Αφηρημένο

Ο χαρακτηρισμός του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (CSC) υποπληθυσμό, μέσω της σύγκρισης της υπογραφής της γονιδιακής έκφρασης σε σχέση με το μητρική καρκινικών κυττάρων, είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ταυτοποίηση νέων και πιο αποτελεσματικών αντικαρκινικών στρατηγικών. Ωστόσο, CSC έχουν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά όσον αφορά την πρόσφυση, την ανάπτυξη και το μεταβολισμό που ενδεχομένως συνεπάγεται μια διαφορετική ρύθμιση της έκφρασης των πιο συχνά χρησιμοποιούνται γονίδια καθαριότητα (HKG), όπως β-ακτίνης (ACTB). Αν και είναι σημαντικό να προσδιορίσει ποια είναι τα πιο σταθερά γονίδια HKG για την κανονικοποίηση των δεδομένων που προκύπτουν από την ποσοτική ανάλυση PCR Πραγματικού χρόνου να αποκτήσει ισχυρή και συνεπή αποτελέσματα, μια εξαντλητική επικύρωση των γονιδίων αναφοράς CSC εξακολουθεί να λείπει. Εδώ, απομονώσαμε CSC σφαίρες από διαφορετικές μυοσκελετικών σαρκώματα και καρκινώματα ως πρότυπο για τη διερεύνηση επί της σταθερότητας της έκφρασης του mRNA της 15ης συνήθως χρησιμοποιημένων HKG, σε σχέση με τα φυσικά κύτταρα. Τα επιλεγμένα γονίδια αναλύθηκαν για το συντελεστή διακύμανσης και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το δημοφιλές αλγορίθμων NormFinder και geNorm να αξιολογηθεί η σταθερότητα κατάταξης. Σαν αποτέλεσμα, βρήκαμε ότι: 1) Tata Πρωτεΐνης Δέσμευσης (ΤΒΡ), Τυροσίνη 3-μονοοξυγενάση /τρυπτοφάνη 5-μονοοξυγενάσης πρωτεΐνη ενεργοποίησης ζήτα πολυπεπτίδιο (YWHAZ), πεπτιδυλπρολύλ ισομεράση Α (PPIA), και υδροξυμεθυλοχολάνη συνθάση (HMBS) είναι οι πιο σταθερό HKG για τη σύγκριση μεταξύ CSC και φυσικά κύτταρα? 2) τουλάχιστον τέσσερα γονίδια αναφοράς θα πρέπει να θεωρείται για την ισχυρή αποτελέσματα? 3) η χρήση της ACTB δεν πρέπει να συνιστάται, 4) ειδική HKG θα πρέπει να εξετάζεται για τις μελέτες που επικεντρώνονται μόνο σε έναν συγκεκριμένο τύπο όγκου, όπως το σάρκωμα ή καρκίνωμα. Τα αποτελέσματά μας πρέπει να ληφθούν υπόψη για όλες τις μελέτες ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης της CSC, και θα συμβάλουν σημαντικά για μελλοντικές έρευνες με στόχο τον εντοπισμό νέων αντικαρκινικών θεραπειών με βάση την CSC στόχευση

Παράθεση:. Λήμμα S, Avnet S, Σαλέρνο Μ, Chano Τ, Baldini Ν (2016) Ταυτοποίηση και επικύρωση της καθαριότητας γονίδια για γονιδιακή έκφραση Ανάλυση καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 11 (2): e0149481. doi: 10.1371 /journal.pone.0149481

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 20 Οκτωβρίου του 2015? Δεκτές: 1 Φλεβάρη 2016? Δημοσιεύθηκε: 19, Φλεβάρη, 2016

Copyright: © 2016 Λήμμα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την επιχορήγηση (FIRB RBAP10447J να ΝΒ) από το Υπουργείο Παιδείας, Πανεπιστημίων και Έρευνας της Ιταλίας, από την Ένωση ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο ( AIRC IG11426 να ΝΒ), και από το ιταλικό Υπουργείο Υγείας, η χρηματοδοτική στήριξη για την Επιστημονική Έρευνα «5 τοις χιλίοις 2012» (στο ΝΒ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Διαφορετικοί πληθυσμοί κυττάρων σχηματίζουν κακοήθεις όγκους. Μέσα σε οποιαδήποτε δεδομένη φυσιολογικούς ιστούς, κατοικούν έναν υποπληθυσμό βλαστικών κυττάρων με ικανότητες της αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης σε εξειδικευμένα κύτταρα. Ομοίως, ένας όγκος αποτελείται από έναν ετερογενή πληθυσμό κακοήθων κυττάρων με διακριτή τάξη της διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού και ογκογόνο δυναμικό. Μεταξύ αυτών των ετερογενών κακοήθη κύτταρα, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) αναφέρεται ως μια μικρή αλλά διακριτή πληθυσμός του στοιχείου στην μάζα του όγκου που είναι πρωταρχικός εμπλέκονται στα στάδια της διαδικασίας, ο μετασχηματισμός και η επακόλουθη πρόοδος του όγκου [1]. Το μοντέλο CSC υποστηρίζει ότι, όπως και τα βλαστικά κύτταρα των φυσιολογικών ιστών, κυττάρων όγκου ακολουθεί ιεραρχική οργανισμούς στους οποίους CSC ευρίσκονται εις τις κορυφή κρατήστε την ικανότητα για ογκογένεση [2], προαγωγή μετάστασης [3-5], και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία [6 -8]. Αυτός ο κυτταρικός πληθυσμός ογκογενή απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά στην ανθρώπινη μυελοειδή λευχαιμία [9,10], και στη συνέχεια, και σε άλλους συμπαγείς όγκους [11-13]. Η πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενη δοκιμασία για την απομόνωση του CSC είναι η δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας και βασίζεται στην ικανότητα των CSC να αναπτύσσονται σε ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες και να σχηματίσουν αποικίες κυμαινόμενο [12], τα λεγόμενα «σφαίρες». Προηγουμένως, απομονώσαμε CSC σφαίρες από ανθρώπινο μυοσκελετικό σαρκώματα [14-16], και σε αυτή τη μελέτη απομονώσαμε επίσης CSC από διαφορετικές καρκίνωμα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η καρκινώματα είναι κοινά ενηλίκων κακοήθειες που εμφανίζουν υψηλό μεταστατικό δείκτη κατά τη διάγνωση και την εκτεταμένη νοσηρότητα [7, 12], μυοσκελετικά σαρκώματα είναι ετερογενείς, σχετικά σπάνια και εξαιρετικά επιθετική κακοήθειες των οστών και των μαλακών ιστών που συμβαίνουν συχνά σε παιδιά και νεαρούς ενήλικες [17] . Το υψηλό ποσοστό υποτροπής χαρακτηριστικό αυτών των νεοπλασμάτων επηρεάζει δραματικά την κλινική έκβαση και, παρά την χειρουργική επέμβαση μπορεί να είναι θεραπευτική, πρόγνωση όγκων παραμένει φτωχή. Ως εκ τούτου, οι τρέχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν είναι επαρκείς για να βελτιώσουν την κλινική έκβαση, και περαιτέρω βελτιώσεις μπορούν να αντλούν μόνον από καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών των ασθενειών αυτών, και από την αναγνώριση ειδικών δεικτών που σίγουρα διακρίνουν CSC από άλλα κύτταρα του όγκου. Έτσι, σύμφωνα με αυτό το πλαίσιο, η

in vitro

απομόνωση των σφαιρών παρέχει ένα πολύτιμο εργαλείο.

Η ποσοτική Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) είναι η πιο ευαίσθητη και ακριβής μέθοδος για την ποσοτικοποίηση mRNA έκφραση ενός απλού γονιδίου σε διάφορες πειραματικές συνθήκες και απαιτεί κανονικοποίηση των δεδομένων έναντι ενός γονιδίου αναφοράς, το οποίο τυπικά πρέπει να έχει μια πολύ σταθερή έκφραση στο πλαίσιο των διαφόρων θεωρείται πειραματική διαδικασίες [18]. Η ταυτοποίηση των ειδικών γονιδίων καθαριότητα (HKG) είναι ένα κεντρικό προαπαιτούμενο για τη μελέτη του σχετική μεταβολή στην έκφραση του mRNA του γονιδίου-στόχου. Η επιλεγμένη HKG δεν θα πρέπει να συν-ρυθμίζονται με το γονίδιο στόχο ή επηρεάζονται από την πειραματική διαδικασία. Θα πρέπει επίσης να εκφράζονται σε αφθονία και έχουν ελάχιστη μεταβλητότητα. Η πιο κοινή μέθοδος για την ομαλοποίηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου είναι να συγκριθούν τα επίπεδα mRNA του γονιδίου ενδιαφέροντος στο ενδογενές γονίδιο ελέγχου. Κανονικοποίηση των δεδομένων qRT-PCR έναντι τυχαίας HKG μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη υπολογισμό του παράγοντα κανονικοποίησης χρησιμοποιείται για να συγκρίνει τις πειραματικές συνθήκες, και ως εκ τούτου κρύβονται βιολογικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων [19]. Μεταξύ των διαφόρων γονιδίων αναφοράς, βήτα-ακτίνης, αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης, ή βήτα-τουβουλίνης είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενη, όπως είναι εντόνως εκφρασμένα, αναγκαία για την επιβίωση, δεν ρυθμίζεται από οδούς σηματοδότησης, και συντίθενται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα, . Ωστόσο, πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι ακόμη και βήτα-ακτίνη, ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενη HKG, θα μπορούσε να είναι ένα ακατάλληλο εσωτερικού ελέγχου [20,21].

qRT-PCR αναλύσεις της CSC έχουν ήδη πραγματοποιηθεί, αλλά, για τις γνώσεις μας, δεν δικαιολογεί την επιλογή του HKG είναι ακόμα διαθέσιμη. Σε αυτή τη μελέτη, επιλέξαμε 15 από τα πλέον χρησιμοποιούμενα HKG να αξιολογηθεί η σταθερότητα τους και στα δύο CSC και προσκολλημένα φυσικά κύτταρα απομονώθηκαν από ανθρώπινο ραβδομυοσαρκώματος (RS), οστεοσάρκωμα (OS), σάρκωμα Ewing (ES), καρκίνωμα μαστού (BC) και νεφρικό καρκίνωμα (RC). Μέσα από τη σύγκριση της διακύμανση του συντελεστή και τη χρήση των geNorm [22] και NormFinder [23] λογισμικά πραγματοποιήσαμε μια έγκυρη, να αναπαραχθεί, και συγκριτική ανάλυση της σταθερότητας του επιλεγμένου HKG.

Υλικά και Μέθοδοι

Native καρκινικών κυτταρικών σειρών και CSC πολιτισμών

RS κυτταρική σειρά (RD), γραμμές OS κυττάρων (MG-63, ΕΟΕ, Saos-2), κυτταρική σειρά ES (Α-673), BC κυττάρων γραμμή κυτταρική γραμμή (MDA-MB-231) και RC (ACHN), αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco του Iscove (IMDM, Gibco) συν 20 U /mL πενικιλλίνη, 100 mg /mL στρεπτομυκίνη, και 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (πλήρες IMDM) στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Ένα ανθρώπινο πρωτογενή καλλιέργεια ES (ES4540) χρησιμοποιήθηκε επίσης, και ελήφθη από ένα φρέσκο ​​βιοψία ανθρώπινων ES, και χαρακτηρίζεται, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Το δείγμα ES4540 συλλέχθηκε μετά από ενυπόγραφη συγκατάθεση και μετά την έγκριση της επιτροπής Istituto ORTOPEDICO Rizzoli ηθική (0033626, 9 Νοεμ, 2011), σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Εν συντομία, δείγματα ιστού υποβλήθηκαν σε μηχανική κοπής, που ακολουθείται από ενζυματική πέψη, για να ληφθούν μεμονωμένα κύτταρα που σπάρθηκαν σε πλήρες IMDM μέχρι το σχηματισμό μιας μονοστιβάδας.

κύτταρα CSC ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες μητρική όγκου διατηρήθηκαν σε ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες σε DMEM: F12 μέσο με της προγεστερόνης (20 ηΜ), putrescin (10 mg /ml), σεληνικό νάτριο (30 ηΜ), απο-τρανσφερρίνης (100 μg /mL) και ινσουλίνη (25 μg /mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σε φιάλες χαμηλής προσκόλλησης (Nunc, Penfield, ΝΥ) (δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας). Έχουμε λάβει το καλλιέργεια CSC διατηρώντας τη σφαιροειδή σε ανεξάρτητη από προσκόλληση σε συγκεκριμένες συνθήκες μέσα κυττάρων, την προσθήκη των παραγόντων ανάπτυξης EGF και bFGF κάθε 3-4 ημέρες (δύο φορές την εβδομάδα). Φρέσκο ​​ανθρώπινο EGF (20 ng /mL) και bFGF (10 ng /mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ) προστέθηκαν δύο φορές την εβδομάδα έως ότου τα κύτταρα άρχισαν να αναπτύσσονται ως πλωτό συσσωματώματα (σφαίρες). Σφαιροειδείς καλλιέργειες ενισχύθηκαν με κατεργασία του πρωτογενούς καλλιέργειας CSC με θρυψίνη, και ακολούθησε ήπια μηχανική διάσπαση, και με εκ νέου επίστρωση εναιώρημα μονοκύτταρους για να ληφθεί η δεύτερη καλλιέργεια σφαιροειδές. Η βιωσιμότητα επαληθεύθηκε με ερυθροσίνη χρώση. Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων ήταν χαμηλή (10-15% των νεκρών κυττάρων). Μόνο αυτές οι καλλιέργειες που ήταν σε θέση να σχηματίσουν σφαίρες και ότι εξέφρασε δείκτες βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με θεωρήθηκαν.

Illumina γονιδίωμα αναλυτή αλληλουχίας και η ανάλυση των δεδομένων

Μια βαθιά ανάλυση της αλληλουχίας του MG-63, ΕΟΕ, και Saos-2 μοντέλα OS κυττάρου διεξήχθη για να συγκριθεί η παγκόσμια μεταγραφική έκφραση του CSC στις αντίστοιχες φυσικά κύτταρα, προκειμένου να επιλεγεί ένα πάνελ σταθερών HKG για ανάλυση qRT-PCR. Εν συντομία, ολικό RNA συλλέχθηκε από το υλικό κυτταρικής λύσεως σε οξύ θειοκυανικό γουανιδίνιο-φαινόλη-χλωροφόρμιο [24]. Το συνολικό RNA ποσοτικοποιήθηκε με Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. RIN (RNA Ακεραιότητα Number) και αναλογία /A280 A260 του παρασκευασμένου ολικού RNA ήταν όλα 10, και πάνω από 1,8, αντίστοιχα. Η βιβλιοθήκη των μορίων εκμαγείου για αλληλούχιση του DNA υψηλής απόδοσης μετατράπηκε από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, CA), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η βιβλιοθήκη επίσης ποσοτικά με Bioanalyzer (Agilent), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η βιβλιοθήκη (19:00) υποβλήθηκε σε σύμπλεγμα ενίσχυσης σε ένα κελί v4 Ενιαία Διαβάστε ροής με ένα μέσο γενιά cluster (Illumina). Αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε σε ένα γονιδίωμα Αναλυτή GAIIx για 70 κύκλους χρησιμοποιώντας αντιβασιλείς Cycle Sequencing v4 (Illumina). Ανθρώπινο γονιδίωμα build 19 (hg19) είχαν κατεβάσει από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στη Σάντα Κρουζ πρόγραμμα περιήγησης γονιδιώματος (https://genome.ucsc.edu/). ανάλυση εικόνας και της βάσης καλώντας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Off-Line Basecaller λογισμικού 1.6 (Illumina). Διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας ταυρότραγος v2 του CASAVA λογισμικού 1.7 με τα σύνολα δεδομένων ακολουθίας. κάλυψη Απομαγνητοφώνηση για κάθε γονιδιακό τόπο υπολογίστηκε από το συνολικό αριθμό που περνά φίλτρο διαβάζει ότι χαρτογραφηθεί, με είδος αντιλόπης-RNA, σε εξώνια. Αυτές οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση προεπιλεγμένες παραμέτρους. Τα στοιχεία που παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας Γονιδιώματος Studio Λογισμικού (Illumina). Η προηγμένη ανάλυση για την ποσοτικοποίηση με ποσοστημόριο αλγόριθμο κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Avadis NGS (version1.5, Strand Επιστημονική Intelligence Inc., San Francisco, CA).

απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA

Σύνολο RNA εκχυλίστηκε από CSC και φυσικά κύτταρα από όλες τις διαφορετικές histotypes περιλαμβάνονται στη μελέτη με τη χρήση του NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germany). On-στήλη DNase πέψη εκτελέσθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συνολική καθαρότητα του RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Φασματοφωτόμετρο Nanodrop (NanoDrop Technologies). Ολικό RNA (0.5 μα) μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA σε 20 μΐ τελικό όγκο, χρησιμοποιώντας MuLV αντίστροφη μεταγραφάση και αναστολέα RNase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή. Για κάθε δείγμα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία 3 βιολογικό επαναλήψεις.

qRT-PCR

qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός μέσου Φως ανακυκλωτή και το σύστημα Οικουμενική Probe Βιβλιοθήκη (Roche Applied Science, Μόντσα, Ιταλία ). Probe και οι εκκινητές επιλέχθηκαν με τη χρήση ενός web-based λογισμικό σχεδιασμού δοκιμασία (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com), και περαιτέρω ελεγχόμενη χρήση ολιγο Primer Analysis Software. Μόνο ενάρκτες που εκτείνονται μία σύνδεση εξονίου-εξονίου και την παραγωγή μιας PCR ενισχυμένου με μήκος μεταξύ επιλέχθηκαν 70 και 150 ζευγών βάσεων. Όλες οι εκκινητές σχεδιάζονται αναλύθηκαν με BLAST για την επαλήθευση τους εξειδίκευση (National Center for Biotechnology Information). Όλα cDNA αραιώθηκαν 1:10 και 10 μΐ χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο και δεν περιλαμβάνονται σε 20 μΐ συνολικού όγκου αντίδρασης qRT-PCR. Το πρωτόκολλο της ενισχύσεως ήταν: 95 ° C για 10 λεπτά? 95 ° C για 10 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 1 s για 45 κύκλους? 40 ° C για 30 s. Κάθε ανάλυση που περιλαμβάνεται ένα κενό. Ο Πίνακας 1 παρέχει μια περίληψη όλων των HKG, αλληλουχίες εκκινητή, και ανιχνευτές που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη. Για την αξιολόγηση της έκφρασης του c-myc (NM_002467.4), KLF4 (NM_004235.4), Nanog (NM_0248695.2) και OCT3 /4 (NM_002701.4), χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: c-Myc-F 5′-gctgcttagacgctggattt-3 ‘, c-Myc-R 5′-taacgttgaggggcatcg-3′, ιχνηλάτης 66? KLF4-F 5’-ccatctttctccacgttcg-3 ‘, KLF4-R 5′-agtcgcttcatgtgggagag-3′, ανιχνευτής 7 ;. Nanog-F 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘, Nanog-R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3, ιχνηλάτης 69? OCT3 /4-F 5’-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3 ‘, OCT3 /4-R 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3’, ανιχνευτή 60. Για τους σκοπούς της κανονικοποίησης, η σχετική έκφραση του KLF4, c-myc, Nanog και OCT3 /4 κανονικοποιήθηκαν από το γονίδιο αναφοράς ACTB ή για το γεωμετρικό μέσο όρο των YWHAZ και GAPDH για CSC και φυσικά κύτταρα από MG-63, ή για το γεωμετρικό μέσο των PPIA και HMBS για CSC και φυσικά κύτταρα από ACHN και MDA-MB-231. Η σχετική έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο ΔΔCt [25].

Η

NormFinder ανάλυση

πρόγραμμα NormFinder είναι μια βοηθητική εφαρμογή VBA [23] με βάση μια προσέγγιση εκτίμηση της διακύμανσης , το οποίο κατατάσσει τον υποψήφιο HKG με βάση την αξιολόγηση της σταθερότητάς τους, και αποδίδει μια τιμή σταθερότητα σε κάθε υποψήφιο γονίδιο χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο που βασίζεται σε προσέγγιση. Σε συμφωνία με τις απαιτήσεις NormFinder, οι τιμές Ct μεταμορφώθηκαν σε σχετική ποσότητα, χρησιμοποιώντας την κατώτατη τιμή Ct ως βαθμονομητή. Σύμφωνα με την ανάλυση, η χαμηλότερη τιμή σταθερότητα κορυφαία. Εμείς ομαδοποιούνται όλα τα δεδομένα σε 3 διαφορετικές ομάδες: 1) όλα τα δεδομένα από την CSC διαφορετικών όγκων? 2) όλα τα δεδομένα από την εγγενή κύτταρα διαφορετικών όγκων? 3) όλα τα δεδομένα από διαφορετικούς όγκους με CSC και φυσικά κύτταρα συγκεντρώνονται μαζί. Για την τρίτη ομάδα των δεδομένων, εκτός από την CSC και φυσικά κύτταρα που λαμβάνονται από όλους τους όγκους συγκεντρωθούν, θεωρήσαμε επίσης CSC και φυσικά κύτταρα που λαμβάνονται από τον μοναδικό τύπο όγκου, από σάρκωμα ή από καρκίνωμα. Όλα τα αποτελέσματα ελήφθησαν από 3 σετ των επαναλήψεων

GeNorm ανάλυση

GeNorm κατά 3,0 [22] διατίθεται σε qbase + [26] (Biogazelle, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο, http:.. //Www .qbaseplus.com) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σταθερότητα των υποψήφιων HKG. GeNorm υπολογίζει όλες τις πιθανές μέσος ζεύγη διακύμανση μεταξύ των υποψήφιων γονιδίων και παρέχει ένα μέτρο της σταθερότητας έκφρασης (Μ) του κάθε γονιδίου. Μια M-τιμή κάτω από 1.5 δείχνει σταθερή HKG. Το γονίδιο υποψήφιος αναφορά με τη χαμηλότερη τιμή Μ θεωρήθηκε ότι έχει την πιο σταθερή έκφραση. GeNorm κατατάσσεται γονίδια αναφοράς υποψήφιος βάσει της σταθερότητας της έκφρασης, και την εκτέλεση σταδιακή αποκλεισμός του γονιδίου με την υψηλότερη M-τιμή (το λιγότερο σταθερό εκφραζόμενο γονίδιο), και υπολογίζει Μ-τιμές για τα υπόλοιπα γονίδια. Χρησιμοποιούμε επίσης GeNorm να επαληθεύσει εάν ένα ενιαίο HKG είναι επαρκής για την κατάλληλη κανονικοποίηση. Πράγματι, GeNorm παρέχει το βέλτιστο αριθμό των γονιδίων αναφοράς που απαιτούνται για την ακριβή κανονικοποίηση. V τιμές κάτω από την τιμή αποκοπής 0,15 υποδεικνύεται ο βέλτιστος αριθμός των γονιδίων που απαιτούνται για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Ομοίως με την ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με NormFinder, έχουμε ομαδοποιήσει όλα τα δεδομένα και τα αποτελέσματα σε 3 διαφορετικές ομάδες. Όλα τα αποτελέσματα ελήφθησαν από 3 σετ επαναλήψεων.

Συντελεστής διακύμανσης ανάλυση

σταθερότητας γονιδιακή έκφραση αξιολογούνται από τον συντελεστή μεταβλητότητας (CV) υπολογίστηκε διαιρώντας την τυπική απόκλιση (SD) του κατώτατου ορίου κύκλων (Ct) από τη μέση τιμή Ct. Όπως και στην ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με NormFinder και GeNorm, έχουμε ομαδοποιήσει όλα τα στοιχεία σε 3 διαφορετικές ομάδες, και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από 3 σετ επαναλήψεων.

Rank συνάθροιση

Οι αναλύσεις που εκτελούνται από το τρεις περιγράφονται μέθοδοι έδειξαν κάποιες διαφορές στο βαθμό σταθερότητας της HKG. Ως εκ τούτου, έχουμε εντοπίσει τα πιο σταθερά γονίδια θεωρώντας τη χαμηλότερη τιμή του μαθηματικού μέσου όρου της μεθόδου NormFinder, geNorm και το βιογραφικό κατατάσσεται για κάθε γονίδιο.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με StatView ™ 5.0.1 λογισμικό (SAS Institute Inc., Cary, NC). Για τον χαρακτηρισμό των CSC και γηγενών κυττάρων από MG-63, MDA-MB-231 και ACHN, θεωρήθηκαν δεδομένα ως μη κανονικά κατανεμημένα, και χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικό Mann-Whitney U. Τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Τυπική απόκλιση (SD) των τιμών κατωφλίου Κύκλου δέλτα (ΔΟΙ) υπολογίστηκε ως συνδυασμένη τυπική απόκλιση (SDpooled). HKG παραλλαγή έκφρασης στην CSC και φυσικά κύτταρα αξιολογήθηκε με την αντιστοιχισμένη signed-rank test Wilcoxon. Για όλες τις αναλύσεις, οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές με ένα

ρ

τιμές ≤ 0,05.

Αποτελέσματα

ποιότητα RNA έλεγχο και τον χαρακτηρισμό της CSC

εγκατεστημένος καλλιέργειες σφαίρα από εμπορικά διαθέσιμες κυτταρικές σειρές από 3 διαφορετικά histotypes σάρκωμα και 2 καρκίνωμα (MG-63 για το OS, RD για RS, α-673 για ES, MDA-MB-23 για την BC, και ACHN για RC), και από ένα φρέσκια βιοψία ES (ES4540). Η φασματοφωτομετρική ανάλυση επιβεβαίωσε την καθαρότητα των δειγμάτων, με Α

260 /

280 αναλογία 2,08 ± 0,06, υποδεικνύοντας πρωτεΐνη χωρίς καθαρό RNA, και Α

260/230 αναλογία 1,98 ± 0,21, υποδεικνύοντας ότι το συνολικό RNA ήταν φαινόλη και αιθανόλη δωρεάν.

Οι βλαστική ικανότητα-όπως χαρακτηριστικά για όλες τις καλλιέργειες CSC που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί [16,27], με την εξαίρεση των cscMG-63, cscMDA- MB-231, και cscACHN για τα οποία η ικανότητα για την ανάπτυξη ως πλωτό συσσωματώματα (Σχήμα 1), και η έκφραση του mRNA για KLF4, c-myc, Nanog, και /4 δείκτες βλαστική ικανότητα OCT3 [28] ήταν εδώ επιβεβαιωθεί.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες των προσκολλημένων γηγενή κύτταρα και CSC κυμαινόμενο σφαίρες παρατηρήθηκε με ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο για τις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές (γραμμή κλίμακας 100 μm, αριστερό πλαίσιο), και γονιδιακή έκφραση δεικτών βλαστοκυττάρων από qRT-PCR (δεξί πάνελ). Κανονικοποίηση να ACTB. Για cscMG-63, c-Myc ** p = 0,0019, KLF4 p = ns, Nanog ** p = 0,0010, OCT3 /4 * p = 0,0265. Για cscMDA-ΜΒ-231, c-Myc ** ρ = 0,0011, KLF4 * ρ = 0,0130, Nanog ** ρ = 0,0011, OCT3 /4 * ρ = 0,0325. Για cscACHN, c-Myc p = ns, KLF4 * p = 0,0130, Nanog * p = 0,0130. Για προσκολλημένη ACHN, OCT3 /4 * p = 0,0130. (N = 6-12)

Η

Ειδικότερα, στην cscMG-63 βρήκαμε μια τάση αυξημένης έκφρασης του KLF4. (Σχήμα 1? Η = 12? P = NS), και μία σημαντικά υψηλότερη έκφραση του c-myc (** ρ = 0,0019), Nanog (** ρ = 0,0010), και OCT3 /4 (* ρ = 0,0265). CSC από MDA-MB-231 πολύ εκφράζουν όλους τους δείκτες stamness από το προσκολλημένα καλλιέργειας (σχήμα 1? Η = 6? KLF4 * ρ = 0,0130? C-Myc ** ρ = 0,0011? Nanog ** ρ = 0,0011? OCT3 /4 * ρ = 0,0325), ενώ οι καλλιέργειες σφαίρα από ACHN εκφράζονται σταθερά επίπεδα του mRNA για KLF4 και Nanog (Σχήμα 1? η = 6? KLF4 * ρ = 0,0130? Nanog * ρ = 0,0130), και δεν διαφέρει έκφρασης για c-Myc . Σε cscACHN, η έκφραση του OCT3 /4 δείκτη είναι χαμηλότερη από την προσκολλημένα μητρική καλλιέργεια (Σχήμα 1? * Ρ = 0,0130). Τα γονίδια βλαστική ικανότητα ομαλοποιήθηκαν από ACTB, ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενη HKG.

προφίλ έκφρασης των υποψηφίων γονιδίων HKG

Δεκαπέντε υποψήφια γονίδια αναφοράς (Πίνακας 1) επελέγησαν μέσα από την ανάλυση της βιβλιογραφίας έρευνα για μελέτες σχετικά φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων και κυττάρων όγκου με ανάλυση qRT-PCR.

Επιλέξαμε εκείνα τα γονίδια τα οποία ανήκουν σε διαφορετικές λειτουργικές κατηγορίες ή πορείες, προκειμένου να μειωθεί η πιθανότητα να συμπεριλάβει στις συν-ρυθμιζόμενων γονιδίων ανάλυση. Η μεταγραφή προφίλ των επιλεγμένων γονιδίων προκαταρκτική ανάλυση της αλληλουχίας των Illumina Genome Analyzer. Η ανάλυση προσδιορισμού αλληλουχίας βαθιά έδειξε ότι οι υποθετικές γονίδια αναφοράς εκφράζονται σταθερά, με την εξαίρεση της G6PD (Πίνακας 2, Σχήμα 2Α).

(Α) Heat χάρτη που δείχνει τη σχετική έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων σε φυσικά κύτταρα και CSC από MG-63, ΕΟΕ, και SAOS-2. (ΣΙ). Μεταγραφικό προφίλ του ορίου του κύκλου (Ct) τιμές των υποψήφιων γονιδίων HKG στην CSC και η μητρική κυτταρικές σειρές. Κουτιά αντιπροσωπεύουν άνω και κάτω τεταρτημόρια του εύρους ορίου του κύκλου με το μεσαίο αναφέρεται, κάθετες μπάρες αντιπροσωπεύουν το 10

ου και 90

ου εκατοστημόρια. Και στις δύο CSC και προσκολλημένη κυτταρικές σειρές, 18S rRNA ήταν η πιο υψηλή έκφραση του γονιδίου (χαμηλότερη τιμή Ct), ενώ G6PD ήταν το λιγότερο που εκφράζεται γονίδιο (υψηλότερη τιμή Ct).

Η

χρησιμοποιείται μόνο MG-63 ως εκπρόσωπος του histotype OS για την επόμενη ανάλυση qRT-PCR για να επιβεβαιωθούν τα δεδομένα που λαμβάνονται από βαθιά αλληλουχίας. Για να συγκρίνετε διαφορετικά επίπεδα μεταγραφής του mRNA χρησιμοποιήθηκαν οι τιμές κύκλους κατωφλίου (Ct). τιμή Ct είναι η τομή μεταξύ μιας καμπύλης ενίσχυσης και μία γραμμή ορίου, και συσχετίζεται αντίστροφα με την ποσότητα του γονιδίου στόχου που υπάρχει στην αντίδραση PCR [29]. Τα 15 υποψήφια γονίδια αναφοράς εμφάνισε ένα ευρύ φάσμα επίπεδο έκφρασης. Η κατανομή των διάμεσες τιμές Ct και εκατοστημόριο για κάθε γονίδιο φαίνεται στην γραφική παράσταση του Σχ blox 2Β. γονίδια αναφοράς λιγότερο εκφράζονται σε CSC σύγκριση με τη φυσική κύτταρα. Οι μικρότερες διαφορές στην έκφραση γονιδίων μεταξύ CSC και η μητρική κυτταρικές σειρές, που εκφράζεται ως ΔΟΙ, ανιχνεύθηκαν για Β2Μ, ΤΒΡ και SDHA, ενώ η υψηλότερη ΔCt υπολογίστηκαν για ACTB, Tubb και PGK1 (Πίνακας 3). Με την εκτέλεση του σε συνδυασμό Wilcoxon signed-rank test για κάθε γονίδιο να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ CSC και φυσικά κύτταρα που λαμβάνονται από τα ίδια τα κύτταρα του προέλευσης, βρήκαμε μια σημαντική διαφορά στην έκφραση HKG μεταξύ CSC και φυσικά κύτταρα για περίπου το ήμισυ του HKG που εξετάστηκαν ( Πίνακας 3).

η

Προσδιορισμός της σταθερότητας της γονιδιακής έκφρασης καθαριότητας

σταθερότητας έκφραση HKG αξιολογήθηκε με τη χρήση NormFinder VBA applet, το λογισμικό GeNorm, και υπολογίζοντας και συγκρίνοντας τον συντελεστή μεταβλητότητας ( CV) σε τρεις διαφορετικές ομάδες: στην (1) CSC ή (2) η μητρική κυττάρων, με στόχο να εντοπίσει τις πιο σταθερές γονίδια μέσα σε ένα συγκεκριμένο υποτύπους κυττάρων, και (3) στις συγκεντρωτικές CSC και φυσικά κύτταρα, με στόχο την προσδιορισμό των πλέον σταθερών γονιδίων πρέπει να θεωρηθούν ως γονίδια αναφοράς για τη σύγκριση της έκφρασης γονιδίου μεταξύ CSC και φυσικά κύτταρα.

Οι τιμές σταθερότητας για NormFinder και M τιμές για GeNorm είναι παράμετροι σταθερότητας που συσχετίζονται αντίστροφα με την έκφραση σταθερότητα της HKG. Όλα τα 15 γονίδια αναφοράς υποψήφιος είχε μια τιμή Μ χαμηλότερη από την τιμή κατωφλίου του 1,5 (Πίνακας 4), η οποία έδειξε ότι όλα μπορεί να θεωρηθεί ως αποδεκτή από την άποψη της σταθερότητας [22].

Η

1) η πιο σταθερή HKG στην CSC. Χρησιμοποιώντας τη VBA Applet NormFinder, το 3 πιο σταθερή HKG είχε ως αποτέλεσμα GAPDH, PGK1 και HMBS (από το πρώτο έως το τρίτο σταθερό), ενώ η λιγότερο σταθερή ήταν RPL13a, Β2Μ και GUSB. Χρησιμοποιώντας το λογισμικό GeNorm, εντοπίσαμε YWHAZ, GAPDH και ΤΒΡ ως το πιο σταθερό HKG, ενώ οι λιγότερο σταθερές γονίδια ήταν ACTB, GUSB και Β2Μ. μέθοδος CV υπογράμμισε, επίσης, ότι η χρήση των ACTB θα πρέπει να αποφεύγεται, ενώ, όπως για GeNorm και αναλύει NormFinder, η χρήση του PGK1 και YWHAZ συνιστάται. Μια σύγκριση της κατάταξης που παράγονται από τις τρεις προσεγγίσεις αποκάλυψε διαφορά ανάλογα με τον τύπο του αλγορίθμου που εφαρμόζεται. Ο ελάχιστος αριθμός των γονιδίων αναφοράς που απαιτούνται για ομαλοποίηση προσδιορίστηκε με υπολογισμό GeNorm του κατά ζεύγη διακύμανσης (συντελεστής διακύμανσης, V) μεταξύ ενός δεδομένου αριθμού γονιδίων και την προσθήκη ενός επιπλέον γονιδίου, και ο βέλτιστος αριθμός των γονιδίων αναφοράς υπολογίστηκε ως 3 (V3 /4 0,114, Σχήμα 3Α). Εν κατακλείδι, για αναλύσεις η γονιδιακή έκφραση του mRNA που απομονώθηκε από CSC, η βέλτιστη παράγοντας κανονικοποίησης θα πρέπει να υπολογίζεται ως ο γεωμετρικός μέσος των στόχων αναφοράς YWHAZ, GAPDH και PGK1.

Ο ελάχιστος αριθμός των γονιδίων που απαιτούνται για την κανονικοποίηση των δεδομένων αξιολογήθηκε από ζεύγη παραλλαγή (Vn /n 1) στο (Α) CSC, (Β) φυσικά κύτταρα, (Γ) στη φυσική κυτταρικές γραμμές CSC και από όλους τους όγκους, (D) από σάρκωμα και (C) από καρκινώματα. Ένας συντελεστής μεταβλητότητας (V) παρακάτω 0,15 υποδεικνύει τον βέλτιστο αριθμό γονιδίων που απαιτούνται για την κανονικοποίηση των δεδομένων. V2 /3 & lt? 0.15 δείχνει ότι τα 2 γονίδια που απαιτούνται για την ομαλοποίηση των δεδομένων

Η

2) Η πιο σταθερή HKG στη μητρική προσκολλημένων κυττάρων.. NormFinder ανάλυση αποκάλυψε ότι 18S rRNA, TBP, και PPIA ήταν οι τρεις καλύτερες HKG, ενώ RPL13a, G6PD, και ACTB ήταν χειρότερα στην σταθερότητα της έκφρασης. Ομοίως, GeNorm προσδιορίζονται PPIA και 18S rRNA ως δύο πιο σταθερή HKG, ακολουθούμενη από GAPDH, ενώ οι λιγότερο σταθερές γονίδια, έτσι ώστε από την τελευταία κατάταξη, ήταν G6PD, RPL13a και ACTB. Η μέθοδος CV πρότεινε HMBS, TBP και YWHAZ ως τα τρία πιο σταθερή γονίδια. Ο υπολογισμός GeNorm του συντελεστή διακύμανσης V πρότεινε ότι ο βέλτιστος αριθμός των γονιδίων αναφοράς ήταν 2 (V2 /3 0.146? Σχήμα 3Β), και η προσθήκη ενός τρίτου γονιδίου αναφοράς είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή επίδραση στην ομαλοποίηση (κάτω από την τιμή αποκοπής 0,15). Εν κατακλείδι, για το φυσικό κύτταρο, σύμφωνα με τις αναλύσεις, η βέλτιστη παράγοντας κανονικοποίησης θα πρέπει να υπολογίζεται ως ο γεωμετρικός μέσος των PPIA και TBP.

3) Τέλος, πραγματοποιείται η ανάλυση της CSC και η μητρική συγκεντρώνονται κύτταρα σε όλα όγκων (Α), το σάρκωμα (Β) και καρκίνωμα (C).

(3Α) σε CSC και φυσικά κύτταρα από όλους τους όγκους, NormFinder προσδιορίζονται GAPDH, TBP, και PPIA ως το τρία πιο σταθερή HKG, ενώ ACTB, RPL13a και GUSB ήταν το λιγότερο σταθερό. PPIA και GAPDH επιβεβαιώθηκαν επίσης με ανάλυση GeNorm, μαζί με 18S rRNA. Και πάλι, ACTB ήταν η τελευταία γονίδιο στο σταθερότητα για την ανάλυση GeNorm, μαζί με Β2Μ και G6PD. Η αξιολόγηση βιογραφικό πρότεινε TBP, Β2Μ και SDHA (Πίνακας 4), ενώ ACTB, Tubb και 18S rRNA ήταν το λιγότερο σταθερό. GeNorm συνιστάται η χρήση του 4 HKG για την ακριβή ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης (V & lt? 0.15 όταν συγκρίνεται ένα παράγοντα κανονικοποίησης με βάση τα 4 ή 5 πιο σταθερό στόχους? Σχήμα 3C). Κατά συνέπεια, ο συντελεστής κανονικοποίησης θα πρέπει να υπολογίζεται ως ο γεωμετρικός μέσος της TBP, PPIA, HMBS και YWHAZ ή GAPDH.

(3β) Στο CSC και η μητρική κυττάρων από σάρκωμα, το λογισμικό NormFinder προσδιορίζονται GAPDH, YWHAZ και 18S rRNA ως τις πιο σταθερές γονίδια, αντί G6PD, RPL13a και Β2Μ ήταν το λιγότερο σταθερό. GAPDH και YWHAZ ταυτοποιήθηκαν ως το καλύτερο HKG, επίσης, από την ανάλυση GeNorm, ενώ ACTB και RPL13a ήταν μεταξύ των τελευταίων κατετάγη γονίδια. Η μέθοδος CV έδειξε ότι HMBS, TBP και SDHA είχε την καλύτερη θέση κατάταξης (Πίνακας 5). Ο βέλτιστος αριθμός των στόχων αναφοράς είναι 2 (V2 /3 0,143, Σχήμα 3D). Εν κατακλείδι, η βέλτιστη παράγοντας κανονικοποίησης μπορεί να υπολογιστεί ως ο γεωμετρικός μέσος των στόχων αναφοράς YWHAZ και GAPDH.

Η

(3C) Η ανάλυση της σταθερότητας HKG σε καρκίνωμα αποκάλυψε ότι PPIA, HMBS και RPL13a ήταν η πιο σταθερή HKG για NormFinder. GeNorm επιβεβαίωσε επίσης PPIA και RPL13a ως πιο σταθερή στόχων από GeNorm, ακολουθούμενη από 18S rRNA, ενώ η μέθοδος CV πρότεινε Β2Μ, TBP και G6PD (Πίνακας 5). Ο υπολογισμός GeNorm του συντελεστή V πρότεινε ότι 2 HKG είναι επαρκής για την εξομάλυνση (V2 /3 0,084, σχήμα 3Ε). Εν κατακλείδι, η βέλτιστη παράγοντας κανονικοποίησης σε αυτή την περίπτωση θα πρέπει να υπολογίζεται ως ο γεωμετρικός μέσος των δύο από τα ακόλουθα γονίδια, PPIA, HMBS ή RPL13a, τα οποία έχουν την ίδια συνολική αξία rank.

Η επικύρωση του εντοπίστηκαν HKG στην η CSC μοντέλο

στην αξιολόγηση της γονιδιακής έκφρασης, η χρήση των μη βέλτιστη HKG μπορεί να παράγει λανθασμένα αποτελέσματα ή μπορεί να κρύψει τη διαφορά στην έκφραση γονιδίων. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τα γονίδια που αλλάζουν ελαφρώς μεταξύ δύο πληθυσμοί κυττάρων, όπως CSC και φυσικά κύτταρα.

Αναλύσαμε την έκφραση των γονιδίων βλαστική ικανότητα c-myc, KLF4, Nanog, και OCT3 /4 που ήταν προηγουμένως κανονικοποιημένη να ACTB (Σχήμα 1), με τις αναγνωρισμένες κορυφαία HKG για την CSC και η μητρική κυττάρων, σάρκωμα και το καρκίνωμα, αντίστοιχα (GAPDH και YWHAZ για σάρκωμα, και PPIA και HMBS για καρκίνωμα). Μερικά από τα γονίδια που σχετίζονται με stem-θεωρούνται έδειξε μία βελτιωμένη ευρωστία της στατιστικής ανάλυσης διεξήχθη με την κανονικοποίηση με την πιο σταθερή HKG, σε σχέση με ACTB. Ειδικότερα, όπως φαίνεται στο σχήμα 4, βρήκαμε ότι η εξομάλυνση των Nanog με τη μέση γεωμετρική από τις πιο σταθερές HKG είχε ως αποτέλεσμα *** ρ = 0,0007 για cscMG-63 και ** ρ = 0,0043 για cscACHN, ενώ με ACTB ομαλοποίηση λάβαμε ** ρ = 0.0011 και ρ = * 0.0130, αντίστοιχα. Σε cscMG-63, για cMyc λάβαμε *** ρ = 0,0003 με τη νέα ανάλυση, στη θέση της ** ρ = 0,0019 με την εξομάλυνση προς ACTB.

Η επίδραση της εξομάλυνσης γονιδιακής έκφρασης με τη βέλτιστη HKG ήταν διερευνηθεί σε CSC και φυσικά κύτταρα από MG-63 και ACHN. (Α) Για την κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος, η έκφραση των δεικτών βλαστικών κυττάρων Nanog και cMyc αξιολογήθηκαν και ομαλοποιήθηκε ως προς το γεωμετρικό μέσο όρο των GAPDH και YWHAZ. *** Ρ = 0,0007 για Nanog, *** ρ = 0,0003 για c-Myc. (Β) Για την ranal κυτταρική γραμμή καρκινώματος, η έκφραση του Nanog και cMyc ομαλοποιήθηκε με τη μέση γεωμετρική της PPIA και HMBS. ** P = 0.0043 για Nanog. (N = 6).

Η

Συζήτηση

Η εξελισσόμενη έννοια της CSC έχει προσελκύσει πολλή προσοχή, και ο χαρακτηρισμός της CSC έχει οδηγήσει το δρόμο σε νέες υποψήφιους για αντικαρκινικές θεραπείες. CSC είναι μια μειονότητα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων-κίνηση που εμπλέκονται σε διάφορες φάσεις της φιλο-ογκογόνο διαδικασία, από την έναρξη του όγκου [30], για να χημειοαντίσταση [31] και της υποτροπής [32]. CSC μπορεί να απομονωθεί από κυτταρικές σειρές και δείγμα ιστού με την μέθοδο σύστημα σφαίρα [12], με βάση την ικανότητα του CSC να αυξάνεται καθώς σφαιρικά επιπλέει αποικίες σε ανεξάρτητο από αγκύρωση συνθήκες. Μέχρι σήμερα, αυτό θεωρείται ένα πολύτιμο μέθοδος για την απόκτηση CSC-εμπλουτισμένες καλλιέργειες. Πρόσφατα, απομονώσαμε CSC από μυοσκελετικά σαρκώματα, τόσο από την κυτταρική γραμμή και φρέσκια βιοψία [16,27].