Αφηρημένο

Ιστορικό

TGF-β παίζει ένα διπλό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου στον άνθρωπο. Κατά τα πρώτα στάδια των λειτουργιών καρκινογένεσης, ΤΟΡ-β ως καταστολέας όγκου. Κατά τη διάρκεια των τελευταία στάδια της ανάπτυξης του όγκου, ωστόσο, ΤΟΡ-β μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. Μια μετατόπιση στο /3 φωσφορυλίωση Smad2 από το καρβοξυτελικό άκρο στο συνδετήρα sites είναι ένα γεγονός κλειδί προσδιορισμό βιολογική λειτουργία του ΤΟΡ-β σε ορθοκολικό και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο των διαφορικών Smad2 /3 φωσφορυλίωση στο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα.

Μεθοδολογία

Η ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-Ρ-Smad2 /3C και αντισώματα /3L P-Smad2 διεξήχθη σε 130 δείγματα αδενοκαρκινώματος στομάχου ενσωματωμένες σε παραφίνη. Η σχέση μεταξύ P-Smad2 /3C και P-Smad2 /3L ανοσοϊστοχημική σκορ και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών αναλύθηκε. Real time PCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η έκφραση του mRNA της Smad2 και Smad3 σε καρκίνο και τον περιβάλλοντα ιστό μη-όγκου.

Principal Εκτίμηση

Καμία σημαντική P-Smad2L και /ή Ρ-Smad3L θετική χρώση ήταν ανιχνεύεται στην πλειονότητα των δειγμάτων (θετική χρώση σε 18/130 δείγματα). χρώση Θετικές P-Smad2 /3L δεν συσχετίστηκε με μείωση της καρβοξυτερματικής χρώση φωσφορυλίωση. Απώλεια της Ρ-Smad2C αξιοσημείωτα συσχετίζεται με το βάθος διείσδυσης του όγκου και την κακή διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Καμία συσχέτιση ήταν ανιχνεύσιμη μεταξύ P-Smad3C και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά του γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Ωστόσο, η ανάλυση συν-χρώση αποκάλυψε ότι η Ρ-Smad3C συν-εντοπισμένη με α-SMA και του κολλαγόνου Ι σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας μια πιθανή σχέση μεταξύ P-Smad3C και επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση του καρκίνου. Real Time PCR κατέδειξε μειωμένη έκφραση του mRNA της Smad2 σε γαστρικό καρκίνο, σε σύγκριση με τον περιβάλλοντα ιστό μη-όγκου σε 15/16 ασθενείς.

Συμπεράσματα

απώλεια της Ρ-Smad2C σφικτά συσχετίζεται με την εισβολή καρκίνου και κακή διαφοροποίηση σε γαστρικό καρκίνο. Σε αντίθεση με ορθοκολικό και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, κανονικά καρβοξυ-τερματική φωσφορυλίωση, αλλά όχι συνδετήρα φωσφορυλίωση, της Smad2 είναι κρίσιμη για γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Wu Υ, Li Q, Zhou Χ, Yu J, Mu Υ, Munker S, et al. (2012) μειωμένα επίπεδα Active SMAD2 συσχετίζονται με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10.1371 /journal.pone.0035684

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 6 Οκτωβρίου, 2011? Αποδεκτές: 20 Μάρτη 2012? Δημοσιεύθηκε: 23, Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Προεδρείο Υγείας της επαρχίας Zhejiang της Κίνας, 2009A065 (YJW)? Άλλο-Kröner Fresenius (H.L.W., Τ.Α.)? BMBF «Hepatosys» 0313082L, «Εικονική συκώτι» και «κυτταρική θεραπεία» 01GN0987 (Τ.Α.)? Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (Τ.Α.) και LA997 /5-1 (Τ.Α.)? και ο Dietmar Ηορρ Stiftung GmbH (Τ.Α.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο, κατέλαβαν τη δεύτερη στους άνδρες και η τέταρτη στις γυναίκες σε συχνότητα [1]. Η παθογένεση του καρκίνου του στομάχου συνδέεται με πολλαπλούς παράγοντες. Μεταξύ αυτών, απορύθμιση της μονοπατιών που σχετίζονται με αναπτυξιακές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-β (ΤΟΡ-β) σηματοδότησης, Wnt /β-κατενίνης, hedgehog και σηματοδότηση Notch, παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου αυτού. [2]

