Αφηρημένο

Ιστορικό

Προς το παρόν διαθέσιμες μέθοδοι για τη διάγνωση και σταδιοποίηση του καρκίνου του προστάτη δεν έχουν την ευαισθησία να διακρίνει μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του προστάτη νωχελικός και εκείνων που απαιτούν ριζική θεραπεία. Μεταβολές σε βασικούς adherens (AJ) και σφιχτό κόμβο έχουν (TJ) συστατικά χαιρετίστηκε ως πιθανούς βιοδείκτες για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, αλλά το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας έχει πραγματοποιηθεί σε μεμονωμένα μόρια.

Στόχος

Για να διαλευκανθεί ένα πάνελ βιοδεικτών που μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση αδρανής καρκίνο του προστάτη από την επιθετική μεταστατική νόσο.

Μέθοδοι

Εμείς αναλύσαμε την έκφραση της 7ης πολύ γνωστά συστατικά AJ και TJ σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακού ιστού (ΡΝΤ2), μη επεμβατική (CAHPV-10) και διηθητικού καρκίνου του προστάτη (LNCaP, DU145, PC-3) χρησιμοποιώντας την έκφραση του γονιδίου, western blotting και ανοσοφθορισμού τεχνικές.

Αποτελέσματα

κλαουδίνης 7, α β-κατενίνης και την έκφραση της πρωτεΐνης β-κατενίνης δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ CAHPV-10 κύτταρα και τα κύτταρα ΡΝΤ2. Ωστόσο, σε κύτταρα PC-3, τα επίπεδα πρωτεΐνης για κλαουδίνης 7, α-κατενίνης ήταν σημαντικά κάτω ρυθμιζόμενες (-1,5 φορές, ρ = & lt? 0.001) ή μη ανιχνεύσιμη αντίστοιχα. Ανοσοφθορισμού έδειξε β-κατενίνης εντοπισμό σε κύτταρα PC-3 να είναι κυτταροπλασματικά σε αντίθεση με μεμβρανικό

Συμπέρασμα

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν παρεκκλίνουσα κλαουδίνης 7, α -. Και β-κατενίνης έκφραση ή /και ο εντοπισμός πρότυπα μπορεί να είναι υποθετικό δείκτες για τη διάκριση εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη από την επιθετική μεταστατική νόσο όταν χρησιμοποιείται συλλογικά

Παράθεση:. Morgan C, Jenkins Α.Ε., Kynaston HG, Doak SH (2013) Ο ρόλος της πρόσφυσης Μόρια ως βιοδείκτες για το επιθετικό Καρκίνος του προστάτη φαινότυπο. PLoS ONE 8 (12): e81666. doi: 10.1371 /journal.pone.0081666

Επιμέλεια: Frédéric André, Πανεπιστήμιο Aix-Marseille, Γαλλία

Ελήφθη: 28 Ιούνη, 2013? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Morgan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από προστάτη δράσης (αριθμός αναφοράς επιχορήγηση G2009 /27) και Ιατρικό Ίδρυμα του Αγίου Δαυίδ, Κολέγιο Ιατρικής του Πανεπιστημίου Swansea. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (ΚΓΠ) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες στο Ηνωμένο Βασίλειο. Κάθε χρόνο περίπου 35.000 περιπτώσεις του Cap διαγνωστεί και αντιπροσωπεύει περίπου το 12% όλων των αρσενικών θανάτων από καρκίνο στο Ηνωμένο Βασίλειο [1]. Η έγκαιρη διάγνωση του Cap οργάνου-περιορίστηκε είναι απαραίτητη, δεδομένου ριζική προστατεκτομή ή ακτινοθεραπεία προσφέρει η μοναδική ευκαιρία πλήρη ίαση και τη θεραπεία της νόσου σε προχωρημένο στάδιο είναι παρηγορητική και αποτελεσματική (μακροπρόθεσμα). Επιπλέον, στις αρχές CaP όργανο-περιορισμένο δεν είναι πάντα απειλητική για τη ζωή και μπορεί να ακολουθήσουν και νωχελικός πορεία, η οποία δεν απαιτεί θεραπεία. Είναι γενικά αποδεκτό ότι επί του παρόντος διαθέσιμες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση και σταδιοποίηση του πώματος (ειδικό προστατικό επίπεδα αντιγόνου, Gleason σκορ και κλινικά και παθολογικά βαθμού) δεν έχουν την ευαισθησία να διακρίνει μεταξύ ασθενών με βραδείας εξέλιξης, Κεφ όργανο-περιορισμένο, αυτές που απαιτούν ριζική θεραπεία και εκείνων σε κίνδυνο υποτροπής μετά από ριζική θεραπεία. Είναι προφανές ότι υπάρχει μία ανάγκη για τον εντοπισμό μοριακών δεικτών του καπακιού εξέλιξης, εισβολή και μετάσταση να προβλέψουμε διάγνωση και καθοδήγηση της θεραπείας.

