Abstract

Πρόσφατες ενδείξεις συνδέει ανώμαλη ενεργοποίηση του Hedgehog (Hh) σηματοδότησης με την παθογένεση πολλών καρκίνων συμπεριλαμβανομένων μυελοβλάστωμα, γλοιοβλάστωμα, το μελάνωμα καθώς και το πάγκρεας, του παχέος εντέρου, και καρκινώματα του προστάτη. Εδώ ερευνήσαμε το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα Gli1 στον καρκίνο των ωοθηκών. Για το σκοπό αυτό, το προφίλ έκφρασης του Gli1 εξετάστηκε σε φυσιολογικές ωοθήκες, όγκοι ωοθηκών, και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, και ο

in vitro

επιδράσεις ενός συγκεκριμένου αναστολέα HH-μονοπάτι, KAAD-κυκλοπαμίνη, ή μια συγκεκριμένη αναστολέα Gli1 (GANT58) επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και στην έκφραση του γονιδίου-στόχου Hh αξιολογήθηκαν επίσης. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται έδειξαν ότι τα επιθηλιακά κύτταρα σε ιστό καρκίνου των ωοθηκών εκφράζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα πυρηνικής Gli1 ό, τι σε κανονικό ιστό ωοθήκης, όπου η πρωτεΐνη ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη. Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η πυρηνική Gli1 συσχετίστηκε ανεξάρτητα με κακή επιβίωση σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών ορώδες (HR = 2,2, 95% CI 1,0 – 5,1, p = 0.04).

In vitro πειράματα απέδειξαν

έκφραση Gli1 στις τρεις κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ωοθήκης που δοκιμάστηκαν, Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αν και KAAD-κυκλοπαμίνη οδήγησε σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυτή η θεραπεία δεν ανέστειλε hedgehog έκφραση του γονιδίου-στόχου σε οποιαδήποτε από τις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, που υποδηλώνει ότι η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ήταν ένα μη ειδικό ή τοξική επίδραση. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό όταν κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GANT58. Συνολικά, τα κλινικά δεδομένα μας υποστηρίζουν το ρόλο του Gli1 ως προγνωστικός δείκτης σε προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών ορώδες και ως πιθανός θεραπευτικός στόχος σε αυτή τη νόσο. Ωστόσο,

in vitro

ευρήματά μας εφιστούν την προσοχή στην ανάγκη για την επιλογή των κατάλληλων πειραματικών μοντέλων που αντιπροσωπεύουν με ακρίβεια την ανθρώπινη όγκου για τη δοκιμή μελλοντικές θεραπείες που περιλαμβάνουν αναστολείς της οδού Hh

Παράθεση:. Ciucci Α, De Stefano Ι, Vellone VG, Lisi L, Μποτόνι C, Scambia G, et al. (2013) Έκφραση του γλοιώματος Associated Oncogene ομόλογο 1 (Gli1) σε προχωρημένους υδαρής καρκίνου των ωοθηκών συνδέεται με δυσμενείς συνολική επιβίωση. PLoS ONE 8 (3): e60145. doi: 10.1371 /journal.pone.0060145

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 7 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 22 Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 28, Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Ciucci et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι μια από τις κύριες αιτίες της. θανάτου στις γυναίκες κακοήθειες στη μεγάλη πλειονότητα των ανεπτυγμένων χωρών [1]. Πράγματι, δεδομένου ότι η ασθένεια έχει λίγα συμπτώματα στα πρώτα στάδια της ανάπτυξής του, η πλειοψηφία των γυναικών έχουν διαγνωστεί μετά ο πρωτογενής όγκος έχει ήδη κάνει μετάσταση? παρά την αρχική απόκριση σε χειρουργική debulking και την θεραπεία πρώτης γραμμής με καρβοπλατίνη και πακλιταξέλη, οι περισσότεροι όγκοι τελικά αναπτύσσουν αντίσταση στο φάρμακο και το 5-ετή επιβίωση είναι γενικά κάτω από 30% [2]. σήμα, αν και έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για να διευκρινιστεί η αιτιολογία των ωοθηκών καρκινογένεση και των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αυτή η ασθένεια παραμένει μια από τις λιγότερο κατανοητές των μεγάλων ανθρώπινων κακοηθειών.

Ο σκαντζόχοιρος Sonic (Shh) -transduction οδός είναι σημαντική στη ρύθμιση σχηματοποίησης, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την ανάπτυξη των πολλά κύτταρα και ιστούς, στο έμβρυο και τον ενήλικα. Δεσμευτική της εκκριτικής συνδέτες Hh (Sonic, ινδική ή της ερήμου, ΕΛΕΡΠΕ, ΙΗΗ ή DHH) με τον υποδοχέα διαμεμβρανική τους ΡαίοΗβά (Ptch1) ξεκινά την κλασσική οδό σηματοδότησης Hh με την απελευθέρωση λειανθούν (ΠΕΑ) από Ptch1-εξαρτώμενη καταστολή. ΠΕΑ διαμορφώνει ένα κυτταροπλασματικό σύμπλοκο που περιέχει Καταστολή της Fused (Sufu), ενεργοποιώντας έτσι τις 3 γλοιώματος που σχετίζονται με (Gli) μεταγραφικές ρυθμιστικές αρχές. επάγει Gli1 και Gli3 καταστέλλει τα γονίδια στόχους Hh που περιλαμβάνουν

Gli1

,

PTCH1

,

κυκλίνης D1

,

c-Myc

, και

Bcl -2

, ενώ Gli2 μπορεί να δράσει είτε σε θετικό ή αρνητικό τρόπο, ανάλογα με μετα-μεταγραφικό και μετα-μεταφραστική επεξεργασία εκδηλώσεις [3].

ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh έχει εμπλακεί σε αρκετές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος, του εγκεφάλου , του παχέος εντέρου, των πνευμόνων, του προστάτη, του αίματος και του παγκρέατος, μεταξύ άλλων, κινείται είτε από έναν συνδέτη εξαρτημένα ή μια οδό ανεξάρτητη συνδεσμικού [4], [5]. εξαρτώμενη Ligand μονοπάτι Hh μπορεί είτε να είναι αυτοκρινής, όπου ο συνδέτης Hh που παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα δρουν επί γειτονικών κυττάρων όγκου προκαλεί την ενεργοποίηση του μονοπατιού κυτταρικού αυτόνομα, ή μπορεί να περιλαμβάνει έναν παρακρινή μηχανισμό όπου Hh συνδέτης εκκρίνεται από το επιθήλιο σηματοδοτεί την υποκείμενη στρωματικό διαμέρισμα για να δημιουργήσει ένα ευνοϊκές μικροπεριβάλλον που υποστηρίζει την ανάπτυξη του όγκου. Αυτοκρινές σηματοδότηση φαίνεται στην περίπτωση του πνεύμονα και του προστάτη, ενώ στην περίπτωση του καρκίνου των ωοθηκών και του παχέος ο παρακρινής μηχανισμός φαίνεται διαδεδομένη [4], [5]. Στην σηματοδότηση συνδέτη ανεξάρτητη, η οδός Hh ενεργοποιείται σε ένα κύτταρο-ενδογενούς τρόπο μέσω μεταλλάξεων απώλειας λειτουργίας σε αρνητικό δράσης συστατικά, όπως Ptch1 και Sufu, ή μέσω μεταλλάξεων κέρδος-of-λειτουργίας σε θετική δράσης εξαρτήματα , όπως Smo [4]. Εκτός αυτού, η σηματοδότηση Hh-Gli αλληλεπιδρά με άλλες οδούς σηματοδότησης σε αμφίδρομη και το πλαίσιο-συγκεκριμένους τρόπους, και πολλά στοιχεία δείχνουν ότι το πλαίσιο που εξαρτάται από ρύθμιση του κώδικα Gli από ογκογονίδια και κατασταλτικά του όγκου αποτελεί τη βάση για την ευρεία συμμετοχή των Gli1 σε ανθρώπινους καρκίνους, αυτή η πρωτεΐνη υποστήριξη της προόδου των όγκων και τη μεταστατική μετάβαση [6], [7]. Αξιοσημείωτα, στον καρκίνο των ωοθηκών, η οδός Hh μπορεί επίσης να αλληλεπιδράσει με το οιστρογόνο σηματοδότησης σε ένα πολύπλοκο δίκτυο ρύθμισης της φαινοτυπική πλαστικότητα [8].

Στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν η οδός Hh ενεργοποιείται σε ωοθηκών Καρκίνος. Για το σκοπό αυτό πρέπει πρώτα να διερευνηθεί ανοσοϊστοχημικά την έκφραση της πρωτεΐνης Gli1 στην κανονική επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών και σε προχωρημένη ορώδες καρκίνους των ωοθηκών και συσχετίστηκε η έκφραση της με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και τα αποτελέσματα των ασθενών. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση του Gli1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, και ο

in vitro

επιδράσεις ενός συγκεκριμένου hedghehog μονοπάτι blocker, KAAD-κυκλοπαμίνη [9], [10] ή ένας ειδικός αναστολέας Gli1, GANT58 [ ,,,0],11], επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και επί hedgehog έκφραση γονιδίου-στόχου. Gli1 είναι στην πραγματικότητα θεωρείται ως το απόλυτο και επομένως κρίσιμο ενεργοποιητής της μεταγραφής του μονοπατιού Hh? μεταγραφή του προκαλείται από σηματοδότηση Hh, καθιστώντας το, μέχρι στιγμής, η καλύτερη αξιόπιστη δείκτης ενός ενεργού οδού, μεταγράφεται με συνέπεια σε HH-αποκρινόμενα κύτταρα [7]. Εκτός αυτού, Gli1 έχει θεωρηθεί κατάλληλος στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, διότι είναι προς τα κάτω των πολλών μονοπατιών σηματοδότησης [12].

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη που λαμβάνεται έγκριση από την Επιτροπή Ηθικής του Καθολικού Πανεπιστημίου της Ιερής Καρδιάς, Ρώμη, Ιταλία και οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των ιστών και αναλύσεις.

