Αφηρημένο

Αν και αδρανοποίησης πλαισίου μεταλλάξεις στο

Μετασχηματισμός αυξητικού παράγοντα τύπου βήτα 2

(

TGFBR2

) γονιδίων θεωρούνται ως οδηγοί των μικροδορυφόρων ασταθής (MSI) ορθοκολικό ογκογένεση, οι επακόλουθες μεταβολές της κατάντη proteome στόχος δεν επιλυθεί πλήρως. Εφαρμόζοντας μια προσέγγιση σήμανσης πρωτεϊνών χημεία κλικ αυτό σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας σε ένα παχέος μοντέλο καρκινικής κυτταρικής σειράς MSI, εντοπίσαμε 21

de novo

συντίθενται οι πρωτεΐνες που εκφράζονται διαφορικά κατά την ανασύσταση έκφραση TGFBR2. Ένα υποψήφιο γονίδιο, ο ΤΟΡ-β οικογένεια διαφοροποίησης Growth μέλος παράγοντα-15 (GDF-15), παρουσίασαν TGFBR2 εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω προκαλώντας αυξημένη ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών επιπέδων πρωτεΐνης. Ως ένα νέο γονίδιο στόχο TGFBR2 μπορεί να παρέχει μια σύνδεση μεταξύ του κλάδου TGF-β και το υποκατάστημα BMP /GDF της SMAD μεσολάβηση σηματοδότηση

Παράθεση:. Lee J, Fricke F, Warnken U, Schnolzer Μ, Kopitz J, Gebert J (2015) Ανασύσταση του TGFBR2-σηματοδότηση μέσω Προκαλεί Προς τα πάνω ρύθμιση της GDF-15 σε κύτταρα HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (6): e0131506. doi: 10.1371 /journal.pone.0131506

Επιμέλεια: Lu-Zhe Sun, Πανεπιστήμιο του Τέξας Κέντρο Διάδοσης Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 25η Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 3 Ιουνίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 26, Ιουνίου του 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η οικονομική στήριξη παρέχεται από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (GE592 /6-2) στο JK και JG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) μπορεί να προκύψει μέσα από τρεις μεγάλες πορείες, που χαρακτηρίζεται από χρωμοσωμική αστάθεια [1], CpG φαινότυπο νησί υπερ-μεθυλίωση [2] και επισκευή ασυμφωνία (MMR) -deficiency [3, 4]. Όγκους που έχουν χάσει την κανονική λειτουργία MMR εμφανίσει ένα υψηλό επίπεδο μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) συνήθως αναγνωρίζονται ως μεταλλάξεις εισαγωγής /διαγραφής σε σύντομο επαναλήψεις μονονουκλεοτιδίου (μικροδορυφόρων) που βρίσκονται σε περιοχές του γονιδίου κωδικοποίησης και μη-κωδικοποίησης. Περισσότερο από το 90% της MSI του παχέος εντέρου έχουν αποκτήσει σωματικές μεταλλάξεις εισαγωγής /διαγραφής στην επανάληψη κωδικοποίησης μονονουκλεοτιδίου (Α10) στο εξόνιο 3 του

Μετασχηματισμός αυξητικού παράγοντα τύπου βήτα 2

(

TGFBR2

) γονίδιο που οδηγεί σε μεταγραφική πλαισιοτροποποιήσεις και μειωμένη υποδοχέα σηματοδότησης [5, 6]. Η πρωτεΐνη TGFBR2 είναι μία κινάση σερίνης-θρεονίνης η οποία, κατά την πρόσδεση του συνδέτη ΤΟΡ-SS1 του, προσδίδει κανονικού SMAD μεσολάβηση σηματοδότηση [7]. σηματοδότηση ΤΟΡ-β διαδραματίζει βασικό ρόλο στην κανονική λειτουργία των επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου, αλλά ο ρόλος του στην ογκογένεση φαίνεται να είναι αμφιλεγόμενη [8, 9]: στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του όγκου, ΤΟΡ-β δρα ως καταστολέας της κλασικής όγκου [10] , ενώ προωθεί EMT, τη μετανάστευση και την μετάσταση σε μεταγενέστερα στάδια της εξέλιξης του όγκου [11]. Αυτές οι φαινομενικά παράδοξη βιολογικά χαρακτηριστικά προσδιορίζονται από έναν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών στόχων των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται σε ΤΟΡ-β-εξαρτώμενο τρόπο [12].

Οι περισσότερες από αυτές

bona fide

κατάντη στόχοι της σηματοδότηση TGF-β έχουν εντοπιστεί από προβολές στο μεταγραφικό επίπεδο, ενώ μελέτες επικεντρώνονται στις TGF-β-εξαρτώμενη πρωτεομική αλλαγές στα κύτταρα όγκου του ορθού είναι μάλλον περιορισμένες και πρωτεομική προφίλ έκφρασης δεν μπορεί πάντα να προέρχονται από τα πρότυπα μεταγραφικό. Αν και το σηματοδοτικό μονοπάτι TGF-β έχει ήδη χαρακτηριστεί εκτενώς, οι επιπτώσεις της στη δυναμική έκφραση της πρωτεΐνης που συμβάλλουν στη βιοχημική /πρωτεομική φαινοτύπου των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου δεν έχει ακόμη διερευνηθεί πλήρως.

Επειδή τα καρκινικά κύτταρα γενικά και MSI καρκινικά κύτταρα ειδικότερα έχουν αποκτήσει έναν περιορισμένο αριθμό μεταλλάξεων οδηγού που συμβάλλουν στην ανάπτυξη όγκων μεταξύ ενός μεγάλου αριθμού άσχετων μεταλλάξεων των επιβατών, οριοθέτηση των πολύπλοκων πρωτεομική αλλαγές με συγκεκριμένες μεταλλάξεις οδηγός είναι μια μεγάλη πρόκληση. Για να κατανοήσουμε πώς δυσλειτουργία ένα μόνο μέλος του μονοπατιού σηματοδότησης TGF-β, η TGFBR2, μεταβάλλει την κυτταρική πρωτεομική και glycomic τοπίο στην MSI καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, έχουμε ήδη δημιουργήσει ένα σύστημα MSI κυτταρική σειρά μοντέλο που επιτρέπει δοξυκυκλίνη (Dox) – ρυθμιζόμενη ανασύσταση της έκφρασης TGFBR2 και μεταγωγής σήματος σε ένα ισογονιδιακές φόντο [13].

Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο κυτταρική σειρά HCT116-TGFBR2 σε συνδυασμό με μια προσέγγιση χημεία κλικ για συγκεκριμένες απομόνωση του

de novo

proteome [14] και η ανάλυση μετέπειτα φασματομετρία μάζας (MS), εντοπίσαμε έναν περιορισμένο αριθμό πρωτεϊνών που αποδείχθηκε να εκφραστεί πρόσφατα ή των οποίων η σύνθεση, καταργούνται από την έκφραση TGFBR2. Ένα από αυτά τα υποψήφιων στόχων, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση παράγοντας-15 (GDF-15) έδειξε TGFBR2 εξαρτώμενη μεταγραφική αυξητική ρύθμιση που συσχετίζονται με αυξημένα επίπεδα ενδοκυτταρικής και εκκρινόμενης πρωτεΐνης. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η GDF-15 είναι ένα ΤΟΡ-β-αποκρίνεται γονίδιο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Life Technologies , Karlsruhe, Germany) συμπληρωμένο με 10% FBS (Life Technologies, Karlsruhe, Germany), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Life Technologies, Karlsruhe, Germany) χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες. Η παραγωγή των δοξυκυκλίνης επαγόμενου κυτταρικών κλώνων HCT116-TGFBR2 αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, η άγριου τύπου

TGFBR2

γονίδιο ενσωματώθηκε στο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική σειρά HCT116, που φιλοξενεί διαλληλόμορφο απενεργοποίησης

TGFBR2

πλαισίου μεταλλάξεις, χρησιμοποιώντας ανασυνδυάση μεσολάβηση ανταλλαγή κασέτα (RMCE) με αποτέλεσμα σε δύο ανεξάρτητες κυττάρων κλώνους, # 5 και # 22, με διαφορετικές μοναδική θέση ενσωμάτωσης αντίγραφο.

μεταβολική επισήμανση

για μεταβολική σήμανση πειράματα, 4×10

6 κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 10 cm. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε και τα κύτταρα είτε αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία 0,5 μg /ml δοξυκυκλίνης (Sigma, Taufkirchen Γερμανία). Μετά από 11 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (Life Technologies, Karlsruhe, Germany), που καλλιεργούνται για 30 λεπτά σε ελεύθερο μεθειονίνης μέσου RPMI 1640 (Sigma, Taufkirchen Γερμανία) και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 ng /ml ΤΟΡ-SS1 (Cell Signaling, Danvers, USA) και το αντιδραστήριο επισήμανσης (40 μΜ L-Azidohomoalanine (ΑΗΑ) ή 4,625 MBq [

35S] -L-μεθειονίνη) σε παρουσία ή απουσία Dox για 4 ώρες (πρωτεΐνη λύμα) ή 24 ώρες (εκκρινόμενες πρωτεΐνες ). Ως μάρτυρας για την ταυτοποίηση μόνο AHA-επισημασμένο νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν εις τριπλούν σε απουσία AHA και σε παρουσία 200 μg /ml κυκλοεξιμιδίου (CHX), ενός αναστολέα της βιοσύνθεσης πρωτεΐνης. Για την ανάλυση της επίδρασης του GDF-15 στη pSmad2 σηματοδότηση, 100 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου GDF-15 (G3046? Sigma, Taufkirchen, Γερμανία) προστέθηκε στα κύτταρα για 1 ώρα. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3χ με PBS, συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν τουλάχιστον 10 λεπτά στα 1000 g στους 4 ° C σε PBS που περιέχει 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Mannheim, Germany). Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν απευθείας σε ρυθμιστικό λύσης. Μέσο του ραδιενεργού-επισημασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες, φυγοκεντρείται στα 1000 g στους 4 ° C για τουλάχιστον 10 λεπτά και το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε GDF-15 ανοσοκαθίζησης.