Ο ΤΟΡ-β οικογένειας μορίων, συμπεριλαμβανομένων των ισομορφών ΤΟΡ-β, ακτιβίνες και μορφογενετικές πρωτεΐνες οστού (ΒΜΡ), έχει σημαντικές λειτουργίες σε διάφορες φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές διεργασίες, π.χ. εμβρυϊκή ανάπτυξη, αυτοάνοσες ασθένειες, ίνωση και καρκίνος [3], [4]. ΤΟΡ-β μετάγει σήματα του διεγείροντας σχηματισμό ετερομερικά σύμπλοκα του ΤΟΡ-β τύπου Ι (ΤΟΡ-βRI) και τύπου II (ΤΟΡ-βRII) σερίνης /θρεονίνης κινάσης των υποδοχέων. Ενεργοποιημένο ΤΟΡ-βRI διαδίδεται σηματοδότησης από την πρόσληψη και φωσφορυλίωση του υποδοχέα-ρυθμίζονται-Smads (R-Smads, συμπεριλαμβανομένων των Smad2 και Smad3). Η φωσφορυλίωση του Ο-τερματικά υπολείμματα σερίνης στην R-Smads είναι ένα κρίσιμο στάδιο για την κανονική σηματοδότηση ΤΟΡ-β. Οι δύο πιο Ο-τερματικά υπολείμματα σερίνης στις σερίνη 465/467 σε Smad2 και σερίνη 423/425 σε Smad3 είναι φωσφορυλιωμένα, μαζί με ένα τρίτο κατάλοιπο μη φωσφορυλιωμένο σερίνη, σχηματίζουν ένα εξελικτικά συντηρημένο μοτίβο SSXS σε όλες R-Smads [5], [6]. Εκτός από Ο-τερματικό φωσφορυλίωση Smad2 /3 (Ρ-Smad2C και Ρ-Smad3C) από τον TGF-βRI, άλλες κινάσες, π.χ. c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) και Ras-συνδυασμένες κινάσες, φωσφορυλίωση αιτία της R-Smads σε θέσεις συνδετήρα γύρω σερίνη 249/254 σε Smad2 και σερίνη 208/213 σε Smad3 (Ρ-Smad2L και Ρ-Smad3L) [7 ], [8]. Η φωσφορυλιωμένη R-Smads σχηματίζουν ένα σύμπλοκο με κοινή Smad (Co-Smad? Smad4 σε θηλαστικά) και μεταφοράς εντός του πυρήνα για γονιδίου στόχου μεταγραφής [3]. Εκτός από R-Smad και συν-Smad, ο τρίτος τύπος Smad πρωτεΐνης είναι αναστολέας-Smad (Ι-Smad? Smad6 και Smad7). I-Smads Τα μεταγραφικά επάγεται από ΤΟΡ-β, υποδεικνύοντας μία μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης αυτής της οδού σηματοδότησης [4].

ΤΟΡ-β παίζει ένα διπλό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου [9], [10] . Στα αρχικά στάδια του καρκίνου, ΤΟΡ-β δρα ως καταστολέας όγκων με αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή με την προώθηση κυτταρική απόπτωση. Ωστόσο, στα τελευταία στάδια, ΤΟΡ-β υποστηρίζει την πρόοδον των όγκων όπως εισβολή των καρκινικών κυττάρων, τη διάδοση και το ανοσοποιητικό φοροδιαφυγής [9]. Επιπλέον, ΤΟΡ-β αναγνωρίζεται ευρέως ως μεσολαβητής επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) στον καρκίνο [11]. Αν και διαταραχές του ΤΟΡ-β /Smad σηματοδότηση είναι κεντρικής σημασίας για την καρκινογένεση στα περισσότερα όργανα, όγκων του προωθώντας αποτέλεσμα είναι άκρως εξαρτώμενη από το πλαίσιο. Για παράδειγμα, σηματοδότηση ΤΟΡ-β είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και ογκογόνο δραστηριότητα σε γλοίωμα και λευχαιμία, ενώ τα αποτελέσματα της σηματοδότησης ΤΟΡ-β σε βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού είναι αμφιλεγόμενη [12]. Μια μελέτη έδειξε ότι η αναστολή της οδού ΤΟΡ-β μέσω μιας κυρίαρχης αρνητικής ΤΟΡ-βRII αυξάνει το μέγεθος των αρχέγονων κυττάρων του μαστού και προάγει την ογκογένεση, υποδεικνύοντας μία καταστολή της καρκινογένεσης του μαστού αυτής της κυτοκίνης [13]. Αντίθετα, η Μάνη και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι η οδός TGF-β εμάς κρίσιμη για τη διατήρηση των ιδιοτήτων του καρκίνου του μαστού βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και ογκογόνο δράση μέσω της επαγωγής EMT [14].

