Αφηρημένο

υποξία παράγοντα-2α (HIF-2α ή EPAS1) είναι σημαντικό για την εξέλιξη του καρκίνου, και είναι μια υποθετική βιοδείκτης για φτωχή πρόγνωση για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ωστόσο, μοριακών μηχανισμών που διέπουν την υπερέκφραση EPAS1 δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Ερευνήσαμε ένα ρόλο ενός μόνο νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός (SNP), που βρίσκονται εντός rs13419896 ενδονίου 1 του

EPAS1

γονίδιο στη ρύθμιση της έκφρασης του. αναλύσεις Bioinformatic πρότεινε ότι μια περιοχή συμπεριλαμβανομένης της rs13419896 SNP παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του

EPAS1

γονιδιακής έκφρασης και ο SNP μεταβάλλει την συνδετική δραστικότητα των παραγόντων μεταγραφής.

In vitro

αναλύσεις απέδειξαν ότι ένα θραύσμα που περιέχει την λειτουργία τόπο SNP ως ρυθμιστική περιοχή και ότι ένα θραύσμα με

A

αλληλόμορφο έδειξαν υψηλότερη δραστικότητα μετενεργοποίησης από ένα με

G

, ειδικά με την παρουσία του υπερεκφράζεται c-Fos ή c-Jun. Επιπλέον, οι ασθενείς με NSCLC με το

Μια

αλληλόμορφο έδειξε χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με

G

στο SNP, ακόμη και μετά την προσαρμογή με διάφορες μεταβλητές. Εν κατακλείδι, ο γενετικός πολυμορφισμός του

EPAS1

γονιδίου μπορεί να οδηγήσει σε μεταβολή των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του να οδηγεί την εξέλιξη του καρκίνου και να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για NSCLC

Παράθεση:. Putra AC , Eguchi Η, Lee KL, Yamane Υ, Gustine Ε, Isobe T, et al. (2015) Η

Μια

αλληλόμορφου σε rs13419896 του

EPAS1

συνδέεται με αυξημένη έκφραση και κακή πρόγνωση για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (8): e0134496. doi: 10.1371 /journal.pone.0134496

Επιμέλεια: Tiffany Seagroves, Πανεπιστήμιο του Τενεσί Επιστημών Υγείας Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 2 Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 9 Ιουλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Putra et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή έγινε εν μέρει υποστηρίζεται από την Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) (Νο 23592766) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs ), επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα με θέμα «Καινοτόμες Περιοχές (Αρ 221S0001)» από το ιαπωνικό Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, και το στρατηγικό Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών Grant-ενισχυόμενο σχέδιο για Ιδιωτικά πανεπιστήμια, MEXT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποξία παράγοντες (HIFs) είναι ετεροδιμερείς παράγοντες μεταγραφής που είναι μέλη της (PAS) οικογένεια Per-ARNT-Sim. Ενεργοποιούνται από έναν αριθμό εισόδων σηματοδότησης περιλαμβανομένων υποξία, θρεπτικό πείνα, φλεγμονή, ογκογόνα σήματα, μηχανικό στρες, και σε ορισμένες περιπτώσεις, την εσωτερική γενετικών πολυμορφισμών [1-4]. Οι παράγοντες μεταγραφής HIF αποτελούνται από υπομονάδες άλφα (HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α), που ρυθμίζονται από τα προαναφερθέντα σήματα ενώ βήτα υπομονάδες γνωστές ως υποδοχέας αρυλ υδρογονάνθρακα πυρηνικός μεταθέτης (ARNT) είναι συντακτικά εκφράζονται και διεγείρει τη μεταγραφή του πιο από εκατό γονιδίων-στόχων που σχετίζονται με παθοφυσιολογικές απόκριση [5, 6]. Μεταξύ υπομονάδες άλφα, HIF-1α και HIF-2α έχουν μελετηθεί εκτενώς. Παρά το γεγονός ότι τα μέλη των ομοιοτήτων μερίδιο άλφα υπομονάδες στη δομή, τη λειτουργία και τη ρύθμιση τους

in vitro

, τους ρόλους τους

in vivo

είναι ανόμοια κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και ογκογένεση [3, 5, 7].

Το ανθρώπινο HIF-2α γονίδιο γνωστό ως πρωτεΐνη τομέα ενδοθηλιακά ΠΑΣ 1 (

EPAS1

), περιέχει 16 εξώνια και εκτείνεται σε 90 kb στο 2p21-p16. Η έκφραση της ανθρώπινης HIF-2α έχει ταυτοποιηθεί σε πνεύμονα, φορείς καρωτίδα, ενδοθηλιακά κύτταρα, νευρογλοιακά κύτταρα, καρδιομυοκύτταρα, νεφρική ινοβλάστες και τα ηπατοκύτταρα όπου παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της φυσιολογίας του οξυγόνου [3, 8]. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία στον πνεύμονα που συνιστά την περιοχή για την ανταλλαγή οξυγόνου και παρέχει τη διεπαφή αέρα-υγρού για τον σκοπό αυτό. Οι πρωτεΐνες HIF-2α εκφράζονται σε τύπου II πνευμονοκύτταρα και πνευμονικά ενδοθηλιακά κύτταρα σε απόκριση στην υποξία, καθώς και σε επιθήλιο και μεσεγχυματικά δομές που δημιουργούν στο αγγειακό ενδοθήλιο [9, 10]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης HIF-2α συνδέθηκαν με αυξημένο μέγεθος του όγκου, εισβολή και την αγγειογένεση σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του πνεύμονα [11,12]. Ενισχυμένη έκφραση του HIF-2α πρωτεΐνης σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ιστός αναφέρθηκε ότι είναι ένας σημαντικός κατασκευαστής για φτωχή πρόγνωση [13-15].

Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι πολλές μοναδικό νουκλεοτίδιο πολυμορφισμοί (SNPs) του

EPAS1

συνδέονται με την ανάπτυξη της οστεοαρθρίτιδας [16], η αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας [17], η μέγιστη μεταβολική απόδοση σε αθλητές αντοχής [18], φυσιολογική προσαρμογή σε πληθυσμούς υψηλού υψομέτρου [19- 22], και την επιδεκτικότητα προς νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) και του καρκίνου του προστάτη [23, 24]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτών των SNPs στα επίπεδα έκφρασης του

EPAS1

είναι ελάχιστα κατανοητή.

Μεταξύ αυτών των SNPs, εστιάσαμε στην SNPs Hap-ετικέτα του

EPAS1

γονίδιο ότι μπορεί να συμβάλει στην προσαρμογή σε μεγάλο υψόμετρο υποξία σε Σέρπα [22], θεωρώντας πνεύμονα σαν όργανο-στόχο. Βιοπληροφορικής αναλύσεις μας ώθησε να εξετάσει το ρόλο των rs13419896 SNP στη ρύθμιση του

EPAS1

γονιδιακή έκφραση και μια ένωση με την πρόγνωση του NSCLC.

αναλύει Υλικά και Μέθοδοι

βιοπληροφορικής

Θα ανακριθούν μεταγραφή ανοσοκατακρήμνιση παράγοντας χρωματίνης (τσιπ επόμενα) σύνολα δεδομένων από την Εγκυκλοπαίδεια του DNA Elements κοινοπραξίας (ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ) χρησιμοποιώντας το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στη Σάντα Κρουζ (UCSC) Γονιδίωμα Browser (https://genome.ucsc.edu /ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ /) για να μάθετε παράγοντες υποψήφιος μεταγραφής που μπορεί να δεσμεύσει ή κοντά στην τοποθεσία rs13419896 SNP. Αλληλόμορφο ειδική επιτήρηση των παραγόντων μεταγραφής δεσμεύεται στο θραύσμα που περιέχει το rs13419896 SNP διεξήχθη χρησιμοποιώντας JASPAR CORE Vertebrata, μια βάση δεδομένων ανοικτής πρόσβασης μήτρας με βάση το προφίλ νουκλεοτιδίων που περιγράφουν την δεσμευτική προτίμηση των παραγόντων μεταγραφής [25].

εκχύλιση του DNA και γονοτυπική ανάλυση

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από δείγματα περιφερικού αίματος ή κατεψυγμένα μη καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26, 27]. Η ακόλουθη εκκινητής σετ χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσουν ένα θραύσμα συμπεριλαμβανομένου του εστίαση SNP σε

EPAS1

Εσώνιο 1? Forward: 5′-CCTAATGAGCCTCTGGGAAAGTGC-3 ‘και Reverse: 5′-CAATGGTGCCTCCTACCCTGTG-3’. Οι συνθήκες αντίδρασης PCR ήταν 40 κύκλοι αποδιάταξης στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 63 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 30 sec. Αλληλουχίας προϊόντων PCR διεξήχθη με τη χρήση του BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit και το σύστημα αυτοματοποιημένη αλληλούχιση ΑΒΙ PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Είκοσι τέσσερις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που αποτελείται από ένα ηπατώματος HepG2 κύτταρα, από του στόματος γραμμές πλακώδες καρκίνωμα HSC-2, HSC-3, HSC-4, ΚΒ και KOSC2, καρκίνων του μαστού MCF-7, MDA-MB-231, MDA -ΜΒ-435S, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-20, ΒΤ-474, SK-BR-3, T-47D και ZR-75-1 και καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549, PC- 6, PC-9, PC14, ΕΚΦΤ-LC-Ad-1, ΕΚΦΤ-LC-Ad-2, ΕΚΦΤ-LC-KJ, και LC-S ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA) ή JCRB (Osaka, Japan) μεταξύ 2001 και 2007, και διατηρήθηκαν σε RPMI1640 ή τροποποιημένο ελάχιστο βασικό μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (NACALAI TESQUE, Inc., Kyoto, Japan) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? BioWhittaker, Verviers, Βέλγιο) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28 -30].

EPAS1

κατάσταση των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση αλληλουχίας όπως περιγράφεται παραπάνω.