ασθενείς

Στη μελέτη συμμετείχαν 56 ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών ορώδες δεκτός στην Ογκολογική Μονάδα Γυναικολογικής, Καθολικό Πανεπιστήμιο της Ρώμης, μεταξύ Μαρτίου 2000 και Δεκεμβρίου 2008. Μακροσκοπικά και ιστοπαθολογικά φυσιολογικές ωοθήκες, αφαιρούνται για λόγους προφύλαξης, ελήφθησαν επίσης από 12 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Οι κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά της συνολικής σειράς συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Σύμφωνα με το πρότυπο κατευθυντήριων γραμμών, η μέγιστη χειρουργική προσπάθεια επιχειρήθηκε σε όλους τους ασθενείς με αποτέλεσμα την πλήρη εκτομή (υπολειπόμενο όγκο μηδέν χιλιοστά) σε 35 (63%) περιπτώσεις. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία με πλατίνα (75-100 mg /m

2 για τη σισπλατίνη, AUC = 5 για καρβοπλατίνη, ανά κύκλο). Πενήντα ασθενείς (89,3%) έλαβαν επίσης πακλιταξέλη (135-175 mg /m

2 για κάθε κύκλο). Υποτροπή της νόσου ορίστηκε σύμφωνα με τα κριτήρια GCIG CA125 [13], [14] και /ή ακτινολογική επιβεβαίωση της εξέλιξης του όγκου. Για να ορίσετε χημειοευαισθησία, χρησιμοποιήσαμε τον κοινό ορισμό της αντίστασης πλατίνας, ορίζει ως «ευαίσθητα» ασθενείς που υποτροπίασαν 6 μήνες ή περισσότερο μετά από προηγούμενη χημειοθεραπεία που περιέχουν λευκόχρυσο, και ως «ανθεκτική» ασθενείς που υποτροπίασαν λιγότερο από 6 μήνες μετά τη χημειοθεραπεία σταμάτησε, ή ότι προχώρησε τη διάρκεια της θεραπείας [15]. Συνέχεια υπήρχαν διαθέσιμα στοιχεία για όλους τους 56 ασθενείς (διάμεση παρακολούθηση 35 μηνών? Εύρος, 9-127 μήνες). Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης, την εξέλιξη και το θάνατο της ασθένειας παρατηρήθηκαν στα 42 και 23 ασθενείς, αντίστοιχα.

Η

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, διαδικασία ανάκτησης αντιγόνου διεξήχθη με μικροκύματα θέρμανση του φούρνου σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ = 6). Οι τομές επωάστηκαν με 20% κανονικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να μειωθεί η μη ειδική δέσμευση. Κύτταρα που εκφράζουν Gli1 (κλώνος H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, αραίωση 1:50), εντοπίστηκαν μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C. Αντίσωμα που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκε για εξειδίκευση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17] – [20]. Οι τομές επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα (αίγας αντι-κουνελιού) για 30 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πλάκες αναπτύχθηκαν με (Σύστημα υπόστρωμα DAB, DakoCytomation) διαμινοβενζιδίνη, αντίθετη χρώση με αιματοξυλίνη Mayer, η αφυδατωμένη σε αιθανόλη και ξυλένιο, και τελικά τοποθετηθεί. καρκίνωμα βασικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος. Χρώση χωρίς πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

Αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημική χρώση

Η έκφραση αξιολογήθηκε με την εξέταση του ποσοστού των κυττάρων που παρουσιάζουν ανοσοαντιδράσεως σε ένα ελάχιστο 500 ιστολογικά προσδιορίζονται νεοπλασματικά κύτταρα. χρώση Gli1 παρατηρήθηκε και στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα των κυττάρων καρκινώματος των ωοθηκών. Ωστόσο, όπως Gli1 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής, μόνο η έκφραση της πυρηνικής Gli1 ήταν σκόραρε για αναλύει τα επόμενα στοιχεία και μελέτες συσχέτισης. Ανοσοχρώση αξιολογήθηκε από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές (GFZ και VGV), οι οποίοι δεν γνώριζαν τη διάγνωση των ασθενών. Για να ορίσετε μια τιμή αποκοπής για Gli1, συγκρίναμε την πυρηνική ανοσολογική αντίδραση μετράται σε κανονική έναντι καρκινικών ιστών. Ανοσοαντιδραστικότητα απουσίαζε στα επιθηλιακά κύτταρα όλων των αλλά μία κανονική ωοθήκες, με ένα μόνο δείγμα που δείχνει ένα ασθενές αντίδραση χρώσης σε περίπου 10% των κυττάρων. Τομές όγκων στις οποίες & gt? χρωματίστηκαν 10% των κυττάρων ήταν ως εκ τούτου θεωρούμε ότι είναι θετικό

Cell Culture

Οι κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ωοθηκών Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3 αγοράστηκαν από την. η Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (ECACC, Salisbury, UK). OVCAR-3 και Α2780 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Lonza, Βασιλεία, Ελβετία), SKOV-3 αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (Lonza). Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Lonza), 2 mM γλουταμίνη και αντιβιοτικά (100 mg /ml στρεπτομυκίνη και 100 IU /ml πενικιλίνη) (Lonza). Όλες οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα (2,0 έως 4,0 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) τοποθετήθηκαν σε slide θάλαμο δύο καλά (slide Nunc® Lab-Tek® II Επιμελητηρίου, Nunc, Inc., Naperville, IL). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση. Τα πλακίδια πλύθηκαν δύο φορές με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100. Η ενδογενής υπεροξειδάση αποκλείσθηκε με 3% Η

2O

2 για 5 λεπτά. Μετά από πλύσιμο δύο φορές με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 20% φυσιολογικό ορό αλόγου σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η περίσσεια του διαλύματος μπλοκαρίσματος στραγγίσθηκε, και τα δείγματα επωάστηκαν με μια αραίωση 1:50 αντι-Gli1 αντίσωμα (κλώνος Η-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology) όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Τα δείγματα κατόπιν ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα, EnVision System-HRP (Dako, Carpinteria, CA), για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα 3,3′-διαμινοβενζιδίνης (Σύστημα υπόστρωμα DAB, Dako). Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Mayer, η αφυδατωμένη σε αιθανόλη και ξυλένιο, και, τέλος, τοποθετημένα.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Α2780 (3,0 × 10

4 ανά φρεάτιο), OVCAR-3 (2,0 × 10

4 ανά φρεάτιο) και SKOV-3 (2,0 χ 10

4 τοις κύτταρα φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε πλήρες μέσο καλλιέργειας. Μετά από ολονύκτια επώαση, το μέσο αλλάχθηκε σε 2% FBS που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις του KAAD-κυκλοπαμίνη (Santa Cruz Biotechnology), ή GANT58 (Calbiochem, San Diego, CA). Ουσίες διαλύθηκαν σε απόλυτη DMSO και αραιώνονται σε κατάλληλο μέσο καλλιέργειας αμέσως πριν από τη χρήση. Τα κύτταρα ελέγχου έλαβαν την ίδια ποσότητα DMSO αραιωτικού. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, και τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Nucleocounter (Chemometec, Allerod, Δανία). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές εις διπλούν.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Όλα κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών σπάρθηκαν (4.0 × 10

3 ανά φρεάτιο) σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο καλλιέργειας. Μετά από ολονύκτια επώαση, το μέσο αλλάχθηκε σε 2% FBS που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις του KAAD-κυκλοπαμίνη (Santa Cruz Biotechnology) ή GANT58 (Calbiochem). Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε ποσοτικά με μέτρηση της μείωσης ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο, μια τετραζόλη) για να παραχθεί ένα σκούρο μπλε προϊόν φορμαζάνης. ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο 48 ώρες μετά την έναρξη της προσβολής. Μετά από 3 ώρες επώαση, η διαλυτοποίηση /Stop Solution προστέθηκαν στα φρεάτια καλλιέργειας για τη διαλυτοποίηση του προϊόντος φορμαζάνης, και η απορρόφηση στα 570 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας 96-φρεατίων (Victor 1420, Wallac, Perkin Elmer). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές εις διπλούν.

Ανάλυση Western Blot

εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν μετά από λύση σε ρυθμιστικό που περιέχει 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 0.2 Μ NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 0,5% ΝΡ-40, 10% γλυκερόλη συμπληρωμένο με αναστολείς φωσφορικό άλας και πρωτεάσης. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg /δείγμα) διαχωρίστηκαν με SDS βαθμίδας πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής (4-20%) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (μεταφορά Immobilon-P μεμβράνη, Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% (w /v) σκόνη άπαχου γάλατος σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween 20 (TBST) και επωάζονται με πρωτεύοντα αντισώματα (Gli1: H300, Santa Cruz Biotechnology? Β-ακτίνη: A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σε TBST με 3% άπαχο ξηρό γάλα, στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση τρεις φορές με TBST, οι μεμβράνες σημάνθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Συγκεκριμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με το σύστημα ECL κηλίδωσης Western σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Ανάλυση β-ακτίνης κηλίδος Western διεξήχθη ως έλεγχος της ίσης φόρτωσης δείγματος.

mRNA ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ολικό RNA απομόνωση NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel GmbH & amp? Co. KG) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας κιτ RETROscript (Ambion®, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για την αξιολόγηση ποσοτικές αλλαγές στα επίπεδα Gli1 mRNA, κάθε μίγμα αντίδρασης RT στη συνέχεια υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο PCR (Q-PCR) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες κύκλου: 35 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 20 s? ανόπτηση και επέκταση στους 60 ° C για 20 s? χρησιμοποιώντας το Brilliant ΙΙΙ Ultra-Fast SYBR® Πράσινο QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε ένα όγκο αντίδρασης 20 μL σε πραγματικό χρόνο PCR μηχάνημα MX3000P (Stratagene). Οι εκκινητές PCR για την ανίχνευση ειδικών μεταγράφων ήταν ως ακολούθως: Gli1, 5′-GCCAGCCAAGAGAGACCAACAG-3 ‘και 5′-CCGACAGAGGTGAGATGGACAG-3′? β-ακτίνης 5’-ACG TTG CTA TCC ΑΓΓ CTG TCC ΑΤ-3 ‘και 5′-ΤΤΑ ATG TCA CGC ACG ΑΤΤ TCC CGC-3’. Σχετική συγκεντρώσεις mRNA υπολογίστηκαν από το σημείο απογείωσης των αντιδράσεων (κύκλος κατωφλίου, CT) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής ποσοτικοποίηση πραγματοποιείται από λογισμικό Stratagene και με βάση την -ΔΔCt μέθοδο. Αυτή η ανάλυση προσεγγίζει στόχος ενός δεδομένου δείγματος mRNA (Gli1) επίπεδο σε σχέση με τη μέση τιμή των επιπέδων mRNA στόχου σε χωρίς θεραπεία ελέγχους ( «βαθμονομητή» αξία), επιτρέποντας έτσι στατιστική ανάλυση του απόκλιση από τη μέση ακόμη και μεταξύ των ελέγχων. τιμές Ct για την έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως σήμα ομαλοποίηση. Σε κάθε δοκιμασία, η αποτελεσματικότητα της PCR υπολογίστηκε επίσης με χρήση σειριακή αραίωση ενός πειραματικό δείγμα? τιμές απόδοσης μεταξύ 80 και 100% αποτελέσματα για κάθε σετ εκκινητών και λαμβάνονται υπόψη για την συγκριτική ανάλυση ποσοτικού προσδιορισμού.