Σε καρκίνο του στομάχου, πολυμορφισμοί μονού νουκλεοτιδίου ( SNPs) του ΤΟΡ-β σχετίζονται με την ευαισθησία σε σταδίου Ι και σταδίου II του γαστρικού καρκίνου [15], [16]. Τα επίπεδα του ΤΟΡ-β στον ορό έχουν αναφερθεί ότι συσχετίζονται σημαντικά με φλεβική εισβολή σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου [17]. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί του ΤΟΡ-β σηματοδότηση σε γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου είναι ακόμη άγνωστες. Επιπλέον, παραμένει ασαφές το πότε και πώς ΤΟΡ-β μεταμορφώνεται από ένα ογκοκατασταλτικό σε έναν προαγωγό όγκου κατά την διάρκεια καρκινογένεσης.

Πρόσφατα, μια μετατόπιση στην φωσφορυλίωση της Smad2 /3 από το C-τερματικό προς θέσεις συνδετήρα καταδείχθηκε ως ένα γεγονός κλειδί προσδιορισμό βιολογική λειτουργία του ΤΟΡ-β στον καρκίνο [18], [19], [20]. Προηγούμενες μελέτες που βασίζονται σε 12 χρόνια παρακολούθησης έδειξε ότι η χρόνια HBV /HCV ασθενείς με P-Smad2 /3L στους ιστούς του ήπατος είχαν υψηλότερο κίνδυνο την προώθηση στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) από εκείνες με P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Συνεπής με τα ευρήματα στο HCC, παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν σε καρκίνο του παχέος εντέρου [7], [22].

Για να εξεταστεί η συμβολή των διαφορικών Smad φωσφορυλίωσης προς την καρκινογένεση στο γαστρικό καρκίνο, ερευνήσαμε P-Smad2 /3C και P-Smad2 /επίπεδα 3L σε 130 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα στομάχου με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Αναλύσαμε δυναμικό συσχετίσεις μεταξύ διαφόρων σημείων της φωσφορυλίωσης του R-Smads και εισβολή, μετάσταση λεμφαδένα, διαφοροποίηση, και το στάδιο του καρκίνου του στομάχου.

Αποτελέσματα

Linker φωσφορυλίωση Smad2 /3 δεν σχετίζεται με γαστρικό καρκίνο

σε αντίθεση με τα προηγούμενα ευρήματα από καρκίνο του παχέος εντέρου και HCC [7], [8], [21], [22], δεν είχαμε εντοπίσει σημαντικές P-Smad2L ή /και P-Smad3L θετική χρώση σε γαστρικό ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Μόνο 18 από 130 ασθενείς έδειξαν ρ-Smad3L θετική χρώση κυρίως σε μη-καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση συνδετήρα σε θέσεις σερίνης της Smad2 /3 δεν είναι κρίσιμη σε γαστρικό καρκίνο.

διαφορετικά χαρακτηριστικά των επιπέδων στο γαστρικό καρκίνο Ρ-Smad2C και Ρ-Smad3C

118 από 130 γαστρικό ιστών έδειξε Ρ-Smad2C θετική χρώση, και 91 από 130 γαστρικών ιστών ήταν θετικά για χρώση P-Smad3C αντίστοιχα. Ξεχωριστά από Ρ-Smad2C θετική χρώση, η οποία εμφανίζει μόνο στον πυρήνα των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων (Εικ. 1Α), θετική χρώση Ρ-Smad3C καταδείχθηκε στον πυρήνα (59/130, Σχ. 1Β), στην μεμβράνη και ή /και στο κυτταρόπλασμα (73/130, Σχ. 1C) του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Επιπλέον, Ρ-Smad3C θεωρήθηκε από θετική χρώση σε ινοβλάστες που περιβάλλουν τα καρκινικά κύτταρα (81/130 και 91/130, Σχ. 1D).

Πρότυπα Ρ-Smad2C (Α) και Ρ-Smad3C (Β χρώση -D) IHC σε γαστρικό καρκίνο. πυρηνική χρώση (Β) Ρ-Smad3? (C) P-Smad3 μεμβράνης /χρώση πλάσμα? (D) χρώση ινοβλαστών P-Smad3.

Η

Μειωμένη P-Smad2C συσχετίζεται σημαντικά με το βάθος του όγκου (Τ) και τη διαφοροποίηση του καρκίνου (G) σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου

Μετρήσαμε χρώση P-Smad2C IHC όχι μόνο στον όγκο αλλά και σε περιβάλλοντες ιστούς μη-όγκου από 130 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. P-Smad2C θετική χρώση είτε του καρκίνου ή φυσιολογικά κύτταρα συσχετίζεται αντίστροφα με τη διαφοροποίηση του γαστρικού καρκίνου (τόσο

ρ

& lt? 0,0001, Πίνακας 1). Επιπλέον, η μειωμένη άνεση P-Smad2C IHC σε καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με το βάθος του όγκου (

ρ

& lt? 0,05, Πίνακας 1). επίπεδα Ρ-Smad2C σε φυσιολογικό ιστό, καθώς έδειξαν δυναμικό αντίστροφη συσχέτιση με εισβολή καρκίνου σε αυτούς τους ασθενείς (

σ

= 0,07, Πίνακας 1). Το σκορ P-Smad2C IHC είχε μειωθεί σημαντικά σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με το μη καρκινικούς ιστούς σε 77 από 130 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, εντός των καρκινικών ιστών, τα καρκινικά κύτταρα με ελάχιστα ατυπία παρουσίασαν μειωμένη χρώση P-Smad2C, σε σύγκριση με καλά διαφοροποιημένο αυτές (Εικ. 2). ανάλυση συσχέτισης Kendall-tau αποκάλυψε ένα δυνητικό συσχέτιση μεταξύ της μείωσης της χρώσης Ρ-Smad2C και τη μετάβαση από κανονική σε καρκινικά κύτταρα στο γαστρικό καρκίνο (

σ

= 0.05, Πίνακας 2), υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του Smad2 σηματοδότηση είναι ένα κρίσιμη καταστολέα του σχηματισμού και εξέλιξης του όγκου.

(α) του ανοσοποιητικού θετικότητα της Ρ-Smad2C μειώθηκε σημαντικά σε καρκινικούς ιστούς (

b

) όταν συγκρίνεται με τις γύρω φυσιολογικούς ιστούς (

a

) σε 77 από 130 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Εκπρόσωπος φωτογραφίες τραβήχτηκαν από έναν ασθενή με καρκίνωμα σφραγίδα δακτύλιο. (Β) Σε ιστούς όγκων, τα καρκινικά κύτταρα με φτωχή ατυπία (

e-h

) έδειξε μειωμένη χρώση P-Smad2C σε σύγκριση με εκείνους με ένα καλά διαφοροποιημένο φαινότυπο (

a-d

).

Απλή αναζήτηση

P-Smad3C απαντάται συχνά στον καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες

P-Smad3C IHC βαθμολογίας δεν παρουσιάζει σημαντική συσχέτιση με Τ /N /G /S του γαστρικού δείγματα καρκίνου (Πίνακας 1). Ωστόσο, Ρ-Smad3C θετική χρώση εμφανίστηκαν συχνά σε ινοβλάστες που περιβάλλουν τα καρκινικά κύτταρα σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (Σχ. 1).

Τα καρκινικά κύτταρα είναι επιθηλιακής προέλευσης και δεν εκφράζουν δείκτες μεσεγχυματικά, π.χ. α-SMA και του κολλαγόνου Ι εάν τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν δείκτες μεσεγχυματικών, είναι ενδεικτικά της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [11]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε α-SMA θετική χρώση σε καρκινικά κύτταρα σε 54 από 130 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (π.χ. ασθενής-1 στο Σχ. 3). Για να διευκρινιστεί η πιθανή σχέση μεταξύ του p-Smad3C και EMT, διερευνήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ χρώση π-Smad3C (καρκίνο και τον περιβάλλοντα ιστό μη-καρκίνου) και θετική χρώση α-SMA σε καρκινικά κύτταρα. Kendall-tau συντελεστές βαθμό συσχέτισης μεταξύ p-Smad3C IHC αποτελέσματα στον καρκίνο του /περιβάλλοντα βαθμολογίες ιστό μη-καρκίνου και α-SMA IHC στον καρκίνο είναι 0,14 (

σ

= 0,08) και -0.09 (

p

= 0,99), αντίστοιχα (Πίνακας 3). Για να επιβεβαιώσετε EMT σε αυτούς τους ασθενείς, πραγματοποιήσαμε συν-χρώση για σαλιγκαριών, ένα άλλο ειδικό δείκτη για την EMT, και το κολλαγόνο Ι /α-SMA στο γαστρικό ιστούς. Ομοεστιακό μικροσκόπιο απεκάλυψε συν-εντοπισμό των σαλιγκάρι και κολλαγόνο Ι (Σχ. 4Α) /α-SMA (Εικ. 4Β) σε ορισμένες γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι α-SMA θετικών γαστρικών καρκινικών κυττάρων, καθώς εμφανίζεται P-Smad3C θετική χρώση (Εικ. 4C). Εκτός από συν-εντοπισμό με α-SMA θετικών γαστρικών καρκινικών κυττάρων, συνεστιακή μικροσκοπία αποκάλυψε ότι η Ρ-Smad3C συν-εντοπισμένη με κολλαγόνο Ι σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα (Εικ. 4D). Περαιτέρω, Ρ-Smad3C θετική χρώση συν-εντοπισμένη με α-SMA και κολλαγόνο Ι όχι μόνο σε καρκινικά κύτταρα, αλλά επίσης και σε ινοβλάστες (Σχ. 4C-4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η Ρ-Smad3C μπορεί να συμβάλει στην ΕΜΤ του γαστρικού καρκίνου σε ορισμένους ασθενείς.

Αντιπροσωπευτικά εικόνες από δύο ασθενείς με καρκίνο του στομάχου show α-SMA και χρώση P-Smad3C στην περιοχή του καρκίνου (του όγκου) και τις περιβάλλουσες μη -cancer ιστούς (μη-όγκου).

Η

συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση καταδεικνύει συν-εντοπισμό των σαλιγκαριών και κολλαγόνο Ι (Α) /α-SMA (Β) σε ένα αντιπροσωπευτικό ασθενή με καρκίνο του στομάχου. Το ίδιο ασθενή επιπλέον οθόνες συν-εντοπισμό της Ρ-Smad3C και κολλαγόνο Ι (C) /α-SMA (D) σε γαστρικό καρκίνο.

Η

απώλεια της συνολικής έκφρασης Smad2 και Smad3 σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο

εκτός από τη μέτρηση της Ρ-Smad2 σε γαστρικό καρκίνο, χρησιμοποιήσαμε PCR πραγματικού χρόνου για να ανιχνεύσει την έκφραση του mRNA του Smad2 και Smad3 σε καρκίνο του στομάχου και των περιβαλλόντων ιστών μη-όγκου από 16 ασθενείς. 15 και 12 ασθενείς αντίστοιχα καταδείξει μειωμένη έκφραση του mRNA της Smad2 και Smad3 σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις γύρω φυσιολογικούς ιστούς (Εικ. 5). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι όχι μόνο ενεργοποιημένα Smad2 αλλά και την έκφραση του mRNA του συνολικού Smad2 μειώνεται κατά τη διάρκεια του γαστρικού καρκινογένεση.

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA του Smad2 (Α) και Smad3 (Β) σε 16 γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τους περιβάλλοντες ιστούς μη-όγκου (Νο 1-5: μεσαία διαφοροποιημένο καρκίνο? όχι. 6-13: κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο και Νο 14-16: σφραγίδα δακτυλίους των καρκινικών κυττάρων)

Η

Συζήτηση

ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα και HCC, μια μετατόπιση σε φωσφορυλίωση από καρβοξυ-άκρο έως συνδέτη περιοχές έχει προταθεί ως ένα κρίσιμο γεγονός που συνδέεται με το διακόπτη του ΤΟΡ-β από ένα καταστολέα του καρκίνου σε ένα ογκογόνο παράγοντα [ ,,,0],8], [18], [19], [20], [21], [22]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αυτή την πιθανή συσχέτιση του καρκίνου του στομάχου. Δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικά επίπεδα P-Smad2L και P-Smad3L σε 130 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. 112 από 130 ασθενείς δεν έδειξε Ρ-Smad2L ή Ρ-Smad3L χρώση στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η προτεινόμενη αλλαγή στην φωσφορυλίωση του R-Smad δεν μπορεί να συνεισφέρει στην ΤΟΡ-β μεσολάβηση καρκινογένεση σε αυτόν τον τύπο καρκίνου. Σε αντίθεση με P-Smad2 /3L, αμφότερα Ρ-Smad2C και Ρ-Smad3C θετική χρώση ανιχνεύθηκε στους περισσότερους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Kendall-tau ανάλυση βαθμό συσχέτισης αποκάλυψε ότι βαθμολογίας P-Smad2C IHC συσχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με το βάθος του όγκου (Τ) και τη διαφοροποίηση του καρκίνου (G).

Ο ρόλος της Smad2 κατά το σχηματισμό και την εξέλιξη των διαφορετικών τύπων καρκίνου παραμένει αμφιλεγόμενη . Σύμφωνα με την τρέχουσα εύρημα, προηγούμενες μελέτες σχετικά με οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου, καρκίνο του μαστού και καρκίνο του παχέος εντέρου έδειξαν ότι η απώλεια της έκφρασης Smad2 συσχετίζεται με την ανάπτυξη όγκου και κακή πρόγνωση [23], [24], [25], [26]. Πρόσφατα, Hoot και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι Smad2, αλλά δεν Smad3, ήταν συχνά χάνονται σε 83 ασθενείς με καρκίνωμα του δέρματος πλακωδών κυττάρων. Περαιτέρω, οι ποντικοί με κερατινοκυττάρων-ειδική διαγραφή Smad2 εμφανίζεται επιταχυνόμενη σχηματισμό και κακοήθη εξέλιξη των χημικά επαγόμενων όγκων δέρματος ποντικού σε σύγκριση με τα ποντίκια άγριου τύπου [27]. Ωστόσο, σε μια μελέτη 52 ασθενών με γλοίωμα, μια θετική βαθμολογία P-Smad2 IHC αναφέρθηκε ότι συσχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των γλοιωμάτων και φτωχή πρόγνωση [28]. Πριν από την παρούσα μελέτη, Σίντο και οι συνεργάτες μετριέται χρώση P-Smad2C σε 135 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Βρήκαν ότι τα επίπεδα P-Smad2C ήταν υψηλότερα σε φτωχά διαφοροποιημένο καρκίνο σε σύγκριση με καλά διαφοροποιημένο αυτά [29]. Δεν είναι ακόμα σαφές γιατί υπάρχουν εντελώς αντίθετες αποτελέσματα στον καρκίνο του στομάχου.

Στην κανονική σηματοδότηση TGF-β, ενεργοποιείται TGF-βRI προκαλεί συνήθως καρβοξυ-τερματική φωσφορυλίωση τόσο Smad2 και Smad3. Ενεργοποιημένος Smad2 και Smad3 παίζουν διαφορετικούς ρόλους στην κυτταρική ανάπτυξη, διαφοροποίηση και άλλες βιολογικές λειτουργίες [30]. Στο ήπαρ, Smad2 είναι κρίσιμη στην μεσολάβηση ανάπτυξης και διαφοροποίησης των ηπατοκυττάρων, ενώ Smad3 διαδραματίζει καίριο αποτέλεσμα στο μορφολογικές και λειτουργικές ωρίμανση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων [31], [32]. Στον καρκίνο, είναι αμφιλεγόμενο εάν διάσπαση του γονιδίου Smad3 συμβάλλει ογκογένεση. Zhu ανέφεραν ότι Smad3-ανεπαρκή ποντίκια αναπτύσσουν καρκίνωμα του παχέος εντέρου [33]. Ωστόσο, άλλες μελέτες που χρησιμοποιούν Smad3-ανεπαρκή ποντίκια πρότεινε ότι η απώλεια της Smad3 από μόνη της δεν είναι επαρκής για να κινήσει ογκογένεση [34], [35], [36], [37]. Σε γαστρικό καρκίνο, Han βρήκε χαμηλά επίπεδα Smad3 σε 3 από τους 8 ασθενείς και σε εννέα ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [38]. Εισαγωγή ενός φορέα Smad3 σε κυτταρικές σειρές γαστρικού αποκατασταθεί ΤΟΡ-β απόκριση. Περαιτέρω, η έγχυση Smad3 εκφράζουν γαστρικών κυττάρων σε γυμνά ποντίκια έδειξαν καθυστερημένη ογκογένεση όταν σύγκριση με τους μάρτυρες, υποδεικνύοντας μία συσχέτιση της απώλειας Smad3 με την καρκινογένεση [38]. Στην παρούσα μελέτη, δεν βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της χρώσης P-Smad3C στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και την εισβολή του καρκίνου, τη διαφοροποίηση και το στάδιο. Ξεχωριστά από Ρ-Smad2C, το οποίο εκφράζεται μόνο σε πυρήνες των κυττάρων, Ρ-Smad3C θετική χρώση είναι ανιχνεύσιμη στον πυρήνα, στη μεμβράνη και στο κυτόπλασμα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Η βιολογική σημασία των διαφορετικών προτύπων χρώσης Ρ-Smad3C στα καρκινικά κύτταρα είναι προς το παρόν παραμένει άγνωστη.

EMT των καρκινικών κυττάρων αποτελεί προϋπόθεση για την πρόοδο σε προχωρημένη μεταστατικούς όγκους [11]. Έχει αναγνωριστεί ότι ο TGF-β είναι ένας σημαντικός παίκτης στην EMT. Smad3, αλλά δεν Smad2, αποτελεί βασικό μεσολαβητή σε TGF-β εξαρτάται EMT [39]. Για παράδειγμα, ο ΤΟΡ-β αποτυγχάνει να διεγείρει EMT σε πρωτογενή σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από νεφρούς Smad3-ανεπαρκή ποντίκια [40]. Η αναστολή της ΤΟΡ-β σηματοδότηση από Ki26894, έναν αναστολέα ΤΟΡ-βRI, μειωμένη εισβολή και EMT του σκιρώδης γαστρικού καρκίνου

in vitro

[41]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα μέρος του γαστρικού καρκίνου κύτταρα εκφράζουν δείκτες EMT, π.χ. Σαλιγκάρι, το κολλαγόνο Ι και α-SMA. Συν-εντοπισμό της Ρ-Smad3C με α-SMA /κολλαγόνου Ι βρίσκεται σε ένα σημαντικό υποσύνολο των ασθενών. Επιπλέον, α-SMA θετική χρώση σε καρκινικά κύτταρα έχει δυνατότητες συσχέτιση με σκορ P-Smad3C IHC των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι τους περιβάλλοντες ιστούς μη καρκινικά. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η P-Smad3C θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην EMT του καρκίνου του στομάχου.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι Smad2 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής για να υπερασπιστεί γαστρικά κύτταρα από την πρόοδο προς την κατεύθυνση κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, Smad3 δεν συνδέεται άμεσα με τα χαρακτηριστικά του γαστρικού καρκίνου, ωστόσο, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι μπορεί να παίζει ένα ρόλο στον καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες και EMT του γαστρικού καρκίνου κυττάρων.

Μέθοδοι

οι ασθενείς

Χειρουργική δείγματα εξετάστηκαν από ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του στομάχου στο Τμήμα Γενικής Χειρουργικής, το πρώτο Affiliated Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα από το 2003 έως το 2009. δείγμα ιστού γαστρική συλλέχθηκαν κατά τις χειρουργικές επεμβάσεις τεμαχίζεται το γαστρικό καρκίνο. Τα συλλεγόμενα ιστοί που περιλαμβάνονται όγκων και των γύρω περιοχών μη-όγκου (ιστοί τουλάχιστον περισσότερο από 5 cm μακριά από τον όγκο). Ένα μέρος των ιστών μονιμοποιήθηκαν με 4% σε φορμαλδεΰδη και εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη για ιστολογία και IHC μέτρηση. Παρέμεινε φρέσκα ιστοί τέθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως για τη μέτρηση του mRNA. Ένα σύνολο από 130 ζεύγη γαστρικού ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και των γύρω ιστών μη-όγκου εγγραφεί. Παθολογική διάγνωση και ταξινομήσεις υπολογίστηκαν σύμφωνα με την ταξινόμηση των όγκων-κόμβο-μετάσταση (TNM) υποστηρίζεται από τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (έβδομη έκδοση) [42]. Τα βασικά χαρακτηριστικά των εγγεγραμμένων ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Το πρωτόκολλο της μελέτης προσαρμόστηκε στις ηθικές οδηγίες της Διακήρυξης του Ελσίνκι (1975). Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη.

Η

Αντισώματα

Κουνέλι πολύκλωνα αντισώματα εναντίον P-Smad2C (Ser 465/467), Ρ-Smad3C (ser 423 /425), Ρ-Smad2L (Ser 250/255), και Ρ-Smad3L (Ser 208/213) έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες [43], [44]. Ποντικού αντι-ανθρώπινης α-SMA (M0851), πολυκλωνικά αντι-ΣΑΛΙΓΚΑΡΙΟΥ (ab-17732), και μονοκλωνικό αντι-κολλαγόνου Ι (C2456) αντισωμάτων αγοράστηκαν από την ϋΑΚΟ, Abcam και Sigma, αντίστοιχα.

ανοσοϊστοχημεία (IHC )

Μετά την εξέταση των H & amp? E-βάφονται διαφάνειες από 130 συμμετείχαν ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, επιλέχθηκαν αντιπροσωπευτικά μπλοκ παραφίνης για κάθε ασθενή για το τμήμα. Τα πλακίδια αφαιρείται η παραφίνη με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε μια σειρά αραίωσης διαβαθμισμένη αιθανόλη σε απεσταγμένο νερό. Το αντιγόνο ανάκτηση έγινε με επεξεργασία με μικροκύματα σε ρυθμιστικό EDTA (1 mmol, ρΗ 8,0). Οι πλάκες στη συνέχεια κατεργάζεται με 3% Η

2O

2 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS τρεις φορές, τα πλακίδια επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι Ρ-Smad2C (1:100), Ρ-Smad3C (1:100), Ρ-Smad2L (1:50), Ρ-Smad3L (1:50 ), και α-SMA (1:200) αντίστοιχα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές. Μετά την πλύση, επωάστηκαν με EnVision υπεροξειδάση (Dako) -σημασμένου αντι-κουνελιού ή αντίσωμα αντι-ποντικού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. δράση υπεροξειδάσης ανιχνεύθηκε με διαμινοβενζιδίνη (DAB). Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Η ανοσοαντιδραστικότητα οπτικοποιήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός

Για ημι-ποσοτική ανάλυση, τα χρωματισμένα τμήματα ιστού αξιολογήθηκαν σε μια κλίμακα 4-σημείων ως εξής: θετική κυτταρική μετρήσεις, οι βαθμοί 0-3 (0, δεν θετικά κύτταρα? 1, & lt. ? 25% θετικά κύτταρα? 2, 25% -50% θετικά κύτταρα? 3, & gt? 50% θετικά κύτταρα)? ένταση θετική χρώση, οι βαθμοί 1-3 (1, αδύναμη θετική χρώση, συνήθως κίτρινο? 2, ισχυρή θετική χρώση, συνήθως καφέ? 3, πολύ ισχυρή θετική χρώση, συνήθως σκούρο καφέ προς μαύρο). Το τελικό σκορ του ανοσοποιητικού χρώση υπολογίστηκε ως αριθμός × ένταση.

ανοσοφθορισμού χρώση

Οι πλάκες αφαιρείται η παραφίνη με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη μέχρι το αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη με κατεργασία μικροκυμάτων σε ρυθμιστικό EDTA (1 mmol, ρΗ 8,0). Οι πλάκες στη συνέχεια κατεργάζεται με 3% Η

2O

2 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, και τα δύο πρωτογενή αντισώματα, κουνελιού αντι-Ρ-Smad3C /σαλιγκάρι και ποντικού αντι-α-SMA /κολλαγόνου Ι, εφαρμόσθηκαν σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, δευτερογενή αντισώματα, Alexa633-κουνελιού ανοσοσφαιρίνη αντι-ποντικού G και Alexa488-γαϊδάρου ανοσοσφαιρίνη αντι-κουνελιού G (Molecular Probes /Invitrogen, Καρλσρούη, Γερμανία), εφαρμόστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα τοποθετούνται χρησιμοποιώντας Dako-Cytomation φθορισμού Τοποθέτηση Medium. Οι πλάκες επιθεωρήθηκαν και οι φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica, Heidelberg). Τμήματα χωρίς πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες.

πραγματικού χρόνου PCR

Το συνολικό RNA καθαρίστηκε από το γαστρικό ιστούς με την Ύπατη Αγνό κιτ απομόνωσης RNA (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και η συγκέντρωση μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά. cDNA συντέθηκε από 1 μα RNA με την Transcriptor First Strand κιτ σύνθεσης cDNA (Roche Diagnostics). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με ένα σύστημα ανιχνεύσεως αλληλουχίας ABIPrism 7700 (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας ένα κύριο μείγμα TaqMan PCR καθολικής αριθ AmpErase UNG (μέρος αρ. 4324018). Οι ακόλουθες αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν: Smad2 (εμπρός: CAAACCAGGTCTCTTGATGG? Αντίστροφη: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (προς τα εμπρός: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG? Αντίστροφη: GAAGGCGAACTCACACAGC) και πεπτιδυλπρολύλ ισομεράση Α (γονίδιο καθαριότητας? Μέρος δεν Mm02342429_g1..). Όλα τα αντιδραστήρια αγοράσθηκαν από την Applied Biosystems. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν υπό τις ακόλουθες συνθήκες: αρχική μετουσίωση επί 2 λεπτά στους 50 ° C και για 10 λεπτά στους 95 ° C που ακολουθείται από 40 κύκλους των 15s στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Τα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της συγκριτικής όριο του κύκλου.

Στατιστική Ανάλυση

Για την αξιολόγηση συσχέτιση μεταξύ επιλεγμένων ανοσοϊστολογικής δεικτών και παραμέτρων του όγκου, Kendall-tau ανάλυση βαθμό συσχέτισης διεξήχθη χρησιμοποιώντας SAS έκδοση 9.2 (Cary, NC, USA). Ένα

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική