Abstract

XB130, μία νέα πρωτεΐνη προσαρμογέα, μεσολαβεί RET /PTC χρωμόσωμα αναδιάταξης σχετίζονται πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων θυρεοειδούς και επιβίωση μέσω φωσφατιδυλο-ινοσιτόλη-3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι. Πρόσφατα, XB130 βρέθηκε σε διάφορα καρκινικά κύτταρα σε απουσία RET /PTC. Για να καθοριστεί εάν RET /PTC απαιτείται από XB130 σχετίζονται καρκινικού κυττάρου πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, WRO καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων (με RET /PTC μετάλλαξη) και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 (χωρίς RET /PTC) υποβλήθηκαν σε αγωγή με XB130 siRNA, και πολλαπλές Akt κάτω εξετάστηκαν -stream σήματα. Χτύπημα κάτω από XB130 ανέστειλε G

εξέλιξη 1-S φάση, και προκαλείται από την αυθόρμητη απόπτωση και αυξημένη ενδογενή και εξωγενή αποπτωτικό ερέθισμα που προκαλείται από το θάνατο των κυττάρων. Χτύπημα κάτω από XB130 μειωμένη φωσφορυλίωση της p21Cip1 /WAF1, p27kip1, FOXO3a και της GSΚ3β, αυξημένα επίπεδα p21Cip1 /WAF1protein και διασπάσεις της κασπάσης-8 και-9. Ωστόσο, η φωσφορυλίωση της FOXO1 και τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 δεν επηρεάστηκαν από XB130 siRNA. Βρήκαμε επίσης XB130 μπορεί να φωσφορυλιωθεί από πολλαπλές πρωτεϊνικές κινάσες της τυροσίνης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι XB130 είναι ένα υπόστρωμα πολλαπλών κινασών τυροσίνης πρωτεΐνης, και μπορεί να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση μέσω της διαμόρφωσης επιλεγμένων κατάντη σήματα ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. XB130 θα μπορούσε να συμμετέχει στην ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων διαφορετικών

Παράθεση:. Shiozaki Α, Shen-Tu G, Bai Χ, Iitaka D, De Falco V, Santoro M, et al. (2012) XB130 Παρεμβαίνει Cancer Cell πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης μέσω πολλαπλών Εκδηλώσεις Σηματοδότησης μεταγενέστεροι της Akt. PLoS ONE 7 (8): e43646. doi: 10.1371 /journal.pone.0043646

Επιμέλεια: Laszlo Buday, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 23 Μάρτη 2012? Αποδεκτές: 24 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Αυγ 2012

Copyright: © Shiozaki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις λειτουργίας (ΜΟΡ-13270 και MOP-42546) από την καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας, Research Fellowship βραβεία από το Ίδρυμα Uehara Memorial και Διεθνούς Εταιρείας Μεταμόσχευσης Καρδιάς και πνευμόνων για το Δρ Atsushi Shiozaki και Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

XB130 είναι ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε πρωτεΐνη προσαρμογέα για ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος? Συμμετέχει στη ρύθμιση των γονιδίων, κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κυτταρική επιβίωση, κυτταρική μετανάστευση, και ογκογένεση [1]. Ανθρώπινα

xb130

γονίδιο ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια της διαδικασίας κλωνοποίησης των ανθρωπίνων

AFAP

γονίδιο [2], [3], [4]. Κωδικοποιεί 818 αμινοξέα με φαινόμενο μοριακό μέγεθος περίπου 130 kDa. Η συνολική δομή της XB130 μετοχών ομοιότητα με AFAP έτσι είναι επίσης γνωστό ως AFAP1 όπως πρωτεΐνη 2 (AFAP1L2). Ως πρωτεΐνη προσαρμογέα, η Ν-τερματική περιοχή του XB130 περιλαμβάνει αρκετές θέσεις φωσφορυλίωσης τυροσίνης και πλούσια σε προλίνη αλληλουχία, η οποία μπορεί να αλληλεπιδράσουν με τις πρωτεΐνες που περιέχει την περιοχή SH2 και SH3, αντίστοιχα. Το μεσαίο τμήμα φιλοξενεί δύο πλεκστρίνης-ομολογίας (PH) τομείς που μπορούν να στοχεύουν πρωτεΐνες για τις κυτταρικές μεμβράνες μέσω αλληλεπιδράσεων με ειδικές φωσφολιπίδια. Η C-τερματική περιοχή περιέχει μια περιοχή συσπειρωμένης σπείρας, η οποία μπορεί να εμπλέκεται σε πρωτεΐνες ολιγομερισμό και DNA δέσμευσης [4]. XB130 μπορούν να αλληλεπιδρούν και να ενεργοποιούν c-Src κινάσης τυροσίνης, που οδηγεί σε αυξημένα φωσφορυλίωση τυροσίνης πολλαπλών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων XB130, και μετενεργοποίηση του ΑΡ-1 και SRE [4]. Κατά τη μετανάστευση των κυττάρων, XB130 ρυθμίζει ακτίνη κυτταροσκελετό αναδιάταξη, όπως αποδεικνύεται από τη μετατόπιση της προς κύτταρο περιφέρεια σε ελασματοπόδια. Φίμωση της ενδογενούς XB130 μπορεί να προκαλέσει μια μείωση στο ρυθμό κλεισίματος τραύματος, αναστέλλουν matrigel εισβολή, και να μειώσει lamellipodial επιμονή και την εξάπλωση των κυττάρων, τα οποία δείχνουν ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή [5].

XB130 εμπλέκεται σε θυρεοειδή τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση [1]. καρκίνος του θυρεοειδούς είναι ένα είδος ενδοκρινική κακοήθεια, η οποία περιλαμβάνει πολλαπλές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές που οδηγούν σε ΜΑΡΚ και ενεργοποίηση μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [6], [7], [8]. Μια κοινή μετάλλαξη που βρέθηκαν στον καρκίνο του θυρεοειδούς είναι RET /PTC χρωμοσωμικές αναδιατάξεις. Η RET προϊόν /PTC είναι μια πρωτεΐνη που παράγεται από το χρωμοσωμικό αναδιάταξη με το συνδυασμό του 3 ‘τμήμα του γονιδίου RET και το 5’ τμήμα ενός γονιδίου συνεργάτη. Αυτό οδηγεί σε μια συστατικά ενεργοποιημένη κινάση τυροσίνης, RET /PTC [9]. RET /PTC εκθέματα μετασχηματισμού ικανότητα μέσω πραγματοποίηση της διαφοροποίησης, μιτογόνες και μεταστατικό δυναμικό στον καρκίνο του θυρεοειδούς [10], [11]. RET /PTC προκαλεί μια ισχυρή φωσφορυλίωση τυροσίνης XB130, το οποίο προωθεί τη σύνδεσή της με την p85α υπομονάδα της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ). Αυτό με τη σειρά της ενεργοποιεί Akt. Κάτω ρύθμιση των XB130 σε TPC1 θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα, που φέρουν το RET /PTC κινάσης, ισχυρώς μειωμένη δραστικότητα Akt, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την επιβίωση των κυττάρων [12]. Επιπλέον, σε κύτταρα WRO, ένα άλλο θυρεοειδούς κυτταρική σειρά καρκίνου με RET /PTC μετάλλαξη [13], τα κύτταρα σταθερώς επιμολυσμένα με XB130 shRNA μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια. Microarray μελέτη διαπίστωσε ότι οι πολλαπλά γονίδια που ρυθμίζονται από XB130 που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση, συμπεριλαμβανομένων πολλών ρυθμιστών μεταγραφής [14].

Από XB130 εκφράζεται έντονα σε θυρεοειδούς, έχει υποτεθεί ότι είναι ένα θυρεοειδή-ειδική τυροσίνης υπόστρωμα κινάσης. Πρόσφατα, έχουμε βρει έκφραση XB130 σε καρκίνο του οισοφάγου [15], καθώς και σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν XB130 παίζει ρόλο σε καρκινικά κύτταρα ανεξάρτητα από την παρουσία του RET /PTC. Επιπλέον, αν και το μονοπάτι PI3K /AKT έχει αναγνωριστεί ως σημαντική για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων XB130 μεσολάβηση και την επιβίωση, οι μεταγενέστεροι σήματα της Akt είναι ακόμη απροσδιόριστο. Έτσι, μελετήσαμε αυτά τα γεγονότα με τα κύτταρα WRO, ενός ανθρώπινου καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρική σειρά με RET /PTC αναδιάταξη, και Α549, ένα ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος χωρίς RET /PTC.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές, Αντισώματα και άλλα αντιδραστήρια

Ανθρώπινο θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς κύτταρα WRO (ιδρύθηκε από τον Δρ GJF Juillard, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας-Λος Άντζελες της Ιατρικής Σχολής του Los Angeles, CA, USA) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% FBS, 1 mM πυροσταφυλικό και μη ουσιώδη αμινοξέα (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA) [13]. Ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα Α549, που ελήφθησαν από ATCC (CCL-185? Manassas, VA) [16], αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ, συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2.

Οι φορείς έκφρασης για RET /PTC3, ενεργοποιημένα εκδόσεις του ABL και SRC [17], ή EGFR και ERBB2 [18 ], τα οποία ενεργοποιούνται κατά την υπερέκφραση, περιγράφονται αλλού. Μονοκλωνικό αντίσωμα XB130 δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Αντισώματα για φωσφο-Akt (Ser473), Akt, φωσφο-GSK-3β (Ser9), p21Cip1 /WAF1, p27kip1, p53, φωσφο-FOXO3a (Thr32), FOXO3a, φωσφο-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), SAPK /JNK, φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ (Thr180 /Tyr182), ρ38 ΜΑΡΚ, φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Thr202 /Try204), phosho-Src (Try416) ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA)? μονοκλωνικό αντι-φωσφοτυροσίνης αντισώματα ήταν από την Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, ΝΥ, USA) και αντι-c-myc (sc-40) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα για GAPDH, ERK1, φωσφο-ρ21 (Thr145), κασπάσης-8 και κασπάσης-9 ήταν από τη Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντι-PCNA αντισώματος ήταν από Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-Ki-67, κλώνος Ki-S5, ήταν από την Chemicon (Temecula, CA, USA). Anti-Src (GD11) και αντι-Fas mAb (κλώνος CH11) ήταν από Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, USA). Αντι-φωσφο-p27kip1 (Thr157) αντίσωμα ήταν από την R &? D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Anti-p85α της PI3K αντισώματος ήταν από BD PharMingen (San Diego, CA, USA). Η σταυροσπορίνη ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA).

Μελέτες Protein

πειράματα

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθησαν σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [2], [3]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν με τροποποιημένο ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσο καταβύθιση (50 mM Tris-HCl? ΡΗ 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA και 1% Triton Χ-100) που περιέχει 10 μg /ml το καθένα απροτινίνη, λευπεπτίνη, πεπστατίνη, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mM Na

3νο

4, και 10 mM NaF. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με μία τροποποιημένη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad, Munich, Germany). Τα κυτταρολύματα που περιέχουν ίση ποσότητα ολικών πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Schleicher & amp? Schuell, Whatman, Middlesex, UK). Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Οι πρωτεΐνες αποκαλύφθηκε από μια ενισχυμένη κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfort, UK). πυκνότητες Band ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/) μετά που σαρώνεται από την ταινία. Το πρωτόκολλο για ανοσοκαταβύθιση έχει περιγραφεί προηγουμένως λεπτομερώς [3], [19].

siRNA Επιμόλυνση

Δύο siRNAs σχεδιάστηκαν σύμφωνα με αλληλουχία XB130 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [12] . Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ ομαδοποιήθηκαν XB130 siRNAs χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [4], [20]. Το μέσο που περιέχει siRNA αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο μετά από 24 ώρες. Η siSTABLE V2 μη στόχευση siRNA # 1 από Dharmacon (Lafayette, CO, USA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Για μελέτες πρωτεϊνών, siRNA επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

εκκινητές Ακολουθία-ειδικό για την ανθρώπινη RET /PTC έχουν σχεδιαστεί από Balogh et al. : 5′-GTCGGGGGGCATTGTCATCT-3 ‘και 5′-AAGTTCTTCCGAGGGAATTC-3’ [21]. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy κιτ (Qiagen, Valencia, CA), και cDNA συνετέθη από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας MuLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green Ι κύριο PCR επί LightCycler480 (Roche, Indianapolis, ΙΝ). Κάθε ανάλυση περιελάμβανε μία πρότυπη καμπύλη πέντε σειριακές αραιώσεις και ένα αρνητικό μάρτυρα χωρίς πρότυπο. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. επίπεδα έκφρασης γονιδίων ομαλοποιήθηκαν στο επίπεδο της SDHA, ένα γονίδιο οικοκυρική [14].

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε φωσφο-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε 70% για όλη τη νύχτα κρύα αιθανόλη. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 και 2 mg /ml RNase Α σε PBS για 30 λεπτά. Αυτά στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά σε PBS και χρωματίστηκαν με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Sigma-Aldrich). Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με τη ροή Cytomix FC500 κυτταρομετρίας συστήματος (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA).

Ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων

Μετά την κατεργασία με σταυροσπορίνη ή FasAb για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ισοθειοκυανικό φλουορεσκεΐνης (FITC), συζευγμένης Annexin V και ΡΙ χρησιμοποιώντας το κιτ αννεξίνης V (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ακολουθώντας τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και αναλύθηκαν με τη ροή Cytomix FC500 κυτταρομετρίας σύστημα.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test του Student. Οι διαφορές θεωρούνται σημαντικές όταν η τιμή Ρ ήταν μικρότερη από 0.05. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του στατιστικού λογισμικού JMP έκδοση 5 (SAS Institute Inc., Cary, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Αποτελέσματα

XB130 Έλεγχοι κυττάρων Κύκλου Εξέλιξη των καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνήσουν το ρόλο της XB130 στον καρκίνο πρόοδο του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήσαμε knockdown πειράματα χρησιμοποιώντας XB130 siRNA σε ανθρώπινο καρκίνωμα του θυρεοειδούς θυλακιώδη κύτταρα WRO (με RET-PTC αναδιάταξη) και σε ανθρώπινα κύτταρα Α549 αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (μια κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιούνται συνήθως σε μελέτες για τον καρκίνο του πνεύμονα [15]). Δύο siRNAs που στοχεύουν διαφορετικές περιοχές της XB130 σχεδιάστηκαν. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι και οι δύο από αυτούς μειωθεί αποτελεσματικά επίπεδα πρωτεΐνης XB130 και φωσφορυλίωση της Akt σε κύτταρα TPC-1 [12] και άλλους τύπους κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνδυασμένη εφαρμογή των δύο αυτών siRNAs μειώνει τη συγκέντρωση του κάθε siRNA στο μισό, έτσι μπορεί να μειώσει το δυναμικό εκτός στόχου επιδράσεις. Ως εκ τούτου, έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή τη στρατηγική προηγουμένως [5], [12] και επίσης στις παρούσες μελέτες. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του XB130 μερικώς μπλοκαριστεί εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από το G

1 έως S φάση και στις δύο WRO και Α549 κύτταρα όπως καθορίστηκε με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 1Α). Υπάρχουν σημαντικά περισσότερα κύτταρα σε φάσεις G1 από είτε στην S ή G2 /M φάση (Εικ. 1Β). Ενώ, κηλίδες Western απεικονίζουν μία σημαντική μείωση στους δείκτες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Ki-67 και PCNA, στις XB130 siRNA κατεργασμένων κυττάρων (Εικ. 1 C). Η παρουσία του RET-PTC αναδιάταξη επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα TPC 1 (ως θετικός μάρτυρας) και σε κύτταρα WRO, λαμβάνοντας υπόψη ότι είναι απουσία σε κύτταρα Α549 όπως δείχνεται με RT-PCR (Σχ. 1D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι XB130 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων είτε παρουσία ή την απουσία του RET /PTC.

(Α και Β) κάτω ρύθμιση των XB130 ανέστειλε G

1- εξέλιξης της φάσης S σε WRO και Α549 κύτταρα. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με τον έλεγχο ή XB130 siRNA χρωματίστηκαν με ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η μέση ± SEM.

n

= 6. *

σ

& lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA). (Γ) Μειωμένα επίπεδα Κί67 και PCNA σε κατεργασμένα WRO και Α549 κύτταρα XB130 siRNA, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western.

n

= 3. *

σ

& lt? 0,05 (σε σύγκριση με την ομάδα στην οποία χορηγήθηκε siRNA ελέγχου). (Δ) Παρουσία του RET /PTC αναδιάταξη επιβεβαιώθηκε στις δύο κύτταρα TPC-1 και WRO χρησιμοποιώντας RT-PCR. κύτταρα Α549 δεν περιέχουν RET /PTC αναδιάταξη.

Η

XB130 Ελέγχει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων

Για τον προσδιορισμό του ρόλου των XB130 στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, που αντιμετωπίζονται WRO και τα κύτταρα Α549 με XB130 siRNA και μεταχειρισμένα κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση και για τη διάκριση μεταξύ εξωγενούς (υποδοχέας θάνατο που επιτελείται) αποπτωτικό μονοπάτι, και την εγγενή (μιτοχονδριακή μεσολάβηση) αποπτωτικό μονοπάτι [23]. Κάτω ρύθμιση των XB130 επάγεται πρώιμη απόπτωση (αννεξίνης V θετική /αρνητική ΡΙ) σε κύτταρα WRO στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA (Σχ. 2Α). Περαιτέρω, XB130 siRNA ενισχυμένη εξωγενούς (FasAb, κλώνος CH11, 100 ng /ml) και ενδογενή (σταυροσπορίνη, 200 ηΜ) αποπτωτικά ερεθίσματα που προκαλείται από νωρίς και αργά απόπτωση (αννεξίνη V /PI διπλά θετικά) (Σχ. 2Α). Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν στο μέσο που περιέχει 10% FBS, ρύθμιση προς τα κάτω του XB130 δεν ενίσχυσε αυθόρμητη ούτε τον κυτταρικό θάνατο σταυροσπορίνης-ή FasAb επαγόμενη, ακόμη και στα 500 ng /ml FasAb (Εικ. S1 Α) . Περαιτέρω, η συνδυασμένη χρήση του FasAb (500 ng /ml) και IFN-γ (100 ng /ml), μια κατάσταση που έχει προηγουμένως αναφερθεί σε επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε διάφορους άλλους τύπους κυττάρων [24], [25], δεν το έκανε επάγουν απόπτωση σε κύτταρα Α549 (Σχ. S1B). Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι η έκφραση του ενδογενούς Fas στα κύτταρα Α549 είναι ακόμη υψηλότερο από ότι στα κύτταρα WRO (Εικ. S1c). Ωστόσο, σύμφωνα με κατάσταση ελεύθερης ορού, θεραπεία XB130 siRNA ενισχυμένη σταυροσπορίνης επαγόμενη πρώιμη απόπτωση σε Α549 κύτταρα (Σχ. 2Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα Α549 είναι ανθεκτικά τόσο εξωγενή και εγγενώς μεσολάβηση σημάτων απόπτωσης. Παρ ‘όλα αυτά, XB130 εμπλέκεται στην κυτταρική επιβίωση και στις δύο κυτταρικές σειρές υπό αποκλίνουσες πειραματικές συνθήκες.

(Α) προς τα κάτω ρύθμιση του XB130 ενισχυμένη αυθόρμητη και επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων WRO καλλιεργήθηκαν με 10% FBS. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με τον έλεγχο ή XB130 siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σταυροσπορίνη (STS, 200 ηΜ), ή αντίσωμα Fas (FasAb, κλώνος CH11, 100 ng /ml) για 24 ώρες. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας ΡΙ /διπλή χρώση αννεξίνης V. (Β) προς τα κάτω ρύθμιση του XB130 ενισχυμένης σταυροσπορίνης-επαγόμενη απόπτωση σε κατάσταση ελεύθερης ορού σε κύτταρα Α549. Κύτταρα Α549 επιμολύνονται με έλεγχο ή XB130 siRNA επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό με ή χωρίς 200 ηΜ STS για 24 ώρες.

n

= 6. Μέση τιμή ± SEM. *

σ

& lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA). (Γ) XB130 μπορούν να φωσφορυλιωθούν από κινάσες τυροσίνης πρωτεΐνης πλην RET /PTC. Ανοσοκαταβύθιση με αντι-myc αντίσωμα σε κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με myc-tagged XB130, μαζί με RET /PTC3, EGFR, Src, Abl, ή erbB2, έδειξαν αύξηση στην φωσφορυλίωση τυροσίνης XB130 χρησιμοποιώντας αντι-φωσφοτυροσίνης αντίσωμα.

Η

Ακόμη κι αν τα κύτταρα Α549 δεν έχουν RET /PTC, άλλες ενδογενείς ΡΤΚ θα μπορούσε να φωσφορυλιώνει XB130. Συνεπώς, έχουμε δείξει δραματική φωσφορυλίωση τυροσίνης πρωτεϊνών σε κύτταρα Α549, τα οποία μπορεί να μειωθεί αποτελεσματικά από αναστολέα SRC, ΡΡ2 [26]. Για να ελεγχθεί αν εάν άλλες κινάσες πρωτεΐνης θα μπορούσε να φωσφορυλιώνουν XB130 σε τυροσίνη, ΗΕΚ293 κύτταρα, μια κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται συνήθως για τον έλεγχο της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, επιμολύνθηκαν με myc-tagged XB130 μαζί με RET /PTC3 ως έλεγχος, ή άλλες δεσμευμένες σε μεμβράνη ( EGFR, erbB2) ή του κυτταροπλάσματος (SRC, ABL) κινάσες της τυροσίνης. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-myc στυπώθηκαν και με αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης. Αν και σε διαφορετικά επίπεδα, όλες οι κινάσες τυροσίνης πρωτεΐνης συν-εκφράζεται με XB130 αυξημένη φωσφορυλίωση τυροσίνης του (Σχ. 2C).

XB130 Συνδέεται να p85α Υπομονάδα ΡΙ3Κ και Controls Akt Δραστηριότητα σε καρκινικά κύτταρα

οι δύο πασίγνωστες καταρράκτη σηματοδότησης που εμπλέκονται στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού και την επιβίωση μέσω φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης είναι η ΡΙ3Κ /Akt και οδοί ρ38 ΜΑΡΚ [7]. Δοκιμάσαμε τα βασικά συστατικά της σηματοδότησης σε αυτές τις δύο οδούς και διαπίστωσε ότι η φωσφορυλίωση Src, JNK και ERK δεν επηρεάστηκε σε XB130 siRNA επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. S2). Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της p38 ήταν ακόμη σημαντικά αυξημένη μετά τη θεραπεία XB130 Siran στα κύτταρα WRO (Εικ. S2), η οποία αποκλείει περαιτέρω τη δυνατότητα του p38 ως ένα σήμα προς τα κάτω ροή που μεσολαβεί XB130 που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι XB130 ρυθμίζουν την εξέλιξη του κύκλου καρκίνο του θυρεοειδούς και επιβίωση κυττάρου μέσω της αλληλεπίδρασής της με ΡΙ3Κ, που οδηγεί στην ενεργοποίηση της Akt. XB130 έχει ένα μοτίβο ΥχχΜ στο Ν-τελικό άκρο ξεκινώντας στο τυροσίνης 54 που μπορεί να συνδεθεί με είτε το Ν-ή το C-τερματικό τομέα SH2 του p85α-υπομονάδας της ΡΙ3Κ (Εικ. 3Α), όπως αποδεικνύεται από pull πρωτεΐνη σύντηξης GST καθόδου δοκιμασίες, συν-ανοσοκαταβύθιση, φώσφορο-πεπτιδίου ανταγωνισμού, και τη χρήση των XB130 μεταλλακτών [12]. Πρόσφατα, η σύνδεση μεταξύ XB130 και ρ85 επίσης αναφερθεί από Yamanaka et al. σε θυρεοειδή αρουραίου FRTL 5-κυττάρων με moldi-TOF MS δοκιμασία [27]. Σε αμφότερες κύτταρα WRO και Α549, δέσμευση μεταξύ XB130 και p85α υπομονάδα της ΡΙ3Κ δείχθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση (Σχ. 3Α). Akt είναι μεταγενέστερος στόχος της PI3K, και η φωσφορυλίωση της στο Ser 473 είναι ένας ευαίσθητος δείκτης της δραστηριότητας Akt [28]. XB130 siRNA μείωσε αποτελεσματικά XB130 επίπεδα πρωτεΐνης? ένα φαινόμενο που σχετίζεται με μειωμένη φωσφορυλίωση της Akt σε αμφότερες WRO και Α549 κύτταρα (Σχ. 3Β).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης δομών XB130 και p85α υπομονάδα της ΡΙ3Κ. Αλληλεπιδράσεις των XB130 με p85α είχαν εντοπιστεί από τους συν-ανοσοκατακρήμνιση στο WRO και Α549 κύτταρα. (Β) XB130 siRNA μείωσε αποτελεσματικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης XB130 και φωσφορυλίωσης Akt στο WRO και Α549 κύτταρα. siRNA επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

n

= 5. *

σ

& lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA)

Η Κύκλος

XB130 Έλεγχοι Cancer Cell Εξέλιξη και την επιβίωση μέσω πολλαπλών Akt Down Stream. μόρια

p27kip1 και p21Cip1 /WAF1 εμπλέκονται στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου μέσω της αναστολής των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάσες CDK1 και CDK2. Ο αναστολέας κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη p27kip1 πυρηνική μετατόπιση μπορεί να προκαλέσει G1 σύλληψη? Akt είναι σε θέση να φωσφορυλιώνει p27kip1, και έτσι εμποδίζουν τη μετατόπιση και τη λειτουργία [29] του, [30], [31]. Ο αναστολέας κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη p21Cip1 /WAF1 μπορούν να διαμορφώσουν αρνητικά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου αναστέλλοντας την ενεργοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης /cdk2 [32]. Η ενεργοποίηση του Akt μπορεί επίσης φωσφορυλιώνει p21Cip1 /WAF1 και κρατήστε το στο κυτταρόπλασμα, η οποία μπορεί να είναι κρίσιμη για την επιβίωση των κυττάρων [33]. Μετά τη θεραπεία XB130 siRNA, η φωσφορυλίωση της p27kip1 και p21Cip1 /WAF1 μειώθηκαν σημαντικά και στις δύο κύτταρα WRO και Α549 (Εικ. 4Α και Β).

(Α και Β) κάτω ρύθμιση των XB130 μειωμένη φωσφορυλίωση της p21 και ρ27, και αυξημένη έκφραση του p21 σε WRO και Α549 κύτταρα. Εκφράσεις του p27 και p53 δεν επηρεάστηκαν από τα κάτω ρύθμιση των XB130. (Γ και Δ) κάτω ρύθμιση των XB130 μειώθηκε φωσφορυλιώσεις των FOXO3a και ΟδΚ3β στο WRO και Α549 κύτταρα.

Ν

= 4. *

σ

& lt?. 0.05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA)

Η

κάτω ρύθμιση των XB130 επίσης αυξηθεί σημαντικά το συνολικό επίπεδο της πρωτεΐνης του p21Cip1 /WAF1 (Εικ. 4Α και Β). FOXO3a μπορεί να συνδεθεί με και να ενεργοποιούν τον υποκινητή της p21Cip1 /WAF1, η οποία έχει forkhead δεσμευτικά στοιχεία δίπλα σε ένα στοιχείο SMAD δέσμευσης. PI3K /Akt μεσολάβηση φωσφορυλίωσης FOXO3a μπορούν να οδηγήσουν σε εξαγωγή του από τον πυρήνα και στη συνέχεια να αποτρέψει την έκφραση του γονιδίου p21Cip1 /WAF1 [34]. Η knockdown XB130 μείωσαν την φωσφορυλίωση του FOXO3a (Thr32), χωρίς να επηρεάζει τα συνολικά επίπεδα FOXO3a (Σχ. 4C και D). Αυτή η μειωμένη φωσφορυλίωση FOXO3a μπορεί να βοηθήσει να αυξήσει την έκφραση p21Cip1 /WAF1. Μεταξύ των μελών της οικογένειας FOXO, FOXO1 είναι γνωστό ότι διεγείρει μεταγραφή p27kip1 [35]. Η knockdown XB130 δεν ήταν σε θέση να αλλάξουν τη φωσφορυλίωση FOXO1 (τμημάτων Thr24) και FOXO1 (Ser256) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συμπτωματικά, η θεραπεία XB130 siRNA δεν είχε καμία επίδραση επί των επιπέδων της πρωτεΐνης p27kip1 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 4Α και Β).

Ένας άλλος μηχανισμός με τον οποίο Akt μπορεί να προάγει πολλαπλασιασμό κυττάρου είναι να φωσφορυλιώνει και απενεργοποιούν ΟδΚ3β, προστατεύοντας έτσι κυκλίνη D1 , ενίσχυση της δραστικότητας /CDK6 CDK4, και να διευκολύνουν την είσοδο των κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου [36]. Η φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β μειώθηκε μετά από αγωγή XB130 siRNA (Σχ. 4C και D). Η ρ53 ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που μπορεί να προκαλέσει είτε διακοπή αύξησης ή απόπτωση. Τα επίπεδα και οι δραστηριότητές του ελέγχεται κυρίως από MDM2, η οποία μπορεί να δεσμεύει ρ53 άμεσα και να προωθήσει ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του. Akt μπορεί να φωσφορυλιώσει MDM2 και έτσι να αυξήσουν p53 αποικοδόμηση [37]. Κάτω ρύθμιση των XB130 με siRNA, ωστόσο, δεν επηρέασε p53 επίπεδα.

Akt μπορεί να αναστείλει την απόπτωση μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Για παράδειγμα, Akt είναι σε θέση να φωσφορυλιώσει procaspase-9, αποτρέποντας τον διαχωρισμό του σε προ-αποπτωτικά κασπάσης-9, η οποία μεσολαβεί εγγενή σήμα κινηθεί απόπτωση [38]. Αναστολή της Akt ενισχυμένης TRAIL επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-8, η οποία μεσολαβεί εξωγενής σήμα κινηθεί απόπτωση [39]. Κάτω ρύθμιση της XB130 αύξησε την διάσπαση της κασπάσης-8 και caspease-9 σε κύτταρα WRO (Εικ. 5Α και Β). Σε κύτταρα Α549, τα κάτω ρύθμιση XB130 μειώθηκε procaspase-8 επίπεδο και αυξημένη διασπασμένη κασπάση-9 (Σχ. 5Α και Β). Η ενεργοποίηση (διάσπαση) της κασπάσης-8 και κασπάσης-9 είναι απαραίτητα βήματα για την εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια του κυτταρικού θανάτου, αντίστοιχα [23]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί τόσο εξωγενών και ενδογενών σημάτων που επάγεται κυτταρικός θάνατος ενισχυθεί με αγωγή XB130 siRNA.

(Α και Β) διασπασμένων θραυσμάτων και των δύο κασπάσης-8 και 9-ήταν σαφώς αυξήθηκε κατά χτυπήσει τα κάτω του XB130 σε κύτταρα WRO. Σε κύτταρα Α549, τα κάτω ρύθμιση XB130 μειώθηκε procaspase-8 και αυξημένη διασπασμένη κασπάση-9.

n

= 4. Μέση τιμή ± SEM. *

σ

& lt?. 0.05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA)

Η

Η φωσφορυλίωση του p21Cip1 /WAF1 από Akt μπορεί να οδηγήσει σε κυτταροπλασματική συσσώρευση και προάγει την κυτταρική επιβίωση [40]. Forkhead παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας μπορούν να πυροδοτήσουν απόπτωση μέσω επαγωγής της έκφρασης των γονιδίων που είναι κρίσιμες για κυτταρικό θάνατο, όπως Bim και συνδέτη Fas [41], [42]. Akt μπορεί να φωσφορυλιώσει FOXO3a, για να εμποδίσει τη μετατόπιση της από κυτόπλασμα μέσα στον πυρήνα [41]. Ετσι, ρύθμιση προς τα κάτω του XB130 με siRNA μείωσε την φωσφορυλίωση του p21Cip1 /WAF1 (Εικ. 4Α και Β) και FOXO3a (Σχ. 4C και D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι XB130 εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης μέσω πολλαπλών μορίων κατάντη της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι.

Συζήτηση

XB130 έχει βρεθεί να είναι ένα υποστρώματος και εταίρο σύνδεσης του RET /PTC, ένα ογκογόνο πρωτεΐνη τυροσίνη κινάση [12]. Πρόσφατα, έχουμε βρει έκφραση XB130 σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών που προέρχονται από θυρεοειδή, πνεύμονα, οισοφάγου, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι XB130 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των WRO καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων (με RET /PTC μετάλλαξη) και κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Α549 (χωρίς RET /PTC μετάλλαξη). Κάτω ρύθμιση των XB130 με siRNA μείωσε επίσης τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του οισοφάγου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι, εκτός από RET /PTC XB130 μπορεί να μεσολαβήσει δραστηριότητες των άλλων πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης. Πράγματι, όταν συν-εκφράζεται με XB130, αρκετές κινάσες τυροσίνης υποδοχέα και κινασών τυροσίνης μη υποδοχέα ήταν σε θέση να αυξήσουν σημαντικά την φωσφορυλίωση του XB130. Έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι η οικογένεια αναστολείς Src, ΡΡ1 ή ΡΡ2, κατήργησε cAMP προκαλούμενη φωσφορυλίωση τυροσίνης του XB130 και την αλληλεπίδρασή του με ρ85 ΡΙ3Κ [27]. Ως εκ τούτου, είναι εύλογο ότι XB130 μπορούσε να είναι ένα υπόστρωμα πολλαπλών κινασών τυροσίνης πρωτεΐνης, και μπορεί να μεσολαβήσει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και επιβίωση σε πολλαπλούς τύπους καρκινικών κυττάρων.

XB130 δεσμεύεται ειδικά p85α υπομονάδα της ΡΙ3Κ, το οποίο στη συνέχεια ενεργοποιούν Akt. Akt διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση. Κάτω ρύθμιση των XB130 με siRNA που πλήττονται πολλαπλά μόρια κατάντη της Akt. Αυτό υποδηλώνει ότι XB130 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής στην PI3K /Akt που σχετίζονται με τον καρκίνο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης.

Η

Κατά την τελευταία δεκαετία, έχει υπάρξει μια αυξανόμενη εστίαση στην PI3K /Akt μονοπατιού ως μία από τις κεντρικές οδοί για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση [43], [44], [45]. Η

class-Ια

ΡΙ3Κ είναι ετεροδιμερή με μια ρυθμιστική υπομονάδα (p85α, ρ85β ή p55δ) και P110 καταλυτική υπομονάδα (ρ110α, ρ110β ή ρ110δ) [46]. Ειδικά υπολείμματα φωσφοτυροσίνης επί ενεργοποιημένων υποδοχέων αυξητικού παράγοντα ή σε πρωτεΐνες προσαρμογέα μπορεί να συνδεθεί με SH2 περιοχές ρ85, η οποία αυξάνει την ενζυματική δραστικότητα του ρ110 καταλυτικής υπομονάδας και επίσης στρατολογεί το ένζυμο σε μεμβράνη, όπου καταλύει το σχηματισμό λιπιδίων δεύτερου αγγελιοφόρου, ΡΙΡ3, από φωσφορυλιώνουν phosphoatidylinositol-4,5-διφωσφορικής (PIP2) στη θέση 3 ‘στο δακτύλιο ινοσιτόλη της [47] (Εικ. 6). Βρήκαμε μια δεσμευτική συναινετική ρ85 θέση (ΥχχΜ) στην Ν-άκρο της XB130 που μπορούν να συνδεθούν είτε στο Ν-ή το πεδίο SH2 Ο-τερματικό του p85α προσδιορίζεται με αναλύσεις καθέλκυσης πρωτεΐνη σύντηξης GST και ότι XB130 είναι συν-ανοσοκατακρημνίστηκαν με p85α σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος του θυρεοειδούς TPC-1. Φωσφο-πεπτίδιο που περιέχει την αλληλουχία του ΥχχΜ XB130 (αλλά όχι κανένας-φωσφορυλιωμένη μορφή της) μειώνεται XB130 /αλληλεπίδραση ρ85 και διαγραφή του Ν-άκρου, καταργούνται αλληλεπίδραση μεταξύ XB130 και ρ85 [12]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, Yamanaka et al. XB130 βρέθηκε αρουραίου συνδέθηκε με p85 υπομονάδα της PI3K, και το ονόμασαν ως PI3KAP. Η αλληλεπίδραση αυτή είναι απαραίτητη για την ενίσχυση της cAMP που προκαλείται από την ενίσχυση του μιτογόνου δραστικότητας IGF σε FRTL-5 θυρεοειδικών κυττάρων [27]. Στην παρούσα μελέτη, η αλληλεπίδραση μεταξύ XB130 και ρ85 βρέθηκε και στα δύο του θυρεοειδούς και καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα. Είναι σημαντικό ότι, κάτω ρύθμιση των XB130 επηρεάζονται πολλές πρωτεΐνες του PI3K /Akt μονοπατιού κατάντη. Αυτά τα αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι XB130 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της PI3K μονοπατιού μέσω ειδικών της δέσμευσης με την p85.

Η ενεργοποίηση της Akt είναι ένα χαρακτηριστικό των καρκίνων του θυρεοειδούς [48], [49], [50]. όγκων του πνεύμονα παρουσιάζουν επίσης υψηλό επίπεδο της φωσφορυλιωμένης Akt [51]. Θεραπεία του θυρεοειδούς ή κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα με αναστολείς ΡΙ3Κ, LY294002 ή wortmannin, οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων ή βιωσιμότητα [48], [49], [50], [52], [53], [54]. Λόγω της κρίσιμο ρόλο του στη ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και επιβίωση, Akt έχει εμπλακεί σε πολλούς τύπους καρκίνου [47], [55]. Προσδιορισμός των XB130 ως ένας αποτελεσματικός ρυθμιστής ανάντη της PI3K /Akt μονοπατιού μπορεί να αποκαλύψει νέους θεραπευτικούς στόχους για την θεραπευτική του καρκίνου.

ογκοπρωτεΐνες μπορούν να ενισχύσουν την ανάπτυξη του όγκου με την αλλαγή εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και /ή ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου. Κάτω ρύθμιση του XB130 με siRNA όχι μόνο την εξέλιξη μειωμένη κυτταρικού κύκλου, αλλά επίσης βελτιωμένη κυτταρικού θανάτου, δεικνύοντας ότι XB130 είναι ένα βασικό ανάντη ρυθμιστή των δύο κυτταρικών διαδικασιών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι XB130 ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και επιβίωση μέσω πολλαπλών μορίων, συμπεριλαμβανομένων p21Cip1 /WAF1, p27kip1, FOXO3a, ΟδΚ3β, κασπάση 8 και 9 Caspase (Εικ. 6). Παρά το γεγονός ότι δεν εξέτασε όλα τα γνωστά υποστρώματα της Akt, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι XB130 ασκεί ρυθμιστική λειτουργία του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης μέσω του PI3K /Akt μονοπατιού. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση XB130 δεν επηρέασε κατάντη ρυθμιστές FOXO1 και ρ53 που δείχνει ότι εκτός από XB130 σχετίζονται δραστηριότητα Akt, αυτά τα μόρια μπορούν να ρυθμιστούν περαιτέρω από άλλους μηχανισμούς σηματοδότησης, το οποίο με τη σειρά του διασφαλίζει την ειδικότητα των λειτουργιών XB130 συνδέονται.

με λίγα λόγια, δείξαμε ότι XB130 θα μπορούσε να ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση μέσω της ρύθμισης της PI3K /Akt μονοπατιού στο θυρεοειδή και τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. XB130 θα μπορούσε να είναι μία νέα ογκοπρωτεΐνη σε πολλαπλές μορφές καρκίνου. Παρεμβολή RNA έχει γίνει ένα ισχυρό εργαλείο για τη ρύθμιση της γονιδιακής λειτουργίας τόσο

in vitro

και

in vivo

[56], [57]. Στόχευση έκφραση XB130 με αυτή την τεχνική θα μπορούσε να είναι μια ελκυστική επιλογή για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

κάτω ρύθμιση των XB130 με siRNA δεν επηρέασε την απόπτωση σε κύτταρα Α549 με την παρουσία 10% FBS. Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε DMEB συν 10% FBS. (Α) προς τα κάτω ρύθμιση του XB130 δεν ενίσχυσε αυθόρμητη και επάγεται θάνατος των κυττάρων. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 ηΜ STS, ή 500 ng /ml FasAb για 24 ώρες. (Β) FasAb (500 ng /ml) με ΙΡΝ-γ (100 ng /ml) δεν προκάλεσε απόπτωση, όπως αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ΡΙ /διπλή χρώση αννεξίνης V.

n

= 3. Μέση τιμή ± SEM. (Γ) έκφραση του Fas επιβεβαιώθηκαν στο Α549 και κύτταρα WRO με western αποτύπωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043646.s001

(TIFF)

Εικόνα S2. επίπεδα

φωσφορυλίωση της Src και MAPKs στην WRO και Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή XB130 siRNA. Φωσφορυλιώσεις της Src, ERK και JNK δεν επηρεάστηκαν από κάτω ρύθμιση των XB130 στην WRO και Α549 κύτταρα, ενώ phosphrylation της p38 ήταν αύξηση στα κύτταρα WRO.

n

= 4. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με κηλίδωση Western. Η μέση ± SEM. *

σ

& lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043646.s002

(TIFF)