παρασκεύασμα RNA και RT-PCR

Ολικό RNA παρασκευάστηκε από κατεψυγμένα σφαιρίδια κυττάρου χρησιμοποιώντας το QIAGEN RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Inc., Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δύο μικρογραμμάρια ολικού RNA που εκχυλίζεται από κάθε κυτταρική γραμμή μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Μια αραίωση του cDNA 1/200 υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR χρησιμοποιώντας δοκιμασίες έκφρασης TaqMan Gene (Applied Biosystems) για

EPAS1

και Προ-Αναπτύχθηκε TaqMan Δοκιμασία Αντιδραστήρια (Applied Biosystems) για

ACTB

όπως τον έλεγχο καθαριότητας. Τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις λήφθηκαν και κατά μέσο όρο με τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου υπολογίζονται ως ποσοστά επί

ACTB

έκφρασης για κάθε κυτταρική σειρά.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Για την ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης, ολόκληρο το κύτταρο εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από καλλιεργημένα κύτταρα με ή χωρίς υποξικό κατεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Πενήντα μα πρωτεΐνης κηλιδώθηκε σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου. Αντι-EPAS1 (HIF-2α) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo) ή αντι-β-ακτίνης (Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα ως 1: 500 ή 1: 5000. IgG αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού Ig συζυγούς με υπεροξειδάση (Amersham Life Science) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα αραιωμένο ως 1: 2000 ή 1: 5000. Ανοσοσύμπλοκα έγιναν ορατά με τη χρήση του αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας ECL Plus (Amersham Life Science).

κατασκευή πλασμιδίου και πειράματα αναφοράς της λουσιφεράσης

ανόπτηση θραύσματα ολιγονουκλεοτιδίων που περιέχει το

EPAS1

SNP θέσης rs13419896 ( 5′-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCGCTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3 ‘ή 5′-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCACTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3’) υποκλωνοποιήθηκαν στον

Κρη

Ι θέση του pGL4.26 (Promega, Madison, WI) με έναν ελάχιστο προαγωγέα οδήγηση του πυγολαμπίδα αναφοράς λουσιφεράσης. Ο /ΕΒΡ-β ή c-myc cDNA ενισχύθηκε από ολικό RNA των MCF-7 ή HSC2 κύτταρα με RT-PCR και υποκλωνοποιήθηκε εντός pRc /CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) ή pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO (Invitrogen ). Τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας και ονομάστηκε ως pGL4.26-EPAS1_G, pGL4.26-EPAS1_A, pCMV-Ο /ΕΒΡ-β ή pcDNA-c-MYC, αντίστοιχα. Rat c-Jun οδηγείται από τον ανθρώπινο β-ακτίνης προαγωγό (c-Jun /β-ακτίνης) και ανθρώπινο φορείς έκφρασης c-fos είχαν γενναιόδωρα από τον Dr. Masaharu Sakai (Πανεπιστήμιο Hokkaido) [31]. Παροδικές επιμολύνσεις διεξήχθησαν όπου κάθε κατασκεύασμα ανταποκριτή pGL4.26-EPAS1 (0.2 μg /15 mm) με Renilla ελέγχου λουσιφεράσης συν-επιμόλυνση (pRL-SV40, 100 pg /15-mm) (Promega) αναμίχθηκε με 0,4 μΙ Αντιδραστήριο trans-IT LT1 Επιμόλυνσης (Takara, Japan) και προστέθηκε στο μέσο. Σε πειράματα συν-διαμόλυνσης, 0.4 μα pRc /CMV, c-Jun /β-ακτίνης, c-fos, pcDNA-c-MYC ή pCMV-Ο /ΕΒΡ-β αναμίχθηκε με EPAS1 ρεπόρτερ όπως παραπάνω. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το μίγμα για 24 ώρες πριν από την ποσοτικοποίηση της δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης για την ενιαία-δείγμα Mini Lumat LB 9505 φωτόμετρο (Berthold Technologies GmbH & amp? Co. KG, Bad Wildbad, Germany) με χρήση διπλής Λουσιφεράσης Assay Kit (Promega) .

δραστηριότητας EPAS1

SNP δημοσιογράφος υπολογίστηκε ως δείκτες τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla και ο μέσος όρος των τριών προσδιορισμών ή περισσότερο για κάθε δημοσιογράφος είχε χρησιμοποιηθεί για συγκρίσεις.

Μελέτες Ασθενών

Ένα σύνολο των 76 ιαπωνικών μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα διαγιγνώσκονται στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Χιροσίμα 1991-1996 [4, 32] εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Θεσμική Γενετική και την Επιτροπή Ιατρικής Ηθικής στο Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα. Οι ασθενείς και τα χαρακτηριστικά τους κλινικοπαθολογικών του καρκίνου του πνεύμονα αξιολογήθηκαν σύμφωνα με το διεθνές σύστημα σταδιοποίησης του καρκίνου του πνεύμονα [33], και φαίνονται στον Πίνακα 1. Εν συντομία, ένα σύνολο 76 ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, των οποίων η μέση ηλικία ήταν 65.8 (± 8.2), αποτελούνταν από 56 άνδρες και 20 θηλυκά? 43 αδενοκαρκινώματα (AD), 29 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC), και 4 καρκινώματα πλακώδους αδενο-(ADSCC). Κατανομή των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα από τα στάδια (31 ασθενείς ήταν στο στάδιο Ι, 7 στο σημείο II, 25 στο III και 13 στο σημείο IV) είναι καλά ταιριάζει με το ευρέως αντιπροσωπευτική του πληθυσμού της Ιαπωνίας καρκίνο του πνεύμονα.