Για ένα καρκίνου για μεταστάσεις, τα κύτταρα πρέπει πρώτα να ξεφύγει από τον πρωτογενή όγκο. Σε επιθηλιακού ιστού, τα κύτταρα συνδέονται μεταξύ τους με μεμβράνη δομές ονομάζονται σφικτών συνδέσμων (TJ), ενώσεις προσφύσεως (AJ) και δεσμοσώματα [2]. Μαζί διατηρούν την αρχιτεκτονική του επιθηλίου. AJ πρωτεΐνες περιλαμβάνουν τις οικογένειες cadherin και κατενίνης. E-cadherin είναι κατά κύριο λόγο παρούσα σε επιθήλια και αντιπροσωπεύει την prototypic μέλος της οικογένειας cadherin. Η κυτταροπλασματική περιοχή της Ε-καδερίνης δεσμεύεται με κυτοσολικές πρωτεΐνες που ονομάζονται κατενίνες (α, β και ρ120) [3]. β-κατενίνης συνδέεται άμεσα με Ε-καδερίνης, ενώ α-κατενίνης συνδέεται έμμεσα μέσω της αλληλεπίδρασής της με β-κατενίνης [4]. Μαζί με δεσμοσώματα που είναι κυρίως υπεύθυνα για την πρόσφυση μεταξύ των γειτονικών κυττάρων [5] και σχηματίζουν σταθερές επαφές κυττάρου-κυττάρου. Το TJ διαχωριστούν τα κορυφαίων και βασεοπλευρικών περιοχές της μεμβράνης του πλάσματος και ρυθμίζουν τη διέλευση των ιόντων, το νερό και μακρομορίων κατά μήκος του επιθηλίου [6]. TJs αποτελούνται από πρωτεΐνες δεσμευμένες σε μεμβράνη (claudins, occludin, tricellulin) και πρωτεΐνες προσαρμογέα και σκαλωσιές τους (συνδετική μορίου προσκόλλησης, ZO-1, ΖΩ-2, ΖΩ-3 cingulin, MUPP1) [7].

Μέχρι πρόσφατα, TJs έχουν μόνο αντιληπτή ως κυτταρική σφραγίδες [8]. Τώρα, όμως, οι απώλειες πρωτεϊνών TJ γίνονται αναγνωρίζονται για την ένωσή τους με μια ποικιλία καρκίνων. Απορρύθμιση των πρωτεϊνών TJ συνδέεται με την απώλεια των επιθηλιακών κυττάρων πολικότητας και αποδιαφοροποίηση που είναι ένα γνωστό γεγονός στην καρκινογένεση πρώιμο στάδιο [7]. Σε χαμηλής διαφοροποίησης του μαστού [9], [10], του θυρεοειδούς [11], του ενδομητρίου [12] και της γαστρεντερικής [13] καρκίνους, η έκφραση του σφιχτό πρωτεϊνών συνδέσεως έχουν δειχθεί να μειωθεί, ενώ στην απώλεια της λειτουργικής TJ ασθενών με καρκίνο του μαστού » πρωτεΐνες έχει επίσης συνδεθεί με μια χειρότερη πρόγνωση [14], [15]. Δεδομένου ότι οι TJ πρωτεΐνες ορίζεται ως το σημείο όπου οι μεμβράνες των δύο κυττάρων ενταχθούν μαζί εκτελέσει μια ζωτικής σημασίας λειτουργία, κρατώντας τα κύτταρα μαζί και είναι ένα κρίσιμο εμπόδιο ότι τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να ξεπεραστούν προκειμένου να διαδοθεί [16].

Ενώ απόδειξη συνεχίζει να αυξάνεται όσον αφορά την έκφραση του TJ και AJ συστατικά στον καρκίνο η πλειοψηφία των μελετών που στοχεύουν στην διερεύνηση μεμονωμένων μορίων. Οι καρκίνοι είναι ετερογενείς από τη φύση και ως εκ τούτου, είναι αδύνατο για τη διάγνωση του καρκίνου ή την πρόβλεψη της εξέλιξης της νόσου, χρησιμοποιώντας ένα μόνο βιοδείκτη.

Χρησιμοποιήσαμε πέντε εμπορικά διαθέσιμο κυτταρικές σειρές προστάτη που προέρχονται από φυσιολογικό επιθήλιο προστάτη, μη επεμβατική καρκίνο του προστάτη και μεταστατικές καρκίνος να αναλυθεί η έκφραση του 7 καλά γνωστών συστατικών AJ και TJ, που ταυτοποιείται ως παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε δείγματα καρκίνου του προστάτη ιστών [17], [18], [19], [20], [21], στο πρώτο στάδιο της δυνητικά αποσαφήνιση ένα πάνελ βιοδεικτών που μπορεί να διακρίνει τον καρκίνο νωχελικός από την επιθετική μεταστατική νόσο όταν χρησιμοποιείται συλλογικά.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (ΡΝΤ2) και κύτταρα καρκίνου του προστάτη που προέρχεται από μεταστατικό καρκίνο στους λεμφαδένες (LNCaP) και του οστού (PC-3) ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα που προέρχονται από μη-διηθητικού καρκίνου του προστάτη (CAHPV-10) και μεταστατικός καρκίνος στον εγκέφαλο (DU145) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. ΡΝΤ2, LNCaP, DU145 και PC-3 ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε περιβάλλον RPMI 1640, 2mM L-Γλουταμίνη γλουταμίνη και 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Paisley UK). CAHPV-10 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και 50 μg /ml εκχυλίσματος υποφύσεως βοοειδών (Invitrogen, Paisley UK).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα από 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα υπο-καλλιεργηθούν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ (Sigma-Aldrich, Dorset, UK).

Αντισώματα

Πρωτογενή αντισώματα για ΖΟ-1 ποντικού και κουνελιού occludin, κλαουδίνης-1 και κλαουδίνης -7 αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Paisley, UK). Κουνέλι, α-κατενίνης, β-κατενίνης, Ε-καδερίνης και κουνελιών β-ακτίνης αγοράστηκαν από την New England Biolabs (Hertfordshire, UK). Χρένα peroxidise συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα /αντι-κουνελιού αντι-ποντικού επίσης αγοράστηκαν από την New England Biolabs (Hertfordshire, UK).

Για ανοσοφθορισμού, και άλλα πρωτογενή αντισώματα για α-κατενίνης, β-κατενίνης ελήφθησαν από Abcam ( Cambridge, UK). Αντι-ποντικού (Qdot655) και αντι-κουνελιού (Qdot525) δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Invitrogen (Paisley UK).

Ανάλυση

Η γονιδιακή έκφραση

Ολικό κυτταρικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης RNeasy ( Qiagen, Crawley, UK) και υπολειμματικό DNA απομακρύνθηκε με κατεργασία με ελεύθερο DNA ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. cDNA συντέθηκε από 1 μα RNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές και το κιτ της αντίστροφης μεταγραφής σύνθεσης cDNA υψηλής χωρητικότητας (Applied Biosystems, Warrington, UK). Real-time PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν στο Thermal Cycler iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) με χρήση της μεθοδολογίας ανίχνευσης SYBR Green. Ομάδες εναρκτήρα (Πίνακας 1) σχεδιάστηκαν για να είναι εξόνιο-εξόνιο που εκτείνονται έτσι ώστε να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα ότι κάθε μολυσματικό γονιδιωματικό DNA θα ενισχυθεί. Τα σύνολα εκκινητών που χρησιμοποιούνται ελέγχθηκαν επίσης να εξασφαλιστεί ότι όλα αποδειχθεί εξίσου την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με 2 cDNA μΙ, 12,5 μl iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) και 0,2 μΜ προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές, σε τελικό όγκο αντίδρασης 25 μΙ. β-ακτίνης και HPRT χρησιμοποιήθηκαν ως γονίδια αναφοράς. συνθήκες ενίσχυσης PCR ήταν 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 94 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s. Fold έκφραση ομαλοποιήθηκε έναντι των φυσιολογικών κυττάρων ΡΝΤ2 επιθηλιακά προστάτη.

Η

κηλίδωση Western

Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (Sigma Aldrich, Dorset, UK). Τριάντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης λειτουργεί είτε 7,5% είτε 12% τρις-γλυκίνης πηκτώματα PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) ανάλογα με το μέγεθος της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε πολυσορβικού /TBS για την αναστολή μη δεσμευτικό (όλα Sigma Aldrich, Dorset, UK) ειδικές και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα σε αυτά, occludin (1:83), ZO- 1 (1:250), κλαουδίνης-1 (1:125), κλαουδίνης-7 (1:125) α-κατενίνης (1:1000), β-κατενίνης (1:1000) και Ε-καδερίνης (1:500) . β-ακτίνης (1:1000) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Οι μεμβράνες πλύθηκαν χωρίς πρωτογενές αντίσωμα και επωάζονται με υπεροξειδάση ραφανίδας συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού /αντι-κουνελιού (1:1000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με τη χρήση του κιτ Immun-Star WesternC ανίχνευση chemiluminescene (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) και η σχετική έκφραση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πυκνομετρία και το πρόγραμμα λογισμικού Ποσότητα One (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK). Στυπώματα Western διεξήχθησαν εις διπλούν.

ανοσοφθορισμού

Μετά την ανάλυση mRNA και η πρωτεΐνη, κλαουδίνης 7 α-κατενίνης και β-κατενίνης φάνηκε να έχουν παρόμοια επίπεδα έκφρασης σε φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη που έγινε μεταβληθεί σε κύτταρα που προέρχεται από ένα επιθετικό μεταστατικού όγκου. Ως εκ τούτου, ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε μόνο σε αυτά τα μόρια να εξακριβωθεί αν οι αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης ακολουθήθηκαν από ανώμαλη εντοπισμού. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα /ml σε αποστειρωμένο πλάκες μικροσκοπίου που περιέχεται σε αποστειρωμένες πλάκες καλλιέργειας ιστού quadriperm (Invitrogen, Paisley UK). Τα κύτταρα αφέθηκαν επί μία νύκτα να προσκολληθούν στα πλακίδια και αναπτύχθηκαν έως συρροής επί 5 ημέρες. Μόλις τα κύτταρα συρροής μέσα απομακρύνθηκαν, τα πλακίδια εκπλύθηκαν δύο φορές με αποστειρωμένο αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) (Invitrogen, Paisley UK) και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) (Sigma Aldrich, Dorset, UK) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. PFA απομακρύνθηκε με πλύσιμο των πλακών σε PBS /100 mM γλυκίνη (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 5 λεπτά τρεις φορές. Τα κύτταρα καθίστανται περατά σε 0.1% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά και πλύθηκαν σε PBS τρεις φορές. Για τη σβέση των αντιδραστικών ομάδων ακόλουθες PFA στερέωση, τα πλακίδια επωάστηκαν σε βοριοϋδρίδιο του νατρίου (Fisher Scientific, Leicestershire, UK) σε συγκέντρωση 1 mg /ml για 10 λεπτά. Αυτό πραγματοποιήθηκε τρεις φορές ακολουθούμενο από 5 λεπτών PBS πλύση πριν το κλείδωμα των διαφανειών σε 10% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) /PBS για 30 λεπτά. Το διάλυμα δέσμευσης απομακρύνθηκε με διεξαγωγή 3 χ 2 λεπτών πλύσεις σε PBS. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-κλαουδίνης 7 (1,100 σε 1% BSA /PBS), α-κατενίνης και β-κατενίνης (1:50 1% BSA /PBS). Τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Πρωτογενής αντίσωμα απομακρύνθηκε με 3 χ 5 λεπτά εκπλύσεις, που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα (1:100 σε 6% BSA /PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Δευτερεύοντα αντισώματα απομακρύνθηκαν με 3 χ 5 λεπτά σε PBS πριν πλακίδια πλύθηκαν με νερό (2 λεπτά) 70%, 85% και 95% αιθανόλη (2 λεπτά το καθένα). Τα πλακίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού AxioCam (Carl Zeiss Ltd, Hertfordshire, UK).

Οι αρνητικοί έλεγχοι (για να αποκλείσει αυτοφθορισμό) διεξήχθησαν με υποκατάσταση του πρωτεύοντος αντισώματος για 1% BSA /PBS.

η στατιστική ανάλυση

ανάλυση διεξάγεται χρησιμοποιώντας το παραμετρικό τεστ ANOVA. ανάλυση post hoc του Dunnett εκτελέστηκε για σύγκριση καρκινικών κυττάρων με τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ελέγχου ΡΝΤ2 και Tukey post hoc ανάλυση διεξήχθη για πολλαπλές συγκρίσεις ομάδας. Ένα

σ

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

ΣΗΜΕΙΩΣΗ:. Μόνο διαφορές στη γονιδιακή έκφραση και τα επίπεδα της πρωτεΐνης που ικανοποιούν τόσο το p-value και μια βιολογική πολλαπλή μεταβολή & lt? 1.5 & gt ? θα πρέπει να θεωρείται μια σημαντική αλλαγή.

Αποτελέσματα

Gene Expression Ανάλυση

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. 1) έδειξε occludin επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ όλων των ομάδων (

σ

& lt? 0.001). Μια σημαντική μείωση της occludin επιπέδων mRNA παρατηρήθηκε σε CAHPV-10 (-19,08 φορές,

σ

= 0,001), DU145 (-3,2 φορές,

σ

= 0,003) και PC-3 ( -4,3 φορές,

σ

= 0,003) κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (ΡΝΤ2). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση του mRNA occludin μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, ανεξάρτητα από επεμβατικές ικανότητας. Ωστόσο, τα επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά πάνω ρυθμίζονται (2,2 φορές,

σ

= 0,001) στα καρκινικά LNCaP κυττάρων σε σύγκριση με τα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (ΡΝΤ2).

Τα επίπεδα έκφρασης έχουν κανονικοποιηθεί προς το φυσιολογική κυτταρική σειρά προστάτη ΡΝΤ2 του οποίου το επίπεδο έκφρασης έχει οριστεί σε 1. * υποδηλώνει σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05) σε σύγκριση με ΡΝΤ2

η

Όσον αφορά την ΖΩ-1, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μεταγραφικό. επίπεδα μεταξύ φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη και οποιοδήποτε από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

γονιδιακή έκφραση κλαουδίνης 1 ήταν σημαντικά κάτω ρυθμίζονται σε όλα τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με το ΡΝΤ2. Σε CAHPV-10 και LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη, κλαουδίνης 1 κάτω ρυθμίζονται -10 φορές (

σ

= & lt? 0.001) και -100 φορές (

σ

= & lt? 0.001) αντίστοιχα . DU145 έδειξε -2.1 φορές κάτω ρύθμιση (

σ

= & lt? 0.001) και PC-3 έδειξαν φορές -3.8 (

σ

= & lt? 0.001). Μειωμένο επίπεδο έκφρασης

επίπεδα έκφρασης του γονιδίου 7 κλαουδίνης ήταν παρόμοια μεταξύ ΡΝΤ2 και CAHPV-10 (τιμή έκφρασης 1.1). Σε αντίθεση, κλαουδίνης 7 μεταγραφή ήταν σημαντικά μέχρι ρυθμίζεται σε LNCaP, (4,63 φορές,

σ

= & lt? 0.001), αλλά κάτω ρυθμίζονται DU145, (-5.3 φορές,

p = 0,004

) και PC-3, (-24,8 φορές,

σ

= 0,01) σε σύγκριση με ΡΝΤ2. Υπήρξε επίσης μια σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης όταν κλαουδίνης 7 επίπεδα mRNA συγκρίθηκαν μεταξύ CAHPV-10 και (DU145, (

σ

= 0,02) και PC-3 (

σ

= & lt ?.. 0.001)

η μεταγραφική επίπεδα για α- κατενίνης δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ ΡΝΤ2, CAHPV-10, (-1.1 φορές) ή LNCaP, (- 1 φορές) Μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω παρατηρήθηκε από -2,2 φορές σε DU145 και -33 φορές σε κύτταρα PC-3, (και τα δύο ρ = & lt? 0,0001). Όταν τα επίπεδα mRNA για CAHPV-10 συγκρίθηκαν με DU145 και PC-3, μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω σε έκφραση ανιχνεύθηκε (τόσο DU145 και PC-3

σ

= & lt?. 0.001)

β-κατενίνης γονιδιακή έκφραση ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε CAHPV-10 κύτταρα, (-3 φορές,

p

= 0,015) σε σύγκριση με ΡΝΤ2 ενώ μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση παρατηρήθηκε σε LNCaP, (3,8 φορές,

σ

= & lt? 0.001), DU145, (2,2 φορές,

σ

= 0.001 ) και PC-3, (2,1 φορές,

σ

= 0.001). Υπήρξε επίσης μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης όταν τα επίπεδα mRNA για CAHPV-10 συγκρίθηκαν με DU145 (

p

= 0.006) και PC-3 (

σ

= 0.001).

E-cadherin επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώθηκαν σημαντικά σε CAHPV-10 (-2.3 φορές,

p

= 0.004), DU145 (-5,6 φορές,

σ

= & lt? 0.001) και PC-3 (-7,25 φορές,

σ

= & lt? 0.001) σε σύγκριση με ΡΝΤ2. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Ε-καδερίνης μεταξύ των μη επεμβατικές και επεμβατικές κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Σε αντίθεση, τα κύτταρα LNCaP κατέδειξε και πάλι μια σημαντική αυξητική ρύθμιση της Ε-καδερίνης σε σύγκριση με ΡΝΤ2 (1,6 φορές,

σ

= 0.037).

Protein Expression Ανάλυση

κηλίδος Western και πυκνότητας πραγματοποιήθηκαν (Εικ. 2) να διαπιστωθεί εάν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν συγκρίσιμη με το επίπεδο της πρωτεΐνης (Πίνακας 2). Τα επίπεδα πρωτεΐνης για occludin ήταν κάτω ρυθμίζονται στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη CAHPV-10 (-2,8 φορές), DU145 (-1,6 φορές) και PC-3 (-9.3 φορές) αλλά πάνω ρυθμισμένα σε LNCaP (2,4 φορές) σε σύγκριση με ΡΝΤ2. Ωστόσο, λόγω της υψηλής διακύμανσης μεταξύ αντιγράφων (τα δεδομένα δεν φαίνονται), δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ καθεμίας των κυττάρων του προστάτη.

β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Κηλίδες Western διεξήχθησαν εις διπλούν και ζώνες είναι αντιπροσωπευτικές των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται.

Η

επίπεδα πρωτεΐνης για ΖΟ-1 δεν έδειξε σημαντική διαφορετική μεταξύ οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές (CAHPV-10 1,1 φορές, LNCaP 3,6 φορές, DU145, 2,5 φορές και PC-3 -1.1 φορές).

σε σύγκριση με ΡΝΤ2, τα επίπεδα κλαουδίνης 1 μειώθηκαν σε όλα τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. CAHPV-10 προς τα κάτω ρύθμιση -2.1 φορές, DU145 -2,3 φορές και PC-3 -1.8 φορές. LNCaP ήταν η μόνη κυτταρική σειρά για να δείξει μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω σε σύγκριση με ΡΝΤ2 (-9,3 φορές,

σ

= 0.04).

κλαουδίνης 7 επίπεδα πρωτεΐνης έδειξε καμία διαφορά μεταξύ CAHPV-10 ( 1.2 φορές) και ΡΝΤ2 αλλά τα επίπεδα ήταν σημαντικά κάτω ρυθμίζονται σε LNCaP (-1.1 φορές), DU145 (-1.1 φορές) και PC-3 (-1.5 φορές). Όλοι είχαν ένα

σ

= αξία των & lt? 0,01. Ωστόσο, LNCaP και DU145 δεν πληρούσε τη βιολογική φορές αλλαγή και, ως εκ τούτου, δεν ελήφθησαν αυτές οι αλλαγές υπόψη. Επιπλέον, όταν κλαουδίνης 7 επίπεδα πρωτεΐνης για CAHPV-10 συγκρίθηκαν με PC-3, μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω επίσης τεκμηριωθεί (

σ

= & lt? 0,01)

Όσον αφορά. α- επίπεδα πρωτεΐνης κατενίνης, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ CAHPV-10 και ΡΝΤ2, ενώ για LNCaP (4,4 φορές,

σ

= 0.03), DU145 (-2 φορές

σ

= 0.04 ) τα επίπεδα α-κατενίνης ήταν σημαντικά κάτω ρυθμίζεται από διάφορους βαθμούς σε σύγκριση με ΡΝΤ2. Για, PC-3 σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω σε α – παρατηρήθηκε κατενίνης επίπεδα πρωτεΐνης, έτσι ώστε μια πρωτεϊνική ζώνη δεν ήταν ανιχνεύσιμη και μια τιμή πυκνομετρία δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί. Επιπλέον, CAHPV-10 επίπεδα πρωτεΐνης ήταν επίσης σημαντικά διαφορετική από LNCaP (

σ

= 0,03) και DU145 (

σ

= 0.04).

Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά σε επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης μεταξύ CAHPV-10 (1,1), LNCaP (2 φορές), DU145 (1,4 φορές) ή PC-3 (1,5 φορές) και ΡΝΤ2, έτσι ακόμη κι αν το PC-3 εμφάνισαν τη βιολογική αλλαγή φορές, το αποτέλεσμα δεν ελήφθη υπόψη

Για τα επίπεδα της πρωτεΐνης E-cadherin μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω ήταν εμφανής σε CAHPV-10 (-1,7 φορές,

σ

= & lt? 0,01). και DU145 (-1.5 φορές,

σ

= & lt? 0,01). Και πάλι, δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω σε PC-3, έτσι ώστε μια πρωτεϊνική ζώνη δεν ήταν ανιχνεύσιμη και μια τιμή πυκνομετρία. Στα κύτταρα LNCaP E-cadherin ήταν μέχρι ρυθμίζονται σε επίπεδο πρωτεΐνης (2,7 φορές

σ

= 0,01).

ανοσοφθορισμού

Για να καθοριστεί αν οι πρωτεΐνες AJ και TJ ήταν παρόντες στην σωστή υποκυτταρικών θέση τους (κυτταρική μεμβράνη), ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε.

ανοσοφθορισμού (Εικ. 3) για κλαουδίνης 7 έδειξαν ισχυρή χρώση στην κυτταρική μεμβράνη για ΡΝΤ2, CAHPV-10 και LNCaP. Τόσο για DU145 και PC-3, φθορίζουσα χρώση ήταν μειωμένη. Η χρώση ήταν σημαντικά μειωμένη τόσο στην DU145 και PC-3 κυττάρων με χρώση εμφανής τόσο στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτόπλασμα. Χρώση για α- κατενίνης έδειξαν ισχυρή ειδική χρώση στην κυτταρική μεμβράνη για ΡΝΤ2, CAHPV-10 και LNCaP κύτταρα, ενώ για DU145 και PC-3 ένταση σήματος ήταν σημαντικά μειωμένη και μη ειδικά. Όσον αφορά σε β-κατενίνης χρώση φθορισμού, ΡΝΤ2, CAHPV-10 και DU145 εμφάνισαν ειδική χρώση στην κυτταρική μεμβράνη. ένταση β-κατενίνης σε LNCaP και PC-3 κύτταρα ήταν ισχυρή στην κυτταρική μεμβράνη και σε θέσεις επαφής μεταξύ κυττάρων, αλλά σε χρώση PC-3 ήταν επίσης εμφανής στο κυτταρόπλασμα.

Για κύτταρα LNCaP, πρωτεΐνη εντόπισης εμφανίζεται στην κυτταρική μεμβράνη και ένταση χρώσης φαίνεται παρόμοιο με ΡΝΤ2 (με την εξαίρεση των β-κατενίνης, η οποία φαίνεται να έχει μια υψηλότερη έκφραση). Σε κύτταρα DU145, η έκφραση για όλες τις πρωτεΐνες είναι μειωμένη και ο εντοπισμός είναι διάχυτη και κυτταροπλασματική. Για κύτταρα PC-3, 7 και κλαουδίνης α- κατενίνης φθορισμός μειώνεται σημαντικά ή /και κυτταροπλασματικής σε διανομή, ενώ ο φθορισμός β-κατενίνης είναι ισχυρότερη, αλλά και κυτταροπλασματική στον εντοπισμό του.

Η

Συζήτηση

το πρώτο βήμα στο μεταστατικό καταρράκτη είναι η απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, προκειμένου για τα κύτταρα να ξεφύγει από τον πρωτογενή όγκο. Έτσι, AJs ήταν μια σημαντική εστίαση των μελετών του καρκίνου και τώρα TJ συστατικά είναι επίσης να αναγνωριστεί για τη συμμετοχή τους. έχουν μεταβολές στις βασικές συνιστώσες AJ και TJ όπως α-κατενίνης, Ε-καδερίνης, β-κατενίνης και κλαουδίνης 1 αναγνωριστεί ως δυνητικός βιοδείκτες για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [18], [22], [23], [24], αλλά η πλειοψηφία των ερευνητικών έχει πραγματοποιηθεί σε μεμονωμένα μόρια. Ο καρκίνος είναι ετερογενής από τη φύση, έτσι υπάρχει ανάγκη για ένα πάνελ βιοδεικτών, σε αντίθεση με απλά μόρια, για να βοηθήσει στον καθορισμό της εξέλιξης του καρκίνου και στην περίπτωση του καρκίνου του προστάτη, καρκίνος διακρίνουν αδρανείς από την επιθετική μεταστατική νόσο. Ως αποτέλεσμα, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει την έκφραση αρκετών καλά γνωστές TJ και AJ συστατικά, συλλογικά, ως ένα σημαντικό πρώτο βήμα για την ταυτοποίηση ενός πάνελ θεωρούμενων βιοδεικτών που μπορούν να βοηθήσουν στη διάκριση αδρανείς καρκίνου του προστάτη από την επιθετική μεταστατική νόσο. Επτά υποθετική βιοδείκτες επιλέχθηκαν λόγω παρεκκλίνουσα έκφραση τους, οι οποίες έχουν τεκμηριωθεί στην επιστημονική βιβλιογραφία και διερευνήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες ασθενών με επίκεντρο [17], [18], [20], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Τα 7 πρωτεΐνες AJ και TJ επιλεγέντα Ε-καδερίνης, α- και β- κατενίνης, ΖΟ-1, occludin, κλαουδίνης 1 και κλαουδίνης 7 και η έκφραση τους ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

μοντέλο της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη . Από το 7, εμείς τονίζεται 3 (κλαουδίνης 7, α- και β- κατενίνης) των οποίων mRNA, τα επίπεδα της πρωτεΐνης και /ή εντοπισμού είναι παρόμοια σε κύτταρα που προέρχονται τόσο από την κανονική και όργανο-περιορισμένο καρκίνο του προστάτη, αλλά τα επίπεδα τους και /ή εντοπισμό όλων μεταβάλλουν σε κύτταρα που προέρχονται από την επιθετική μεταστατικών όγκων. Κλαουδίνης 7 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε μη διηθητικού καρκίνου του προστάτη κύτταρα (CAHPV-10) ήταν παρόμοια με εκείνα που βρέθηκαν σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά κάτω ρυθμίζονται με τον πιο επιθετικό μεταστατική κυτταρική γραμμή PC-3 σε σύγκριση με CAHPV-10. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζονται από Sheehan et al, οι οποίοι έδειξαν μια μείωση στην κλαουδίνης 7 έκφραση συσχετίζεται με όγκους του προστάτη υψηλής ποιότητας [19]. Ως εκ τούτου, κλαουδίνης 7 επίπεδα πρωτεΐνης μπορεί να είναι μια αντανάκλαση της επιθετικότητας αυτών των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και μπορεί να τροποποιηθεί μόνο στην πιο επιθετική μορφή της νόσου. Επιπλέον, περαιτέρω ανάλυση με ανοσοφθορισμό αποκάλυψε ότι κλαουδίνης 7 εντοπισμός στα κύτταρα PC-3 ήταν κυτταροπλασματική καθώς και δεσμευμένη σε μεμβράνη. Η ανώμαλη εντοπισμός του κλαουδίνης 7 στο κυτταρόπλασμα έχει δειχθεί ότι συμβαίνουν σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [28] και του οισοφάγου ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα [2]. Αυτή η ανακατανομή των Claudins έχουν αποδοθεί σε διάφορους μηχανισμό συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών κάτω ρύθμιση με αποτέλεσμα κυτταροπλασματική εσωτερίκευσης [2]. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, μπορεί να υποτεθεί ότι κλαουδίνης 7 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός υποψήφιος για τη διάκριση νωχελικός καρκίνους από τις πιο επιθετικές μορφές μεταστατικό, η οποία απαιτεί την επικύρωση σε δείγματα ασθενών.

Σε συνδυασμό με κλαουδίνης 7, α-κατενίνης επίπεδα σε μη επεμβατικές καρκίνου του προστάτη κύτταρα ήταν παρόμοια με τα επίπεδα σε προστάτη επιθηλιακά κύτταρα, αλλά όπως κλαουδίνης 7, μειώθηκε σημαντικά στις πιο επιθετικές μεταστατικά κύτταρα. Μια σημαντική σχέση μεταξύ της μείωσης της έκφρασης α-κατενίνης και υψηλή βαθμολογία Gleason έχει αναφερθεί σε όγκους του προστάτη [24]. Παρομοίως, α-κατενίνης έχει αναφερθεί να είναι παρόντες σε όγκους του προστάτη με ένα χαμηλό Gleason βαθμού [17]. Έχει προταθεί, ως εκ τούτου, ότι η απώλεια του α-κατενίνης οδηγεί στην απώλεια της λειτουργίας του e-cadherin που οδηγεί σε μια χειρότερη πρόγνωση [18], ενώ, κορεσμός του α-κατενίνης σε α-κατενίνης null καρκινικά κύτταρα του προστάτη έχει αναφερθεί αυξήσει προσφύσεων σχηματισμός διασταύρωση και μειωμένη μεταγραφική δραστικότητα του β-κατενίνης, η κυκλίνη D1 επίπεδα και κυτταρικός πολλαπλασιασμός [26].

προς β-κατενίνης επίπεδα πρωτεΐνης mRNA και ανοσοφθορισμού ένταση χρώσης του CAHPV-10 κύτταρα ήταν παρόμοια με φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα και έχει ενδιαφέρον, ανοσοφθορισμό αποκάλυψε β-κατενίνης σε κύτταρα PC-3 να είναι τόσο μεμβράνη και κυτταροπλασματική. β-κατενίνης εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, ως αποτέλεσμα της προσφύσεως διασταύρωση συγκρότημα κατανομή και στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου ασκεί μεταγραφική δράση [29]. Αυτό παρεκκλίνουσα εντοπισμός στο κυτταρόπλασμα έχει αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στην θυρεοειδή carciongenesis [30] και να συνδέεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [31]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μπορεί να είναι σκόπιμο να εξετάσουμε κυτταροπλασματική εντόπιση της β-κατενίνης, σε αντίθεση με την ποσοτική εκτίμηση είναι τα επίπεδα mRNA ή πρωτεΐνης, ως υποθετικό βιοδείκτη της επιθετικής νόσου.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το mRNA και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά LNCaP σπάνια ακολούθησε την ίδια τάση όπως DU145 και PC-3. Αυτή η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης θα μπορούσαν να εξηγηθούν από την μεταστατικό δυναμικό και τη διαφοροποίηση κατάσταση της κυτταρικής γραμμής. LNCaP έχει τεκμηριωθεί ότι έχει περιορισμένη μεταστατικό δυναμικό και παραμένει καλά διαφοροποιημένο όταν εισαχθούν σε μοντέλα ποντικών [32]. Έτσι, μπορεί να υποτεθεί ότι μετά μετάσταση στους λεμφαδένες, αυτή η κυτταρική σειρά έχει επιστραφεί σε μια πιο επιθηλιακό μορφή, ως αποτέλεσμα της αποικισμού [33] και την ανάπτυξη. Επιπλέον, υπήρχαν και κάποιες διαφορές μεταξύ mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης για κλαουδίνης 7 και occludin σε LNCaP, και β-κατενίνης σε CAHPV -10 και DU145 και α-κατενίνης σε CAHPV-10 και LNCaP. Όπως μεταφράζεται mRNA σε πρωτεΐνη μπορεί να θεωρηθεί ότι πρέπει να υπάρχει μια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης. Ωστόσο, οι μελέτες που έχουν ερευνήσει μία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης έχουν αναφερθεί ελάχιστες ή περιορισμένη συσχετίσεις [34]. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που ανιχνεύεται μπορεί πιθανόν να επηρεαστούν από τη μετάφραση και μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις παρέχουν μια δευτερεύουσα βαθμό ελέγχου έκφρασης που θα μπορούσαν να ευθύνονται για τις διαφορές αυτές.

Συμπέρασμα

Λόγω της ετερογενούς φύσης του καρκίνου , η ανάλυση των μεμονωμένων μορίων παρέχει περιορισμένες πληροφορίες και είναι αδύνατο να διαγνώσει τον καρκίνο ή την πρόβλεψη της εξέλιξης της νόσου, χρησιμοποιώντας ένα μόνο βιοδείκτη. Οι 7 βιοδείκτες που αναλύθηκαν εδώ, έχουν αναφερθεί ότι εκφράζεται με παρεκκλίνοντα σε δείγματα καρκίνου του προστάτη, αλλά ιστού κυρίως σε ατομική βάση. Ωστόσο, μας

in vitro

έρευνα έδειξε, ότι εκτός από αυτά τα 7 μόνο 3 (κλαουδίνης 7, α-κατενίνης και της β-κατενίνης) μπορούν συλλογικά να χρησιμοποιηθεί για να διακρίνει εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη από τα κύτταρα που εκπροσωπούν επιθετική μεταστατική νόσο. Πιστεύουμε ότι αυτή η

in vitro

εντοπισμό των αλλαγών σε πολλά βασικά γονίδια σε συνδυασμό τονίζει τη σημασία της αξιοποίησης πολλών μοριακών δεικτών και αποτελεί ένα σημαντικό πρώτο βήμα για τον εντοπισμό ενός πίνακα των θεωρούμενων βιοδεικτών που μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση αδρανής καρκίνο του προστάτη από επιθετική μεταστατική νόσο. Μια μελέτη IHC μεγάλος ασθενής χρειάζεται τώρα να επικυρώσει τα αποτελέσματα αυτά.