Στατιστική Ανάλυση

Η έκφραση της Gli1 και τη σύνδεσή της με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας η μη παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney. Ελεύθερη νόσου επιβίωση και η συνολική επιβίωση ήταν υπολογίζονται από την ημερομηνία της διάγνωσης μέχρι την ημερομηνία της εξέλιξης /θανάτου, ή από την ημερομηνία δει για τελευταία φορά. Η προγνωστική επίδραση των διαφόρων παραμέτρων στην κλινική έκβαση (δηλαδή υποτροπή ή θάνατος της νόσου) ελέγχθηκε με γραφική παράσταση καμπυλών επιβίωσης σύμφωνα με τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίνοντας τις ομάδες χρησιμοποιώντας την δοκιμασία log rank, καθώς και με πολυμεταβλητή ανάλυση χρησιμοποιώντας το μοντέλο Cox . εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν από την ημερομηνία ιστολογική διάγνωση με το χρόνο της τελευταίας παρακολούθησης ή θάνατο. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, κάθε παράμετρος κατηγοριοποιήθηκε για μετέπειτα στατιστική ανάλυση. Μόνο μεταβλητές με ≤0.2 p-τιμή στην μονοπαραγοντική ανάλυση περιελήφθησαν στο πολυπαραγοντικό μοντέλο. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε

in vitro

πειράματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD και αναλύθηκαν με t-test δύο ουρών Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές εάν p ≤ 0,05. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού GraphPad Prism5 (San Diego, CA, USA). ανάλυση Cox εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το StatPlus 2009.

Αποτελέσματα

Gli1 Έκφραση in Advanced υδαρής ωοθηκών

Ένα σύνολο από 56 πρωτοβάθμια προηγμένων ορώδες καρκίνους των ωοθηκών και 12 φυσιολογικά ωοθηκών ιστούς από μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες αξιολογήθηκαν. Gli1 ανοσοαντιδραστικότητα απουσίαζε στην επιφάνεια επιθήλιο, καθώς επίσης και σε στρωματικά κύτταρα, των κανονικών ωοθηκών (σχ. 1Α) σε όλες εκτός από μία περίπτωση, αυτό το τελευταίο δείχνει ένα ασθενή πυρηνική χρώση σε περίπου 10% των κυττάρων. Μια θετική πυρηνική αντίδραση παρατηρήθηκε στο 29% των καρκινωμάτων ορώδες (Σχήμα 1Β).? κυτταροπλασματική ανοσοαντιδραστικότητα παρατηρήθηκε επίσης στην πλειονότητα των δειγμάτων που εξετάστηκαν. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η οδός σήμα ΗΗ ενεργοποιείται σε κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες για Gli1 ανοσοχρώση που δείχνει την έκφραση σε φυσιολογικό επιθήλιο ωοθήκης (Α), και υψηλή (Β) ή χαμηλή (C ) έκφραση σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών. καρκίνωμα βασικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (D). Μεγέθυνση 20x και 40x. καμπύλη επιβίωσης (Ε) Kaplan-Meier για την πιθανότητα επιβίωσης ελεύθερης νόσου και (F) συνολική επιβίωση, σύμφωνα με την έκφραση του πυρηνικού Gli1 σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών ορώδες. Θετική (& gt? 10%) έκφραση Gli1 στον πυρήνα συνδέεται σημαντικά με τη συνολική μειονέκτημα επιβίωση (p = 0.04)

Η

Ο Πίνακας 2 δείχνει μέση πυρηνική ανοσοδραστικότητα των Gli1 σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών ορώδες σύμφωνα με. κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Καμία συσχέτιση φάνηκε ανάμεσα στην έκφραση των πυρηνικών Gli1 και καμία από τις παραμέτρους που εξετάστηκαν.

Η

Η προγνωστική ρόλος της έκφρασης Gli1 τόσο για DFS και OS δοκιμάστηκε σε μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις προσαρμοσμένο για κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Μονομεταβλητό μοντέλο της DFS δεν ανίχνευσε καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Gli1 και της κλινικής έκβασης (Πίνακας 3, Σχ. 1Ε). Από την άλλη πλευρά, χρησιμοποιώντας ανάλυση Kaplan-Meier βρήκαμε ότι οι ασθενείς με έκφραση θετική Gli1 είχε δυσμενή συνολική πρόγνωση επιβίωσης? η διάμεση συνολική επιβίωση σε αυτό τον πληθυσμό ήταν 35 μήνες, ενώ παρέμεινε απροσδιόριστη για ασθενείς με αρνητικό Gli1, καθώς περισσότερο από το 50% από αυτούς ήταν ακόμη ζωντανοί κατά τη στιγμή της ανάλυσης (Ρ = 0,04) (Πίνακας 4, Εικόνα 1 F). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στο πολυπαραγοντικό μοντέλο, Gli1 πυρηνική έκφραση διατηρηθεί μια ανεξάρτητη αρνητικό προγνωστικό ρόλο για το OS (p = 0.04, Πίνακας 4).

Η

Κλασική προγνωστικούς παράγοντες σε προχωρημένους υδαρής ωοθηκών

Η προγνωστική ρόλος της ηλικίας κατά τη διάγνωση, η ιστολογική ποιότητα, υπολειμματικό όγκο, και τηςχημειοευαισθησίας τόσο για DFS και OS δοκιμάστηκε σε μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις (πίνακες 3 και 4). Η παρουσία του υπολειπόμενου όγκου στην πρωτοβάθμια χειρουργική επέμβαση (& gt? Μηδέν χιλιοστά) [21] και η πλατίνα-αντίσταση βρέθηκε να σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής της νόσου, τόσο στην μονοπαραγοντική (p = 0,003 και p & lt? 0,0001, αντίστοιχα) , και πολυπαραγοντική ανάλυση (ρ = 0,003 και ρ & lt? 0,0001, αντίστοιχα). Platinum-αντίσταση βρέθηκε επίσης να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δυσμενής μεταβλητή για το OS (p = 0,002).

Gli1 εκφράζεται σε Καρκίνωμα Ωοθηκών Κύτταρα

Για να διερευνηθεί μία πιθανή ρόλο για Gli1 στον καρκίνο των ωοθηκών , προσδιορίσαμε πρώτο επίπεδο πρωτεΐνης σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ωοθηκών Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3. Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση έδειξε Gli1 πυρηνική χρώση στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Α). Η έκφραση πρωτεΐνης ήταν δίπλα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος western χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό αντίσωμα που εγείρεται έναντι αμινοξέα 781-1080 του Gli1 ανθρώπινης προέλευσης (Εικόνα 2Α). Το αντίσωμα αναγνώρισε διάφορες μορφές οι οποίες ήταν σχεδόν ορατό σε όλες τις κυτταρικές σειρές: την 130 KDa ισομορφή πιθανόν ενεργεί ως ενεργοποιητής, η ασθενής καταστολέας 100 KDa [22], και μια πρόσθετη ζώνη 70 KDa δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί, αλλά έχει επίσης αναφερθεί σε κακόηθες πλευριτικό κύτταρο μεσοθηλίωμα καλλιέργειες [23].

(Α) Τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ωοθηκών, Α2780, SKOV-3, και OVCAR-3 υποβλήθηκαν σε ανοσοχρώση με αντίσωμα έναντι Gli1. Όλα τρεις κυτταρικές σειρές εκφράζουν Gli1. Η έκφραση πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε επίσης με ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 2% FBS μέσο και υποβάλλεται σε αγωγή με 2, 5 και 10 μΜ KAAD-κυκλοπαμίνη (K) ή GANT58 για 48 ώρες. KAAD-κυκλοπαμίνη θεραπεία αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές ενώ GANT58 δεν επηρεάζει την κυτταρική ανάπτυξη. Δεικνύονται ο αριθμός των κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό των κυττάρων DMSO-αγωγή (μέση τιμή ± SD από τρία διαφορετικά πειράματα? * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** Ρ & lt? 0.001, δοκιμασία t). έκφρασης (C) Gli1 mRNA εκτιμήθηκε με ανάλυση Q-PCR σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε επεξεργασία με 10 μΜ KAAD-κυκλοπαμίνης για 48 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής εναντίον κάθε αντίστοιχου ελέγχου (CTRL), λαμβάνεται ως βαθμονομητής για συγκριτική ανάλυση ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA. Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν, το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Γραφικά δείχνουν μέση τιμή ± SD.

Η

Η θεραπεία με KAAD-κυκλοπαμΐνης αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων των ωοθηκών καρκινώματα

Για να εξεταστεί αν η ενεργοποιημένη οδός HH είναι απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκίνωμα κύτταρα, Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3 εκτέθηκαν σε αυξανόμενη συγκέντρωση KAAD-κυκλοπαμίνη, μια ένωση ικανή να αναστέλλει τόσο Hh εξαρτώμενη από συνδετήρα και ανεξάρτητη ενεργοποίηση της οδού, μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης με Smo. Άμεση μέτρηση των βιώσιμων κυττάρων έδειξε ότι KAAD-κυκλοπαμίνη προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών (Εικόνα 2Β). Αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ επιβεβαίωσε την ανασταλτική επίδραση της KAAD-κυκλοπαμίνης στην ανάπτυξη των κυττάρων Α2780, ενώ δεν ανασταλτική επίδραση παρατηρήθηκε για SKOV-3 και OVCAR-3 κύτταρα (Σχ. S1). Ένα υπερ- ή υπο-εκτίμηση των αποτελεσμάτων ΜΤΤ σε σύγκριση με τα αποτελέσματα του αριθμού των κυττάρων έχει ήδη αναφερθεί από διάφορους συγγραφείς, οι μεγάλες παράγοντες που συμβάλλουν σε αυτή την ασυμφωνία που αντιπροσωπεύονται από τις διαφορές στο μέγεθος των κυττάρων, τη μορφολογία των κυττάρων, την ανάπτυξη των κυττάρων (cluster ή μονοστρωματική) ή μιτοχονδριακή δραστηριότητα [24] – [26]

Επίδραση της KAAD-κυκλοπαμίνης σε σηματοδότηση Hh

για να επιβεβαιωθεί ότι η μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vitro από

KAAD-κυκλοπαμίνη. οφειλόταν σε ειδική αναστολή του μονοπατιού Hh, αναλύσαμε την αλλαγή στη mRNA και επίπεδα πρωτεΐνης Gli1 σε αγωγή με φάρμακο κυτταρικές σειρές ωοθηκικού καρκινώματος. ανάλυση Q-PCR έδειξαν ότι η θεραπεία του Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3 με 10 μΜ KAAD-κυκλοπαμίνη δεν ρυθμίζει σημαντικά επίπεδα Gli1 μετά από 48 ώρες έκθεσης (Σχ. 2C). Η έλλειψη επίδρασης του KAAD-κυκλοπαμίνης στη δραστικότητα σηματοδότησης Hh επιβεβαιώθηκε επιπλέον με ανοσοστύπωμα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού του καρκίνου των ωοθηκών

in vitro από

KAAD-κυκλοπαμίνη δεν είναι ένα Smo μεσολάβηση συμβάν.

Η θεραπεία με GANT58 δεν αναστέλλει κυτταρικού πολλαπλασιασμού ωοθηκικών καρκινωμάτων Cells

για να επιβεβαιώσει την έλλειψη αποτελέσματος της διαμόρφωσης μονοπατιού Hh στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ωοθηκών, Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3 εκτέθηκαν σε αυξανόμενη συγκέντρωση GANT58, ένας ειδικός αναστολέας Gli1. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται έδειξαν ότι GANT58 δεν προκάλεσε καμία μείωση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών πολλαπλασιασμού (Σχ. 2Β). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. S1).

Συζήτηση

Αν και η ενεργοποίηση του μονοπατιού Hh έχει αποδειχθεί σε διάφορους τύπους κακοηθειών [5], υπάρχουν μόνο λίγες αναφορές που δείχνουν ότι σε δείγματα ανθρώπινου καρκινώματος ωοθήκης [27] – [30], με δύο μόνο την εξέταση του ρόλου προγνωστική των μορίων σήματος Hh σε καρκίνο των ωοθηκών. Εκτός αυτού, τα αποτελέσματα από αυτές τις δύο μελέτες ήταν αντικρουόμενα: Τσεν και οι συνεργάτες του [27] διαπίστωσε ότι μεταξύ των Shh, Dhh, Ptch, ΠΕΑ και Gli1, Dhh ήταν ο μόνος παράγοντας που σχετίζεται με την έκβαση της επιβίωσης, ενώ στη μελέτη του Liao [29] εξετάζει την προγνωστική ρόλος της Shh, Ptch, ΠΕΑ και Gli1, η τελευταία ήταν η μοναδική πρωτεΐνη ανεξάρτητα σχετίζονται με την επιβίωση των ασθενών. Δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία τη στιγμή που θα μπορούσε να βοηθήσει εξηγούν αυτή την διαφορά, αν και θα μπορούσε να οφείλεται στην ανάλυση των διαφόρων πληθυσμών από την άποψη του σταδίου και /ή histotype όγκου. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η προγνωστική ρόλο της Gli1 σε μια ομοιογενή πληθυσμό των προηγμένων ορώδες καρκίνων των ωοθηκών που δείχνουν ότι οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εκφράζουν χρώση των πυρηνικών Gli1 (& gt? 10%) να εμφανίσουν μικρότερη OS σε σύγκριση με αρνητικές περιπτώσεις (≤10%). Ο ανεξάρτητος ρόλος της έκφρασης Gli1 ως δείκτης κακής πρόγνωσης διατηρήθηκε από πολυπαραγοντική ανάλυση, μετά την προσαρμογή για την υπολειπόμενη όγκων σε χειρουργική επέμβαση και τηςχημειοευαισθησίας. Συνολικά τα ευρήματά μας δεν είναι μόνο να ενισχύσει την υπόθεση ότι Gli1 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο σημαντικό προγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο των ωοθηκών, αλλά και υποδηλώνουν ότι Gli1 εκφράζουν όγκοι ανταποκρίνονται καλά στις θεραπείες δεύτερης γραμμής, στηρίζοντας έτσι το δυναμικό θεραπευτική χρησιμότητα των συνδυασμών της Gli-παράγοντα στόχου με πρότυπες θεραπείες σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών.

σε αυτό το πλαίσιο, ήμασταν προτροπή να εξετάσουμε εάν το ενεργοποιημένο μονοπάτι Hh είναι ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Για το σκοπό αυτό κατ ‘αρχάς αξιολογείται από ανοσοκυτταροχημικές και ανοσοστύπωμα ανάλυση της έκφρασης του Gli1 σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, δηλ Α2780, SKOV-3 και OVCAR-3, αυτές οι μελέτες αποκαλύπτουν παρόμοια έκφραση πρωτεΐνης σε όλες τις 3 κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν. Δεδομένου ότι η κυκλοπαμίνη αναστέλλει σηματοδότηση Hh με σύνδεση προς και αποτρέποντας ενεργοποίηση από Smo [31], από την επόμενη αξιολόγησε τη συμβολή του αυτοκρινούς σηματοδότηση για την ανάπτυξη του όγκου με τη μελέτη της επίδρασης του φαρμάκου αυτού στο

in vitro

πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι βρήκαμε ότι, αν και αυτό το φυτό αλκαλοειδές προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ωστόσο αυτή η επίδραση δεν συσχετίζεται με την αναστολή της σηματοδότησης Hh, όπως κρίνεται από την έλλειψη Gli1 διαφοροποίησης στον επεξεργασμένο κύτταρο καλλιέργειες. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού δεν ήταν το αποτέλεσμα του κανονικού SMO-παρεμπόδιση που προκαλείται οδού Hh, αλλά μάλλον ένα μη ειδικό ή τοξική επίδραση. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό όταν κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GANT58, ένας ειδικός αναστολέας Gli1. Συγκεκριμένα, η έλλειψη απόκρισης των κυτταρικών γραμμών SKOV-3 και OVCAR-3 σε Hh αναστολή μονοπάτι είναι συνεπές με τα προηγούμενα αποτελέσματα από ομάδες μας και άλλων, με τη χρήση κυκλοπαμίνης ή ενός ειδικού αναστολέα Gli1 [32], [33]. Επιπλέον, Kudo

et al

. [34] επίσης πρόσφατα έδειξαν ότι η θεραπεία με αντι-Gli1 shRNA δεν επηρέασε Gli1 έκφραση σε Α2780 κύτταρα. Από την άλλη πλευρά,

in vitro

δεδομένα μας στέκονται σε αντίθεση με τις μελέτες του Liao

et al

. [29] και Kandala και Srivastava [35] αποδεικνύουν ότι, μετά τη θεραπεία με κυκλοπαμίνη, έκφραση Gli1 μειώθηκε σε κύτταρα Α2780 SKOV-3 και OVCAR-3, ή, αντίστοιχα. Οι λόγοι για αυτές τις αντικρουόμενα αποτελέσματα παραμένουν ασαφή, προσθέτοντας ένα άλλο στρώμα της πολυπλοκότητας στις προσπάθειες που αποσκοπούν στην αποδώσουμε την ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών σε υπερβολική δραστηριότητα HH. Αν και μπορεί να οφείλεται σε διαφορές σε πειραματικά συστήματα (π.χ. κυτταρικές γραμμές είναι επιρρεπείς σε γενοτυπικών και φαινοτυπικών μετατόπιση κατά τη διάρκεια της συνεχούς καλλιέργειας τους) και /ή μεθόδους ανάλυσης, είναι επίσης κατανοητό ότι θα μπορούσαν να αντανακλούν στην πραγματικότητα ετερογένεια των αυτοκρινών και παρακρινών σηματοδότηση στον καρκίνο των ωοθηκών . Στο πλαίσιο αυτό, αξίζει να σημειωθεί ότι, μαζί με την κηλίδωση των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων, παρατηρήσαμε επίσης σποραδική πυρηνική έκφραση του Gli1 στον περιβάλλοντα στρώμα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), το εύρημα αυτό υποδηλώνει μια κυτταρική αλληλεπίδραση μεταξύ στρώματος και επιθηλίου, με πιθανές εμφάνιση της παρακρινούς σηματοδότησης. Δυστυχώς, λόγω του περιορισμένου συστατικό στρώμα που συνήθως συνδέονται με υψηλής ποιότητας βλάβες, δεν ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει την έκταση της έκφρασης Gli1 στο μικροπεριβάλλον του όγκου, και οι περισσότερες μελέτες που απαιτούνται για την καλύτερη αποσαφήνιση του ρόλου της παρακρινούς σηματοδότηση Hh σε καρκίνο των ωοθηκών.

στην πραγματικότητα, παρόμοιες διαφοροποιήσεις σε πειραματικά αποτελέσματα έχουν επίσης αναφερθεί σε άλλους όγκους, όπως του προστάτη, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και [36], [37]. Yauch και συνεργάτες [38] έκανε την ενδιαφέρουσα παρατήρηση ότι SMO-ανταγωνιστής μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης ενός μεγάλου αριθμού των κυτταρικών σειρών καρκίνου επιθηλιακής προέλευσης δεν συσχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου στόχου Hh σε αυτά τα κύτταρα, προτείνοντας ότι α) η παρατηρούμενη

in vitro

ανάπτυξη καταστολή μπορεί να οφείλεται στην εκτός στόχου επιδράσεις όταν οι ενώσεις αυτές χρησιμοποιούνται σε υψηλές συγκεντρώσεις, και β) υπάρχει μια απαίτηση για παρακρινή σηματοδότηση συνδέτη Hh στην ογκογένεση του Hh καρκίνων που εκφράζουν, με σημαντικές συνέπειες για το