Αφηρημένο

Οι βιοδείκτες που προβλέπουν την απόκριση σε στοχευμένες θεραπεία στην ογκολογία είναι ένα βασικό συστατικό της εξατομικευμένης ιατρικής. Σε προκλινικές μελέτες ανταπόκριση στη θεραπεία που χαρακτήρισε τα μοντέλα του άγριου τύπου

KRAS

ή μεταλλαγμένο

BRAF

καρκίνο του παχέος εντέρου θεραπεία είτε με cetuximab ή vemurafenib, αντίστοιχα, έχουμε δείχνουν ότι [

18F] -FLT PET, μια μη επεμβατική ένδειξη μοριακή απεικόνιση της θυμιδίνης διάσωσης, αντανακλά στενά απαντήσεις προ-επιβίωσης για στοχευμένη θεραπεία που προκαλούνται από δραστικότητα ΡΙ3Κ-mTOR. Η ενεργοποίηση των μηχανισμών προ-επιβίωσης αποτελεί τη βάση πολλών τρόπων αντίστασης. Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι [

18F] -FLT ΡΕΤ μπορεί να εξυπηρετήσει ένα νέο και δυνητικά κρίσιμο ρόλο να προβλέψουμε τους όγκους που εμφανίζουν μοριακά χαρακτηριστικά που τείνουν να αντανακλούν δυστροπία να ΜΑΡΚ-στοχευμένη θεραπεία. Αν και αυτές οι μελέτες επικεντρώθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου, οραματιζόμαστε ότι τα αποτελέσματα μπορεί να εφαρμόζεται σε άλλους συμπαγείς όγκους, καθώς

Παράθεση:. McKinley ET, Zhao P, Coffey RJ, Ουάσιγκτον ΜΚ, Manning HC (2014) 3 ‘ -δεοξυ-3 ‘- [

18F] -Fluorothymidine PET απεικόνισης Αντανακλά PI3K-mTOR που διαμεσολαβείται Pro-επιβίωση Response to Στοχευμένη θεραπεία στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (9): e108193. doi: 10.1371 /journal.pone.0108193

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Φλεβάρη του 2014? Αποδεκτές: 24, Αυγούστου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2014

Copyright: © 2014 McKinley et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση της έρευνας : R25 CA136440, Κ25 CA127349, CA128323 Ρ50, Ρ50 CA095103, R25 CA092043, R01 CA140628, RC1 CA145138, R01 CA046413, Ρ30 DK058404, Το Ίδρυμα Kleberg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με αυξημένη ικανότητα να γρήγορα και ανέξοδα χαρακτηρίζουν τη γενετική βάση του όγκου σε κάθε ασθενή, εξατομικευμένες θεραπείες γίνονται γρήγορα διαδεδομένη στην ογκολογία. Ορόσημο παραδείγματα της επιτυχίας της εξατομικευμένης ιατρικής στην ογκολογία περιλαμβάνουν τη χρήση των vemurafenib για τη θεραπεία

V600EBRAF

μελάνωμα [1] και trastuzumab για τη θεραπεία

HER2

υπερεκφράζουν τους καρκίνους του μαστού [2]. Με μια αυξανόμενη εξάρτηση από μοριακά στοχευμένες θεραπείες, εξακολουθεί να υπάρχει μια εξίσου σημαντική πρόκληση για την ανάπτυξη και την επικύρωση ειδικών βιοδεικτών που απεικονίζουν την αναστολή στόχου, αδρανοποίηση μονοπάτι, και να προβλέψει τη συνολική κλινική ανταπόκριση. Οι περισσότεροι βιολογικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται στις μελέτες ογκολογίας απαιτούν δειγματοληψία ιστού που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε δειγματοληπτικό σφάλμα και η μεροληψία λόγω της ετερογένειας. βιοδείκτες ορού με βάση δεν έχουν την ικανότητα να βλέπει κατ’ευθείαν τον όγκο και δείχνουν ότι το μετρούμενο αποτέλεσμα είναι άμεσα το αποτέλεσμα της απόκρισης του όγκου. Μη επεμβατική απεικόνιση παρακάμπτει αυτούς τους περιορισμούς και προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών βιοδείκτες. Των διαθέσιμων μεθόδων απεικόνισης κλινικά, την ευαισθησία και την ικανότητα να παράγουν άμεσα βιολογικά ενεργά μόρια που φέρουν ισότοπα που εκπέμπουν ποζιτρόνια κάνει τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (ΡΕΤ), ένα από τα πιο ελκυστικά λεπτομέρειες για την ανίχνευση όγκων και προφίλ βιολογικές αντιδράσεις στη θεραπεία.

το εργαστήριο μας έχει μελετήσει την βιολογική βάση της 3′-δεσοξυ-3 ‘[18F] -fluorothymidine ([

18F] -FLT) συσσώρευση σε όγκους [3] – [6] και άλλα ασθενή ιστό [7]. Ένα ανάλογο θυμιδίνης, [

18F] -FLT αναπτύχθηκε αρχικά για να χρησιμεύσει ως μια μη επεμβατική μέτρο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, με προφανή χρησιμότητα στην ογκολογία [8], [9] με αναφορά της διάσωσης μονοπάτι θυμιδίνης που παρέχει προδρόμους DNA για διαιρούμενα κύτταρα. Μετά την κυτταρική ενσωμάτωση, [

18F] -FLT φωσφορυλιώνεται σε μία αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο κυτοσολικό κινάσης θυμιδίνης 1 (ΤΚ1) και παγιδεύεται στο κύτταρο. δραστηριότητα ΤΚ1 συσχετίζεται στενά με τη σύνθεση του DNA και τείνει να μειωθεί σε αδρανή κύτταρα. [

18F] -FLT έχει μελετηθεί ευρέως ως δείκτης της ανταπόκρισης στη θεραπεία σε ένα φάσμα των τύπων όγκου και θεραπείες τόσο στις προ-κλινικές και κλινικές ρυθμίσεις [10]. Ωστόσο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι σε αντίθεση με περισσότερο γενικεύσιμων δείκτες πολλαπλασιασμού, όπως Ki67, [

18F] -FLT ΡΕΤ αντικατοπτρίζει πολλαπλασιαστική δείκτες σε μεταβλητές και ενδεχομένως αναξιόπιστη βαθμούς [6], [11]. [

18F] -FLT-PET δεν μπορεί να διακρίνει μέτρια πολλαπλασιασμού, θυμιδίνης διάσωσης με γνώμονα όγκους από εκείνα των πολύ πολλαπλασιασμού όγκων που βασίζονται κατά κύριο λόγο στην

novo

σύνθεση de θυμιδίνης. Παρά την έλλειψη συσχετισμού με τον πολλαπλασιασμό σε ορισμένες περιπτώσεις, οραματιστήκαμε ότι τα επίπεδα ΤΚ1, και έτσι [

18F] -FLT PET, θα μπορούσε να αντικατοπτρίζει άλλες δυνητικά σημαντικό μοριακά γεγονότα που συνδέονται με την ανταπόκριση στη θεραπεία.

Χρησιμοποιώντας προκλινικές μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου δείχνουμε δύο περιπτώσεις [

18F] -FLT ΡΕΤ δεν συσχετίζονται με πολλαπλασιασμό, αλλά μάλλον αντανακλά PI3K-mTOR απαντήσεις μεσολάβηση προ-επιβίωσης για στοχευμένη θεραπεία. Σε αυτές τις ρυθμίσεις, [

18F] -FLT ΡΕΤ ήταν ασύμφωνα 2-δεοξυ-2 – [

18F] φθοριο-D-γλυκόζης ([

18F] -FDG) PET, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη ιχνηθέτη στα Clinical oncology, η οποία δεν ήταν ευαίσθητα σε mTOR- ή δραστικότητα ΡΙ3Κ-μονοπατιού. Το cetuximab μεσολάβηση αναστολή της δραστηριότητας ΜΑΡΚ σε άγριου τύπου

KRAS

μοντέλο κυτταρική σειρά και vemurafenib μεσολάβηση αναστολή της BRAF σε μια

V600EBRAF

μεταλλαγμένο μοντέλο κυτταρική σειρά είχε καμία επίδραση στην [

18F] -FLT ΡΕΤ εκτός PI3K-mTOR στη συνέχεια εξασθενεί φαρμακολογικά ή

μέσω

γενετικής αποσιώπησης. Συνολικά, αυτές οι μελέτες επιδεικνύουν μία νέα ρόλο για [

18F] -FLT ΡΕΤ ως μέσο για την πρόβλεψη των όγκων που ανθίστανται αναστολή της ΜΑΡΚ μέσω της ενεργοποίησης της ΡΙ3Κ-mTOR σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ενδεχομένως άλλων συμπαγών όγκων.

Υλικά και μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και τα μοντέλα του ποντικιού

Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπής του Πανεπιστημίου Vanderbilt και όλα έγιναν προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων. ανθρώπινα κύτταρα DiFi ήταν ένα δώρο από τον Dr. Bruce Boman [12] και COLO 205 κύτταρα ελήφθησαν από ATCC (CCL-222). DiFi ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) και COLO 205 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI (Cellgro) με 10% ορό εμβρύου μόσχου, (Atlanta Biologicals), 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (GIBCO) στους 37 ° C και 5% CO

2. C225 ελήφθη από την Vanderbilt Pharmacy, PLX4032 και PLX4720 συντέθηκαν όπως περιγράφεται [13], PP242 ελήφθη από την Sigma Aldrich, και BEZ235 από Σέλεκ Chem. Στοκ διαλύματα του κάθε φαρμάκου παρασκευάστηκαν και κλασματοποιήθηκαν να επιτευχθούν τελικές συγκεντρώσεις φαρμάκου για

in vitro

μελέτες.

Για

in vivo μελέτες

, ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς παρήχθησαν σε αθυμικά γυμνά ποντικούς (Harlan) όπως περιγράφεται [3] και θεραπεία ξεκίνησε όταν ο όγκος έφθασε σε περίπου 150 mm

3. Για τη θεραπεία της DiFi ξενομοσχευμάτων, αλατούχο όχημα, 20 mg /kg, ή 40 mg /kg cetuximab χορηγήθηκε ε.π. κάθε τρίτη ημέρα. ΡΕΤ απεικόνιση DiFi ποντικών ξενομοσχεύματος φέρουν διεξήχθη 7 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας, 24 ώρες μετά την τρίτη αγωγή. Για COLO 205 ξενομοσχεύματα, ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα DMSO, 60 mg /kg PLX4720, ή 40 mg /kg ημερησίως BEZ235 από του στόματος καθετηριασμό (100 μL συνολικός όγκος). ΡΕΤ απεικόνιση COLO 205 ξενομόσχευμα ποντικούς που φέρουν διεξήχθη 4 ημέρες μετά την έναρξη της αγωγής, περίπου 24 ώρες μετά την τρίτη αγωγή. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν αμέσως μετά την ολοκλήρωση της απεικόνισης PET.

μεθόδους siRNA

Raptor (L-004107-00) και τυχαία σειρά (D-001810-01) αντιδραστήρια siRNA ελήφθησαν από Thermo Scientific. siRNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα DiFi χρησιμοποιώντας το κιτ μορφομετατροπής DharmaFect (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν ολίγοις, 500.000 κύτταρα DiFi τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, siRNA προστέθηκε στα κατάλληλα φρεάτια. Μετά από 48 ώρες, το αλατούχο όχημα, 0.5 μg /mL ή 5,0 μg /mL C225 προστέθηκαν στα κατάλληλα φρεάτια. Μετά από περαιτέρω 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για κηλίδωση Western και qRT-PCR όπως περιγράφεται παρακάτω.