Click-iT Αντίδραση

Μετά την επισήμανση του μεταβολισμού ΑΗΑ (C10102? Life Technologies, Karlsruhe, Germany), σφαιρίδια κυττάρου υπέστησαν λύση με 100 μΐ 1% SDS σε 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8, συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ, κατεργασία με υπερήχους για 30 s και επωάζεται τουλάχιστον 30 λεπτά στους 4 ° C ενώ περιστρέφεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Μετά από φυγοκέντρηση στους 4 ° C για 30 λεπτά σε 12,000 g, συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories GmbH, Μόναχο, Γερμανία). 200 μα πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε για να αντιδράσουν με 40 μΜ βιοτίνη Ακετυλενικές σε DMSO (B10185? Life Technologies, Karlsruhe, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά μεθανόλη /χλωροφόρμιο (4: 1) καταβύθιση, τα ιζήματα επαναδιαλυτοποιήθηκε σε 200 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA, κατεργασία με υπερήχους για 30 s και περιστρέφονται επί μία νύκτα στους 4 ° C. Για να αφαιρέσετε αδιάλυτες υλικό, το δείγμα πρωτεΐνη φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C για 20 λεπτά σε 12,000 g. Το υπερκείμενο επωάστηκε στη συνέχεια σε ένα περιστροφέα με πολτό 80 μΙ επικαλυμμένων με στρεπταβιδίνη μαγνητικών σφαιριδίων (Dynabeads MyOne Streptavidin Τ1, Life Technologies, Karlsruhe, Germany), που είχε πλυθεί 3χ με PBST (PBS /0.01% Tween 20). Μετά από 2 ώρες στους 4 ° C, τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές με 1 ml PBST που περιέχει 2% SDS ακολουθούμενη από τελικές πλύσεις με PBS και 40 mM διττανθρακικού αμμωνίου.

Ανάλυση φασματομετρίας μάζας

Για φασματομετρία μάζας , τα δείγματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, σφαιρίδια πρωτεΐνης φορτωμένα μειώθηκαν, αλκυλιώνεται και trypsinysed στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την προσθήκη του TFA, το δείγμα αναλύθηκε με nanoLC ESI-MS /MS σε φασματογράφο μάζας LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Καρλσρούη, Γερμανία). Οι MGF αρχεία που δημιουργούνται από το λογισμικό Xcalibur (Thermo Scientific, Καρλσρούη, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για τις αναζητήσεις βάσεων δεδομένων με τη μηχανή αναζήτησης ΜΑΣΚΩΤ (Matrix Science? Έκδοση 2.4) κατά τη βάση δεδομένων SwissProt (SwissProt έκδοση 2013_02 (539.165 ακολουθίες? 191.456.931 υπολείμματα)) με η ταξινόμηση οριστεί σε άνθρωπο. Οι υποψήφιες πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν ως εκφράζονται διαφορικά (TGFBR2 ανεπάρκεια ή-καλά) εάν ανιχνευθεί σε τουλάχιστον μία από τις τρεις βιολογικές επαναλήψεις σε κάθε μία από τις δύο κυτταρικών κλώνων (# 5 και # 22) αλλά όχι σε γονικά HCT116-Tet-On κύτταρα.

ποσοτική πραγματικού χρόνου (qRT) -PCR

1 μg ολικού RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy κιτ (Qiagen, Hilden, Germany) και αντίστροφη μεταγραφή με ολιγο-dT εκκινητές και SuperScript II αντίστροφη μεταγραφάση σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Real-time PCR ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας PowerSYBR Πράσινη Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία) και ειδικούς εκκινητές για TGFBR2 (για: 5′-CGGCTCCCTAAACACTACCAA-3′, rev: 5′-AACAAATTGGACTAATCCGGA-3′) και GDF-15 (για: 5′-AAGATTCGAACACCGACCTC-3′, 5′-AGAGATACGCAGGTGCAGGT-3′). Εις τριπλούν διαφορετικά δείγματα cDNA (- /+ Dox) αναλύθηκαν στην StepOnePlus θερμο-κυκλοποιητή (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με StepOne v2.1 Software (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε ως προς την έκφραση του γονιδίου αναφοράς

υδροξυμεθυλοχολάνη Συνθάσης

(

HMBS

) (για: 5′-CACCACAGGGGACAAGATTC-3′, rev: 5`-GTGAACAACCAGGTCCACTTC-3′).

ανάλυση Western blot

προϊόντα λύσης RIPA πρωτεϊνών και ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Για ανοσοστύπωση, χρησιμοποιήθηκαν 30-60 μg πρωτεΐνης. Πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως ακολούθως: ποντίκι anti-TGFBR2 (SC-17799? Santa Cruz, Dallas, USA? 1: 500, 4 ° C, όλη τη νύκτα)? ποντικού αντι-SS-ακτίνης (κλώνος 4? ΜΡ Biomedicals, Solon, USA? 1: 20.000, RT, 30 λεπτά)? κουνελιού αντι-GDF-15 (HPA011191? Sigma, Taufkirchen Γερμανία? 1: 500, 4 ° C, όλη τη νύκτα)? αντι-φωσφο-Smad2 και αντι-Smad2 (Ser465 /467) και (86F7)? Κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής? 1: 1000, 4 ° C, όλη τη νύκτα). Τα στυπώματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με δευτερογενή αντισώματα: αντι-ποντικού προβάτου-IgG HRP (1: 5.000? GE-Healthcare, Μόναχο, Γερμανία) ή κατσίκας αντι-κουνελιού-IgG HRP (1: 2.500? Promega, Madison, USA ). Η ανίχνευση έγινε είτε πραγματοποιείται με τυπική διαδικασία με χρήση Amersham Hyperfilm ECL ή ChemiDoc MP Σύστημα (Bio-Rad Laboratories GmbH, Μόναχο, Γερμανία).

GDF-15 ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ)

Μετά από [

35S] -L-μεθειονίνη επισήμανση (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, USA), το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 200 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA που περιείχε 2χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης που λαμβάνεται όπως περιγράφεται παραπάνω. Για GDF-15 ανοσοκατακρήμνιση, 0,3 ml του λύματος που περιέχει 1.8 mg πρωτεΐνης ή 5 ml υπερκειμένου καλλιέργειας περιστρέφονται με 1,5 μg GDF-15 αντίσωμα (HPA011191? Sigma, Taufkirchen, Γερμανία) και 2χ αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ όλη τη νύκτα στους 4 ° C. 25 μΙ πρωτεΐνης Α /Ο πολτός αγαρόζη (Oncogene Science, Uniondale, USA) πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό RIPA και στη συνέχεια επωάζονται με το κυτταρόλυμα ή υπερκείμενο καλλιέργειας και το αντίσωμα για 2 ώρες με περιστροφή στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 5 χ με 500 μΙ RIPA ρυθμιστικού και εκλούστηκε με 2χ 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος 1χ SDS-δείγμα (106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris Base, 2% SDS, 10% γλυκερόλη, 0.51 mM EDTA) στους 99 ° C για 5 min σε 800 rpm. Τα δείγματα στη συνέχεια αναμίχθηκαν με 10 ml κοκτέιλ σπινθηρισμού και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή υγρού σπινθηρισμού (TRI-CARB 2900TR? Packard, PerkinElmer, Waltham, Η.Π.Α.).

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι επαναλήψεις σε 96-πηγαδιών μία ημέρα πριν την προσθήκη των ακόλουθων αντιδραστηρίων: 0,5 μg /ml Dox, 10 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-SS1 και 100 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου GDF-15. Μετά από 6 ημέρες, δοκιμασίες πολλαπλασιασμού MTS διεξήχθη με το CellTiter 96 Υδατικό κιτ (Promega, Madison, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φασματοφωτομετρικές μετρήσεις έγιναν με τη χρήση του αναγνώστη μικροπλακός GENIOS (Tecan Group Ltd., Männedorf, Ελβετία) και την τιμή της απορρόφησης του ελεύθερου κυττάρων μέσο αφαιρείται από τις τιμές απορρόφησης των δειγμάτων.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

3.1. Προσδιορισμός των

de novo

συντίθεται TGFBR2 εξαρτώμενη από τις πρωτεΐνες-στόχους

Για να διασφαλιστεί TGFBR2-εξαρτώμενη ρύθμιση, έχουμε ήδη δημιουργήσει ένα μοντέλο κυτταρική γραμμή, που αναφέρεται στο παρόν ως HCT116-TGFBR2 [13]. Εν συντομία, το HCT116 κυτταρική σειρά μεταλλάσσεται και για τα δύο αλληλόμορφα για

TGFBR2

οδηγεί στην απουσία της πρωτεΐνης πλήρους μήκους. Οι δύο καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές HCT116-TGFBR2 (κλώνος # 5 και # 22), όμως, περιέχει ένα μόνο αντίγραφο ολοκληρωμένο άγριου τύπου

TGFBR2

γονίδιο, το οποίο εκφράζεται μόνο παρουσία δοξυκυκλίνης (Dox). ανάλυση χρόνου-φυσικά αποκάλυψε ότι 11-12h θεραπεία Dox αυτών των κυττάρων ήταν αρκετή για να κορυφωθεί επίπεδα TGFBR2 πρωτεΐνης (S1 Σχήμα).

Για να προσδιοριστεί η TGFBR2 εξαρτώμενη από

de novo

πρωτέωμα, τόσο οι κλώνοι HCT116-TGFBR2 (# 5 και # 22) έχουν εκτεθεί στον συνδέτη ΤΟΡ-SS1 παρουσία (TGFBR2-καλά) ή απουσία (TGFBR2 ανεπάρκεια) της δοξυκυκλίνης και εν τω γεννάσθαι πρωτεΐνες σημάνθηκαν μεταβολικά με το υποκατάστατο μεθειονίνη L- Azidohomoalanine (ΑΗΑ). Μετά κλικ-it-μεσολάβηση βιοτινυλίωση, επισημασμένες πρωτείνες συνελήφθησαν από επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια και αναλύθηκε με φασματομετρία μάζας. Προκειμένου να αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες που εμφανίζουν μη εξειδικευμένη δέσμευση στα σφαιρίδια ή πρωτεΐνες που βρίσκονται

a priori

στις εμπορικά διαθέσιμα σφαιρίδια επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη, το ίδιο πείραμα εκτελέστηκε με την απουσία του αντιδραστηρίου σήμανσης (-AHA) [14]. Τουλάχιστον 480

