Αφηρημένο

ΡΤΕΝ είναι ένας ισχυρός πρωτεΐνη όγκου-καταστολέα. Επιθετικά και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (PC) συνδέεται με μια μείωση ή απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ. μείωση ΡΤΕΝ συμβαίνει συχνά χωρίς μεταλλάξεις γονιδίων, και προς τα κάτω ρύθμιση της δεν είναι πλήρως κατανοητή. Εδώ, δείχνουμε ότι ΡΤΕΝ ενσωματώνεται στο φορτίο εξωσωμάτων που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα. ΡΤΕΝ δεν ανιχνεύεται σε εξωσώματα που προέρχονται από φυσιολογικό, noncancerous κύτταρα. Βρήκαμε ότι ΡΤΕΝ μπορούν να μεταφερθούν σε άλλα κύτταρα μέσω εξωσώματα. Σε κύτταρα τα οποία έχουν μία μείωση ή πλήρη απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ, η μεταφερόμενη ΡΤΕΝ είναι ικανός να προσδώσει δραστικότητα όγκου-καταστολής σε κύτταρα δέκτη. Σε PC ασθενείς, δείχνουμε ότι ΡΤΕΝ ενσωματώνεται στο φορτίο εξωσωμάτων που κυκλοφορούν στο αίμα τους. Είναι ενδιαφέρον ότι, φυσιολογικά άτομα δεν έχουν καμία έκφραση ΡΤΕΝ σε εξωσώματα αίμα τους. Περαιτέρω, βρήκαμε ότι η ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) ενσωματώνεται σε ασθενείς PC »και φυσιολογικά άτομα» εξωσώματα αίματος. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι exosomal ΡΤΕΝ μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια PTEN στην ανεπάρκεια των κυττάρων PTEN, και μπορεί να έχουν διαγνωστική αξία για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Γαβριήλ Κ, Ingram Α, Austin R, Kapoor Α, Tang D, F Majeed , et al. (2013) Ο κανονισμός του Ογκοκατασταλτικής PTEN μέσω Εξωσώματα: Ένα διαγνωστικό Δυναμικό για τον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (7): e70047. doi: 10.1371 /journal.pone.0070047

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 17 του Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουλ, 2013

Copyright: © 2013 Gabriel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο βραβεύτηκε από τον καρκίνο του προστάτη και του Καναδά είναι περήφανα χρηματοδοτείται από το Movember Foundation, Grant # D2013-2 για K.Al. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και η δεύτερη κατά σειρά αιτία θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [1], [2], [3]. Η απώλεια ενός αντιγράφου του γονιδίου ΡΤΕΝ συμβάλλει στην έναρξη του όγκου του προστάτη, ενώ περαιτέρω μείωση στην έκφραση ΡΤΕΝ υποστηρίζει την εισβολή και τη μεταστατική συμπεριφορά των PC [4]. ΡΤΕΝ είναι μια πρωτεΐνη /λιπιδίου φωσφατάση. πεδίο φωσφατάσης τυροσίνης πρωτεΐνης του έχει τα χαρακτηριστικά ενός φωσφατάση διπλής ειδικότητας που είναι σε θέση να αποφωσφορυλιώνουν αμφότερα τα υπολείμματα σερίνης /θρεονίνης και τυροσίνης. Το κύριο λιπιδικό υπόστρωμα του ΡΤΕΝ είναι φωσφατιδυλινοσιτόλης (3,4,5) τριφωσφορικής (ΡΙΡ-3). Ο κύριος μηχανισμός της καταστολής όγκου από ΡΤΕΝ είναι η διατήρηση του κυτταρικού PIP-3 σε χαμηλά επίπεδα, αναστέλλοντας έτσι την ΡΙ3Κ-ΑΚΤ οδού και συμβάλλοντας στην κυτταρική απόπτωση ή κύκλου κυττάρου [5]. Η μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης ΡΤΕΝ συχνά συμβαίνει με την απουσία των μεταλλάξεων του γονιδίου [6], [7], [8]. Συνολικά, περίπου το 70-80% των πρωτοπαθών όγκων PC έχουν μια μείωση στην έκφραση ΡΤΕΝ [9]. έχουν διαφορετικούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στη μείωση της έκφρασης ΡΤΕΝ σε όγκους έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων υποκινητή μεθυλίωση [10], [11], και αρνητικός ρυθμιστής πρωτεΐνες [12]. Έχει προταθεί ότι άλλες, άγνωστων μηχανισμών μπορεί να ενεργεί σε πολλούς όγκους [10], [11]. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα ρυθμίζουν την έκφραση ΡΤΕΝ μέσω εξωσώματα.

Τα καρκινικά κύτταρα απελευθερώνουν κυστίδια στο περιβάλλον τους. Μικροκυστίδια είναι μία μόνο ποικιλία υπόστεγο κυστιδίων, που παράγονται μέσω της άμεσης εκβλάστηση της κυτταρικής μεμβράνης. Τα εξωσώματα είναι ένα άλλο, σχετικά μικρότερο είδος των κυστιδίων τα οποία είναι αποθηκευμένα σε πολυκυστικά σώματα και απελευθερώνεται όταν η πολυκυψελικό σώμα συγχωνεύεται με τη μεμβράνη των κυττάρων [13], [14]. Εξωσωμάτων περιεχόμενο αντικατοπτρίζει κυτταρική πηγή του [15], [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα περιεχόμενα αυτά θα μπορούσαν να περιλαμβάνουν ογκογόνες πρωτεΐνες, όπως έχουμε ήδη αναφερθεί [17], [18], ή ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών, όπως αναφέρθηκε στο παρόν. Έτσι, θα μπορούσε κανείς να προβλέψει ότι τα μόρια που μεταφέρονται από εξωσώματα προσδίδουν μια επίκτητη φαινότυπο σε κύτταρα δέκτη, οδηγώντας σε θετικές ή αρνητικές επιδράσεις σε σχέση με την εξέλιξη του όγκου εξαρτάται από την φύση των μορίων που μεταφέρονται. Το φορτίο εξωσωμάτων συνεπώς μπορεί να μεταβάλει την ισορροπία μεταξύ ογκογόνο και όγκου χαρακτηριστικά καταστολέα. Η ανάλυση των εν λόγω εμπορευμάτων θα μπορούσε να δείξει την κατάσταση έκφραση ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα, χωρίς να χρειάζεται να δοκιμάσετε άμεσα την κακοήθεια. Τα εξωσώματα αναδεικνύεται ως μια σημαντική πηγή για βιοδείκτες του καρκίνου και περιγράφονται ως μπαούλα βιοδείκτη θησαυρός για PC [19]. Έχει προταθεί ότι το καθεστώς ΡΤΕΝ σε ασθενείς PC θα μπορούσε να είναι ένα προγνωστικό παράγοντα ασθενείς σε κίνδυνο για μετάσταση καρκίνου ή υποτροπή μετά από ριζική προστατεκτομή [20], [21], [22]. Για αρκετές δεκαετίες, ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) έχει χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο βιοδείκτη για την ανίχνευση PC [23]. Ωστόσο, η χρήση του PSA περιορίζεται από την έλλειψη ειδικότητας και η αδυναμία να γίνει διάκριση μεταξύ νωχελικός και απειλητικές για τη ζωή μορφές της νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης [24]. ελέγχου PSA μπορεί να μειώσει το ποσοστό θνησιμότητας των PC, αλλά συνδέεται επίσης με ένα υψηλό ποσοστό των υπερδιάγνωσης και υπερθεραπεία [25], [26]. Στη μελέτη τους, Harvey et al. κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η εξέταση PSA έχει υψηλή ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών σημαντικό ποσοστό [27]. Αυτή η έλλειψη της προγνωστικής αξίας οδηγεί σε μια τεράστια αύξηση σε περιττές βιοψίες και στην υπερβολική θεραπεία των ασθενών PC χαμηλού κινδύνου [23], [25]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα ευρήματα, υπάρχει σοβαρή ανάγκη να βρούμε νέους δείκτες για PC ή για να ενισχύσει την ιδιαιτερότητα του τεστ PSA.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Τα μονοκλωνικά αντισώματα για ΡΤΕΝ, ΑΚΤ, Flotilin-1, ρ27, και η κυκλίνη D1 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Όλες οι αντίστοιχες συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling. Alexa Fluor 488 δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Molecular Probes (Eugene, OR).

Κυτταρικές σειρές.

DU145, PC-3 (ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα), U87 (ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος αστροκύτωμα) και τα ανθρώπινα κανονικά κύτταρα [ανθρώπινα αορτικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HAOEC), ανθρώπινα αορτικά κύτταρα λείων μυών (HAOSMC) και Ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (HPEC)] αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). κύτταρα DU145 με ΡΤΕΝ knockdown (DU145Kd) και κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με μη ειδικές siRNA είχαν αρχικά δημιουργούνται σε ένα από τα εργαστήριά μας (D.T.) στο νεφρό Hamilton Κέντρο Ερευνών (HKRC), Πανεπιστήμιο McMaster. κύτταρα DU145Kd παρήχθησαν χρησιμοποιώντας ΡΤΕΝ siRNA που εκφράζεται από ένα ρετροϊικό με βάση το Η1 υποκινητή-καθοδηγούμενο φορέα shRNA, και τα κύτταρα DU145 ελέγχου μολύνθηκαν με ρετροϊό που εκφράζει μη ειδικό siRNA, όπως και προηγουμένως λεπτομερώς [12]. CHO και ΟΗΟ-EGFR κύτταρα ελήφθησαν στο παρελθόν ως μια γενναιόδωρη δωρεά από το εργαστήριο Δρ Guha του στο Νοσοκομείο για Άρρωστα Παιδιά, Toronto. Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη καλλιεργήθηκαν σε μικροκυστίδιο-εξαντλημένο FBS (με φυγοκέντρηση επί μία νύκτα σε 100.000

ζ

). Για τις τυπικές καλλιέργεια, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο βασικό μέσο Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS).

Ο Απομόνωση εξωσωμάτων από τα ρυθμισμένα μέσα και Blood Plasma

Εξωσώματα συλλέχθηκαν από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης των διαφόρων κυτταρικών γραμμών και από ανθρώπινο πλάσμα, όπως περιγράφεται προηγουμένως [18], [28], [29]. Εν συντομία, ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε από κύτταρα σε περίπου 80% συρροή, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, και αυτό το υλικό υποβλήθηκε σε δύο διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε 300

g

για 5 λεπτά και μετά σε 12.000

g

για 20 λεπτά για να εξαλειφθούν τα κύτταρα και υπολείμματα. Τέλος, εξωσώματα ελήφθησαν μετά από φυγοκέντρηση για 2 ώρες σε 100.000

g

και στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με ένα μεγάλο όγκο αλατόνερου ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Αυτό το πρωτόκολλο συλλέγει συγκεκριμένα εξωσώματα και αποκλείει μεγάλα κυστίδια. Οι πρωτεΐνες εξωσωμάτων ανακτήθηκαν μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad).

Έκφραση PTEN Προφίλ

Τα κύτταρα (DU145, DU145Kd και DU145 με έλεγχο siRNA) και τα πρωτογενή κύτταρα (HAOEC , HAOSMC και HPEC), μαζί με τις αντίστοιχες εξωσώματα τους, λύθηκαν για 10 λεπτά σε πάγο σε ένα ρυθμιστικό λύσης που περιέχει: 10 mM Tris (ρΗ 6.8), 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 30 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 2% (κ.β. ./vol) SDS, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), και 1 mM Να

3νο

4. Τα λύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού για ΡΤΕΝ. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κατάλληλο συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα και χημειοφωταύγεια συν κιτ (κιτ ECL? Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο), μετά την οποία σαρώθηκαν οι κηλίδες και λωρίδες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad, CA) .

η ανίχνευση της σηματοδότησης γεγονότων που σχετίζονται με PTEN

για να αξιολογήσει τον αντίκτυπο εξωσωμάτων που περιέχουν PTEN σε κύτταρα DU145Kd, ο τελευταίος απλώθηκαν σε δίσκους 100 mm σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /mL, καλλιεργούνται εν συντομία, και σε νηστεία επί 24 ώρες (είτε σε DMEM συμπληρωμένο με 0,5% FBS, ή σε DMEM ελεύθερο ορού). Οι καλλιέργειες στη συνέχεια διεγείρονται όλη τη νύκτα με διάφορες συγκεντρώσεις εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα DU145. Μετά τη θεραπεία εξωσωμάτων, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για περιεχόμενο τελεστή σηματοδότηση τους χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ΑΚΤ αντισώματα (Cell Signaling), σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Η ανίχνευση της έκφρασης του ρ27 και κυκλίνη D1 διεξήχθη χρησιμοποιώντας τις ίδιες πειραματικές ρυθμίσεις που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του ρΑΚΤ.

φθορισμού Απεικόνιση εξωσωμάτων πρόσληψης

Για

in vitro

ανάλυση της έκφρασης ΡΤΕΝ, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου (Nalge Nunc, ΝΥ). Οι καλλιέργειες πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε προθερμασμένο (37 ° C) 4% (wt./vol) παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας αλατούχο ορό για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS, και antiquenching πραγματοποιήθηκε σε 50 mM ΝΗ

4Cl για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και επωάστηκαν με BSA [1% (wt./vol) σε PBS] για 30 λεπτά. Η επώαση με ένα πρωτεύον αντίσωμα εκτελέστηκε για 1 ώρα, ακολουθούμενη από πλύση σε PBS, και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση με δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά. Μετά τη χρώση, τα πλακίδια στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας Dako φθορισμού μέσο στερέωσης και παρατηρήθηκαν κάτω από ομοεστιακό μικροσκόπιο για την ανίχνευση της παρουσίας του περιεχομένου exosomal (ΡΤΕΝ) στις κύτταρα δέκτες.

Δοκιμασία Δραστηριότητα ΡΤΕΝ

Τα υλικά λύσεως από κύτταρα DU145Kd, τα οποία υποβλήθηκαν σε θεραπεία με εξωσώματα από κύτταρα DU145, υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας αντισώματα ΡΤΕΝ (Cell Signaling) και πρωτεΐνης G-Sepharose. δραστηριότητα ΡΤΕΝ εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τα υδατοδιαλυτά DiC8PtdIns υπόστρωμα (3, 4, 5) Ρ3 (Echelon). Τα απελευθερωμένα ελεύθερα φωσφορικά μετρήθηκαν με BIOMOL πράσινο αντιδραστήριο και ομαλοποιήθηκε έναντι μιας αντίδρασης που περιέχει μόνο ΡΙΡ3 υπόστρωμα [12].

Ανίχνευση του ΡΤΕΝ mRNA

DU145Kd κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα παρασκευάσματα εξωσωμάτων που προέρχονται από DU145, που ακολουθείται από εκτεταμένη πλύση και την εκχύλιση του RNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, ΝΥ). ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ενός σταδίου (Qiagen, CA) όπου ΡΤΕΝ ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τα σύνολα εκκινητών: νοηματικό 50-ATGACAGCCATCATCAAAGAG-30 και αντινόημα 50-GTGCCACTGGTCTATAATCCAG-30 [12]. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε 50 μL με την αρχική ενεργοποίηση Taq στους 95 ° C για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση εκκινητή στους 60 ° C για 1 λεπτό, και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% και φωτογραφήθηκαν. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος χρησιμοποιώντας τα σύνολα εκκινητών: αίσθηση 50-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-30 και αντίθετης φοράς 50-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-30

Ο πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας (Chemicon. ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 0.1 χ 10

4 κύτταρα DU145Kd απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων? μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα DU145. Άλλα κύτταρα DU145Kd υποβλήθηκαν σε αγωγή με DU145Kd προερχόμενο εξωσώματα για να δείξει την επίδραση της εξωσωμάτων με κατιούσα ρύθμιση ΡΤΕΝ. κύτταρα DU145 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για να δείξει την ικανότητα των εξωσωμάτων να αντισταθμίσει ΡΤΕΝ μειορρύθμιση σε DU145Kd. Η διαδικασία αυτή χρησιμοποιήθηκε για U87 και PC-3 κύτταρα.

Καρκίνος του προστάτη ασθενείς και στα φυσιολογικά άτομα

Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από δεοντολογική έγκριση από την ηθική διοικητικό συμβούλιο του Πανεπιστημίου McMaster (REB # 02-2174) . Οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν για το σκοπό της μελέτης και γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί από όλα τα άτομα που συμμετείχαν στη μελέτη. Δείγματα από 30 ασθενείς PC χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Οι ασθενείς είχαν προχωρήσει (Τ3 /Τ4) το στάδιο του όγκου. Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν πριν από την προστατεκτομή, και ιστοί όγκου συλλέχθηκαν μετά από χειρουργική επέμβαση και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. συλλέχθηκαν κλινικά αρχεία, όπως σκορ Gleason, PSA, το μέγεθος του όγκου, του όγκου των ιστοπαθολογικών βαθμό και μετάσταση. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σύμφωνα με τα ηθικά πρότυπα του Πανεπιστημίου McMaster, και η συναίνεση του ασθενούς ελήφθη πριν από τη δειγματοληψία. Οκτώ υγιείς εθελοντές άνδρες ηλικίας 50-65 (που ταιριάζουν με τα δείγματα ασθενών PC) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη? όλα ήταν χωρίς ιστορικό καρκίνου και με φυσιολογικά επίπεδα PSA.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλαμβάνονται τουλάχιστον τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή των επαναλήψεων εντός του αντιπροσωπευτικό πείραμα ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση t-test ενός μηχανογραφικού 2-tailed του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε Ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

PTEN εκφράζεται σε Εξωσώματα από το PC κύτταρα, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα

Εμείς καθορίζεται το καθεστώς του PTEN στην ακόλουθες κύτταρα PC: DU145, DU145 σταθερά επιμολυσμένα με ΡΤΕΝ siRNA (DU145Kd) για ΡΤΕΝ μειορρύθμιση ή knockdown, και DU145 επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA [12]. Τα εξωσώματα συλλέχθηκαν από τα προσαρμοσμένα μέσα από κάθε κυτταρικό τύπο, και ίσες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης από τα κύτταρα και τα εξωσώματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοστύπωση, μετά ανιχνεύθηκαν με αντισώματα ΡΤΕΝ. Αμφότερα τα κύτταρα DU145Kd (Σχήμα 1Α) και εξωσώματα (Σχήμα 1Β) έδειξε μία προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΡΤΕΝ σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου DU145 και τα κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA. Εκτιμήσαμε επίσης την κατάσταση φωσφορυλίωσης του ΡΤΕΝ στα εξωσώματα που προέρχονται από αυτά τα κύτταρα. Η φωσφορυλίωση του ΡΤΕΝ διατηρεί σε κλειστή κατάσταση προστατεύονται από την αποδόμηση? αργότερα ΡΤΕΝ θα είναι διαθέσιμη για να ενεργοποιηθεί στο κυτταρόπλασμα, δεσμεύοντας την κυτταρική μεμβράνη κατά την αποφωσφορυλίωση, και στη συνέχεια κινεί κύτταρο σηματοδότηση [30], [31]. Βρήκαμε ότι η ΡΤΕΝ ενσωματώθηκαν στην εξωσώματα φωσφορυλιώνεται (Σχήμα 1Β, μεσαίο πλαίσιο). Flotilin-1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για εξωσώματα [32]. Τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των γονικών κυττάρων DU145, DU145 με έλεγχο siRNA και τα κύτταρα DU145Kd (Σχήμα 1 C) δείχνουν ότι τα ΡΤΕΝ knockdown κυττάρων εμφάνισαν ένα σημαντικά υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού από τις άλλες δύο τύπους κυττάρων. Ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα (κανονικό, μη καρκινικά κύτταρα), όπως ανθρώπινα αορτικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HAOEC), ανθρώπινα κύτταρα αορτικού λείου μυός (HAOSMC), και Ανθρώπινου Προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (HPEC) εκφράζουν ΡΤΕΝ, αλλά βρήκαμε ότι ΡΤΕΝ δεν ενσωματώνεται στα εξωσώματα αυτών των κυττάρων (Σχήμα 1D). Αυτό μπορεί να σημαίνει ότι η ενσωμάτωση της PTEN στην εξωσωμάτων είναι ένα αποκλειστικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων, ωστόσο το εύρημα αυτό απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Σχήμα 1Ε είναι μια μικρογραφία ηλεκτρονικής σάρωσης που δείχνει την αποβολή εξωσωμάτων από τα καρκινικά κύτταρα.

Α. PC κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΡΤΕΝ ειδικά siRNA παρουσίασε σαφή knockdown έκφρασης ΡΤΕΝ, ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με αναντιστοιχία ελέγχου siRNA δεν έδειξε μείωση της έκφρασης ΡΤΕΝ. B. Εξωσώματα προέρχονται από DU145, DU145Kd και DU145 με siRNA ελέγχου δείχνουν το ίδιο πρότυπο έκφρασης ΡΤΕΝ όπως παρατηρείται με το κύτταρο από το οποίο προέρχονται. PTEN ενσωματωθεί σε εξωσώματα είναι φωσφορυλιωμένη? φωσφορυλίωσης ΡΤΕΝ προστατεύει από την αποικοδόμηση, και μπορεί να ενεργοποιηθεί από αποφωσφορυλίωση κατά τη μεταφορά σε άλλα κύτταρα. Εξωσώματα είναι θετικές για Flotilin-1. Γ διαφορές στον πολλαπλασιασμό των DU145, DU145 με έλεγχο siRNA και DU145Kd αξιολογήθηκαν, με σημαντικά υψηλότερο πολλαπλασιασμό εκτεθεί από DU145Kd. πρωτογενή κύτταρα Δ Ανθρώπου, HAEC, HASMC και HPEC, και εξωσώματα τους είχαν προφίλ για την έκφραση ΡΤΕΝ. Και οι τρεις κύτταρα έχουν ΡΤΕΝ έκφρασης, αλλά ΡΤΕΝ δεν εκφράζεται σε εξωσώματα τους. Η έκφραση για τις δύο κύτταρα και εξωσώματα τους ομαλοποιήθηκε με Flotilin-1. Ε Α σάρωσης ηλεκτρονικό μικροσκόπιο που δείχνει την αποβολή εξωσωμάτων από τα κύτταρα DU145.

Η

ενδοκυτταρικής μεταφοράς του PTEN από Εξωσώματα

Για να διερευνηθεί η μεσοκυττάρια ανταλλαγή PTEN, εξωσωμάτων που προέρχεται από την πατρίδα DU145 PC κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας την τυπική διαδικασία της φυγοκέντρησης. κύτταρα DU145Kd επωάστηκαν με το παρασκεύασμα εξωσωμάτων που προέρχεται από γονικά κύτταρα DU145. Η φαινομενική πρόσληψη microvesicular ΡΤΕΝ από κύτταρα DU145Kd παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία (αφαίρεση υποβάθρου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ως έλεγχος, και ο φθορισμός αφαιρέθηκε τόσο από μη επεξεργασμένο και επεξεργασμένα κύτταρα για να δείξει την απόκτηση του ΡΤΕΝ σε κύτταρα κατεργασμένα εξωσωμάτων) και ανοσοκηλίδωση (Σχήμα 2 Α και Β).

DU145Kd κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα DU145 για 24 ώρες. κύτταρα Α DU145Kd καλλιεργήθηκαν σε θαλάμους διαφάνεια και αντιμετωπίζονται με εξωσώματα DU145 προέλευσης. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), και ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα ΡΤΕΝ και Alexa fluor 488 δευτερογενή αντισώματα. Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (IF- ανοσοφθορισμού). κύτταρα DU145Kd απέκτησε PTEN (πράσινο) μετά από επώαση με Du145 που προέρχονται εξωσώματα. B. DU145Kd καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 100 mm και κατεργάζονται με τον ίδιο τρόπο όπως στο (Α) με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων DU145 προέλευσης. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, λύθηκαν με ρυθμιστικό λύσης RIPA και αναλύθηκαν για έκφραση ΡΤΕΝ χρησιμοποιώντας ανοσοκηλίδωση. κύτταρα DU145Kd απέκτησε έκφρασης ΡΤΕΝ. C. Τα εξωσώματα έχουν ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της μεταγραφής του ΡΤΕΝ. DU145Kd υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων προέρχονται από γονικά κύτταρα DU145. Ολικό RNA συλλέχθηκε από τα επεξεργασμένα κύτταρα, κύτταρα DU145, και DU145 με έλεγχο siRNA. RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικοί για ΡΤΕΝ. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός σταδίου κιτ RT-PCR. Τα προϊόντα διαχωρίστηκαν επί πηκτής αγαρόζης 1.1%. Δ Εξωσώματα PTEN μεταφορά U87 PTEN

– /- κύτταρα. κύτταρα U87 καλλιεργήθηκαν σε θαλάμους slide και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DU145 εξωσώματα προέλευσης. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντισώματα ΡΤΕΝ και Alexa fluor 488 δευτερογενή αντισώματα, και στη συνέχεια έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (IF-ανοσοφθορισμού). κύτταρα U87, τα οποία δεν εκφράζουν ΡΤΕΝ καθώς έχουν μεταλλάξεις στα δύο αλληλόμορφα ΡΤΕΝ, απέκτησε έκφραση ΡΤΕΝ (πράσινο).

Η

Για να διασφαλιστεί ότι η αύξηση του ΡΤΕΝ σε κύτταρα DU145Kd μετα-επώαση με DU145 προερχόμενο εξωσώματα δεν ήταν αποτέλεσμα τη διέγερση του ΡΤΕΝ μεταγραφή με εξωσώματα, εκτελέσαμε RT-PCR για ΡΤΕΝ σε κύτταρα DU145Kd σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων DU145 προέλευσης. Παρατηρήσαμε μια ανασταλτική δράση επί της μεταγραφής ΡΤΕΝ (Σχήμα 2C). Για να διασφαλιστεί περαιτέρω ότι ήμασταν παρατηρώντας την μεσοκυττάρια μεταφορά του ΡΤΕΝ πρωτεΐνης, σε αντίθεση με την διέγερση της μεταγραφής, χρησιμοποιήσαμε την U87 γραμμή γλοιοβλαστώματος κύτταρο, μια μηδενική γονότυπο, το οποίο περιέχει μια μετάλλαξη στο δύο αλληλόμορφα ΡΤΕΝ [33]. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με εξωσώματα προέρχονται από κύτταρα DU145, κύτταρα U87 θετικοί για ΡΤΕΝ (Σχήμα 2D). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι η αποκτηθείσα PTEN στην DU145Kd και U87 σχετίζεται μόνο με τη μεσοκυττάρια μεταφορά PTEN πρωτεΐνης μέσω της ανταλλαγής εξωσωμάτων. Επιπλέον, αντιμετωπίζεται με τον προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή PC-3, η οποία είναι ΡΤΕΝ null, με εξωσώματα που προέρχεται από κύτταρα DU145, δείχνοντας την απόκτηση του ΡΤΕΝ (Σχήμα S1). Προσδιορίσαμε έκφραση ΡΤΕΝ σε εξωσώματα από διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου δηλαδή καρκινώματος πνεύμονα (Α549), ο καρκίνος του μαστού (MDA-MB-231), ορθοκολικό καρκίνωμα (HCT116) και αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (BxPC-3) (Σχήμα S2, Α), προς δείχνουν ότι η ΡΤΕΝ αποβάλλεται μέσω εξωσώματα από άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων. Επίσης αντιμετωπίζονται PC-3 κυττάρων με εξωσώματα προέρχονται από κύτταρα καρκινώματος HCT116 ορθοκολικού, και διαπίστωσε ότι η PC-3 κύτταρα που αποκτήθηκαν έκφραση ΡΤΕΝ (Σχήμα S2, Β).

εξωσώματα Μεταφορά Active ΡΤΕΝ μεταξύ Cancer Cells

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η ΡΤΕΝ μεταφέρεται μέσω εξωσώματα είναι ενεργή, εμείς κατεργασμένα κύτταρα DU145Kd με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα DU145. Τα επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση για ΡΤΕΝ. Τα ανοσοϊζήματα αξιολογήθηκαν για δραστικότητα ΡΤΕΝ χρησιμοποιώντας δοκιμασία λιπιδίων φωσφατάση. κύτταρα DU145Kd παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε δραστικότητα φωσφατάσης κατά την κατεργασία με εξωσώματα που προέρχονται από κύτταρα DU145 (Σχήμα 3Α).

A. κύτταρα DU145Kd υποβλήθηκαν σε αγωγή με εξωσώματα που προέρχεται από κύτταρα DU145. ΡΤΕΝ ανοσοκαταβυθίστηκε με ΡΤΕΝ αντισώματα και δραστικότητα ΡΤΕΝ φωσφατάσης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τα υδατοδιαλυτά DiC8PtdIns υπόστρωμα (3, 4, 5) Ρ3 (Echelon). Τα απελευθερωμένα ελεύθερα φωσφορικά μετρήθηκαν με BIOMOL πράσινο αντιδραστήριο και κανονικοποιημένες έναντι της αντίδρασης που περιέχει μόνο υπόστρωμα ΡΙΡ3. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών πειραμάτων ± SEM, και είναι σημαντικές σε Ρ & lt? 0,01. Β ΡΤΕΝ-θετικά εξωσώματα (από DU145) προκάλεσε μείωση στην φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε κύτταρα δέκτη (DU145Kd)? φωσφορυλίωση ΑΚΤ μειώθηκε σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με DU145 κυττάρων με έλεγχο siRNA, και τα γονικά κύτταρα ομόλογό DU145 (δύο τελευταίες λωρίδες προς τα δεξιά, αντίστοιχα). κύτταρα C. DU145Kd απλώθηκαν σε πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας των 100 mm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων DU145 προέλευσης. Τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με ρ27 και την κυκλίνη D1 αντισώματα. ΡΤΕΝ προκάλεσε την έκφραση των ρ27 και μείωσε την έκφραση της κυκλίνης D1 (C). Τα δύο γεγονότα οδήγησαν στα κύτταρα εισέρχονται σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Η έκφραση ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη.

Η

Για να διερευνηθεί αν το μεταβιβαζόμενο PTEN είναι αρμόδια να αλλάξει κυτταρική σηματοδότηση στα κύτταρα του δέκτη, τα κύτταρα DU145Kd υποβλήθηκαν σε θεραπεία με εξωσώματα που προέρχεται από τα κύτταρα DU145 για 24 ώρες. Η κατάσταση φωσφορυλίωσης κινάσης φωσφατιδυλινοσιτόλης 3′-κινάση /σερίνης-θρεονίνης (ΑΚΤ), το κύριο υπόστρωμα για ΡΤΕΝ, αξιολογήθηκε. Σε κύτταρα DU145Kd, βρήκαμε μια μείωση στην φωσφορυλίωση της ΑΚΤ που έφθασε σε επίπεδα συγκρίσιμα με τα γονικά κύτταρα DU145 (PTEN θετικά) και τα κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχήμα 3Β).

Για να προσδιορίσετε αν το μεταβιβαζόμενο PTEN επηρεάζει κατάντη κύτταρο μονοπατιών σηματοδότησης που συνδέονται με την ΑΚΤ, αξιολογήσαμε κινάσης (CDK) αναστολέα ρ27 (KIP1) έκφραση εξαρτώμενη από κυκλίνη. ρ27 ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κυτταρική κινητικότητα, και την απόπτωση. Μια μείωση στην έκφραση ρ27 παρατηρείται στα πιο θανατηφόρα επιθηλιακούς καρκίνους και σχετίζεται με κακή έκβαση των ασθενών [34]. ρΑΚΤ ρυθμίζει αρνητικά ρ27 για την υποστήριξη αντιαποπτωτικών δραστηριότητα στην πρόοδο του καρκίνου. Βρήκαμε ότι η έκφραση ρ27 είναι αυξημένη σε κύτταρα DU145Kd όταν θεραπεύτηκαν με εξωσώματα DU145 προερχόμενο (Σχήμα 3C). Έχει αναφερθεί ότι η σύλληψη του κυτταρικού κύκλου G1 συντονίζεται από δραστηριότητα ΡΤΕΝ λιπιδίων φωσφατάσης μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση ρ27 και δραστηριότητας ΡΤΕΝ πρωτεΐνης φωσφατάσης μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1 [35]. Διαπιστώσαμε ότι η κυκλίνη D1 είναι μειωτικά στα κύτταρα DU145Kd αντιμετωπίζονται με Du145 εξωσώματα, όπως αναμενόταν (Σχήμα 3C).

PTEN μεταφέρονται μέσω Εξωσώματα Επηρεάζει Βιολογικές Λειτουργίες των Acceptor κύτταρα

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η βιοχημική οι αλλαγές που παρατηρούνται στο Σχήμα 3 σχετίζεται με την τροποποίηση της βιολογικής λειτουργίας, εκτιμήσαμε την επίδραση της ΡΤΕΝ-θετικών εξωσώματα (που προέρχεται από τα κύτταρα DU145) επί του πολλαπλασιασμού των τριών κυτταρικών γραμμών που στερούνται έκφρασης ΡΤΕΝ. DU145Kd, PC-3, και U87 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων DU145, και τα ποσοστά πολλαπλασιασμού ανεστάλησαν σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4 Α, Β και C). Τα εξωσώματα λείπει ΡΤΕΝ έκφρασης, που προέρχεται από DU145Kd, έδειξε μικρή επίδραση επί των ρυθμών πολλαπλασιασμού.

τρεις κυτταρικές γραμμές που στερούνται ΡΤΕΝ έκφρασης, DU14Kd, PC-3, και U87 (Α, Β και C, αντίστοιχα), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωσωμάτων DU145. Μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας. Σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, τα ποσοστά πολλαπλασιασμού ανεστάλησαν σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων DU145Kd φτάσει σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με κύτταρα DU145, δείχνοντας ότι εξωσώματα αντισταθμίζεται πλήρως για την απώλεια του ΡΤΕΝ (Α). Τα εξωσώματα προέρχονται από DU145Kd, οι οποίες στερούνται ΡΤΕΝ, δεν έδειξε καμία επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και των τριών κυτταρικών γραμμών. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος τριών πειραμάτων ± SEM. Οι διαφορές από τον έλεγχο (0 εξωσώματα) είναι σημαντικές * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01, και # οι διαφορές δεν είναι σημαντικές

Η

Ενσωμάτωση της PTEN σε Εξωσώματα ρυθμίζεται από ογκογονίδια

Για να ερευνηθεί ο μηχανισμός ενσωματώσεως του ΡΤΕΝ σε exosomal φορτίου, εξετάσαμε το ρόλο του ογκογόνου υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σε αυτή τη διαδικασία. Χρησιμοποιήσαμε την κινεζική κυτταρική σειρά Hamster Ovary (CHO), τα οποία αυθόρμητα αθανατοποιημένη [36] και δεν έχουν καμία έκφραση EGFR. CHO κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα για να εκφράσουν EGFR είχαν παρόμοια επίπεδα ΡΤΕΝ εκφράζονται σε εξωσώματα ως γονικά κύτταρα CHO (Σχήμα 5Α). Κατά την διέγερση των κυττάρων ΟΗΟ-EGFR με διαφορετικές συγκεντρώσεις EGF (5, 10 και 20 ng /mL), υπήρξε μια αύξηση στην ποσότητα του ΡΤΕΝ σε εξωσώματα, εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 5Β). Επιπλέον, ελέγξαμε την επίδραση της αναστολής EGFR σε κύτταρα DU145 επί ενσωμάτωση ΡΤΕΝ στα εξωσώματα. Εμείς κατεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα EGFR CI-1033 (5, 10 μΜ). Η αναστολή του EGFR μείωσε την ενσωμάτωση της ΡΤΕΝ σε εξωσώματα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 5C).

A. Παρουσιάζοντας EGFR σε κύτταρα CHO δεν έδειξε καμία επίδραση επί της έκφρασης του ΡΤΕΝ σε κύτταρα και εξωσώματα. B. Η διέγερση των ΟΗΟ-EGFR κύτταρα με τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του EGF (5, 10 και 20 ng /mL) οδήγησε σε αύξηση ενσωμάτωση ΡΤΕΝ σε εξωσώματα. κύτταρα C. DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο συγκεντρώσεις (5 μΜ, 10 μΜ) του CI-1033, ένα μη αναστρέψιμο αναστολέα του EGFR. ενσωμάτωση ΡΤΕΝ σε εξωσώματα αναστάλθηκε σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο? Flotilin-1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για τη συγκέντρωση εξωσωμάτων.

Η

PTEN Κατάσταση στον υπολογιστή ασθενείς μπορεί να αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας αίματος Εξωσώματα

Για να μελετήσει το ρόλο εξωσωμάτων στην αξιολόγηση της PTEN κατάσταση σε ασθενείς με PC, συλλέξαμε το αίμα από 30 ασθενείς PC πριν από την προστατεκτομή, και 8 φυσιολογικά άτομα ταιριάζουν με την ηλικία των ασθενών (50-65 ετών). Οι υγιείς εθελοντές δεν είχαν ιστορικό καρκίνου ή τεκμηριωθεί προηγουμένως PSA αυξημένα στον ορό. Το αίμα κλασματώθηκε, και το πλάσμα χρησιμοποιήθηκε ως πηγή για εξωσώματα. ΡΤΕΝ-εξωσώματα ανοσοκατακρημνίσθηκαν χρησιμοποιώντας ΡΤΕΝ αντισώματα και Sepharose πρωτεΐνης-G. Η ενσωμάτωση του ΡΤΕΝ σε εξωσωμάτων από το αίμα των ασθενών PC »προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωση, και τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν μεταξύ των ασθενών. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε έκφραση ΡΤΕΝ σε εξωσώματα από όλους τους ασθενείς PC, και καμία έκφραση ΡΤΕΝ στα εξωσώματα από το αίμα των φυσιολογικών ατόμων (Σχήμα 6 Α, Β)? ανάλυση t-test έδειξαν τα αποτελέσματα ήταν πολύ σημαντικές Ρ & lt? 0.001. Επιπλέον, θα μπορούσαμε να εκτιμηθεί η συγκέντρωση του PTEN έχει εξωσωμάτων ασθενείς PC »με ανοσοκηλίδωση με πρότυπες συγκεντρώσεις του ανασυνδυασμένου ΡΤΕΝ, και η συγκέντρωση του ΡΤΕΝ προσδιορίστηκε ως (ng του ΡΤΕΝ /mg πρωτεΐνης εξωσωμάτων) (Σχήμα 6C).

Α. Τα εξωσώματα συλλέχθηκαν από το πλάσμα του 30 προ-προστατεκτομή ασθενείς PC και 8 φυσιολογικά άτομα. Εξωσώματα υποβλήθηκαν σε τυπική ανάλυση ανοσοαποτύπωση για το καθεστώς της PTEN. Η εικόνα δείχνει την ικανότητα εξωσωμάτων να αξιολογήσει την κατάσταση της PTEN. Όπως φαίνεται στο σχήμα, τα υγιή άτομα δεν είχαν ΡΤΕΝ έκφρασης σε εξωσώματα πλάσμα τους. B. οπτικές πυκνότητες για τις ζώνες ΡΤΕΝ (Α) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Ποσότητα-1 λογισμικό. Exosomal-ΡΤΕΝ έκφραση σε ασθενείς PC και φυσιολογικών ατόμων υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος ± SEM, και οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων ήταν πολύ σημαντική (Ρ & lt? 0.001). συγκέντρωση C. ΡΤΕΝ στα εξωσώματα από το αίμα του ασθενούς PC εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση πρότυπες συγκεντρώσεις του ανασυνδυασμένου ΡΤΕΝ μαζί με τα δείγματα ασθενών. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος της έκφρασης ΡΤΕΝ ± SEM και είναι στατιστικά σημαντικές P & lt?. 0.01

Η

Αίμα exosomal-PTEN παρέχει ένα απλό εργαλείο για την αξιολόγηση PTEN Κατάσταση

όγκων PC είναι ετερογενείς σε ΡΤΕΝ έκφρασης όπως φαίνεται στο (Σχήμα 7 Α, Β, C). κατάσταση ΡΤΕΝ στους όγκους των τεσσάρων ασθενών PC προσδιορίσθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Η εικόνα δείχνει τη δυσκολία σχηματισμού συμπέρασμα σχετικά με την έκφραση ΡΤΕΝ χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική. ΡΤΕΝ έκφραση στα εξωσώματα αίμα των ίδιους ασθενείς εκτιμάται στο σχήμα 7D, επιδεικνύοντας έναν απλό και άμεσο τρόπο για την αξιολόγηση συγκέντρωση ΡΤΕΝ σε ασθενείς PC. Το Σχήμα 7Ε είναι ένα μικρογράφημα σάρωσης ηλεκτρονίου που δείχνει την ομοιογενή πληθυσμό εξωσωμάτων αίμα.

Αυτό το σχήμα παρέχει μια μελέτη σύγκρισης της αξιολόγησης ΡΤΕΝ χρησιμοποιώντας ΡΤΕΝ exosomal, και οι όγκοι του ασθενούς Ανοσοϊστοχημεία του PC. Ανοσοϊστοχημεία των ιστών όγκου από τέσσερις ασθενείς PC καταδεικνύει την ετερογένεια της έκφρασης ΡΤΕΝ σε όγκους του προστάτη. Α Εοσίνης & amp? χρώση με αιματοξυλίνη. B. Χρώση με δευτερογενή αντισώματα. C. Χρώση με ΡΤΕΝ ειδικά αντισώματα, τα βέλη υποδεικνύουν ΡΤΕΝ θετικά κύτταρα. D. Αξιολόγηση της έκφρασης ΡΤΕΝ χρησιμοποιώντας εξωσώματα πλάσματος από τους ίδιους ασθενείς. Ε) Ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης μικρογράφημα που δείχνει την ομοιογενή πληθυσμό εξωσωμάτων συλλέγονται από το αίμα του ασθενούς. Εξωσώματα συνδέθηκαν με μια καλυπτρίδα χρησιμοποιώντας πολυλυσίνη, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης.

Η

Η έκφραση του PSA στο εξωσωμάτων Προετοιμασίες από το PC ασθενείς και στα φυσιολογικά άτομα

Χρησιμοποιώντας 30 ασθενείς PC και 8 φυσιολογικά άτομα, ανιχνεύσαμε PSA σε εξωσώματα τόσο από τους ασθενείς PC και φυσιολογικά άτομα (Σχήμα 8Α): οπτικές πυκνότητες των ζωνών PSA (από το Σχήμα 8Α) χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση. Οι διαφορές στις exosomal PSA μεταξύ των ασθενών PC και φυσιολογικά άτομα δεν ήταν σημαντικές (Σχήμα 8Β).