Ραδιοφάρμακο σύνθεση

[

18F] -FLT παρασκευάζεται σε μία δύο σταδίων, αντίδραση ενός δοχείου όπως περιγράφεται [4], [14]. [

18F] -FLT λήφθηκε με μέση ραδιοχημική καθαρότητα 98,3% και η ειδική δραστικότητα ≥345.5 TBq /mmol. [

18F] -FDG συντέθηκε στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt Medical Center Ραδιοφαρμακευτική και διανέμεται από την PETNET. Η μέση ραδιοχημική καθαρότητα του προϊόντος ήταν 98,5% και η συγκεκριμένη δραστηριότητα ήταν περισσότερο από 37 TBq /mmol.

Μικρές ζώων απεικόνισης

απεικόνισης PET Μικρό-ζώο έγινε χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή ειδικό microPET ( Concorde Microsystems Focus 220). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από 2% ισοφλουράνιο σε οξυγόνο αναισθησία στα 2 λίτρα /λεπτό και διατηρείται ζεστό μέσω ενός κυκλοφορούντος μαξιλάρι θέρμανσης νερού για τη διάρκεια της ΡΕΤ scan. Για [

18F] ζώα απεικόνισης -FLT PET χορηγήθηκαν 07.04 – 09.03 MBq (200-250 μΟί) ενδοφλεβίως. Τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό κατά τη διάρκεια μιας περιόδου πρόσληψης 40 λεπτό, που ακολουθείται από αναισθησία και απόκτησης εικόνας 20 λεπτών. Για το [

18F] απεικόνισης -FDG ΡΕΤ, οι ποντικοί νήστεψαν για περίπου 6 ώρες πριν από την απεικόνιση και θερμαίνεται σε ένα θερμαινόμενο (31 ° C) θάλαμο για 1 ώρα πριν από [

18F] ένεση -FDG και κατά τη διάρκεια της πρόσληψη περίοδο για την ελαχιστοποίηση καφέ πρόσληψη λίπους του [

18F] -FDG. Τα ποντίκια χορηγήθηκαν 7.4 έως 9.3 MBq του [

18F] -FDG ενδοφλεβίως και αφήνεται ελεύθερη πρόσβαση σε νερό κατά τη διάρκεια μιας περιόδου πρόσληψης 50 λεπτά που ακολουθείται από μια εξαγορά ΡΕΤ 10 λεπτά.

δεδομένα PET ανοικοδομήθηκαν χρησιμοποιώντας OSEM3D /ΧΆΡΤΗΣ. Οι προκύπτουσες τρισδιάστατες αναπαραστάσεις είχε x-y μεγέθους voxel mm και μεταξύ των τομών απόσταση 0,796 χιλιοστά 0,474. λογισμικού ASIPro (Siemens) χρησιμοποιήθηκε για να σχεδιάσετε το χέρι τρισδιάστατες περιοχές ενδιαφέροντος του όγκου του όγκου. δείγματα όγκων συλλέγεται αμέσως μετά από [

18F] -FLT-PET και καταψύχονται σε υγρό άζωτο. [

18F] πρόσληψη -FLT ποσοτικοποιήθηκε ως το ποσοστό της εγχυμένης δόσης ανά γραμμάριο ιστού (% ID /g) με τη διαίρεση του δραστηριότητα ROI από την εγχυθείσα δόση και πολλαπλασιάζοντας με το 100.

Ανοσοκηλίδωση

για

in vitro μελέτες

, τα κύτταρα λύθηκαν με CelLytic Μ (Sigma Aldrich), φυγοκεντρήθηκε στις 16.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο απομακρύνεται πριν από την μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης με δικιγχονικού οξύ (BCA) δοκιμασία (Thermo Scientific). Για

in vivo μελέτες

κατεψυγμένα ιστός ομογενοποιήθηκε σε CelLytic ΜΤ (Sigma Aldrich) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, φυγοκεντρήθηκε στα 16.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο απομακρύνεται πριν από την μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης με BCA χημική δοκιμή. Πριν από την ανάλυση με ηλεκτροφόρηση, 20-40 μg πρωτεΐνης από κάθε δείγμα φορτώνεται σε πηκτώματα 7,5 έως 12% δϋδ PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (PerkinElmer). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για όλη τη νύχτα σε 4 ° C σε ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα Τπδ 0,1% Tween-20 (TBST) που περιέχει 5% β /ο άπαχο ξηρό γάλα σε σκόνη. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες ανακρίθηκαν με αντισώματα που λαμβάνονται από την Cell Signaling Technology, εκτός αν σημειώνεται με π-ERK 1/2 Thr202 /Tyr204 (# 4370), ERK 1/2 (# 4372), ΤΚ1 (Abcam, # 57757), p27 (# 3686 ), ρ-ΑΚΤ Ser473 (# 4060), ρ-ΑΚΤ Thr308 (# 4056), ΑΚΤ (# 4685), ρ-rpS6 Ser236 /236 (# 4858), rpS6 (# 2217), ρ-4EBP1 Thr37 /46 ( # 2855), ρ-MEK Ser217 /221 (# 9154), ΜΕΚ (# 9126), DUSP6 (# 3058), β-ακτίνη (# 4970), β-τουμπουλίνης (Novus Biologicals, # NB600-936). Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε TBST με λευκωματίνη 3% βόειου ορού (BSA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch) αραιώθηκε 1:5000 σε TBST που περιείχε 3% BSA. Δυτική Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση χημειοφωταύγειας σε Xenogen IVIS 200.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Τα ζώα θυσιάστηκαν και τα δείγματα όγκων συλλέχθηκαν αμέσως μετά την απεικόνιση ΡΕΤ, στη συνέχεια, στη συνέχεια, σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για 24 ώρες. Οι ιστοί στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε 70% αιθανόλη πριν από την εμβάπτιση σε παραφίνη. Οι ιστοί κόπηκαν σε τομές (5 μm πάχος) και βάφτηκαν για ρ-rpS6 (Cell Signaling, # 4858, 1:100 βασικής αραίωσης), ρ-ΑΚΤ Ser473 (Cell Signaling, # 4060, 1:100 βασικής αραίωσης), Ki67 (Dako, # M7240, 1:100 βασικής αραίωσης), ρ27 (Dako, # M7203, 1:100 αρχικής αραίωσης). Εν συντομία, τα δείγματα ιστού από-παραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6.0) διάλυμα για 15 λεπτά στους 105 ° C ακολουθούμενη από έναν πάγκο 10 λεπτό χαλάρωσης. Τα δείγματα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% για την εξάλειψη της ενδογενούς δραστηριότητας της υπεροξειδάσης. Οι τομές στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με αντιδραστήριο αποκλεισμού πρωτεΐνη χωρίς ορό για 20 λεπτά. ανίχνευση πρωτογενές αντίσωμα επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το ακόλουθο σύστημα: Οι τομές ιστών επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά στις αναφερόμενες αραιώσεις που ακολουθείται από μια επώαση 30 λεπτών με χρήση της Envision + System-σημασμένα με HRP μέθοδος ανίχνευσης Polymer (Dako, Carpinteria, CA). Χρώση ολοκληρώθηκε μετά από επώαση με ένα διάλυμα υποστρώματος-χρωμογόνου 3,3′-διαμινοβενζιδίνη. διαφάνειες ιστού απεικονίστηκαν σε μεγέθυνση 40x και με το χέρι σκόραρε για να καθοριστεί το ποσοστό των θετικών κυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος.

qRT-PCR

RNA συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy όπως προτείνεται από τον προμηθευτή (QIAGEN) . Τόσο cDNA και πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA iScript και iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) με οδηγίες του προμηθευτή. Ενισχύσεις πραγματοποιήθηκαν σε έναν BIO-RAD CFX96 πραγματικό χρόνο σύστημα για 40 κύκλους. Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν από το λογισμικό Bio-Rad CFX Manager και διπλώστε αλλαγές αναλύθηκαν όπως περιγράφεται από Schefe et al [15]. Ανθρώπινη ΤΚ1 (5′-AATCAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 ‘προς τα εμπρός? 5′-ATCACCAGGCACTTGTACTGAGCA-3′ αντίστροφο), η ανθρώπινη Ρ27 (5’-AGCAATGCGCAGGAATAAGGAAGC-3 ‘προς τα εμπρός? 5′-TACGTTTGACGTCTTCTGAGGCCA-3’ αντίστροφη) ελήφθησαν από την Integrated DNA Technologies.

Στατιστική Ανάλυση

η στατιστική σημαντικότητα των δεδομένων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το μη-παραμετρικό Wilcoxon Rank Sum (Mann-Whitney U) των δοκιμών με τη χρήση του πακέτου λογισμικού GraphPad Prism 4. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Κανονισμός του ΤΚ1 μετά από αποκλεισμό του EGFR σε άγριου τύπου

KRAS

καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Προηγουμένως , δείξαμε ότι αναγνώσεις απεικόνιση της πληρότητας EGFR και την απόπτωση, αλλά δεν [

18F] -FLT PET, προέβλεψε ανταπόκριση στο cetuximab σε DiFi ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς που εκφράζουν άγριου τύπου KRAS και εμφανίζουν EGFR ενίσχυσης [3], [12] . Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε πρώτα να διευκρινίσει τις σχέσεις μεταξύ αποκλεισμό EGFR με cetuximab και ρύθμιση ΤΚ1. Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε καλλιεργημένα κύτταρα DiFi να αξιολογηθεί η χρονική σχέση μεταξύ της έκθεσης cetuximab και ρ-ΕΚΚ, ΤΚ1, και τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ27 σε 24 ώρες (Εικ. 1Α). Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα ρ-ERK ήταν σχεδόν αμέσως εξασθενημένα, δείχνοντας μια δραματική μείωση εντός της πρώτης ώρας του cetuximab έκθεσης (5.0 μg /mL), και το υπόλοιπο καλά κάτω από τα επίπεδα αναφοράς για μέχρι και 24 ώρες. Παραδόξως, τα επίπεδα ΤΚ1 αυξήθηκαν μετά cetuximab έκθεση, η οποία κορυφώθηκε στις 12 ώρες, και στη συνέχεια μειώθηκε γρήγορα κάτω από τα αρχικά επίπεδα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου ρ27 αυξήθηκε δραματικά και σταθεροποιήθηκαν με 12 ώρες. Η αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων ΤΚ1 και πρωτεΐνη p27 εμπλέκεται p27 ως καθοριστικό παράγοντα ρύθμισης ΤΚ1 στα κύτταρα DiFi.

(Α) κηλίδας Western των προϊόντων λύσης κυττάρων DiFi παρακάτω cetuximab έκθεση (5 μg /ml) είχε ως αποτέλεσμα την ταχεία εξασθένηση κατάντη στόχους ΜΑΡΚ συμπεριλαμβανομένων π-ΕΚΚ, το οποίο παρέμεινε καλά κάτω από τα αρχικά έως 24 ώρες. Παραδόξως, τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1 αυξήθηκε από 1-12 ώρες έως ότου τα επίπεδα της πρωτεΐνης p27 αυξήθηκε, οπότε ΤΚ1 έπεσε παρακάτω βασική γραμμή. κύτταρα (Β) DiFi αγωγή είτε με 0.5 μg /mL ή 5,0 μg /mL cetuximab οδήγησε σε μείωση κατά 50% και την πλήρη εξασθένιση των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ-ΕΚΚ, αντίστοιχα, σε 24 ώρες. Στο 0,5 μg /mL επίπεδα ΤΚ1 ήταν ανεπηρέαστη παρά μια μέτρια αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης p27. Ωστόσο, 5,0 μg /mL cetuximab οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη ΤΚ1 με μια μεγάλη αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ27. δραστικότητα ΡΙ3Κ-mTOR, όπως μετράται με ρ-ΑΚΤ Ser473, ρ-rpS6, και ρ-4E-BP1, ήταν είτε να διατηρηθούν ή να ανυψωθεί σε 0,5 μg /mL cetuximab αλλά εξασθένησε στα 5.0 μg /mL cetuximab. (C) qRT-PCR ανάλυση έδειξε

ΤΚ1

mRNA ήταν σημαντικά μειωμένο σε 0,5 μg /mL (p = 0,0279) και 5,0 μg /mL (p = 0,0186), ενώ καμία αλλαγή στο

ρ27

επίπεδα mRNA παρατηρήθηκε σε κάθε δόση. (D) Σίγαση mTORC1 διευκόλυνε προς τα πάνω ρύθμιση της ρ27 και εξασθενημένα επίπεδα πρωτεΐνης ΤΚ1 στα 0,5 μg /mL cetuximab χωρίς να επηρεάζει τα αποτελέσματα αντι-ΜΑΡΚ του cetuximab. Επίπεδα ρ-ΑΚΤ Ser473, ρ-rpS6, και ρ-4E-BP1 μειώθηκαν στα 0,5 μg /mL έκθεση cetuximab με Raptor knockdown αλλά όχι σε κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA. (Ε) Ως απόδειξη της λειτουργικότητας του p27,

ΤΚ1

επίπεδα mRNA ήταν επίσης μειωμένο κατά 0,5 μg /mL και 5,0 μg /mL με Raptor νοκ ντάουν.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η σχέσεις μεταξύ της αναστολής ΜΑΡΚ μονοπάτι, ρύθμιση ΤΚ1, και ρ27, κύτταρα DiFi εκτέθηκαν σε δύο συγκεντρώσεις (0,5 μg /mL και 5,0 μg /mL) του cetuximab για 24 ώρες (Εικ. 1Β). Με 0.5 μg /mL, τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1 ήταν ανεπηρέαστες παρά μετρίως αυξημένα ρ27 και μία μείωση περίπου 50% του ρ-ERK και ρ-ΑΚΤ Ser473. Αντίθετα, το 5,0 μg /mL επίπεδο έκθεσης οδήγησε σε δραματική εξασθενημένα επίπεδα ΤΚ1. Παρόμοια με την μελέτη χρονικής πορείας, μειωμένη ΤΚ1 συσχετίζεται με μια ισχυρή αύξηση του ρ27. Επιπλέον, η πλήρης εξασθένηση του ρ-ERK και ρ-ΑΤΚ Ser473 παρατηρήθηκε σε 5,0 μg /mL. Σε αντίθεση με την πρωτεΐνη,

ΤΚ1 mRNA

έτειναν να ακολουθήσουν τα επίπεδα ρ-ERK πιο άμεσα (Σχ. 1 C), το οποίο δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου

ΤΚ1

‘s εξάρτηση από τις E2F μεταγραφής [16], μεταγενέστερος προϊόν της δραστηριότητας ΜΑΡΚ. Είναι ενδιαφέρον,

p27

mRNA ήταν ανεπηρέαστη από cetuximab έκθεσης, υποδηλώνοντας ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης αυξημένα p27 προήλθε από την αναστολή των κατάντη στόχων που επηρεάζουν μετα-μεταγραφική τροποποίηση του p27, με ΑΚΤ συνήθως είναι ένα από αυτά [17]. Για να προσδιοριστεί εάν τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1 παρατηρούνται σε επίπεδα 0,5 μg /mL της έκθεσης διατηρήθηκαν μέσω της αύξησης της μεταφραστικής αποτελεσματικότητας, μετρήσαμε ρ-rpS6 και τα επίπεδα ρ-4E-BP1, και τα δύο προϊόντα των προ-μεταφραστική δραστικότητα ΡΙ3Κ-mTOR (Εικ. 1Β) . Βρήκαμε επίπεδα ρ-rpS6 να είναι εξασθενημένοι μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση του cetuximab. Επιπλέον, τα επίπεδα της p-4E-BP1 ήταν αυξημένα στη χαμηλότερη συγκέντρωση του cetuximab, γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη πιθανότητα για μετάφραση στο ριβοσωματικού καπάκι [18]. Σε συνδυασμό με τις

ΤΚ1

επίπεδα mRNA, τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να υποδηλώνουν ότι η μεταφραστική απόδοση του ΤΚ1 στο χαμηλότερο επίπεδο του cetuximab έκθεσης που πιθανόν να προχωρήσει μέσω της ενεργοποίησης του mTOR.

Σίγαση mTOR-PI3K διευκολύνει δραστηριότητα cetuximab μεσολάβηση εξασθένηση των επιπέδων ΤΚ1 στα κύτταρα DiFi

για να διερευνήσουν το ρόλο της mTOR σχετικά με τη ρύθμιση ΤΚ1 σε αυτό το πλαίσιο, έχουμε σιωπήσει mTOR με τη χρήση siRNA σε Raptor, βασικό μέλος της λειτουργικής mTOR Complex 1 (mTORC1) [ ,,,0],19]. Σε περίπτωση απουσίας της δραστηριότητας mTORC1, τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1 ήταν εξασθενημένα και στις δύο συγκεντρώσεις 0,5 μg /mL και 5,0 μg /mL του cetuximab, χωρίς εμφανή επίδραση επί της δραστικότητας ΜΑΡΚ μονοπάτι (Σχ. 1D). Όπως ήταν αναμενόμενο, αρπακτικών σίγηση οδήγησε σε μεγαλύτερη cetuximab μεσολάβηση εξασθένηση του ρ-ΑΚΤ Ser473 και ρ-rpS6 καθώς και φωσφορυλίωση μπλοκάρισμα της 4Ε-ΒΡ1. Εκτός από την εξασθενημένη επίπεδα πρωτεΐνης ΤΚ1, mTORC1 αδρανοποίηση οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ27 που φάνηκε να είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για

ΤΚ1

μεταγραφική ρύθμιση στο χαμηλότερο επίπεδο του cetuximab έκθεσης (Εικ. 1 Ε). Είναι ενδιαφέρον, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως, η αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης p27 η ίδια δεν ήταν ένα προϊόν της αυξημένης

p27

μεταγραφής (Εικ. S1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του mTOR προσδίδει επίδρασή της στην ΤΚ1 μέσω καθοδικούς τελεστές όπως ΑΚΤ και ERK μέσω μετα-μεταφραστική τροποποίηση και η υποβάθμιση των αναστολέων κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων ρ27 [17]. Ως απόδειξη αυτού, mTORC1 αναστολή σε συνδυασμό με αποκλεισμό EGFR οδήγησε σε μια βαθιά μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΤΚ1 δεν παρατηρείται με cetuximab έκθεση και μόνο στη χαμηλότερη συγκέντρωση.

[

18F] -FLT ΡΕΤ αντικατοπτρίζει την αναστολή της δραστηριότητα PI3K-mTOR στο cetuximab αντιμετωπίζονται DiFi ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς

in vivo

Η

στη συνέχεια απεικονίζεται DiFi ξενομόσχευμα φέρουν ποντίκια με [

18F] -FLT ΡΕΤ μετά από θεραπεία με cetuximab (20 mg /kg ή 40 mg /kg) ή αλατούχο όχημα. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας [3], παρόμοια [

18F] συσσώρευση -FLT παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα που έλαβαν θεραπεία με όχημα ή 20 mg /kg cetuximab. Η αύξηση της δοσολογίας του cetuximab έως 40 mg /kg είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη [

18F] συσσώρευση -FLT (Σχ. 2Α). Μειωμένη επίπεδα πρωτεΐνης ΤΚ1 παρατηρήθηκαν στο 40 mg /kg δόση σε σχέση με φορέα και 20 mg /kg όγκους cetuximab αγωγή (Σχ. 2Β). Παρόμοια με

in vitro

μελέτες, τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώνεται ΤΚ1 συσχετίζεται με αυξημένη πρωτεΐνη p27, αλλά όχι

p27

επίπεδα του mRNA (Εικ. S2). Επιπροσθέτως, ρ-ΑΚΤ Ser473 επίπεδα πρωτεΐνης όγκου αυξήθηκαν στη δόση 20 mg /kg σε σύγκριση τόσο με όχημα και 40 mg /kg cetuximab. τα επίπεδα πρωτεΐνης ΤΚ1 δεν επηρεάστηκαν από τη χαμηλότερη δοσολογία του cetuximab, παρά μείωσε σημαντικά

ΤΚ1

mRNA (Σχ. 2C), το οποίο μειώθηκε σε σχέση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα και στα δύο επίπεδα του cetuximab έκθεσης. IHC απεικόνισης ταιριαστό ξενομοσχεύματος ιστοί απεικονίζεται ότι η δραστηριότητα της ΡΙ3Κ-mTOR, όπως μετράται με ρ-rpS6 και ρ-ΑΚΤ επίπεδα Ser473, ανεστάλη στην υψηλότερη έκθεση cetuximab (Σχ. 2D, Σχ. S3). Είναι ενδιαφέρον, Ki67 μειώθηκε σε δύο επίπεδα cetuximab έκθεσης (Σχήμα 2D, Εικ. S4), γεγονός που υποδηλώνει ότι [

18F] -FLT ΡΕΤ αποσυνδεθεί από τα τυποποιημένα μέτρα διάδοσης στη χαμηλότερη δόση. Ενώ [

18F] -FLT PET φαίνεται να είναι ευαίσθητα σε δράση ΡΙ3Κ-mTOR, [

18F] απεικόνισης -FDG ΡΕΤ δεν ήταν ευαίσθητα σε αυτό το φαινόμενο. Παρατηρήσαμε μειωμένη [

18F] -FDG πρόσληψη σε σχέση με τους ελέγχους των οχημάτων και στα δύο επίπεδα του cetuximab έκθεσης (Εικ. S5). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το [

18F] -FLT PET παρέχει μοναδικές πληροφορίες σχετικά με τη σηματοδότηση του mTOR που δεν συλλαμβάνεται από [

18F] -FDG PET ή τυποποιημένα μέτρα διάδοσης, όπως Ki67 IHC.

DiFi ξενομοσχεύματα όγκου απεικονίστηκαν την ημέρα 7 των 20 mg /kg ή 40 mg /kg cetuximab αγωγές θεραπείας. (Α) [

18F] -FLT ΡΕΤ μειώθηκε μόνο σε DiFi ξενομοσχεύματα αντιμετωπίζονται στο /kg επίπεδο 40 mg (p = 0,0012). (Β) ανάλυση κηλίδας Western των ιστών που συλλέγονται αμέσως μετά την απεικόνιση επιβεβαίωσε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1 μειώθηκαν μόνο στο επίπεδο των 40 mg /kg δόση. Αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης ρ27 παρατηρήθηκαν στα επίπεδα 40 mg /kg δόση. Αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ-ΑΚΤ Ser473 παρατηρήθηκαν στο επίπεδο των 20 mg /kg δόση. (C) Όμοια με το

in vitro

παρατηρήσεις,

ΤΚ1

mRNA μειώθηκε σημαντικά τόσο σε 20 mg /kg (ρ = 0,0009) και 40 mg /kg (ρ = 0.0001) δόση επίπεδα. (D) IHC ανάλυση του ρ-rpS6 και ρ-ΑΚΤ Ser473 έδειξε ελαφρώς αυξημένα επίπεδα χρώσης στα 20 mg /kg. Ωστόσο, και οι δύο δείκτες μειώθηκαν σημαντικά στα 40 mg /kg. Κί67 ανοσολογική αντίδραση μειώθηκε σε δύο επίπεδα cetuximab έκθεσης.

Η

επιπέδων της πρωτεΐνης ΤΚ1 δεν αντανακλούν

V600EBRAF αναστολή σε COLO 205 κύτταρα

Ανάλογα με το μοντέλο DiFi θεραπεία με cetuximab, αξιολογήσαμε τις σχέσεις μεταξύ της αναστολής στόχου, καθοδικούς τελεστές, και τα επίπεδα ΤΚ1 σε

V600EBRAF κυτταρική γραμμή που εκφράζει, COLO 205, που έλαβαν θεραπεία με έναν εκλεκτικό

αναστολέας V600EBRAF (Εικ. 3). έκθεση PLX4032 για 48 ώρες οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της ρ-ΜΕΚ επίπεδα. Παραδόξως, τα επίπεδα ρ-ΕΚΚ αυξήθηκαν σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, εκτός στην υψηλότερη δόση (5 μΜ) (Σχ. 3Α). Η αναντιστοιχία μεταξύ των ρ-ΜΕΚ και ρ-ΕΚΚ δεν παρατηρήθηκε σε διάρκειες έκθεσης 2 ώρες (Εικ. S6) ή 24 ώρες (Σχ. S7). Ενώ τα επίπεδα ρ-ΑΚΤ Ser473 ήταν μόνο μετρίως μειωμένη με έκθεση PLX4032 στις 48 ώρες, παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση της ρ-rpS6 που συσχετίζεται με την αύξηση της ρ-ERK. Ταυτοχρόνως αυξήθηκε ρ-rpS6 και μειωμένα επίπεδα DUSP6 αναφέρθηκε ότι η αύξηση σε ρ-ERK ήταν τουλάχιστον εν μέρει προέκυψε από δραστηριότητα μειωμένη φωσφατάσης που πιθανόν σχετίζονται με την ενεργοποίηση του mTOR [20]. έκθεση PLX4032 οδήγησε σε μια μέτρια αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης p27. επίπεδα ΤΚ1 αυξήθηκαν ελαφρώς σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις PLX4032 και αμετάβλητος από το όχημα σε υψηλότερα επίπεδα έκθεσης, εκτός από την υψηλότερη συγκέντρωση (5 μΜ). Παραδόξως,

ΤΚ1

επίπεδα mRNA φάνηκε να σχετίζεται περισσότερο με την αναστολή της π-ΜΕΚ και, σε αντίθεση με τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1, μειώθηκαν σε μια ουσιαστικά εξαρτάται από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 3Β).

COLO 205 κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες PLX 4032 έκθεση στα 10 ηΜ, 100 ηΜ, 500 ηΜ, 1 μΜ, ή 5 μΜ. (Α) ανάλυση κηλίδας Western κατέδειξε αναστολή στόχου π-ΜΕΚ παρά τα αυξημένα επίπεδα ρ-ΕΚΚ. σηματοδότηση PI3K-mTOR ανυψώθηκε σε ένα PLX 4032-εξαρτώμενο τρόπο, όπως εκτίθενται από μια σταθερή αύξηση των επιπέδων σ-rpS6. Η DUSP6 ΕΚΚ-φωσφατάση μειώθηκε σε συνδυασμό με σηματοδότηση mTOR και ήταν αντιστρόφως ανάλογη προς τα επίπεδα ρ-ΕΚΚ. Μια μικρή αύξηση των επιπέδων της p27 παρατηρήθηκε ταυτόχρονα με μόνο μικρές αλλαγές στα επίπεδα ΤΚ1, εκτός από την υψηλότερη δόση του PLX4032. (Β) Μείωση

ΤΚ1

επίπεδα mRNA παρατηρήθηκαν σε όλες τις συγκεντρώσεις του φαρμάκου πάνω από 10 nM (p & lt? 0,05).

Η

[

18F] -FLT ΡΕΤ, αλλά δεν [ ,,,0],

18F] -FDG PET, αντανακλά αυξημένη δραστικότητα του mTOR και συσχετίζεται με την έλλειψη αναστολής p-ERK σε PLX4720 επεξεργασμένο COLO 205 ξενομοσχεύματα

Ποντίκια που φέρουν COLO 205 ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε θεραπεία καθημερινά με 60 mg /kg PLX4720 για 4 ημέρες και απεικονίστηκαν με [

18F] -FLT PET ή [

18F] -FDG PET (Εικ. 4). Σε συμφωνία με το

in vitro

μελέτες που δείχνουν ότι η αναστολή BRAF είχε μικρή επίδραση στα επίπεδα ΤΚ1 σε COLO 205 κύτταρα, η θεραπεία με PLX4720 είχε μικρή επίδραση στην [

18F] απεικόνισης -FLT PET. Αντιστρόφως, [

18F] -FDG ΡΕΤ ήταν σημαντικά μειωμένη σε παρόμοια επεξεργασία ομάδες (Εικ. 4Β). Σε συμφωνία με την απεικόνιση, τα επίπεδα ΤΚ1 ξενομοσχευμάτων PLX4720 αγωγή ήταν παρόμοια με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα. Επίσης, παρόμοια με

in vitro μελέτες

βρήκαμε αυξημένα επίπεδα ρ-ERK και τα επίπεδα ρ-rpS6 σε PLX4720 αντιμετωπίζονται ξενομοσχεύματα σχέση με τους μάρτυρες που έλαβαν φορέα, παρά την αναστολή της τελεστή BRAF, π-ΜΕΚ.

(Α) Εκπρόσωπος εγκάρσια [

18F] -FLT και [

18F] εικόνες -FDG ΡΕΤ που αποκτήθηκαν μετά από τρεις καθημερινές θεραπείες με όχημα ή 60 mg /kg PLX4720 (όγκου που υποδεικνύεται από το βέλος). (Β) Ποσοτικοποίηση των δεδομένων PET απεικονίζονται παρόμοια [

18F] πρόσληψη -FLT σε αγωγή με όχημα και PLX4720 αγωγή όγκων. Σε αντίθεση με [

18F] -FLT ΡΕΤ, η έκθεση PLX4720 προκάλεσε σημαντική μείωση στο [

18F] -FDG πρόσληψη (p = 0,0006). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των φορέα και PLX4720 επεξεργασμένο ιστό όγκου επιβεβαιώθηκε ότι PLX4720 δεν είχε καμία επίδραση επί των επιπέδων της πρωτεΐνης ΤΚ1 σε συμφωνία με [

18F] -FLT ΡΕΤ. Στόχευση αναστολή όπως μετριέται από π-ΜΕΚ επίπεδα παρατηρήθηκε. Ωστόσο, παρόμοια με

in vitro

μελέτες, PLX4720 επεξεργασμένο COLO 205 ξενομοσχεύματα παρουσίασαν αυξημένα p-ERK και πρωτεϊνών ρ-rpS6 επίπεδα σε σχέση με τους ελέγχους οχημάτων.

Η

Κανονισμός του ΤΚ1 παρακάτω mTOR ή διπλή αναστολή PI3K-mTOR και

αναστολή V600EBRAF σε COLO 205 κύτταρα

Για να εξετάσει το ρόλο του mTOR στην ρύθμιση ΤΚ1 παρακάτω

αναστολή V600EBRAF, καλλιεργημένα κύτταρα COLO 205 υποβλήθηκαν σε θεραπεία ταυτόχρονα με 250 nM pp242, μια επιλεκτική αναστολέα mTORC1 /mTORC2 [21] και αυξανόμενες συγκεντρώσεις PLX4032 για 48 ώρες (Εικ. 5). Προσθέτοντας PP242 είχε μικρή επίδραση στην PLX4032-εξαρτώμενη αναστολή της ρ-ΜΕΚ, ακόμη αποτελεσματικά μπλοκάρει την ενεργοποίηση του ρ-ΑΚΤ σε Ser473 και αμβλύνεται το προηγουμένως παρατηρηθεί ενεργοποίηση του π-rpS6 προκαλούνται από την έκθεση PLX4032 (σύγκρινε με το Σχ. 3Α). Ωστόσο, mTOR αποκλεισμός ήταν ανεπαρκής για την εξασθένηση ρ-ERK ή επίπεδα ρ-ΑΚΤ Thr308 σε PLX4032-εξαρτώμενο τρόπο, ούτε να εξασθενεί τελείως επίπεδα ρ-rpS6 (Εικ. 5Α). Όπως και με μοναδικό παράγοντα

in vitro

μελέτες, η ενεργοποίηση π-rpS6 συσχετίζονται με μια μικρή εξασθένιση των επιπέδων DUSP6 και ελαφρά αύξηση του p-ERK σε υψηλότερες συγκεντρώσεις PLX4032. Παρ ‘όλα αυτά, σε συνδυασμό αναστολή της ρ-ΑΚΤ Ser473 και π-ΜΕΚ οδήγησε σε δραματικά μειωμένη ΤΚ1, τόσο σε πρωτεΐνη και το επίπεδο του mRNA. Με την παρουσία αυξημένων ρ27,

ΤΚ1

επίπεδα mRNA μειώθηκε δραματικά, με σημαντικές μειώσεις παρατηρήθηκαν σε συγκεντρώσεις PLX4032 τόσο χαμηλές όσο 10 ηΜ (Σχ. 5Α). Επιπλέον, υποδηλώνοντας ότι η δραστηριότητα ΑΚΤ ήταν υπεύθυνη για την μετα-μεταφραστική τροποποίηση και την υποβάθμιση του ρ27, με την παρουσία της αναστολής ρ-ΑΚΤ Ser473, πρωτεΐνη ρ27 ήταν δραματικά αυξημένα αλλά

ρ27

mRNA δεν ήταν (Εικ. 5C).

(Α) κηλίδας Western των COLO 205 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με PP242 (250 nM) και την αύξηση της PLX4032. Παρόμοια με απλού παράγοντα PLX4032, π-ΜΕΚ, αλλά όχι π-ΕΚΚ, ανεστάλη σε PLX4032-εξαρτώμενο τρόπο. Συνεπής με mTORC1 /mTORC2 αναστολή, π-ΑΚΤ Ser473, αλλά όχι π-ΑΚΤ Thr308, ανεστάλη. Σε αντίθεση με απλού παράγοντα PLX4032, η οποία οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση την ενεργοποίηση του ρ-rpS6, συνδυασμένη θεραπεία διατήρησαν τα επίπεδα ρ-rpS6 σε επίπεδα ουσιαστικά βασική γραμμή εκτός από την υψηλότερη συγκέντρωση PLX4032. Ομοίως, τα επίπεδα DUSP6 ήταν αντιστρόφως ανάλογη προς τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ-ΕΚΚ. Με συνδυασμό mTOR και

επίπεδα αποκλεισμό V600EBRAF, p27 και της πρωτεΐνης ΤΚ1 συσχετίζονταν αντίστροφα και επηρεάζεται δραματικά από την έκθεση PLX4032. (Β) Ομοίως,

ΤΚ1

mRNA μειώθηκε σημαντικά σε συγκεντρώσεις PLX4032 τόσο χαμηλά όσο 10 nM. (C) Παρά τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ27,

p27

mRNA ήταν ανεπηρέαστη από συνδυασμένη αναστολή mTOR-

V600EBRAF.

Η

Δεδομένου ότι το συνδυασμένο

αναστολή V600EBRAF-mTOR ήταν ανεπαρκής για την εξασθένηση ρ-rpS6, και σε συνδυασμό με την παρατήρηση ότι δραστικότητα ΡΙ3Κ και κατάντη σηματοδότησης έχει προταθεί ως μηχανισμός αντίστασης στην αναστολή BRAF σε καρκίνο του παχέος εντέρου [22] και το μελάνωμα [23], [24], αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της διπλής αναστολή PI3K-mTOR στην COLO 205 κύτταρα σε συνδυασμό με το

V600EBRAF αναστολή (Εικ. 6). COLO 205 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με PLX4032, BEZ235, ένα μικρό μόριο διπλής αναστολέας της ΡΙ3Κ και mTOR [25], ή τον συνδυασμό για 24 ώρες. Πράγματι, αναστέλλοντας τόσο δραστικότητα του mTOR, όπως μετράται με ρ-ΑΚΤ Ser473, και δραστικότητα ΡΙ3Κ, όπως μετράται με ρ-ΑΚΤ Thr308, παρουσία του PLX4032 οδήγησε σε υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης ρ27 και μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ΤΚ1. Αυτά τα αποτελέσματα οδήγησαν αξιολόγηση μας αυτού του συνδυασμού

in vivo

.

Single παράγων PLX4032 οδήγησε σε ενεργοποίηση των ρ-ΑΚΤ Ser473 μετά από 24 ώρες έκθεσης σε δύο συγκεντρώσεις (100 ηΜ, 1 μΜ).