de novo

συντίθενται οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν κατά μέσο όρο και στις δύο κυτταρικούς κλώνους (S1 πίνακα) και υπό τις δύο συνθήκες (-Dox: TGFBR2 ανεπάρκεια? + Dox: TGFBR2-καλά) κατά τη διέγερση με TGF-SS1 und ως εκ τούτου παρέμεινε ανεπηρέαστη από την κατάσταση έκφρασης TGFBR2 (Πίνακας 1). Επιπλέον, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με την παρουσία του κυκλοεξιμιδίου αναστολέα μετάφρασης (CHX) για την ταυτοποίηση bona fide

de ηονο

συντεθούν πρωτεΐνες (σημειώνονται με αστερίσκους στο S1 πίνακα). Έως 56 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν επίσης σε κύτταρα ελέγχου που αναπτύχθηκαν απουσία του AHA, περίπου 10 φορές μικρότερος από τον αριθμό των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στην παρουσία της σήμανσης AHA, επιβεβαιώνοντας έτσι την εξειδίκευση αυτής της προσέγγισης bioorthogonal επισήμανσης. Συγκριτική ανάλυση της TGFBR2 εξαρτώμενη

de novo

πρωτεώματος αποκάλυψε 21 υποψηφίους που βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά είτε σε TGFBR2 ανεπάρκεια ή TGFBR2-καλά κύτταρα αλλά σε τουλάχιστον μία από τις τρεις επαναληπτικές δειγμάτων και σε κάθε ένα από τα δύο κυτταρικοί κλώνοι. Πρωτεΐνη εμφάνιση και στις δύο κυτταρικές κλώνους χρησιμοποιήθηκε ως το ισχυρότερο κριτήριο επιλογής εξαιτίας κάποιες παραλλαγές σε περιστατικό πρωτεΐνη μεταξύ δείγματα εις τριπλούν. Ειδικότερα, 12/21 πρωτεΐνες εμφανίστηκαν αποκλειστικά σε κύτταρα TGFBR2-deficent ενώ οι υπόλοιπες πρωτεΐνες (9/21) ανιχνεύθηκαν αποκλειστικά σε TGFBR2-καλά κύτταρα που εμφανίζουν ανασυσταθεί σηματοδότηση ΤΟΡ-β (Πίνακας 2). Σύμφωνα με την GO-όρος ταξινόμησης, τα διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις βασικές κυτταρικές διεργασίες όπως η ανοσία (1B59), μεταγωγή σήματος (ASM, CSN3, DOCK8, GDF-15, TGFBR2), τροποποίηση πρωτεϊνών (CHIP, PP2AA), μεταγραφή (DTD2, RBM42, T2FA, TE2IP, TFAM, UBF1) και μεταφορά πρωτεϊνών (ERP29, RB6I2, HGS, TMEM9). Μόνο μερικές από αυτές τις πρωτεΐνες έχουν σύμφωνα με πληροφορίες που συνδέονται με την οδό TGF-β /SMAD σηματοδότησης (ASM, CHIP, HGS, PP2AA, SYNE2, GDF-15), αλλά άμεση ρύθμιση της έκφρασης τους από τον υποδοχέα TGFBR2 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου δεν έχει αποδειχθεί. Δεδομένου ότι η πειραματική στρατηγική στην παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στον εντοπισμό των νέων συντίθενται οι πρωτεΐνες, οι υποψήφιες λίστα των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών πιθανότατα αντιπροσωπεύουν πιθανές νέες

καλόπιστους

στόχους της TGFBR2 μεσολάβηση σηματοδότησης σε MSI HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα .

Η

Προφανώς, ορισμένα γνωστά κατάντη στόχοι της κανονικής TGF-β /SMAD σηματοδότησης όπως Smad7 [15], SERPINE [16] ή JunB [17] λείπουν από τη λίστα μας διαφορικά εκφρασμένων υποψήφιων πρωτεϊνών. Αρκετοί λόγοι μπορεί να ευθύνεται για τον περιορισμό αυτό: Πρώτον, τα κριτήρια επιλογής μας για τις υποψήφιες πρωτεΐνες βασίστηκαν σε διαφορική έκφραση σε τουλάχιστον ένα δείγμα σε κάθε μία από τις δύο κυτταρικών κλώνων που μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν παραλλαγές στην πρωτεϊνική έκφραση μεταξύ αυτών των δύο κλώνων κυτταρική γραμμή. Για παράδειγμα, JunB και CSK1 [18], ένας άλλος καταστολέας της ανάπτυξης και TGF-β γονιδίου-στόχου στα επιθηλιακά κύτταρα, δεν είχαν προσληφθεί στη λίστα των διαφορικά εκφρασμένων υποψήφιος πρωτεΐνες, επειδή εντοπίστηκαν μόνο σε ένα κλώνο του TGFBR2-καλά και TGFBR2 ανεπάρκεια κύτταρα, αντίστοιχα. Δεύτερον, πειραματική στρατηγική μας έχει σχεδιαστεί για να αποκαλύψει μόνο

de novo

συντίθενται οι πρωτεΐνες με σαφή περιορισμό με την κατάσταση έκφρασης του μετατροπέα σήματος TGFBR2 και ποσοτικές αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης κατά TGFBR2 την ανασύσταση και ως εκ τούτου θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί κάποιοι υποψήφιοι μπορεί να έχουν δραπέτευσε ανίχνευσης. Εναλλακτικά, η έλλειψη ανίχνευσης θα μπορούσε να οφείλεται σε διαφορές στην αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης της μεθειονίνης και της αναλογικής του AHA και /ή επίσης μπορεί να εξαρτάται από τον αριθμό των καταλοίπων μεθειονίνης που υπάρχουν πραγματικά σε κάθε πρωτεΐνη. Τρίτον, η έκθεση συνδέτη ΤΟΡ-SS1 περιοριζόταν σε ένα σύντομο χρονικό διάστημα από 4 ώρες που μπορεί να μην αρκεί για να προκαλέσει ανιχνεύσιμα επίπεδα ορισμένων νεοσυντιθέμενη πρωτεϊνών στόχων TGF-SS1 [19]. Τέλος, ως προειδοποίηση, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι ορισμένοι από τους υποψηφίους που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη στην πραγματικότητα δεν αντιπροσωπεύουν

de novo

συντίθενται οι πρωτεΐνες μόνο λόγω της σύνδεσής τους με το

καλόπιστους

TGFBR2 στοχεύουν πρωτεΐνες μέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Το πιο σημαντικό, όμως, προσδιορίζεται σαφώς η ίδια η πρωτεΐνη TGFBR2 σε δύο κλώνους του TGFBR2-ανασυσταθεί μοντέλο κυτταρική γραμμή μας, η οποία υποστηρίζει σθεναρά την εγκυρότητα της πειραματικής προσέγγισης μας.

3.2. TGFBR2 εξαρτώμενη έκφραση του GDF-15

Μεταξύ των

de ηονο

συντεθούν πρωτεΐνες ειδικά επάγεται σε TGFBR2 ανασυσταμένο κύτταρα, προσδιορίσαμε τον παράγοντα ανάπτυξης και διαφοροποίησης 15 (GDF-15). Παρόμοια με ΤΟΡ-β μόνη της, η GDF-15 μπορεί να εμφανίζουν αποκλίνουσες λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα [20]. Για παράδειγμα, μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκου και να προκαλέσει την απόπτωση όταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα HCT116 [21], αλλά βρίσκεται επίσης σε αυξημένα επίπεδα σε καρκίνους προχωρημένο στάδιο υποδηλώνοντας χρησιμότητα του ως δείκτης της εξέλιξης του όγκου [22]. Προκειμένου να αναλυθεί TGFBR2-γονιδίων που αποκρίνονται με περισσότερες λεπτομέρειες, εστιάσαμε στην GDF-15 ως ένα εν δυνάμει υποψήφιων γονιδίων επειδή είναι ακόμα άγνωστο αν τα μέλη της TGF-β οικογένειας των κυτοκινών μπορεί να ρυθμιστεί σε ένα TGFBR2-εξαρτώμενο τρόπο με τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Ως πρώτο βήμα, εξετάσαμε την ρύθμιση της GDF-15 έκφραση στο επίπεδο μεταγραφής. TGFBR2-καλά και TGFBR2 κύτταρα με ανεπαρκές HCT116 εκτέθηκαν σε ΤΟΡ-SS1 για δύο διαφορετικές χρονικές περιόδους (2 h και 4 h) και η έκφραση του mRNA GDF-15 προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (Σχήμα 1Α). Η διέγερση με ΤΟΡ-SS1 για 2 ώρες προκάλεσε περίπου διπλάσια αύξηση των επιπέδων μεταγραφής GDF-15 σε δύο κλώνους HCT116-TGFBR2 κατά τη σύγκριση TGFBR2-ικανοί έναντι TGFBR2 ελλειμματικών κυττάρων. Αυτός ο παράγοντας επαγωγής μειώθηκε ελαφρά σε περίπου 1,5 φορές όταν συνδέτη χρόνος έκθεσης παρατάθηκε (4 ώρες). Γονικών κυττάρων ελέγχου HCT116-Tet-On δεν έδειξε Dox-εξαρτώμενη μεταβολές της έκφρασης GDF-15, το οποίο αποκλείει τυχόν μη ειδικά αποτελέσματα που απορρέουν από δοξυκυκλίνη. Εκτός από τις αλλαγές έκφρασης του ΤΟΡ-SS1-εξαρτώμενη, παρατηρήσαμε επίσης μια διαφορά της GDF-15 έκφρασης μεταξύ των δύο κλώνων HCT116-TGFBR2. Ειδικότερα, πολλαπλάσια αύξηση του GDF-15 επίπεδα μεταγραφής ήταν πάντοτε μικρότερη στον κλώνο 22 σε σύγκριση με την κλωνοποίηση 5. Το πιο πιθανό, αυτό μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές θέσεις ενσωμάτωσης του

TGBFR2

διαγονιδίου σε αυτούς τους κλώνους [13 ].

(Α) Προς τα πάνω ρυθμισμένη επίπεδα μεταγραφής του GDF-15 σε παρουσία Dox χρησιμοποιώντας ανάλυση σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτείνης GDF-15 σε συνολική πρωτεΐνη λύματα (30 μα) του ΤΟΡ-SS1 διεγερμένα κύτταρα (4 ώρες). Η έκφραση του GDF-15 είναι αυξημένη όταν TGFBR2 εκφράζεται (+ Dox) και στα δύο κυτταρικούς κλώνους αλλά όχι στην γονική Tet-On κυτταρική γραμμή. σηματοδότηση TGF-β1 δεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα pSmad2 στις TGFBR2-κλώνους έκφρασης. Η προσθήκη κυκλοεξιμίδιο (CHX) μειώνει το επίπεδο έκφρασης του GDF-15. β-ακτίνη και Smad2 χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Εκτός από αυτές τις μεταγραφικές αλλαγές, ερευνήσαμε αν τα επίπεδα GDF-15 πρωτεΐνη είναι επίσης διαμορφώνονται από την κατάσταση έκφρασης TGFBR2 σε σύστημα μοντέλου μας. Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από Dox-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων HCT116-TGFBR2 κλώνους και κύτταρα μάρτυρες HCT116-Tet-On μετά ΤΟΡ-SS1 έκθεσης (4 ώρες) και εξετάζεται με ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 1Β). Σε συμφωνία με τα δεδομένα της μεταγραφής, την ανασύσταση του συνδετήρα-ενεργοποιείται σηματοδότηση TGFBR2 προκάλεσε αύξηση του GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης σε αμφότερες τις κυτταρικές κλώνους ενώ SS-ακτίνης επίπεδα παρέμειναν ανεπηρέαστα. κύτταρα ελέγχου HCT116-Tet-On δεν έδειξε Dox μεταβολές που εξαρτώνται από την έκφραση της GDF-15. Επιπλέον, η προσθήκη κυκλοεξιμιδίου (+ CHX) μειώθηκε την έκφραση του GDF-15 σημαντικά το TGFBR2 κυττάρου που εκφράζει τον κλώνο # 5 σε αντίθεση με β-ακτίνη ή Smad2 πρωτεΐνες που παρέμειναν CHX ανθεκτικά. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν την

de novo

σύνθεση της GDF-15 και να υποστηρίξει σθεναρά τα αποτελέσματά μας πρωτεομική (Πίνακας 2). Αυξημένα επίπεδα pSmad2 από την ανασύσταση του TGFBR2 (+ Dox) επιβεβαιώνει ότι το μοντέλο αυτό σύστημα είναι σε θέση να αποσπάσει τη σωστή Smad σηματοδότησης.

Για να επικυρώσετε τις παρατηρούμενες αλλαγές της έκφρασης πρωτεϊνών GDF-15 σε μια πιο ακριβή και ποσοτικό τρόπο , πραγματοποιήσαμε μια μεταβολική πείραμα επισήμανσης με τη χρήση [

35S] -L-μεθειονίνη. Οι πρωτεΐνες ραδιενεργά σημασμένο υπό τις ίδιες συνθήκες όπως στο πείραμα επισήμανση AHA αλλά σημασμένο GDF-15 πρωτεΐνη στη συνέχεια ανοσοκαταβυθίζεται και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή υγρού σπινθηρισμού (Σχήμα 2). Ένα περίπου 2,5-3 φορές αύξηση της ενδοκυτταρικής επίπεδο πρωτεΐνης GDF-15 παρατηρήθηκε σε δύο κλώνους του Dox-κατεργασμένων κυττάρων HCT116-TGFBR2 κατά την διέγερση του ΤΟΡ-β σε σύγκριση με το βασικό επίπεδο έκφρασης των ίδιων κυττάρων που καλλιεργούνται εν απουσία Dox ( Σχήμα 2Α). Δεδομένου ότι η GDF-15 μπορεί να δράσει σε ένα παρακρινή ή αυτοκρινή τρόπο, αναλύσαμε επίσης την ποσότητα του [

35S] -L-μεθειονίνη επισημασμένο εκκρίνεται GDF-15 πρωτεΐνης με GDF-15 ανοσοκαθίζηση από το μέσο καλλιέργειας (Σχήμα 2Β). Ανασυσταθέν TGFBR2 μεσολάβηση σηματοδότηση στα δύο κλώνους κυττάρων οδήγησε σε σημαντική αύξηση των εκκρινόμενων GDF-15 πρωτεΐνη παρόμοια με την άνοδο του ενδοκυτταρικά επίπεδα. Η γονική κυτταρική γραμμή Tet-On δεν έδειξε μεταβολές νεοσυντιθέμενους GDF-15 έκφραση ούτε στην πρωτεΐνη λύματα ούτε στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συμπερασματικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η εξαρτώμενη από TGFBR2 αυξημένη έκφραση του GDF-15 φαίνεται να μεταφέρονται σε θέση δράσης τους στο εξωκυτταρικό περιβάλλον.