Η

Η στατιστική ανάλυση

Τα πρωτογενή αποτελέσματα σε αυτή τη μελέτη ήταν πνεύμονα ειδική θνησιμότητα λόγω καρκίνου και τον κίνδυνο του θανάτου. χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε ως ο χρόνος από την πρωτογενή χειρουργική επέμβαση στο θάνατο λόγω καρκίνου του πνεύμονα, λογοκρίνει κατά την ημερομηνία της τελευταίας επαφής ή θανάτου μη καρκινικά. Chi-square ή ακριβής δοκιμασία Fisher χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση κατανομών των μεταβλητών. Διαφορές στην επιβίωση εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank. Cox μοντέλο αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η σχετική κινδύνου για θάνατο και διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα στατιστικό λογισμικό JMP έκδοση 10.0.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), εάν ορίζεται διαφορετικά. Επέκταση ακριβές τεστ του Fisher διεξήχθη με τη χρήση «R»: (. R πυρήνα της ομάδας, το 2013. R Ίδρυμα για στατιστικούς υπολογισμούς, Βιέννη, Αυστρία URL https://www.R-project.org/) μια γλώσσα και το περιβάλλον για στατιστικούς υπολογισμούς με ένα πακέτο «νόμισμα». Hardy-Weinberg ισορροπία εξετάστηκε για να συγκρίνουν τις παρατηρούμενες και αναμενόμενες συχνότητες γονότυπο χρησιμοποιώντας Chi-square test. Η στατιστική σημαντικότητα των πειραμάτων δημοσιογράφος και γονιδιακής έκφρασης αναλύσεις αναλύθηκαν με τη χρήση στατιστικών λογισμικών JMP έκδοση 10.0.2 και StatView έκδοση 5.0 του λογισμικού (SAS Institute Inc.).

Αποτελέσματα

επιτήρηση Βάση δεδομένων των SNPs της

EPAS1

σε σχέση με την έκφραση γονιδίων του

Μεταξύ των 3 SNPs Hap-tag (rs13419896, rs4953354 και rs4953388) που εμπλέκονται να συμβάλει στην προσαρμογή σε μεγάλο υψόμετρο υποξία σε Σέρπα [22 ], βρήκαμε θέσεις σύνδεσης και πρόσδεσης δραστηριότητες για το Ο /ΕΒΡ-β, ΑΡ-1 ή MYC οικογένεια παραγόντων μεταγραφής σε έναν αριθμό τύπων καρκινικών κυττάρων στην περιοχή της

EPAS1

rs13419896 τόπο εντός ιντρονίου 1 του γονιδίου με την επιτήρηση των τσιπ επόμενα σύνολα δεδομένων από το ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ (S1 Σχήμα). Το ενδιαφέρον είναι ότι, όταν ανέλυσε τις ακολουθίες χρησιμοποιώντας JASPAR Πυρήνας Vertebrata, βρήκαμε ότι σε σχέση με τα αποτελέσματα, δείκτες για την πιθανότητα δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής, της C /ΕΒΡ-β και ΑΡ-1 επλήγησαν από την rs13419896 SNP μεταξύ των παραγόντων 3 μεταγραφής όπως αναφέρθηκε παραπάνω ? Ο /ΕΒΡ-β και ΑΡ-1 έδειξε πολύ υψηλότερες βαθμολογίες των 0.842 και 0.855 στην αλληλουχία με

A

αλληλόμορφου σε rs13419896, αντίστοιχα, από εκείνες με το

G

αλληλόμορφο (0,734 και 0,744) . Αυτά τα στοιχεία μας ώθησε να εξετάσει το ρόλο των rs13419896 στη ρύθμιση του

EPAS1

γονιδιακής έκφρασης.

Η rs13419896 SNP μεταβάλλονται οι δραστηριότητες του γονιδίου αναφοράς

Για να ελέγξετε πιθανές λειτουργικές διαφορές που προκαλούνται από τον τόπο rs13419896, έχουμε την επόμενη παρασκευαστούν κατασκευάσματα αναφοράς λουσιφεράσης που φέρουν το

EPAS1

θραύσμα που περιλαμβάνει την ενεργητική rs13419896 μπροστά από το ελάχιστο προαγωγέα (Σχήμα 1Α) και εκτελείται παροδική επιμόλυνση αναλύσεις σε Α549, PC-9 και HSC -2 καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα κατασκευάσματα με τα θραύσματα που περιέχει τη θέση rs13419896 έδειξαν αυξημένη δραστηριότητα αναφοράς σε σύγκριση με την αρχική ρεπόρτερ pGL4.26 σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ανεξάρτητα από το γονότυπο του SNP, υποδηλώνοντας ότι αυτό το σύντομο αλληλουχία εντός του ενδονίου 1 του

EPAS1

λειτουργία ως μεταγραφικός ενισχυτικό στοιχείο (

P

& lt? 0,05, Σχήμα 1Β-1ϋ). Είναι ενδιαφέρον ότι, το κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει το θραύσμα με το

A

αλληλόμορφο του rs13419896 (pGL4.26-EPAS1-Α) έδειξε σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα από ένα με το

G

αλληλόμορφο (pGL4.26- EPAS1-G) σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (

P

& lt? 0,01,

P

& lt? 0,05, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β-1ϋ), γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα ενισχυτής αυτού του ρυθμιστικού στοιχείου επηρεάζεται από το γονότυπο του rs13419896 SNP.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της λουσιφεράσης κατασκευάζει με διαφορετικό

EPAS1

SNP αλληλόμορφα, όπως φαίνεται. Σύντομη θραύσματα που περιέχουν το

EPAS1

SNP θέσης (rs13419896) υποκλωνοποιήθηκαν στον ελάχιστο προαγωγέα πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης pGL4.26. (Β-D) ιστογράμματα δείχνουν δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή μετά πειράματα παροδικής επιμόλυνσης σε Α549 (Β), PC9 (C), και HSC-2 κύτταρα (D). Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή υπολογίσθηκε σαν ένας λόγος προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla που δημιουργείται από τον έλεγχο συν-επιμόλυνση pRL-SV40. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή + τυπική απόκλιση (SD) για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του Student

t-test

με *:

P

& lt? 0.05, **:

P

& lt? 0,01 και ***:

P

& lt? 0,0001.

Η

Επειδή η rs13419896 SNP ενεπλάκη να τροποποιήσει συγγένειες δέσμευσης ΑΡ-1 και Ο /ΕΒΡ-β από την προαναφερθείσα ανάλυση βιοπληροφορικής, έχουμε την επόμενη εκτελούνται πειράματα συν-επιμόλυνσης σε κύτταρα Α549 να αξιολογηθεί η επιδράσεις των υπερεκφράζουν ΑΡ-1, c-myc, ή Ο /ΕΒΡ-β παραγόντων μεταγραφής για τις δραστηριότητες ανταποκριτή. Παραδόξως, η αναγκαστική έκφραση του c-Jun ή c-fos, τα συστατικά του παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-1, αύξησε σημαντικά την δραστικότητα ανταποκριτή του μόνο pGL4.26-EPAS1-Α αλλά όχι εκείνη του pGL4.26-EPAS1-G (σχήμα 2Α και 2Β). Από την άλλη πλευρά, Ο /ΕΒΡ-β αύξησε την μεταγραφική δραστικότητα τόσο του ρεπόρτερ κατασκευασμάτων με παρόμοια ένταση, ενώ το c-Myc δεν έδειξε σημαντικές μεταβολές στη δραστηριότητα και των δύο κατασκευασμάτων.

(Α και Β ) για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της υπερεκφράζουν ΑΡ-1 (c-Jun και c-Fos), MYC, ή C παράγοντες μεταγραφής /ΕΒΡ-β επί rs13419896 δραστηριότητα ανταποκριτή λουσιφεράσης SNP, τα πειράματα συνεπιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 πνεύμονα. ιστογράμματα δείχνουν λουσιφεράσης δραστηριότητα ρεπόρτερ της pGL4.26-EPAS1-G (A) ή pGL4.26-EPAS1-Α (Β). Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή υπολογίσθηκε σαν ένας λόγος προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla που δημιουργείται από τον έλεγχο συν-επιμόλυνση pRL-SV40. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή + τυπική απόκλιση (SD) για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση της δοκιμής Dunnett με ***:

P

& lt? 0.0001.

Η

Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του

EPAS1

mRNA και πρωτεΐνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές από το rs13419896 SNP

Για να εξερευνητή αποτελέσματα της SNP rs13419896 για ενδογενή επίπεδα έκφρασης γονιδίου του

EPAS1

, εμείς γονότυπος τον SNP και αξιολογούνται τα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικά καρκινικές κυτταρικές σειρές. Όταν τα κύτταρα χωρίστηκαν σε δυο ομάδες με την παρουσία ή απουσία του

A

αλληλόμορφο στον τόπο rs13419896, τα καρκινικά κύτταρα με την

A

αλληλόμορφο του rs13419896 κατέδειξαν σημαντικά υψηλότερη

EPAS1

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης από ό, τι για τυχόν άλλους χωρίς την

Μια

αλληλόμορφο (

P

= 0.022,

t

δοκιμή του Welch) (Σχήμα 3Α). Αναλύσαμε περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης EPAS1 (HIF-2α) σε διάφορες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές με ανοσοκηλίδωση αναλύσεις. Ως αποτέλεσμα, EPAS1 πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν σε PC9 και LC-KJ με το

Μια

αλληλόμορφων ακόμη και κάτω από συνθήκες ορθοξικές και προφανώς αυξηθεί σε ορισμένες από υποξικά καρκινικά κύτταρα, Α549, PC9, LC-KJ, και LC-S (Σχήμα 3Β)

(Α) Οι

EPAS1

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης αξιολογούνται με πραγματικού χρόνου RT-PCR συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων των καρκινικών κυττάρων »από το καθεστώς rs13419896.? ένα με το

Μια

αλληλόμορφου στη θέση SNP (με

Α

αλληλόμορφο) και άλλοι χωρίς (w /o

Α

αλληλόμορφο). Τα επίπεδα έκφρασης του

EPAS1

σε κάθε κυτταρική σειρά υπολογίστηκε ως η αναλογία προς εκείνη του

ACTB

και κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (ανοιχτός κύκλος). Κάθε ράβδος υποδεικνύει όρο επίπεδο έκφρασης σε κάθε ομάδα.

P

-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

τεστ Welch με *:

P

= 0.022. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης EPAS1 (Β) συγκρίθηκαν μεταξύ των γονότυπων όπως παραπάνω. Αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα επωάστηκαν υπό ορθοξικές (21% pO

2) ή υποξικά (1% pO

2) για 24 ώρες. Ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κάθε κυτταρική γραμμή υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοστύπωσης χρησιμοποιώντας αντι-EPAS1 (HIF-2α) ή αντι-β-ακτίνης ως ένας έλεγχος.

Η

Η Α αλληλόμορφο του rs13419896 SNP του

EPAS1

συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση των μη-μικρών ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα

EPAS1

γονίδιο, μπορούμε τότε διερευνηθούν πιθανές p> ενώσεις του SNP με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες του NSCLC ασθενείς ιαπωνικά. Γονότυπους του rs13419896 SNP προσδιορίστηκαν σε 76 ασθενείς με NSCLC, και διαπιστώθηκε ότι είναι σε καλή συμφωνία με την ισορροπία Hardy-Weinberg (

P

= 0.45, Chi-square test, Πίνακας 2). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των συχνοτήτων γονοτύπου μεταξύ των δειγμάτων Ιαπωνικά NSCLC σε αυτή τη μελέτη και την υγιή ιαπωνικό πληθυσμό του έργου HapMap (

P

= 0,94, παρατείνεται ακριβές τεστ του Fisher, Πίνακας 2). Στη συνέχεια εξετάστηκε η σχέση μεταξύ του

EPAS1

SNPs και διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά (Πίνακας 3). Η συχνότητα των έλασσον αλληλόμορφο του rs13419896 έτεινε να είναι υψηλότερη στις γυναίκες από ότι στους άνδρες: Μια συχνότητα των ασθενών που έχουν τουλάχιστον έναν

Μια

αλληλόμορφο rs13419896 (

Μια

/

A

ή

A

/

G

γονότυπος) ήταν 70.0% (14 από 20) στις γυναίκες και 44,6% (25 από 56) στους άνδρες, αν και αυτό δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (

P

= 0.07, ακριβής δοκιμασία του Fisher). Επιπλέον, η κατανομή της διαφοροποίησης έτειναν να διαφέρουν από το SNP με οριακή σημασία (

P

= 0,06, επεκτάθηκε ακριβής δοκιμασία του Fisher). Εκτός από το φύλο και τη διαφοροποίηση, δεν βρήκαμε καμία στατιστική ενώσεις του SNP με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, ιστολογία, το μέγεθος του όγκου, και το στάδιο.

Η

Στη συνέχεια αξιολογούνται ένωση του rs13419896 SNP με τη συνολική επιβίωση για την NSCLC. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών με τουλάχιστον ένα

Μια

αλληλόμορφο rs13419896 (

Μια

/

Μια

ή

Μια

/

G

) ήταν σημαντικά μικρότερος από ότι με το

G

/

G

ομοζυγώτες (28,0 μήνες έναντι 52,5 μηνών,

P

= 0,047, δοκιμασία log-rank, Εικ 4). Όταν σε σύγκριση αθροιστικά ποσοστά επιβίωσης στους 12, 24, και 48 μήνες, οι ασθενείς με το

G /G

ομοζυγώτες παρουσίασαν πολύ υψηλότερα ποσοστά από ό, τι τα άτομα με

A /G

ή

Α /Α

γονότυπο σε 12 και 48 μήνες (

P

= 0,009 και 0,004, αντίστοιχα) (S1 πίνακα). Μια πολυπαραγοντική ανάλυση των 74 ασθενών με NSCLC (2 ασθενείς αποκλείστηκαν λόγω της έλλειψης δεδομένων μεγέθους του όγκου) χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο αναλογικών κινδύνων Cox έδειξαν ότι η κατοχή του

Μια

αλληλόμορφο (

A /G

ή

Α /Α

γονότυπος) της rs13419896, μαζί με το κλινικό στάδιο, ήταν μια ανεξάρτητη μεταβλητή για την εκτίμηση του κινδύνου για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC [λόγος κινδύνου (HR) = 2,31, 95% CI = 1,14 – 4,81 ,

P

= 0.021], μετά την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, το στάδιο, ιστολογία, το μέγεθος του όγκου, και διαφοροποίηση.

οικόπεδα επιβίωσης Kaplan-Meier στρωματοποιημένη σύμφωνα με γονότυπους των rs13419896 φαίνονται. Διαφορά στη συνολική επιβίωση σε όλη την γονοτυπική ομάδες των ασθενών με NSCLC εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank με

P

-τιμές όπως υποδεικνύεται.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα, αρκετές SNPs του

EPAS1

έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με την ανάπτυξη των διαφόρων ασθενειών, όπως η οστεοαρθρίτιδα [16], αμφιβληστροειδοπάθεια του προώρου [17], η μέγιστη ισχύς του μεταβολισμού σε αθλητές αντοχής [18], φυσιολογικές προσαρμογή σε μεγάλο υψόμετρο πληθυσμούς [19-22], και την επιδεκτικότητα προς νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) και του καρκίνου του προστάτη [23, 24]. Ωστόσο, μια μηχανιστική σύνδεση μεταξύ αυτών των SNPs και τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου του

EPAS1

έχει ελάχιστα είναι γνωστά, εκτός από το rs17039192 που βρίσκεται στην 5 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή, που έδωσε μεταβληθεί δραστηριότητες υποκινητή σε προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς σε χονδρογονικό κύτταρα [16].

σε αυτή τη μελέτη, βιοπληροφορικής αναλύσεις μας ώθησε να δοκιμάσει ένα ρόλο ενός από τα SNPs Hap-tag, rs13419896 βρίσκεται μέσα Εσώνιο 1 του γονιδίου, στη ρύθμιση του

EPAS1

έκφραση. Στην πραγματικότητα, βρήκαμε ότι ένα θραύσμα στο ιντρόνιο 1 του

EPAS1

περιέχει μεταγραφικά ρυθμιστικά στοιχεία και διαφορά νουκλεοτιδίου εις τον τόπο rs13419896 μπορεί να επηρεάσει λειτουργικά τις δραστηριότητες ενισχυτή σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον ότι, περαιτέρω πειράματα συν-επιμόλυνσης έδειξε έντονα ότι ΑΡ-1 μεταγραφικού παράγοντα μπορεί να εμπλέκεται στις διαφορική μεταγραφική δραστηριότητα μεταξύ των αλληλόμορφων rs13419896. Η παρατηρούμενη συγκεκριμένη διενεργοποίηση από εξωγενείς συνιστώσες AP-1 μόνο σε κατασκευές με

Μια

αλληλόμορφο στο rs13419896 συμφώνησε επίσης με την υψηλότερη σχετική βαθμολογία για την ΑΡ-1 με

Μια

αλληλόμορφο στο SNP, όπως φαίνεται με ανάλυση JASPAR πυρήνα Vertebrata. Προηγουμένως, η υπερέκφραση του c-Jun και πρωτεΐνες c-Fos παρατηρήθηκε σε 31-50 και 60%, αντίστοιχα, των ιστών NSCLC [34, 35]. Το υπερεκφρασμένο c-Jun ή c-Fos μπορεί διαενεργοποιούν τον

EPAS1

γονιδιακή έκφραση

μέσω

, τουλάχιστον εν μέρει, στοιχείο ενισχυτή εντός εσωνίου 1 του γονιδίου σε ένα αλληλόμορφο-ειδικό τρόπο σε ο τόπος rs13419896. Αυτό υποστηρίχθηκε επίσης από την παρατήρηση των επιπέδων του γονιδίου και την έκφραση της πρωτεΐνης του

EPAS1

από την rs13419896 SNP σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Αν και δεν μπόρεσε να επιβεβαιώσει πλήρως τα γονότυπους (συμπεριλαμβανομένων των αλληλομόρφων απώλεια, την ενίσχυση, ή μεταλλάξεις) των καρκινικών κυτταρικών σειρών που ελέγχθηκαν, βρήκαμε ότι τα κύτταρα με

Μια

αλληλόμορφο σε rs13419896 του

EPAS1

έδειξε σημαντικά υψηλότερο

EPAS1

επίπεδα του γονιδίου και την έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με εκείνους που στερούνται

Μια

αλληλόμορφο ανεξάρτητα από τις διαφορές στο γενετικό υπόβαθρο. Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα, είναι έντονα πρότεινε ότι η

Μια

αλληλόμορφο σε rs13419896 SNP του

EPAS1

διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μεταβολή της συγγένειας δέσμευσης του AP-1, με αποτέλεσμα διαφοροποιημένα επίπεδα έκφρασης της EPAS1 στον NSCLC ιστό.

Η παρατηρούμενη συσχέτιση του

Μια

αλληλόμορφο του SNP rs13419896 με αυξημένα επίπεδα έκφρασης της EPAS1 μας ενέπνευσε να εξετάσει περαιτέρω τον πιθανό ρόλο του SNP στην πρόγνωση της NSCLC ασθενείς Ιαπωνικά, αφού η υπερέκφραση του EPAS1 αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι ο τόπος rs13419896 ήταν μια ανεξάρτητη μεταβλητή για την εκτίμηση του κινδύνου της συνολικής επιβίωσης των NSCLC.

Στο ανθρώπινο NSCLC, η υπερέκφραση του HIF-2α (EPAS1) συνδέθηκε σταθερά με ιστολογία όπως SCC είναι κυρίαρχη , αυξημένο μέγεθος του όγκου, και η αγγειογένεση, με αποτέλεσμα την χειρότερη πρόγνωση και μειωμένη ποσοστά επιβίωσης [13, 14]. Στη μελέτη μας, δεν βρήκαμε καμία συσχέτιση του SNP rs13419896 με ιστολογία και το μέγεθος του όγκου. Από την άλλη πλευρά, η αναλογία κινδύνου της κατοχής

A

αλληλόμορφο πάνω από το

G

αλληλόμορφο στο μοντέλο κινδύνου του Cox ήταν 2.31, που είναι συγκρίσιμη με την αναλογία υψηλή έκφραση του HIF-2α που λαμβάνεται προηγουμένως (2,01 και 1,71) [13, 14]. Πρόσφατη μετα-ανάλυση εξετάζει τη συνολική επιβίωση από την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HIF-2α κατέδειξε επίσης HR 2,02 (95% CI: 1,47 – 2,77) [36]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά, το SNP rs13419896 μπορεί να είναι ένας από τους σημαντικούς παράγοντες που συμβάλλουν στην υπερέκφραση του HIF-2α σε NSCLC ιστό και έτσι να είναι ένας χρήσιμος προγνωστικός δείκτης για NSCLC. Παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική διαφορά της αθροιστικό ποσοστό επιβίωσης μεταξύ ασθενών με

Μια

αλληλόμορφο και χωρίς στους 12 μήνες μετά τη λειτουργία (S1 πίνακα). Αν η παρατήρηση μας επιβεβαιώνεται και από άλλες ομάδες στο μέλλον, προσδιορισμό του γονότυπου του SNP μπορεί να γίνει κλινικά σημαντική για την εξέταση της φροντίδας των ασθενών και την παροχή συμβουλών αμέσως. Εκτός NSCLC, άλλους καρκίνους όπως του παχέος εντέρου και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου αναφέρθηκαν επίσης να δείχνουν μια κακή πρόγνωση με υπερέκφραση του HIF-2α σε μετα-αναλύσεις [37, 38]. Δεδομένου ότι η υπερέκφραση του ΑΡ-1 συστατικά μπορεί να παρατηρηθεί για αυτούς τους καρκίνους [39, 40], η rs13419896 SNP μπορεί να συμβάλλει στην υπερέκφραση του HIF-2α και είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό δείκτη σε διάφορους καρκίνους.

Εν κατακλείδι, βρήκαμε εδώ για πρώτη φορά, ότι η διαφορά νουκλεοτιδίων στο rs13419896 SNP μπορεί να επηρεάσει

EPAS1

έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών, ειδικά σε απάντηση AP-1, και ότι το

Μια

αλληλόμορφο του

EPAS1

SNP συνδέεται με φτωχότερη πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Για να καθοριστεί το

EPAS1

SNP ως ένα χρήσιμο κλινικό προγνωστικό δείκτη και για την περαιτέρω διευκρίνιση μοριακών μηχανισμών τους, κλινικοπαθολογοανατομικές μελέτες μεγαλύτερης κλίμακας του καρκίνου του πνεύμονα ή /και άλλους τύπους καρκίνου, θα παρέχουν πρόσθετες γνώσεις σχετικά με αυτές τις πτυχές.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. UCSC γονιδίωμα εκπροσώπηση Browser της ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ Κοινοπραξία τσιπ Seq δεδομένων για τον παράγοντα μεταγραφής σύνδεση με επικάλυψη στο ανθρώπινο γονιδίωμα hg19 κατασκευής.

Top πάνελ δείχνουν γονιδιωματική δομή του

EPAS1

γονίδιο που καταρτίζονται από UCSC, REFSEQ και GenBank με παχιά μπαρ υποδεικνύοντας εξονικές αλληλουχίες κωδικοποίησης, λεπτές ράβδοι που δείχνουν μη-κωδικοποιητικές περιοχές εξονίου (5 ‘και 3’ UTRs) και τα βέλη δηλώνουν ιντρόνια με 5 ‘προς 3’ κατευθυντικότητας. Ο οριζόντιος άξονας δείχνει τη θέση του γονιδιώματος στην bp στο διάστημα από CHR2: 46,514,938-46,626,784. Η θέση του SNP rs13419896 ενδείκνυται σε κόκκινο και η σχετική θέση της είναι παρέκταση σε όλα τα σύνολα δεδομένων ως διακεκομμένη μπλε γραμμή. ChIP-Seq δεδομένων εμφανίζεται στην ίδια θέση γονιδιώματος με τον κάθετο άξονα δείχνει ChIP εμπλουτισμό του μεταγραφικού παράγοντα δεσμευτική για CEBPB (μαύρο), MYC (κόκκινο), FOS (πράσινο), ΙΟΥΝ (μπλε), JunB (βιολετί) και JunD ( πορτοκάλι) στις καθορισμένες κυτταρικές σειρές. μπαρ κλίμακας δείχνει γονιδιωματική απόσταση 50 kb

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134496.s001

(PDF)

S1 πίνακα. Συγκρίσεις αθροιστικά ποσοστά επιβίωσης μεταξύ ασθενών με γονότυπους

G

/

G

και

Μια

/

G

ή

A

/

A

.

doi:10.1371/journal.pone.0134496.s002

(DOCX)

Acknowledgments

The συγγραφείς ευχαριστήσω τον καθηγητή Ν Kohno, Ομότιμος Καθηγητής Κ Inai (Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα), ο καθηγητής F. Γιουνούς και Δρ Ε Syahruddin (Πανεπιστήμιο της Ινδονησίας) για την ευγενική υποστήριξη και την ενθάρρυνσή τους. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω την κα Γ Oda για την τεχνική βοήθεια της. Μέρος αυτής της εργασίας πραγματοποιήθηκε στο Κέντρο Ανάλυσης της Ζωής Επιστήμης, Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα.