Αφηρημένο

β, β-Dimethylacrylshikonin, ένα από τα ενεργά συστατικά στα εκχυλίσματα ρίζας του Lithospermum erythrorhizon, κατέχουν αντικαρκινική δράση. Σε αυτή τη μελέτη, συζητήσαμε των μοριακών μηχανισμών της β, β-dimethylacrylshikonin στην απόπτωση των SGC-7901 κύτταρα. β, β-Dimethylacrylshikonin μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα των SGC-7901 κύτταρα σε ένα δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο και την επαγωγή απόπτωσης. β, θεραπεία β-Dimethylacrylshikonin σε SGC-7901 κύτταρα ρυθμισμένα προς τα κάτω την έκφραση του ΧΙΑΡ, CIAP-2, και Bcl-2 και τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση του Bak και Βαχ και προκάλεσε την απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c . Επιπλέον, β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία οδήγησε σε ενεργοποίηση κασπασών-9, 8 και 3, και διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), η οποία καταργήθηκε με προ-επεξεργασία με τον αναστολέα παν-κασπάσης Ζ-VAD-FMK . β, β-Dimethylacrylshikonin επαγόμενη φωσφορυλίωση της εξωκυτταρικής κινάσης σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ) σε SGC-7901 κύτταρα. U0126, ένας ειδικός αναστολέας ΜΕΚ, μπλοκάρει την ενεργοποίηση ERK με β, β-dimethylacrylshikonin και κατήργησε β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin ανέστειλε την ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων SGC-7901 με διέγερση οδό σηματοδότησης ERK, και παρέχεται μια ένδειξη για προκλινικές και κλινική αξιολόγηση του β, β-dimethylacrylshikonin για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου.

Παράθεση: Shen XJ, Wang ΗΒ, Ma XQ, Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin Προκαλεί μιτοχόνδρια εξαρτημένων απόπτωση μέσω της ERK Διαδρομή στον Καρκίνο ανθρώπινο γαστρικό SGC-7901 κύτταρα. PLoS ONE 7 (7): e41773. doi: 10.1371 /journal.pone.0041773

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Μάρτη του 2012? Αποδεκτές: 25 του Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιουλίου 2012

Copyright: © Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Zhejiang Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας στο X-QM (LY12H28005), και την επιστήμη θεμέλιο της Zhejiang κινεζική Ιατρικό Πανεπιστήμιο στο H-BW (2011ZY05). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο είναι μία από τις επιθετικές κακοήθεις όγκους, αν και με την ανάπτυξη της ακτινοθεραπείας, της χημειοθεραπείας και βιοθεραπεία, οι σοβαρές παρενέργειες είναι αναπόφευκτες [1], ως εκ τούτου, πιο αποτελεσματική κατά του όγκου φάρμακα με λιγότερες παρενέργειες για την θεραπεία του καρκίνου του στομάχου είναι απαραίτητα.

Lithospermum erythrorhizon είναι ένα σημαντικό κινεζικό χορτάρι. Έχει κάποια δραστικά συστατικά: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (Εικ. 1Α) και shikonin [2]. Στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική, εμφανίζει πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων αντι-μικροβιακών, αντι-φλεγμονώδη, κατά του όγκου, το ανοσοποιητικό ρύθμιση και ιδιότητες κατά του HIV [3] – [6]. Η επίδραση κατά των όγκων των shikonin και των παραγώγων της για πρώτη φορά αποδεικνύεται με τις δραστηριότητές τους κατά την ανάπτυξη του όγκου σε σαρκώματος ποντικού-180 [7]. Shikonin εκθέματα αποτέλεσμα όχι μόνο από τη θανάτωσή τους άμεσα τα καρκινικά κύτταρα, αλλά επίσης και με την αναστολή της αγγειογένεσης όγκου [8]. Μελέτες αποκάλυψαν ότι επάγεται shikonin απόπτωση σε ανθρώπινα κακόηθες μελάνωμα, καρκίνο της ουροδόχου κύστης, τον καρκίνο του τραχήλου, τον καρκίνο του πνεύμονα και καρκίνο του ήπατος, και ούτω καθεξής [9] – [13]. Ωστόσο, έχει λιγότερες παρενέργειες και περισσότερο προστατευτικές επιδράσεις στην ανθρώπινη κανονικά κύτταρα [14], [15]. Hsu PC κ.ά. έδειξαν ότι shikonin οδήγησε κυτταρικής απόπτωσης μέσω πάνω ρύθμιση του ρ27, ρ53, Βαχ και ρύθμιση προς τα κάτω της Bcl-2 και Bcl-xL σε ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος COLO 205 κύτταρα [16]. Η εισβολή του όγκου αναστέλλεται από shikonin σε μερικά καρκινικά κύτταρα μπορεί, μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση του NF-κΒ-διαμεσολαβούμενη έκφραση ΜΜΡ-9 [17]. Shikonin επάγει επίσης την απόπτωση μέσω παραγωγή ROS σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [12]. Singh F et al διαπίστωσε επίσης ότι shikonin μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένου EGFR, ERK και κινάσες τυροσίνης πρωτεΐνης και αύξησε τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση, η οποία προκάλεσε τα κύτταρα επιδερμοειδούς καρκινώματος να υποστούν απόπτωση [18].

(Α) Η χημική δομή του β, β-dimethylacrylshikonin (MW. 370.4). (Β) Επίδραση του β, β-dimethylacrylshikonin στην αναστολή κυτταρικής βιωσιμότητας του SGC-7901 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις β, β-dimethylacrylshikonin για 24 ώρες και 48 ώρες. Η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα της ομάδας ελέγχου (0,1% DMSO) ρυθμίστηκε στο 100%. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD που λαμβάνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Υποδεικνύεται ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντίστοιχα

Η

Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin είχαν σημαντική επίδραση κατά του όγκου επί ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 [19].. Ωστόσο, τέτοια επίδραση του β, β-dimethylacrylshikonin σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα δεν έχει αναφερθεί και οι μοριακοί μηχανισμοί δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Έτσι, στην παρούσα μελέτη, θα συζητήσουμε επίδραση των β, β-dimethylacrylshikonin στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική SGC-7901 και των σχετικών σημάτων της για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού β, β-dimethylacrylshikonin για καρκίνο του στομάχου.

υλικά και Μέθοδοι

υλικά και αντιδραστήρια

SGC-7901 κύτταρα αγοράστηκαν από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών κυττάρων Τράπεζας Type Culture Collection (Σαγκάη, Κίνα). β, β-Dimethylacrylshikonin αγοράστηκε από την Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan). ΜΤΤ και DAPI αγοράστηκαν από την Calbiochem (San Diego, CA, USA). U0126 αγοράστηκε από την Cell Signaling (Boston, MA, USA). αναστολέα της Pan-κασπάσης (Ζ-VAD-FMK) αγοράστηκε από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Σαγκάη, Κίνα). Αντίσωμα για κυτόχρωμα c αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα έναντι ΕΚΚ, φωσφο-ΕΚΚ, Bcl-2, Bcl-XL, ΧΙΑΡ, CIAP-2, survivn, Βαχ, Bak, διασπασμένη κασπάση 9, διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη PARP και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Cell Signaling ( Boston, MA, USA). Κιτ FITC-αννεξίνης V ανίχνευσης απόπτωσης αγοράστηκε από την Becton Dickinson (San Diego, CA, USA).

Κυτταρική καλλιέργεια και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δοκιμασία

SGC-7901 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, UT), και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα δίσκο των 96 φρεατίων σε μια τελική συγκέντρωση 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FCS για 24 ώρες, μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του β, β-dimethylacrylshikonin για 24 ώρες και 48 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο μαζί με 20 μΐ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml). Μετά από 4 ώρες επώασης, 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες διαβάστηκαν σε μήκος κύματος 570 nm χρησιμοποιώντας Varioskan Flash Πολύτροπες Reader (Thermo Scientific, USA). Τέσσερις αναδιπλασιάζω φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε θεραπεία, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

μορφολογικές αλλαγές

SGC-7901 κύτταρα

τοποθετήθηκαν στο φρεάτιο μιας έξι φρεατίων. Μετά από καλλιέργεια κυττάρων 24 ώρες, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με β, β-dimethylacrylshikonin για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Η κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. (Μοντέλο IX70? Ολύμπου, Τόκιο, Ιαπωνία)

DAPI (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) χρώση

SGC-7901 κύτταρα τοποθετήθηκαν στο φρεάτιο μιας πλάκας έξι φρεατίων. Μετά από καλλιέργεια κυττάρων 24 ώρες, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με β, β-dimethylacrylshikonin για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, τότε τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε κρύα ακετόνη για 30 λεπτά, και επωάστηκαν με DAPI (1 mg /ml) για 30 λεπτά. Οι αποπτωτικών πυρήνων που χαρακτηρίζεται ως έντονα χρωματισμένο ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. (Μοντέλο IX71? Ολύμπου, Τόκιο, Ιαπωνία)

αννεξίνη V /PI δοκιμασίες για την απόπτωση

Για προσδιορισμούς PI, κύτταρα /Αννεξίνη V βάφτηκαν με AnnexinV-FITC και ΡΙ, και αξιολογήθηκαν για την απόπτωση με κυτταρομετρία ροής, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του mannufacturer του (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Εν συντομία, 1 × 10

5 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και χρωματίστηκαν με 5 μΙ Αηηβχίην-FITC και 5 μΙ PI σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας BD FACS Diva software (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). χρώση Αηηβχίη V χρησιμεύει ως ένα μέτρο της φωσφατιδυλοσερίνης εξωτερίκευσης και τα κύτταρα που είναι αννεξίνης V

+ /ΡΙ

-. αντιπροσωπεύουν πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα

Μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό

Cells ( 5 × 10

5 κύτταρα /ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με JC-1 (BD MitoScreen JC-1 Kit, Becton Dickinson, USA) για 15 λεπτά στους 37 ° C. δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACSCanto II, Becton Dickinson, USA).

Western Bloting ανάλυση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του β, β-dimethylacrylshikonin για τον υποδεικνυόμενο χρόνο σε RPMI 1640 με 10% FCS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε παγωμένο PBS, και τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με αναστολέα πρωτεϊνάσης κοκτέιλ από την Calbiochem (San Diego, CA). Οι συγκεντρώσεις πρωτείνης των κυτταρικών λυμάτων προσδιορίστηκε και βράζεται με ρυθμιστικό φόρτωσης πηκτής για 10 λεπτά στους 100 ° C. Δείγματα που περιέχουν 30 μg ολικής πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore, Temecula, CA). Μετά τη μεταφορά, η μεμβράνη μπλοκαρίστηκαν σε TBST (TBS που περιέχει 0.1% Tween 20) που περιέχει 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με κατάλληλη πρωτοταγή αντισώματα. Μετά από πλύση τρεις φορές σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου 1:5000. Τέλος, οι μεμβράνες οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Immun-Star WesternC Kit, Bio-Rad, USA).

ανοσοφθορισμού χρώση

χρώση Immunofluorescene χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η υποκυτταρική κατανομή της κυτόχρωμα c σε SGC-7901 κυττάρων που επάγεται από β, β-dimethylacrylshikonin. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί αποστειρωμένα γυάλινα coverlips σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη για 10 λεπτά. Μετά από διαπερατά με 0,3% Triton Χ-100 για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα κύτταρα είχαν μπλοκαριστεί σε 3% αλβουμίνη βόειου ορού για 30 λεπτά και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντίσωμα αντι-κυτοχρώματος ο (1:30). Μετά από πλύση τρεις φορές σε PBS, SGC-7901 κύτταρα σημάνθηκαν με Alexa Fluor 488 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο. DAPI προστέθηκε στην συνέχεια για την πυρηνική χρώση. Μικροσκοπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (μοντέλο IX71? Ολύμπου, Tokyo, Japan).

Η στατιστική ανάλυση

Τα στοιχεία που καταγράφονται είναι η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Αυτά αξιολογήθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Σημαντικές διαφορές ιδρύθηκαν σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

β, β-Dimethylacrylshikonin αναστέλλει τη βιωσιμότητα της ΓΓΕ-7901 κύτταρα

Για να προσδιοριστεί η κυτταροτοξική δράση της β, β-dimethylacrylshikonin στην γαστρική καρκινικά κύτταρα. SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,5, 5, 7,5, 10 mmol /L του β, β-dimethylacrylshikonin για 24 ώρες και 48 ώρες, το μειωμένο βιωσιμότητα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με β, β-dimethylacrylshikonin ήταν 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82%, και 61,76 ± 0,18% αντίστοιχα στις 24 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (Εικ. 1Β). Για τη θεραπεία από 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν 52.03 ± 9.45%, 38,99 ± 1,43%, 30,70 ± 1,58%, και 27,4 ± 0,31% (Σχ. 1Β). Η μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) της β, β-dimethylacrylshikonin για SGC-7901 κύτταρα ήταν 11,04 μΜ και 2,89 μΜ σε 24 ώρες και 48 ώρες αντίστοιχα.

β, β-Dimethylacrylshikonin προκαλεί SGC -7901 κύτταρα απόπτωσης

SGC-7901 κύτταρα πρώτα σε επεξεργασία με β, β-dimethylacrylshikonin, τα αποτελέσματα έδειξαν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε σημειώνονται μορφολογικές αλλαγές μετά από επεξεργασία με 10 mmol /L β, β-dimethylacrylshikonin σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα για 24 h. Με την παρουσία του β, β-dimethylacrylshikonin, SGC-7901 του αριθμού των κυττάρων μειώνεται και τα κύτταρα έγιναν στρογγυλά και μικρά σε σχήμα, και αποσπώντας από την πλάκα σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου (Εικ. 2Α). β, β-dimethylacrylshikonin επάγεται επίσης πυρηνική συμπύκνωση με εντατική χρώση ϋΑΡΙ σε σύγκριση με το πυρηνικό του ελέγχου SGC-7901 κύτταρα για 24 ώρες (Εικ. 2Β).

(Α) Cell μορφολογία ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός ανάστροφου μικροσκοπίου με 200 × μεγέθυνση. (Β) συμπύκνωση DNA (λευκό βέλος) μετρήθηκε με DAPI χρώση και αναλύθηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού με 200 × μεγέθυνση. (Γ) Η αποπτωτική κατάσταση αξιολογήθηκε με δοκιμασία σύνδεσης Annexin V-FITC. Το κάτω δεξί μέρος (Αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

-) θεωρήθηκε ως πρώιμο στάδιο αποπτωτικών κυττάρων και πάνω δεξιά μέρος (Αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

+) θεωρήθηκε ως όψιμο στάδιο αποπτωτικών κυττάρων. Το κάτω αριστερό μέρος (Αννεξίνη V-FITC

– /PI

-) θεωρήθηκε ως βιώσιμα κύτταρα και το άνω αριστερό τμήμα (Αννεξίνη V-FITC

– /PI

+) θεωρήθηκε ως νεκρωτικές κύτταρα.

η

για να προσδιορίσετε αν κυτταροτοξικότητα της β, β-dimethylacrylshikonin εμπλέκεται απόπτωση, αξιολογήσαμε την αποπτωτική δράση του β, β-dimethylacrylshikonin στη ΓΓΕ-7901 κυττάρων με κυτταρομετρία ροής για αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο ( PI) χρώση. Το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+ /ΡΙ

-) ήταν 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3%, και 24,4% σε απόκριση προς το όχημα, 2,5, 5, 7,5, και 10 μmol /L β, β-dimethylacrylshikonin αντίστοιχα για 24 ώρες (Σχ. 2C). Είναι ενδιαφέρον ότι η καθυστερημένη αποπτωτικά κύτταρα (αννεξίνης V

+ /ΡΙ

+) ήταν σημαντικά αυξημένα σε SGC-7901 κύτταρα (29,7% με 7,5 μmol /L και 33,6% με 10 μmol /L β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία ) (Σχ. 2C).

β, β-dimethylacrylshikonin επάγει μιτοχονδριακή συμβάντα που σχετίζονται με την απόπτωση σε SGC-7901 κύτταρα

οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών περιλαμβάνουν προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Βαχ, Bak και Bid) και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2, Bcl-xL, CIAP-2, ΧΙΑΡ και survivin). Μπορούν να ενεργοποιούν ή αναστέλλουν την απελευθέρωση των κατάντη παράγοντες που οδηγούν στην ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και PARP στην εκτέλεση της απόπτωσης [20]. Προκειμένου να ανιχνευθούν οι απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες, προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Βαχ, Bak) και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (ΧΙΑΡ, CIAP-2, Bcl-2, Bcl-xL, survivin) ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western μετά SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του β, β-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5, και 10 mmol /L) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin μειώσουν την έκφραση των ΧΙΑΡ, CIAP-2, Bcl-2 (Σχ. 3Α). Ωστόσο, η ρύθμιση προς τα κάτω των ΧΙΑΡ και Bcl-2 ήταν λιγότερο έντονη, ενώ η ρύθμιση προς τα κάτω του CIAP-2 ήταν αρκετά δραματική και δοσοεξαρτώμενη. Δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή των Bcl-xL και survivn στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα. Είτε β, β-dimethylacrylshikonin μπορούν να διαμορφώσουν την έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Βαχ, Bak) εξετάσθηκε επίσης. Βρήκαμε ότι β, β-dimethylacrylshikonin αύξησε την έκφραση του Bak με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά είχε μικρή επίδραση στην Βαχ (Εικόνα 3Β).

κηλίδωση Western ανάλυση για αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών:. Bcl-2, Bcl-xL, CIAP-2, ΧΙΑΡ και survivin (Α), και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών: Βαχ, Bak (Β), και διασπασμένη PARP, διασπασμένη κασπάση 9, διασπασμένη κασπάση-8, διασπασμένη κασπάση 3 (C) σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων μετά από τις SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με β, β-dimethylacrylshikonin για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. (Δ) Ανίχνευση δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης με κυτταρομετρία ροής. SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με JC-1 για 15 λεπτά στους 37 ° C και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής. (Ε) SGC-7901 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και επισημανθεί προς κυτοχρώματος c (πράσινο) και DNA (μπλε). (F) SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με β, β-dimethylacrylshikonin παρουσία ή απουσία του Ζ-VAD-FMK (10 μmol /L) για 24 ώρες. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι διασπασμένης κασπάσης-3, διασπασμένη PARP. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. (G) SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με β, β-dimethylacrylshikonin παρουσία ή απουσία του Ζ-VAD-FMK (10 μmol /L) για 24 ώρες. Η αποπτωτική κατάσταση προσδιορίσθηκε με Annexin V-FITC δοκιμασία δέσμευσης. Το κάτω δεξί μέρος (Αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

-) θεωρήθηκε ως πρώιμο στάδιο αποπτωτικών κυττάρων και πάνω δεξιά μέρος (Αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

+) θεωρήθηκε ως όψιμο στάδιο αποπτωτικών κυττάρων. Το κάτω αριστερό μέρος (Αννεξίνη V-FITC

– /PI

-) θεωρήθηκε ως βιώσιμα κύτταρα και το άνω αριστερό τμήμα (Αννεξίνη V-FITC

– /PI

+) θεωρήθηκε ως νεκρωτικές κύτταρα.

Η

Η οικογένεια πρωτεϊνών κασπάσης είναι κρίσιμα ένζυμα για να εκτελέσει απόπτωση. Μεταξύ κασπάση μέλη της οικογένειας, κασπάσης-3 είναι ένα βασικό εκτελεστή για απόπτωση σε κύτταρα θηλαστικών [21]. Μπορεί να ενεργοποιηθεί μέσω του θανάτου τη μεσολάβηση υποδοχέα εξωγενή κασπάσης-8 μονοπάτι και τα μιτοχόνδρια εξαρτώμενη-κασπάση-9 ενδογενούς οδού [22], [23]. Για την περαιτέρω κατανόηση του μοριακού μηχανισμού της απόπτωσης, SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με β, β-dimethylacrylshikonin και ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση για την αλλαγή έκφραση της κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9, τα αποτελέσματα έδειξαν μια εξαρτώμενη από τη δόση ανύψωση της διασπασμένης κασπάσης-3, διασπασμένη κασπάση-8 και διασπασμένη κασπάση-9 σε β, κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία β-dimethylacrylshikonin. διάσπαση PARP, ένα άλλο πολύ γνωστό χαρακτηριστικό της απόπτωσης, βρέθηκε επίσης σε β, β-dimethylacrylshikonin κατεργασμένων κυττάρων (Σχ. 3C). Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία προκαλούμενη απόπτωση η οποία είναι συχνά η συνέπεια της μείωσης του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Έχει αποδειχθεί να είναι κεντρικής σημασίας για την αποπτωτική παθολογική οδό. Οι SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) για 24 ώρες, τα αποτελέσματα έδειξαν μιτοχόνδρια δυναμικού μεμβράνης μειώθηκε από 98,6% σε 56,9% μετά από β, β-dimethylacrylshikonin υπέστη κατεργασία με την ΓΓΕ- 7901 κύτταρα (Σχ. 3D). Στη συνέχεια εξετάσαμε την κατανομή και την υποκυτταρική εντόπιση του κυτοχρώματος c για να βρείτε αν η οδός μιτοχόνδρια εμπλέκεται σε β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση. Μετά SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) για 24 ώρες, η κατανομή του κυτοχρώματος c οπτικοποιήθηκε με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ, τα β, β-dimethylacrylshikonin αγωγή κύτταρα έδειξαν θολή μορφολογία (σχ. 3Ε) σε αντίθεση με την προφανώς σαφής εμφάνιση στα κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας την μετατόπιση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα σε β, β-dimethylacrylshikonin επεξεργασμένα κύτταρα.

για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος της ενεργοποίησης κασπάσης σε β, που προκαλείται από β-dimethylacrylshikonin- απόπτωση, υποβάλλαμε σε αγωγή SGC-7901 κυττάρων με αναστολέα παν-κασπάσης Ζ-VAD-FMK (10 μmol /L), πριν από β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία. Ο αναστολέας παν-κασπάσης Ζ-VAD-FMK προεπεξεργασία μείωσε την έκφραση του διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη PARP και μειωμένη β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση (Σχ 3F & amp?. G). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι μιτοχονδριακής μεσολάβηση μονοπάτι αλληλουχίας κασπάσης διαδραματίζει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση.

β, β-Dimethylacrylshikonin επάγει παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK σε SGC-7901 κύτταρα

έχει δειχθεί ότι ΜΑΡΚ σηματοδότηση εμπλέκεται σε διάφορες εκδηλώσεις της κυτταρικής τάσεων και ερεθίσματα που επάγεται κυτταρικής απόπτωσης [24], [25]. Συνεπώς εξετάσαμε την ενεργοποίηση της ERK, JNK και ρ38 μετά β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α & amp? Β, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK και JNK προφανώς αυξήθηκε σε απόκριση της β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία για 2 ώρες, και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης εμφάνισαν μία δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Εκτός αυτού, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK τελευταίων είκοσι τέσσερις ώρες. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές των επιπέδων φωσφορυλίωσης της ρ38 μετά τη β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι παρατεταμένη ενεργοποίηση της ERK ενέχεται σε β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση σε SGC-7901 κύτταρα.

SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη β, β-dimethylacrylshikonin συγκέντρωση ή η υποδεικνυόμενη διάστημα, ολικό κυτταρικό εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένες μορφές της ERK (Α), JNK (Β) και p38 (C). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντισώματα έναντι ολική ΕΚΚ, JNK και ρ38 για ομαλοποίηση.

Η

Η οδός σηματοδότησης ERK ενέχεται στην β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση σε SGC-7901 κύτταρα

τότε εξεταστεί κατά πόσον η β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη παρατεταμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ERK παίζει ένα ρόλο στην απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5A & amp? Β, δοκιμασία κηλίδος Western αποκάλυψε ότι U0126 (ένας ειδικός αναστολέας ΜΕΚ) ανέστειλε παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK και διάσπαση της κασπάσης-3, PARP σε β, β-dimethylacrylshikonin θεραπεία ενώ ο αναστολέας παν-κασπάσης Ζ-VAD-FMK είχε καμία επίδραση στην β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη ενεργοποίηση της ERK (Σχ. 5D). Επιπλέον, U0126 μειωμένη β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση σε SGC-7901 κυττάρων (Σχ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση σε SGC-7901 κυττάρων που προκαλείται από την παρατεταμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ERK.

(Α) SGC-7901 κύτταρα προκατεργάστηκαν ή όχι σε προεπεξεργασία με U0126 ( 10 μmol /L) στη συνέχεια προστέθηκε με DMSO (φορέας) ή β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) επί 2 ώρες, 24 ώρες αντίστοιχα. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK. τα επίπεδα πρωτεΐνης του συνόλου των ERK επίσης μετρούν ως μάρτυρες. (Β) SGC-7901 κύτταρα προκατεργάστηκαν ή όχι προεπεξεργασία με U0126 (10 μmol /L) στη συνέχεια προστέθηκε με DMSO (φορέας) ή β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) για 24 ώρες. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι διασπασμένης κασπάσης-3, διασπασμένη PARP. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. (C) SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με β, β-dimethylacrylshikonin παρουσία ή απουσία U0126 (10 μmol /L) για 24 ώρες. Η αποπτωτική κατάσταση προσδιορίσθηκε με Annexin V-FITC δοκιμασία δέσμευσης. Το κάτω δεξί μέρος (Αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

-) θεωρήθηκε ως πρώιμο στάδιο αποπτωτικών κυττάρων και πάνω δεξιά μέρος (Αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

+) θεωρήθηκε ως όψιμο στάδιο αποπτωτικών κυττάρων. Το κάτω αριστερό μέρος (Αννεξίνη V-FITC

– /PI

-) θεωρήθηκε ως βιώσιμα κύτταρα και το άνω αριστερό τμήμα (Αννεξίνη V-FITC

– /PI

+) θεωρήθηκε ως νεκρωτικές κύτταρα. (D) SGC-7901 κύτταρα προκατεργάστηκαν με ή χωρίς Ζ-VAD-FMK (10 μmol /L) επωάζονται περαιτέρω με β, β-dimethylacrylshikonin (10 μmol /L) για 24 ώρες. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK. τα επίπεδα πρωτεΐνης ERK μετρήθηκαν επίσης ως μάρτυρες.

Η

παράγωγα Συζήτηση

shikonin είναι τα ενεργά συστατικά που απομονώνονται από το κινέζικα βότανα erythrorhizon Lithospermum [5]. Αυτές οι ενώσεις ελπιδοφόρα υποψήφια φάρμακα όπως έχουν αναφερθεί να έχουν πολλαπλές αντικαρκινικές επιδράσεις in vivo και in vitro [5], [26]. Μεταξύ των συνιστωσών του Lithospermum erythrorhizon, β, β-Dimethylaerylshikonin έχει σημαντικές επιπτώσεις κατά του όγκου σε σύγκριση με άλλα δραστικά συστατικά [27]. Αναφορικά με αντικαρκινική δράση, shikonin-καθίστανται απόπτωση των κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-εξαρτώμενη οδό βρέθηκε σε πολλές κακοήθεις όγκους. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση της β, β-dimethylacrylshikonin σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα SGC-7901. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι θεραπεία του SGC-7901 κυττάρων με β, β-dimethylacrylshikonin έδειξε μία σημαντική κυτταροτοξική δράση κατά SGC-7901 κύτταρα σε μια δόση και εξαρτάται από τον χρόνο τρόπο, και β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση σε SGC-7901 κυττάρων αποδεικνύεται από Μια αυξημένη πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+ /ΡΙ

-). και αργά αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+ /ΡΙ

+)

Ο λόγος της αντι- και προ-αποπτωτική έκφραση πρωτεΐνης, όπως Bcl-2 /Bax, είναι κρίσιμη για την επαγωγή της απόπτωσης, και αποφασίζει την επιδεκτικότητα των κυττάρων να υποστούν απόπτωση [28]. Τα μιτοχόνδρια παίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σήματος απόπτωσης [29]. Η translocalization αποπτωτικών πρωτεϊνών από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια οδηγεί στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και δεύτερου μιτοχόνδρια προερχόμενο ενεργοποιητή κασπασών από τη μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης [30], [31]. Shikonin έχει αναφερθεί ότι διεγείρει απόπτωση μέσω μιτοχόνδρια οδού σε κύτταρα HepG2 [32]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι β, β-dimethylacrylshikonin ρυθμισμένα προς τα κάτω την έκφραση του ΧΙΑΡ, CIAP-2 και Bcl-2 και επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του Bak και Βαχ, και προκάλεσε την απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό και την απελευθέρωση του κυτόχρωμα c σε SGC-7901 κύτταρα, σύμφωνα με τα εξαρτώμενα μιτοχόνδρια απόπτωση. Η παρατήρηση του β, β-dimethylacrylshikonin διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-9, κασπάσης-3, και την επακόλουθη διάσπαση της PARP, όπως επίσης και το αποτέλεσμα ότι η παν-κασπάσης αναστολέας Ζ-VAD-FMK ελαττωμένη β, β-dimethylacrylshikonin απόπτωση σε SGC-7901 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η μιτοχονδριακή μεσολάβηση μονοπάτι αλληλουχίας κασπάσης διαδραματίζει βασικό ρόλο στην β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση, προκαλεί κυτοχρώματος απελευθέρωσης C και trigs κασπάσης-εξαρτώμενη κυτταρική αποπτωτικό θάνατο.

Μιτογόνο-ενεργοποιημένες πρωτεϊνοκινάσες (ΜΑΡΚ) ρυθμίζουν ποικίλες κυτταρικά προγράμματα που περιλαμβάνουν την εμβρυογένεση, πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [33]. Οι πρωτεΐνες της οικογένειας ΜΑΡΚ αποτελείται από τρία πρωτεϊνικών κινασών: ERK1 /2 (εξωκυτταρική κινάσες σήμα ρυθμιζόμενων 1 και 2), JNK (c-Jun Ν-τελική κινάση) και p38 [34], [35]. Γενικά, η παροδική ενεργοποίηση ERK οδηγεί σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά παρατεταμένη ενεργοποίηση της ERK είναι assoctiated με διαφοροποίηση [36]. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της ERK συμβάλλει στην απόπτωση. Jeong et al. έδειξαν ότι kaempferol προκαλείται καρκινικών κυττάρων να υποβληθούν σε απόπτωση μέσω ενός ΕΚΚ-εξαρτώμενο μονοπάτι [21], [37], [38]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι icaritin επάγει αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε ανθρώπινα PSMCs μέσω μονοπατιού σηματοδότησης ERK [39]. Li et al. έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης /MEK /ERK RAF διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε ασβέστιο επαγόμενη απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων του φακού [40]. Εδώ βρήκαμε επίσης ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση της ERK ενέχεται σε β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε SGC-7901 κύτταρα. U0126, ένας ειδικός αναστολέας της ΜΕΚ (ΜΑΡΚ /ΕΚΚ κινάσης), αποτελεσματικά μπλοκάρει β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη ενεργοποίηση ERK και εξασθενημένα β, β-dimethylacrylshikonin απόπτωση, προτείνοντας τις προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του β, β-dimethylacrylshikonin σε οι SGC-7901 κυττάρων που προκαλείται από την παρατεταμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK1 /2 σηματοδότηση.

Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι β, β-dimethylacrylshikonin ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται σε SGC-7901 κύτταρα. Μελετήσαμε επίσης των υποκείμενων μηχανισμών που εμπλέκονται στην β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin-επαγόμενη απόπτωση συνεπάγεται τη μείωση των ΧΙΑΡ, CIAP-2, και Bcl-2 έκφραση πρωτεΐνης και την επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης Bak και Βαχ, και προκάλεσε την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση του κυτοχρώματος γ σε SGC-7901 κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι β, β-dimethylacrylshikonin απόπτωση που επάγεται περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9 και την διάσπαση της PARP. Εκτός αυτού, ERK μονοπάτι σηματοδότησης συμμετείχε επίσης σε β, β-dimethylacrylshikonin επαγόμενη απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι β, β-dimethylacrylshikonin θα μπορούσε να αναπτυχθεί ως ένα εν δυνάμει αντικαρκινικό παράγοντα ενάντια στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου.

Ευχαριστίες

Θα ήθελα να ευχαριστήσω H-BW για την τεχνική βοήθεια τους και εμείς επίσης να ευχαριστήσω X -QM και J-HC για τα χρήσιμα σχόλια για αυτό το άρθρο.