Αφηρημένο

Μια ισορροπημένη αριθμό χρωμοσωμάτων (ανευπλοειδία) είναι παρούσα σε περισσότερες κακοήθεις όγκους και έχει αποδοθεί σε μιτωτικά mis-διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει μια σχετικά υψηλό ποσοστό των χρωμοσωμικών mis-διαχωρισμού επίσης σε μη νεοπλασματικά ανθρώπινα κύτταρα, ενώ η συχνότητα των κυττάρων ανευπλοειδικών παραμένει χαμηλό σε όλη τη ζωή στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς. Αυτό συνεπάγεται ότι πρόσφατα σχηματισμένο ανευπλοειδικών κύτταρα υπόκεινται σε αρνητική επιλογή σε υγιείς ιστούς και ότι η εξασθένηση αυτής της επιλογής θα μπορούσε να συμβάλει στην ανευπλοειδία στον καρκίνο. Για να δοκιμάσετε αυτό, διαμόρφωσε την κυτταρική ανάπτυξη ως διακριτές διαδικασίες φορά διακλάδωση, κατά το οποίο παρήχθησαν τα κέρδη και τις ζημίες των χρωμοσωμάτων και κύτταρα-ξενιστές τους υπόκεινται σε πιέσεις επιλογή των διαφόρων μεγεθών. Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν πειραματικά τη συχνότητα των χρωμοσωμικών mis-διαχωρισμού καθώς και η επικράτηση των ανευπλοειδικών κυττάρων σε ανθρώπινο μη νεοπλασματικά κύτταρα και στα καρκινικά κύτταρα. Η ενσωμάτωση αυτών των δεδομένων σε μοντέλα μας επέτρεψε εκτίμηση της μείωσης γυμναστικής που προκύπτει από μια μόνο αλλαγή αριθμού αντιγράφων του χρωμοσώματος σε έναν μέσο όρο ≈30% σε φυσιολογικά κύτταρα. Σε σύγκριση, τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν μέση μείωση καταλληλότητα του μόνο το 6% (ρ = 0,0008), ενδεικτικό της ανευπλοειδίας ανοχής. Προσομοιώσεις με βάση τη συνδυασμένη παρουσία των χρωμοσωμικών mis-διαχωρισμού και ανευπλοειδισμών ανοχή αναπαραχθεί διανομές χρωμοσωμικές εκτροπές σε

για τις γνώσεις μας, λίγα, εάν υπάρχουν πειράματα που έχουν ασχοληθεί με αυτά τα ζητήματα χρησιμοποιώντας πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα με συγκρίσεις σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Ένας λόγος για αυτό είναι ότι είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθούν ταυτόχρονα χρωμοσωμική αστάθεια, ανευπλοειδία και κυτταρικό πολλαπλασιασμό παραμέτρους σε αναπτυσσόμενα ανθρώπινα κύτταρα. Μια εναλλακτική προσέγγιση είναι να αξιολογήσει προσεκτικά τα ποσοστά του χρωμοσωμικού mis-διαχωρισμού, καθώς και την ακριβή επιπολασμός της ανευπλοειδικών κυττάρων τόσο του καρκίνου και κανονικούς πληθυσμούς κυττάρων, που ακολουθείται από ενσωμάτωση αυτών των δεδομένων σε ένα ισχυρό υπολογιστικό μοντέλο της εξέλιξης σε κυτταρικό επίπεδο. Χρησιμοποιώντας μια τέτοια υπολογιστική προσέγγιση, ερευνήσαμε αν τα καρκινικά κύτταρα έχουν μεγαλύτερη ανοχή σε νέες αλλοιώσεις σε ολόκληρο το χρωμόσωμα σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά κύτταρα και σε ποιο βαθμό μια τέτοια μειωμένη ανοχή θα μπορούσε να εξηγήσει την γενική τάση των μεταβολών χρωμοσωμάτων σε νεοπλασία.

Αποτελέσματα

Κατασκευάζοντας Αλγόριθμοι για την εκτίμηση των επιπτώσεων των Aneuploidy για κυτταρικού πολλαπλασιασμού επιβίωσης

ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να εκτιμήσει τις συνέπειες της ανευπλοειδίας σε μακροχρόνια κυτταρική επιβίωση σε ένα ανθρώπινο σύστημα, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Για να επιτευχθεί αυτό, κατασκευάσαμε έναν αλγόριθμο που προσομοιώνεται την ανάπτυξη ενός πολυ-κυτταρικού πληθυσμού από ένα μόνο κύτταρο ως ένα διακριτό χρόνο διαδικασία διαδοχικών μιτώσεων διακλάδωσης, το καθένα με μια σταθερή πιθανότητα σφάλματος χρωμοσώματος διαχωρισμού (Σχήματα 1 και 2). Ο κύριος αλγόριθμος υλοποιείται ως λογισμικό Χείρωνα (Σχήμα S1? Πρωτόκολλο S1? Λογισμικό S1 και S2), όπου οι ακόλουθες παράμετροι θα μπορούσε να οριστεί αυθαίρετα: (1) τη συχνότητα των σφαλμάτων ολόκληρο το χρωμόσωμα του διαχωρισμού ανά χρωμόσωμα ανά μίτωση? (2) ο αντίκτυπος στην πολλαπλασιαστική επιβίωση οποιασδήποτε αυτοσωματικό ολόκληρη χρωμοσωμικών εκτροπών (μονοσωμία, τρισωμία, τετρασωμίας κ.λπ.), εκτός από την nullisomy (0 αντίγραφα ενός αυτοσωμικό). Πλήρης αυτοσωματικό nullisomy ήταν πάντα θεωρείται θανατηφόρος, επειδή αυτός ο τύπος της εκτροπής παρατηρείται πολύ σπάνια σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Οι αρνητικές συνέπειες της ανευπλοειδίας είχαν καθοριστεί από την παράμετρο επιλογής 0 ≤

s

≤ 1, σε σχέση με το μέσο όρο της πολλαπλασιαστικής επιβίωση των κανονικών διπλοειδών κυττάρων. Εάν

s =

0 για μια συγκεκριμένη ανωμαλία χρωμοσωμάτων, τότε η πολλαπλασιαστική επιβίωση ενός κυττάρου που φέρουν αυτό το εκτροπή (

δηλαδή

είναι aneusomic) θα είναι ίση με αυτή των γύρω διπλοειδή κύτταρα, προσομοίωση ως μια ίση πιθανότητα να υποβάλλονται σε μια άλλη μίτωσης. Εάν

s =

1, υπονοώντας μέγιστη αρνητική επιλογή, η ανευπλοειδές κύτταρο θα πρέπει να αποκλείονται από όλες τις μελλοντικές γενιές μιτωτική. Οι τιμές των

s

κάτω από το 1 αλλά μεγαλύτερη από 0 συνεπάγεται μια σχετική μείωση του πολλαπλασιασμού επιβίωσης. Για παράδειγμα,

s

= 0.4 ισούται πιθανότητα 40% μόνιμα την έξοδο από την μιτωτική κύκλο πριν από την επόμενη κυτταρική διαίρεση, δεδομένου ότι η πιθανότητα μιας άλλης μίτωσης για διπλοειδή κύτταρα είναι 100%,

δηλαδή

μια μείωση κατά 60% του πολλαπλασιασμού επιβίωσης.

με βάση την προηγούμενη πειραματικά δεδομένα [6] mis-διαχωρισμού προσομοιώθηκε όπως προκύπτει από την αδελφή-χρωματιδικές μη διάζευξη με αποτέλεσμα ένα monosomic και ένα τρισωμικών κόρη κυττάρων (άνω τμήμα) και χρωματιδίων μείνει με αποτέλεσμα μονοσωμία σε μία κόρη πυρήνα (κάτω πίνακας). Κάθε ένα από αυτά τα γεγονότα ήταν περίπου ίση με τη συχνότητα, σε όλα με αποτέλεσμα σε ένα μέσο όρο 75% ανευπλοειδικών θυγατρικά κύτταρα (κόκκινο και πράσινο φόντο) ανά mis-διαχωρισμού εκδήλωση.

Η

Aneuploidy παράγεται σε ένα συγκεκριμένο ποσοστό (

σ

) της μιτωτικής mis-διαχωρισμός, όπου τρισωμικών (κόκκινοι κύκλοι) και monosomic κύτταρα (πράσινοι κύκλοι) έχουν ορισμένες πιθανότητες έχουν (

s

t και

s

m, αντίστοιχα) των μόνιμων πολλαπλασιαστικών σύλληψης /death (μαύρες οριζόντιες γραμμές) σε κάθε μιτωτική κύκλο. Δύο ή περισσότερα aneusomies θα οδηγήσει σε αύξηση των πιθανοτήτων σύλληψης /θανάτου όπως αποδεικνύεται από τα κύτταρα επισημαίνονται ++ και + -.

Η

Για να παρακολουθεί τις εγγενείς ιδιότητες αυτού του μοντέλου, που παρουσιάστηκε για πρώτη φορά προσομοιώσεις με το ποσοστό της μιτωτική σφάλματα διαχωρισμός στερεωμένο στην τάξη μεγέθους που βρέθηκαν σε μη νεοπλασματικά ανθρώπινα κύτταρα. Σε μια προηγούμενη μελέτη [6], που ανέφεραν ποσοστό μέση λανθασμένη διαχωρισμός των 4 × 10

-4 /χρωμόσωμα /μίτωση (εύρος 3.3 έως 4.1 × 10

-4) σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα ινοβλαστών χαμηλής διόδου , με σχέση 2:01 μεταξύ συμμετρικών μη αποσύνδεση του χρωματίδες και χρωματίδων υστερούν (Σχήμα 1). Αυτό το ποσοστό λανθασμένη διαχωρισμός ήταν παρόμοια σε μέγεθος με προηγουμένως αναφερθέντα ποσοστά για μη νεοπλασματικών αθανατοποιημένες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, που προέρχονται από εμβρυϊκά ή μεταγεννητική ινοβλάστες και /ή τα επιθήλια [4], [13], [14]. Χρησιμοποιώντας ένα σταθερό ρυθμό λανθασμένη διαχωρισμός των 4 × 10

-4 /χρωμόσωμα /μίτωση, η επικράτηση των aneusomic κυττάρων μελετήθηκε ως συνάρτηση των διαφορετικών βαθμών αρνητικής επιλογής έναντι ανευσωμίας για οποιοδήποτε χρωμόσωμα σε ένα πληθυσμό κυττάρων επεκτάθηκαν για 500 γενιές . Όπως ήταν αναμενόμενο, η επικράτηση των κυττάρων με ανευσωμίας ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το βαθμό της αρνητικής επιλογής. Μετά από περίπου 25 γενιές προσομοιώσεις με το

s

≥ 10% φτάσει σε ένα οροπέδιο, υποδεικνύοντας ότι μια κατάσταση δυναμικής ισορροπίας είχε επιτευχθεί μεταξύ της παραγωγής aneusomic κυττάρων και την αποβολή τους από την αρνητική επιλογή (Εικόνα 3Α). Επειδή 25 μετα-ζυγωτικά γενιές θα δημιουργήσει ένα μέγιστο 3,36 × 10

7 κύτταρα (χωρίς να υπολογίζονται κυτταρικό θάνατο και το σχηματισμό των εξω-εμβρυονικών ιστών), με τη σειρά του αντιστοιχεί σε ένα στερεάς βιομάζας στην κλίμακα από 18 έως 140 μί μόνο ( υποθέτοντας μια περιοχή διαμέτρου κυττάρου 10-100 μm), η δυναμική ισορροπία μπορεί να υποτεθεί ότι έχουν παρουσιάσει καλά πριν από τη γέννηση για τα επίπεδα επιλογή ≥ 10%. Ως εκ τούτου, για ένα σωματικό κύτταρο γενεαλογίας με ένα αρκετά σταθερό επίπεδο χρωμοσώματος mis-διαχωρισμό, τη συχνότητα των aneusomic κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση του βαθμού ανευσωμίας εξαρτώμενη αρνητική επιλογή για ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα, εκτός εάν αυτό τιμή επιλογής είναι πολύ μικρή (Εικόνα 3Β ).

(Α) Χείρωνα που βασίζεται προσομοίωσης (20 παράλληλες διαδρομές) ενός αυξανόμενου πληθυσμού κυττάρων με ποσοστό mis-διαχωρισμού των 4 × 10

-4 όπου διαφορετικούς βαθμούς επιλογής (

s

) κατά τα ανευπλοειδικών κύτταρα που επιβάλλονται. Οι προκύπτουσες μέσες τιμές επιπολασμού των κυττάρων aneusomic (μη disomic) για ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα δίνονται ως δείκτες ανευσωμίας (ΑΙ) στον γ-άξονα. AI μειώνεται με υψηλότερες

s

αξίες και φτάνει μια δυναμική ισορροπία περίπου 25 γενιές, ακόμη και σε τιμές επιλογή τόσο χαμηλά όσο το 10%. (Β) Σχέση της μέσης AI για ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα και αρνητική επιλογή που ενεργούν στα κύτταρα με ανευσωμίας για αυτό το χρωμόσωμα. Κόκκινο γραμμές αντιστοιχούν σε εκτιμήσεις του επιλογή που γίνεται από τα πειραματικά δεδομένα για τα χρωμοσώματα 1 και 17 στην F1 και F2. Οι ράβδοι σφάλματος αντιστοιχούν σε τυπικές αποκλίσεις σε 20 προσομοιώσεις. (Γ) φθορισμού

in situ υβριδισμού

(FISH) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση AI σε ανθρώπινους φυσιολογικούς ινοβλάστες, παραδειγματικά με F1 κύτταρα disomic (2Ν) και τρισωμικών (3η) για το χρωμόσωμα 17 (κόκκινο, σήμα ανιχνευτή βραχίονα q? μπλε, κεντρομερική σήμα). (Δ) Η επικράτηση των monosomic και τρισωμικών κύτταρα καθώς και τη συνολική AI εκτιμάται από FISH στις δύο γραμμές ινοβλαστών F1 και F2. (Ε) Chiron με βάση εκτιμήσεις του βαθμού αρνητικής επιλογής που ενεργούν επί κυττάρων aneusomic για χρωμοσώματα 2 και 17 στην F1 και F2, συνάγεται από τη σύγκριση FISH-δεδομένων (AI) με μοντελοποίηση AI ως συνάρτηση του

s

(Εικόνα 3Β). Οι max και min τιμές αντιστοιχούν στο ± 2 τυπικές αποκλίσεις.

Η

Η εκτίμηση Aneuploidy Επίπεδα και Aneuploidy Ανοχή στα φυσιολογικά κύτταρα

Για να εκτιμηθεί ο βαθμός της μειωμένης φυσικής κατάστασης που προκύπτει από αυτοσωματικό ανευσωμίας στην κανονική θέση -natal ανθρώπινα κύτταρα με πιθανοτικές μοντελοποίησης, τότε να προσδιοριστεί ο επιπολασμός της aneusomic κυττάρων σε πληθυσμούς ινοβλαστών από δύο εφηβεία άτομα (F1 και F2) όπου τα ποσοστά mis-διαχωρισμού είχε προηγουμένως εκτιμηθεί [6]. Προγενέστερες μελέτες ανευπλοειδίας επιπολασμού σε ανθρώπινα κύτταρα από υγιείς ιστούς έδειξαν πολύ διαφορετικά αποτελέσματα, ακόμη και μέσα στο ίδιο κυτταρικό τύπο [15] – [19]. Οι διακυμάνσεις αυτές θα μπορούσαν σε κάποιο βαθμό να αποδοθεί στη σχετικά υψηλό υπόβαθρο των ψευδώς θετικών για το είδος της ανάλυσης που χρησιμοποιείται (φθορισμού in situ υβριδισμού, FISH), όταν χρησιμοποιείται ένα μόνο καθετήρα να αξιολογήσει ένα χρωμόσωμα του οποίου ανευσωμίας είναι παρούσα μόνο σε ένα μικρό αριθμό των κυττάρων. Για να διαχωριστεί το πιθανώς χαμηλό επίπεδο ανευσωμίας σε φυσιολογικά κύτταρα από το φόντο που προκαλείται από μη ειδική υβριδοποίηση, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικά επισημασμένων ανιχνευτών FISH για κάθε χρωμόσωμα διερευνηθεί σε F1 και F2, με στόχο την κεντρομερίδιο και ένα βραχίονα χρωμόσωμα, αντίστοιχα. Αυτή η προσέγγιση επέτρεψε όχι μόνο την αναγνώριση των εσφαλμένων θετικών λόγω διασταυρούμενης υβριδοποίησης ενός μόνο ανιχνευτή, αλλά επίσης αφαίρεση των βασικών επιπέδων που προκύπτει από λανθασμένη υβριδισμό δύο διαφορετικά επισημασμένων ανιχνευτών (διπλό false positives? Εικόνα S2). Για τον έλεγχο για πιθανές διαφορές στην επίπτωση μεταξύ aneusomies για χρωμοσώματα με διαφορετικό μέγεθος και το περιεχόμενο γονίδιο [15], επιλέξαμε χρωμοσώματα 2 (≈243 Mb? 10.496 ευθυγραμμίσεις απομαγνητοφώνηση) και 17 (≈81 Mb? 6330 ευθυγραμμίσεις μεταγραφή) ως χρωμοσώματα δείκτης για την αξιολόγηση από μεσόφαση FISH (Σχήμα 2C).

η εκτίμηση του επιπολασμού των κυττάρων aneusomic για τα χρωμοσώματα 2 και 17 στην F1 και F2 με την προσέγγιση αυτή οδήγησε σε μια μέση επικράτηση της aneusomic κύτταρα του 1,5 × 10

-3 ανά χρωμόσωμα ζευγάρι μετά την αφαίρεση του υποβάθρου (Σχήμα 2D). Αυτό αντιστοιχούσε σε μια επικράτηση της ανευπλοειδικών κυττάρων περίπου 3%, όταν επεκταθούν σε όλα τα χρωμοσώματα (= ζεύγη 23 χρωμοσωμάτων). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην επικράτηση ανευσωμίας μεταξύ των πληθυσμών των ινοβλαστών ή μεταξύ των δύο χρωμοσωμάτων δείκτη. Οι aneusomies παρατηρήθηκαν περιορίστηκαν σε μονοσωμίες και τρισωμίες, όπου οι πρώτες ήταν τουλάχιστον δύο φορές πιο συχνή από την τελευταία. Αυτό ήταν σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες [6] δείχνοντας ότι μιτωτικών mis-διαχωρισμού στα φυσιολογικά κύτταρα αποτελούνται κυρίως από αδελφών χρωματίδων μη διάζευξη (3-1 διαχωρισμός) και χρωματίδων υστερούν (2-1 διαχωρισμός), συνολικά με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός σχετικά υψηλότερο ποσοστό των μονοσωμίες από τρισωμίες σε μια κατά προσέγγιση αναλογία 2:01. Η διττή προσέγγιση χρώμα FISH οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερες εκτιμήσεις επικράτησης της ανευσωμίας από προηγούμενες μελέτες FISH single-ανιχνευτή, που δείχνει τα ποσοστά ανευσωμίας 1-20% ανά ζεύγος χρωμοσωμάτων [16] – [19], υποδεικνύοντας ότι η προσέγγισή μας μείωσε το ποσοστό των ψευδών θετικά. Οι εκτιμήσεις μας ήταν της ίδιας τάξης μεγέθους με τις πρώτες μελέτες που εκτελούνται από το χρωμόσωμα banding σε λεμφοκύτταρα και αμνιοκύτταρα [20]. Για να επικυρώσετε την περαιτέρω προσέγγισή μας πραγματοποιήσαμε κυτταρογενετική ανάλυση σε πολλαπλές πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων ινοβλαστών συμπεριλαμβανομένων των F1 και F2 (Πίνακες S1 και S2), όλα δείχνουν μια επικράτηση ανευσωμίας περίπου 1 × 10

-3. Σε αντίθεση, οι εκτιμήσεις μονού ανιχνευτή του επιπολασμού της aneusomic κυττάρων σε F1 και F2 ήταν κατά μέσο όρο εννέα φορές υψηλότερη. Στο σύνολό τους, διαπιστώνουμε ότι οι περισσότερες προηγούμενες μελέτες έχουν παράσχει υπερεκτιμήσεις του επιπολασμού της ανευπλοειδίας σε μη νεοπλασματικά ανθρώπινα κύτταρα, ενώ μια διπλή προσέγγιση χρώμα παρείχε μια πιο ουσιαστική αξιολόγηση.

Ο επιπολασμός της aneusomies στην F1 και F2 ήταν τότε σε σύγκριση με Chiron δημιουργείται δεδομένων για να συναγάγει το βαθμό της εκγύμνασης μείωσης /αρνητική επιλογή για monosomic και τρισωμικών κυττάρων σε σύγκριση με διπλοειδή κύτταρα (Σχήμα 3Β). Προσομοίωση μονοκλωνικό επέκτασης με ένα κανονικό ρυθμό mis-διαχωρισμού (4 × 10

-4), η αρνητική επιλογή που προκύπτει από μονοσωμία βρέθηκε να είναι κατά μέσο όρο 28% και ότι από τρισωμία 31%, χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ τους (Σχήμα S3). Ούτε ήταν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο χρωμοσωμάτων δείκτη εκεί. Για την εκτίμηση του μεγαλύτερου δυνατού περιθωρίου σφάλματος για τους υπολογισμούς αυτούς, μπορούμε στη συνέχεια έλαβε επίσης υπόψη (1) η μεταβλητότητα εκτιμάται ινοβλαστών ποσοστό mis-διαχωρισμός των 3.3 – 4.1 × 10

-4 και (2) το γεγονός ότι υπήρχαν παραλλαγές για τα χρωμοσώματα του δείκτη. Αυτό οδήγησε σε μια έκταση αρνητική επιλογή 19% έως 50% (μέση τιμή ± αντανακλώντας 2 τυπικές αποκλίσεις). Ο μέγιστος βαθμός αρνητικής επιλογής σε αυτές τις εκτιμήσεις ήταν πάντοτε πολύ κάτω του 100%, γεγονός που συνεπάγεται ότι η απέκκριση των ανευπλοειδικών κυττάρων από έναν αυξανόμενο φυσιολογικό πληθυσμό κυττάρων είναι συνήθως μια διαδικασία που αρκετές μιτωτική γενιές. Επειδή δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ τρισωμία και μονοσωμία, υπολογίσαμε τη συνολική αρνητική επιλογή έναντι ανευσωμίας χρησιμοποιώντας τον Χείρωνα, με αποτέλεσμα κατά μέσο όρο 29% σε σχετική κλίμακα (Σχήμα 3Β, E). Αυτό σημαίνει ότι σε ένα συνεχώς αυξανόμενο πληθυσμό με 100% πιθανότητα επανένταξης μίτωση για διπλοειδή κύτταρα, μια που δημιουργήθηκε πρόσφατα ανευπλοειδές κύτταρο θα σταθεί μια πιθανότητα της τάξης του 49% για την πολλαπλασιαστική επιβίωσης έως και δύο γενιές, αλλά μόνο μια πιθανότητα 3% για επιζών έως και 10 γενιές.

ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου μπορεί να έχουν αυξημένη ανοχή Aneuploidy

για να πραγματοποιήσετε μια παρόμοια αξιολόγηση του βαθμού μείωσης των κυτταρικών γυμναστικής που προκύπτουν από ανευπλοειδία στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε τέσσερα καρκινικό κύτταρο γραμμές (LoVo, DLD1 και SW480 που προέρχονται από ορθοκολικό καρκίνωμα, CRC? WiT49 που προέρχεται από όγκο Wilms, WT), στην οποία είχαμε προηγουμένως εκτιμηθεί το ποσοστό του χρωμοσώματος mis-διαχωρισμό [6]. Ενώ DLD1 και WiT49 είχαν ποσοστά mis-διαχωρισμού κοντά σε εκείνες των ινοβλαστών, LoVo και SW480 έδειξε υψηλό βαθμό μιτωτικής αστάθεια (Πίνακας 1). Ενώ η stemline του DLD1 ήταν ψευδο-διπλοειδή, οι άλλες γραμμές παρουσίασαν ουσιαστική ανευπλοειδία με έναν αριθμό αντιγράφων ≠ 2 για αρκετές χρωμοσώματα στο stemline [3], [21]. Για την εκτίμηση του επιπολασμού των ανευπλοειδικών κύτταρα σε αυτές τις γραμμές, FISH αναλύει με φόντο την αφαίρεση έγιναν και πάλι. Επειδή ο στόχος μας ήταν να μελετήσουμε συνεχή σχηματισμό και την εξάλειψη της aneusomies, ο δείκτης ανευσωμίας σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του ορίστηκε ως η επικράτηση των κυττάρων με ένα μη-τροπική αριθμού αντιγράφων για το χρωμόσωμα στόχου [22]. Για να είναι σε θέση να παρακολουθεί τις πιθανές διαφορές στην αρνητική επιλογή μεταξύ των κυττάρων αλλάζει αριθμό αντιγράφων από δισωμία και εκείνων που αλλάζει τον αριθμό αντιγράφων από μια προϋπάρχουσα κατάσταση stemline ανευσωμίας, επιλέχθηκαν ανιχνευτές για την κάλυψη των χρωμοσωμάτων που δείχνει δισωμία, τρισωμία και τετρασωμίας στα stemlines των διαφόρων κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1).

η

Όπως ήταν αναμενόμενο, η επικράτηση των κυττάρων με μη-τροπική αριθμούς χρωμοσωμάτων ήταν σημαντικά (≈10-300 φορές) υψηλότερες στα καρκινικά κύτταρα γραμμές με αυξημένη χρωμοσωμική mis-διαχωρισμός ποσοστά (LoVo και SW480) σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα είχαν ερευνηθεί στο παρελθόν. Ωστόσο, ακόμη και σε καρκίνο κυτταρικών πληθυσμών με ένα κοντά στο φυσιολογικό ρυθμό mis-διαχωρισμού (DLD1 και WiT49), η επικράτηση των κυττάρων με μη-τροπική αριθμό αντιγράφων ήταν τουλάχιστον 10 φορές υψηλότερη από τη μέση τιμή σε ινοβλάστες (Πίνακας 1). Αυτό παρείχε έμμεση απόδειξη για την εξασθένιση της ανευπλοειδίας που εξαρτώνται από την αρνητική επιλογή σε καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα. Ωστόσο, η ανάλυση δεν

per se

απόδοση σχετικές τιμές των πολλαπλασιαστικών επιβίωσης που θα μπορούσαν να συγκριθούν μεταξύ φυσιολογικών κυττάρων και καρκινικών κυττάρων. Για να επιτευχθεί αυτό, θα ενσωματωθεί το ποσοστό χρωμοσωμικό MIS-διαχωρισμού για κάθε κυτταρική γραμμή στον αλγόριθμο Chiron και χρησιμοποιούνται αυξανόμενη κλίμακα της αρνητικής επιλογής έναντι νέων aneusomies με τρόπο παρόμοιο με την ανάλυση των ινοβλαστών. Αυτό έγινε με την παραδοχή ότι διαφορετικά χρωμοσώματα διαφέρει ελάχιστα σε σχέση με τα ποσοστά ατομικών mis-διαχωρισμό τους, η οποία είναι συνεπής με τα προηγούμενα δεδομένα [4], [6]. Αρνητικές τιμές επιλογής για τις κυτταρικές σειρές καρκίνου υπολογίστηκαν για κάθε χρωμόσωμα, που ταιριάζουν με το επίπεδο ανευσωμίας του σε ένα σημείο της δυναμικής ισορροπίας μεταξύ mis-διαχωρισμού και απομάκρυνσης από την επιλογή (Σχήμα 4). Εκτός από την WiT49, η δυναμική ισορροπία επιτεύχθηκε πριν από 500 μιτωτική γενιές. Ως εκ τούτου, σημεία ισορροπίας από 500 γενιές χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της αρνητικής επιλογής. WiT49 δεν έφθασε ισορροπία μέχρι ≈1800 γενεών για τις αρνητικές τιμές επιλογή & lt? 0,5% και, ως εκ τούτου, τα σημεία ισορροπίας σε 2.000 γενιές χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της αρνητικής επιλογής. Ένα μονοκλωνικό πληθυσμό καρκινικών κυττάρων που προέρχεται από ένα συνεχούς αναγέννησης πληθυσμό βλαστικών κυττάρων μπορεί να εκτιμάται ότι έχουν υποστεί τουλάχιστον 2.000 γενεές πριν από την ανίχνευση [23]. Έτσι, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι τα κύτταρα WiT49, αντιπροσωπεύει μια συνεχή υπο-καλλιεργηθούν καθιερωμένη κυτταρική γραμμή, έχουν υποστεί τουλάχιστον 2000 γενιές πριν από τις αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν εδώ.

(Α-Β) Μια δυναμική ισορροπία με σεβασμό να ανευσωμίας δείκτης (ΑΙ) έχει επιτευχθεί πριν από 500 γενιές ακόμη και με πολύ χαμηλές αρνητικές πιέσεις επιλογής στον καρκίνο κυτταρικών πληθυσμών με χαμηλό ποσοστό mis-διαχωρισμού (παράδειγμα κατά 1% για DLD1 έχει ένα σχεδόν φυσιολογικό ρυθμό mis-διαχωρισμό). Και τα δύο οικόπεδα είναι από μόνο τρεξίματα προσομοίωσης. (C-F) Σε όλες τις τέσσερις αναλύονται γραμμές προσομοιώσεις των καρκινικών κυττάρων προβλέψει μια σχεδόν γραμμική αρνητική σχέση μεταξύ anusomy δείκτης (ΑΙ) και ο βαθμός της αρνητικής επιλογής (

s

) σε λογαριθμική κλίμακα. Πλήρεις γραμμές δείχνουν μέσες τιμές AI και διακεκομμένες γραμμές οι ελάχιστες και μέγιστες τιμές για κάθε προσομοίωση της γρίπης των πτηνών για ένα συγκεκριμένο

s

. Γκρι γραμμές αντιστοιχούν σε προσομοίωση AI για φυσιολογικούς ινοβλάστες και γκρι κύκλοι δείχνουν AI ποσοτικά με FISH για τα χρωμοσώματα 2 και 17 σε ινοβλάστες. Χρωματιστά γραμμές αντιστοιχούν σε προσομοίωση AIS για την χρωμοσώματα των διαφόρων τρόπων μεταφοράς αριθμών και χρωματιστούς κύκλους το ψάρι-εκτιμώμενες τιμές AI για τις αναλύονται χρωμοσωμάτων στα καρκινικές κυτταρικές σειρές. Εκτός από ένα χρωμόσωμα σε LoVo, οι αρνητικές πιέσεις επιλογής που ενεργούν για aneusomic κύτταρα είναι χαμηλότερα στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Τα πλήρη στοιχεία υπολογίζονται από αυτές τις Άη

s

εκτιμήσεις που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και συνοψίζεται στο Σχήμα 5.

Η

Η εκτίμηση των αρνητικών πιέσεων επιλογής κατά μυθιστόρημα aneusomic κύτταρα στο καρκινικό κύτταρο πληθυσμούς αποκάλυψε ότι LoVo εμφάνισαν μια μεγαλύτερη μεταβολή στην interchromosomal ανευπλοειδίας ανοχή από ό, τι τις άλλες τρεις κυτταρικές γραμμές, με τάση προς επικάλυψη με φυσιολογικά κύτταρα (Σχήματα 4 και 5? Πίνακας 1). Οι άλλες τρεις πληθυσμούς καρκινικών κυττάρων εμφάνισαν μικρότερη ποικιλομορφία με έως και 30 φορές χαμηλότερη ανευπλοειδία εξαρτώμενη αρνητική επιλογή από τα φυσιολογικά κύτταρα. Στο σύνολό τους, τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν μία μέση κίνδυνο θανάτου /συλλήψεως από μια πρόσφατα υπέστη ανευσωμίας μόνο 5,8% (ρ = 0,0008 σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ινοβλάστες), ενδεικτικό της ανευπλοειδίας ανοχής. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτή βρέθηκε όχι μόνο στον WiT49 και SW480, που έχει τεράστια ανευπλοειδίας stemline, αλλά και σε DLD1 με ένα ψευδο-διπλοειδή stemline και ανευπλοειδισμών παρόν μόνο στο subclonal επίπεδο [3]. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι μεσοκυττάρια πολυμορφία στον αριθμό των χρωμοσωμάτων σε καρκινικά κύτταρα εξαρτάται όχι μόνο σε ένα υπερυψωμένο ρυθμό mis-διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων, αλλά επίσης και σε ένα υπερυψωμένο ανοχή σε νεοαποκτηθείσα εκτροπών.

Mean ανευσωμίας εξαρτώμενη αρνητική επιλογή (

s

) υπολογίζεται από τον Χείρωνα-προσομοιώσεις. Το ενιαίο αστέρι δηλώνει p & lt? 0.05 και το διπλό αστέρια p & lt?. 0.001 (Μαθητή

t-test

) σε σύγκριση μεταξύ κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου και κανονικούς ινοβλάστες (F1 + F2)

Η

σε συνδυασμό αστάθεια μιτωτικά και Aneuploidy ανοχή Προβλέψτε το σενάριο της Aneuploidy σε ανθρώπινους καρκίνους

Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι αριθμητικές χρωμοσωμικές αλλαγές στον καρκίνο μπορεί να προκύψει από έναν συνδυασμό αυξημένο ποσοστό σφάλματος μιτωτική και την αύξηση της ανευπλοειδίας ανοχή. Αντίθετα, η συντριπτική πλειονότητα των προηγούμενα μοντέλα της ανευπλοειδίας στον καρκίνο έχουν ενσωματώσει μόνο γενωμική αστάθεια που προκαλείται από αυξημένα ποσοστό mis-διαχωρισμό [3], [4], [6], [7], [22]. Για να ελέγξετε αν συνδυαστεί το μοντέλο μας εξήγησε την επιδημιολογική σενάριο χρωμοσωμικές ανωμαλίες στον καρκίνο του καλύτερα από ό, μοντέλα που βασίζονται σε χρωμοσωμική αστάθεια και μόνο, αναλύσαμε δημοσιεύθηκε κατανομές των αριθμητικών αλλαγές στους τύπους όγκων, για τα οποία είχε ληφθεί πειραματικά δεδομένα καρκίνο μας,

δηλαδή

. CRC και WT. Μια τέτοια συνολική κατανομή των χρωμοσωμικών παρεκκλίσεων έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα κατατοπιστική όσον αφορά την χρονική μοτίβα κλωνικής εξέλιξης και των υποκείμενων μηχανισμών τους [24] – [27]

Για να διερευνήσουν ειδικά την κατανομή των αριθμητικών εκτροπών σε CRC. και WT, κυτταρογενετική δεδομένα εισήχθησαν από τη βάση δεδομένων Mitelman χρωμοσωμικές εκτροπές και Gene συγχωνεύσεις στον Καρκίνο (https://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman), το οποίο περιλαμβάνει 346 και 463 περιπτώσεις με μη φυσιολογική καρυότυποι, αντίστοιχα. Μετά το φιλτράρισμα καρυότυποι με ελλιπείς ή ασαφείς κυτταρογενετική πληροφορίες (δείκτες, χρωμοσώματα δαχτυλίδι, ελλιπής καρυότυποι, και διπλοειδή περιπτώσεις), παρέμεινε εκεί καρυότυποι από 151 CRCs και 269 WTS. Χάραξη τις σχετικές συχνότητες των περιπτώσεων όγκου σύμφωνα με το συνολικό αριθμό των αριθμητικών εκτροπών αποκάλυψε μια πολύ παρόμοια λογαριθμική-γραμμική διανομή (Σχήμα 6Α) και για τους δύο τύπους όγκων, όπου η επικράτηση των περιπτώσεων με έναν ορισμένο αριθμό ανωμαλιών ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τον αριθμό των εκτροπές. Η κατανομή ήταν σαφώς διαφορετική από το παρελθόν αναφερθεί συνολική σχέση log-log των εκτροπών, συμπεριλαμβανομένων των διαρθρωτικών αλλαγών [27]. Αυτό δείχνει ότι κανένα από τα δύο θεωρητικά μοντέλα πρότεινε πριν από τη συσσώρευση των χρωμοσωμικές εκτροπές σε καρκίνο (πολλαπλασιαστική διακύμανσης και των προτιμησιακών συνημμένο [27]) μπορεί να εξηγήσει το πρότυπο των αριθμητικών εκτροπών /ανευπλοειδία σε CRC ή WT.

( Α) Αναφέρθηκαν κυτταρογενετική δεδομένα από τη βάση δεδομένων του Mitelman χρωμοσωμικές εκτροπές και Gene συγχωνεύσεις στον Καρκίνο δείχνουν μια σχέση λογαριθμική-γραμμική μεταξύ της σχετικής επικράτηση και ο αριθμός των αριθμητικών εκτροπών ανά όγκου (Nnapt), με πολύ παρόμοιες κατανομές για όγκο Wilms (WT) και καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). (Β) Μοντελοποίηση ενός ορισμένου αριθμού stemlines καρκίνου που προέρχεται από τον ίδιο αριθμό ασθενών. Κάθε stemline υποτίθεται ότι προέρχονται από ένα διπλοειδές κύτταρο (που έχει μηδέν αριθμητικών εκτροπών) και αφέθηκαν να πολλαπλασιαστούν για ένα μέγιστο 2.000 γενεών (G), όταν γίνεται δειγματοληψία η συνολική κατανομή των αριθμητικών εκτροπών. Stemlines συσσωρεύονται αριθμητικών εκτροπών σε ένα ορισμένο ποσοστό mis-διαχωρισμού (

σ

) και υπόκεινται σε ανευπλοειδισμών εξαρτώμενη από την επιλογή σε ένα ορισμένο βαθμό (

s

), η οποία μπορεί με τη σειρά του να οδηγήσει σε τερματισμό της ο stemline (οριζόντια αλτήρα), που αντιστοιχεί στο τέλος του κλωνική επέκταση. Επειδή αυτό μπορεί να οδηγήσει σε υποχώρηση της ογκογένεσης σε πρώιμο στάδιο, όταν ήταν έτσι τερματίστηκε stemlines αφαιρέθηκαν από τη δειγματοληψία. (C) Προσομοίωση κατανομή των υποθέσεων όγκου με ένα ορισμένο αριθμό αριθμητικών εκτροπών καθώς η ομάδα όγκου δειγματοληψία σε γενιές 1-2000 σε ένα περιβάλλον όπου οι όγκοι φιλοξενούν ένα ανυψωμένο ρυθμό mis-διαχωρισμού σε απουσία αρνητικής επιλογής έναντι ανευπλοειδικών κύτταρα (βλέπε κύρια κείμενο για λεπτομέρειες). Αυτό θα οδηγήσει σε μια διωνυμική-σαν διανομής ήδη μετά από 100 γενεές, η τροπική αξία της οποίας αυξάνει με το χρόνο, σε αντίθεση με την πραγματική κατανομή σε ανθρώπινους όγκους (σε σύγκριση με 6Α).

Η

Σε αναζήτηση λοιπές επεξηγηματικές μοντέλα, έχουμε δημιουργήσει έναν αλγόριθμο που μιμήθηκε την παράλληλη εξέλιξη της 500 καρυότυποι stemline όγκου (περιπτώσεις καρκίνου) πάνω από 2000 γενεών [23], καθένα αρχίζοντας με ένα κανονικό διπλοειδές γονιδίωμα, στην οποία εφαρμόστηκαν διαφορετικές συνθήκες μιτωτική αστάθεια και επιλογής ( Σχήμα 6Β). Δοκιμάσαμε πρώτα το καθιερωμένο μοντέλο της χρωμοσωμικής αστάθειας στον καρκίνο, η οποία δεν λαμβάνει επιλογής έναντι νεοσυσταθείσα ανευπλοειδικών κύτταρα υπόψη, ενώ το ποσοστό της μιτωτικής χρωμοσώματος mis-διαχωρισμού είναι συχνά αυξημένα. Επειδή ο ρυθμός μιτωτικής mis-διαχωρισμού είναι γνωστό ότι ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των όγκων, κάθε εικονικό stemline όγκου αποδόθηκε ένα τυχαίο ποσοστό λανθασμένη διαχωρισμός που εκτείνονται από την κανονική (4 × 10

-4 /χρωμόσωμα /μίτωση) με την υψηλότερη τιμή αναφερθεί ( 36 × 10

-4 [6]). Το μόνο κριτήριο επιλογής που επιβλήθηκε ήταν υποχρεωτικό εξόντωση των stemlines έχουν λάβει nullisomies, με βάση το γεγονός ότι οι όγκοι με πλήρη απουσία του υλικού από ένα αυτοσωμικό έχουν αναφερθεί πολύ σπάνια (https://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) . Οι συνθήκες αυτές οδήγησαν σε μια συνεχή αύξηση του συνολικού αριθμού των χρωμοσωμικές εκτροπές στον πληθυσμό του δείγματος με την αύξηση της μιτωτικής γενιές (Σχήματα 6C και S4A), με αποτέλεσμα σε ένα διωνυμικό-όπως τη διανομή με τον τρόπο 15 εκτροπών μετά το 2000 γενεών (Εικόνα 7Α). Πολλαπλές παραλλαγές στην κατανομή των ποσοστών mis-διαχωρισμός ελέγχθηκαν επίσης, με παρόμοια αποτελέσματα από μια διωνυμική-σαν διανομή.

Τα αναμενόμενα κατανομές σύμφωνα με τις διαφορετικές συνθήκες του χρωμοσωμικού mis-διαχωρισμό και την επιλογή προβλέφθηκαν με προσομοιώσεις, όπως περιγράφεται στο σχήμα 6. σε κάθε γραφική παράσταση, τα αναφερόμενα δεδομένα για όγκο Wilms (WT, μαύροι κύκλοι) και του παχέος εντέρου (CRC, κόκκινο κύκλοι) συμπεριλαμβάνεται για σύγκριση.