστάτη.

Ρυθμισμένο μέσο συλλέγεται από τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιείται ευρέως για να μιμηθεί τοπικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ ξενιστών μικροπεριβάλλοντος και των όγκων. Χρησιμοποιώντας ένα HUVEC in vitro μοντέλο, τα καρκινικά κύτταρα δείχθηκαν να μυστικό ιντερλευκίνη (IL) -1α να διεγείρουν IL-8 έκκριση από τα ενδοθηλιακά κύτταρα [41]. Επιπλέον, ρυθμισμένο μέσο της Α549 πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου ρυθμίζει αυξητικός παράγοντας (PDGF) έκφραση των ενδοθηλιακών κυττάρων των αιμοπεταλίων που εξαρτάται VEGF [42]. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι HUVEC κυττάρου είναι ένας κατάλληλος

in vitro

μοντέλο για τη διερεύνηση ενεργά συστατικά σε ρυθμισμένο μέσο από καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων. PC-3-ρυθμισμένο μέσο που επάγεται λεμφικών ενδοθηλιακών κυττάρων (LEC) πολλαπλασιασμός, σχηματισμός σωλήνα, και την επούλωση τραυμάτων. Επιπλέον, VEGFR-2 σηματοδότηση Εντοπίσθηκε επίσης παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην ανταπόκριση LECs »στη θεραπεία με PC-3-ρυθμισμένο μέσο [43]. Εδώ, δείξαμε ότι ο VEGF-C είναι ένα σημαντικό επαγωγέας της έκφρασης των HUVEC λεμφικού δεικτών σε PC-3-ρυθμισμένο μέσο. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με προηγούμενες μελέτες που PC-3 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά VEGF-C siRNA ελαττωμένη ενδοογκική λεμφαγγειογένεση [44]. Επιπλέον, η έρευνα μας απέδειξαν περαιτέρω ότι η ενεργοποίηση του LPA

1/3 ρυθμίζει PC-3 έκφραση VEGF-C, και ρυθμισμένο μέσο από PC-3 ήταν ικανό να επάγει την έκφραση της ενδοθηλιακής λεμφικού δεικτών κυττάρου.

συνοπτικά, δείξαμε ότι το ενισχυτικό αποτέλεσμα του LPA και του άξονα ΑΤΧ επί της έκφρασης VEGF-C σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, οι ανταγωνιστές του ΙΡΑ

1/3 και ATX μπορεί να είναι εφικτό θεραπευτικές στρατηγικές για την αναστολή του καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από λεμφαγγειογένεση και ως εκ τούτου εμποδίζουν την μετάσταση θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Culture

Το PC-3, DU145, και LNCaP ανθρώπινου προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ΑΤΟΟ καλλιεργήθηκαν σε RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), πενικιλλίνη ( 100 U /ml), και στρεπτομυκίνη (100 U /ml) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2. Ανθρώπινα ομφάλιο λώρο είναι ευγενική παραχώρηση (έγκριση Institutional Review Board όχι. 9561709146) Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο. HUVECs καλλιεργήθηκαν σε 1% ζελατίνη επικαλυμμένα (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) 10-cm τρυβλία σε 60% Μ199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη, 20% FBS και 20% μέσο ανάπτυξης ενδοθηλιακού (EGM). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ένα πέρασμα σε εβδομαδιαία βάση. Τα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν μετά θρυψινοποίηση και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα μέχρι πέρασμα 4. PC-3 σταθερά επιμολυσμένα με VEGF-C μικρό-φουρκέτα (sh) RNA διατηρήθηκε και ενισχύθηκε σε πλήρες μέσο συμπληρωμένο με πουρομυκίνη (0,25 μg /ml) για 6 εβδομάδες πριν από τα πειράματα διεξήχθησαν.

LPA διέγερση

LPA (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) παρασκευάστηκε σε χλωροφόρμιο και μεθανόλη (1:09) και αποθηκεύτηκε στους -20 ° ΝΤΟ. Εκατό χιλιάδες κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 3,5-cm διαμέτρου με πλήρες μέσο. Μετά από 24 ώρες από την εμφύτευση, PC-3 κύτταρα στερήθηκαν τροφής με RPMI-1640 χωρίς ορό για 16 ώρες. Μετά ασιτία, LPA προστέθηκαν σε RPMI άνευ ορού με λευκωματίνη 0,005% λιπαρό οξύ χωρίς βόειου ορού (BSA) ως φορέα. Το LPA

1/3 ανταγωνιστή, Ki16425 (Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA) και ο αναστολέας ATX, S32826 (Echelon, Salt Lake City, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) και οι δύο διαλύθηκαν σε DMSO. Η συγκέντρωση εργασίας για Ki16425 και S32826 ήταν 10 μΜ και 200 ​​ηΜ.

Ανάλυση Western Blot

Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και λύθηκαν επί πάγου με ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris σε ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, και 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS)). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στους 4 ° C και 14,000 rpm για 15 λεπτά, και να αποσαφηνιστούν τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Ίσες ποσότητες των δειγμάτων διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Millipore, Bellerica, ΜΑ, USA). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την αποτύπωση: αντι-ΗνΕΟΡ-C αντίσωμα κατσίκας μονοκλωνικό (AF752? Ε & amp? Α, Minneapolis, MN, USA), κατσίκα πολυκλωνικό αντι-hLEDGF αντίσωμα (SC-33371? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,