[

35S] -L-μεθειονίνη χρησιμοποιήθηκε για μεταβολική επισήμανση και επακόλουθη ανοσοκαθίζηση των ενδοκυτταρικών GDF-15 από το σύνολο των προϊόντων λύσεως (Α) ή εκκρίνονται GDF-15 από μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (Β). Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με ΤΟΡ-SS1 για 4 ώρες στο (Α) και 24 ώρες στο (Β)

Η

GDF-15 είναι γνωστό ότι υπάρχουν σε διαφορετικές μορφές [23]:. Το προ-πεπτίδιο είναι διασπάται από μία πρωτεάση για την παραγωγή της ώριμης βιοδραστικών πρωτεϊνών. Η ώριμη πρωτεΐνη GDF-15 είναι γνωστό ότι εκκρίνεται αλλά αυτό έχει επίσης αναφερθεί για τη προ-πεπτίδιο [24]. Το αντίσωμα που χρησιμοποιείται στα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης μας είναι σε θέση να αναγνωρίσει το προ-πεπτίδιο, αλλά δεν δεσμεύονται με την ώριμη μορφή. Ως εκ τούτου, θα θέλαμε να τονίσουμε ότι τα αποτελέσματά μας ισχύουν για την προ-πεπτίδιο εκδοχή του GDF-15, το οποίο εξακολουθεί να μπορεί να συνδέεται με την ώριμη μορφή ή μπορεί επίσης να διασπαστεί και ανεξάρτητα αναγνωρίζεται. Προκειμένου να διευκρινιστεί κατά πόσον η ώριμη μορφή επηρεάζεται σε βαθμό παρόμοιο με άλλα αντισώματα πρέπει να δοκιμαστούν.

Για να δοκιμαστεί για τις επιπτώσεις της GDF-15 στην κυτταρική ανάπτυξη και τη σηματοδότηση, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού και pSmad2 ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας ανθρώπινη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GDF-15 (Σχήμα 3). ΤΟΡ-SS1 ή GDF-15 εκτός από μόνη της μείωσε το ρυθμό πολλαπλασιασμού, ωστόσο, το αποτέλεσμα αναστολής αύξησης έγινε πιο εμφανή όταν προστέθηκαν και τα δύο κυτοκίνες ταυτόχρονα κατά τη σύγκριση TGFBR2 εκφράζουν (+ Dox) να TGFBR2 ελλειμματικά κύτταρα (-Dox) στην HCT116- TGFBR2 # 5 (Σχήμα 3Α). Ο πολλαπλασιασμός της μητρικής κυτταρικής γραμμής Tet-On δεν μεταβλήθηκε καθόλου με διέγερση με οποιοδήποτε κυτοκίνης και – /+ Dox σε όλους τους συνδυασμούς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση του εξωγενούς προσθήκης του GDF-15 στη Smad σηματοδότηση. Η ανασυνδυασμένη GDF-15 μόνη της ήταν σε θέση να διεγείρει την έκφραση pSmad2 σε TGFBR2 κύτταρα που εκφράζουν (+ Dox), αλλά όχι σε TGFBR2 ελλειμματικών κυττάρων (-Dox) (σχήμα 3Β). Σε περίπτωση απουσίας του ανασυνδυασμένου GDF-15 και ΤΟΡ-SS1 συνδέτη δεν pSmad2 ανιχνεύθηκε, ενώ διέγερση με ΤΟΡ-SS1 μόνος έδειξε μια σε αύξηση του επιπέδου pSmad2 σε TGFBR2-καλά κύτταρα. ΤΟΡ-SS1 και GDF-15 Επιπλέον εμφανίζεται το ισχυρότερο αύξηση του φωσφορυλιωμένου επιπέδων Smad2 η οποία είναι σύμφωνη με την παρατηρούμενη μειωμένο συντελεστή πολλαπλασιασμού όταν και οι δύο συνδέτες προστέθηκαν ταυτόχρονα (σχήμα 3Α). Αυτό είναι, με τις γνώσεις μας, την πρώτη έκθεση που δείχνει φωσφορυλίωση των Smad2 από την GDF-15 σε ένα TGFBR2-εξαρτώμενο τρόπο με τον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Στο πλαίσιο του καρκίνου και την εξέλιξη της νόσου όπου TGFBR2 είναι μη λειτουργικό, η μείωση του GDF-15 έκφραση μπορεί να οδηγήσει σε πλεονέκτημα ανάπτυξης σε σύγκριση με την άγριου τύπου, TGFBR2 κύτταρα που εκφράζουν, προσομοιώνοντας μάλλον τη μη καρκινικό φαινότυπο. Στην ανάλυση στυπώματος Western φαίνεται επίσης ότι ο TGF-β1 και μόνο αυξάνει το επίπεδο της έκφρασης pSmad2 απουσία της TGFBR2 σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (Σχ 3Β). Παρατηρήθηκε Αυτό το βασικό επίπεδο της pSmad2 στη γονική HCT116-Tet-On και το TGFBR2 εκφράζουν τον κλώνο κυττάρων και είναι σε συμφωνία με τις προηγούμενες δημοσιευμένες εργασίες μας [13]. Υπάρχει μία έκθεση σχετικά με την πιθανή ρύθμιση της GDF 15-mRNA από τον TGF-β1 [25]. Μέχρι στιγμής, αυτό έχει παρατηρηθεί μόνο σε μακροφάγα και δεν υπάρχει καμία απόδειξη ακόμη περίπου TGFBR2 εξαρτώμενη ρύθμιση της έκφρασης GDF-15 σε άλλους ιστούς ή ασθένειες όπως ο καρκίνος του παχέος. Ωστόσο, άλλες μελέτες παρέχουν κάποιες πειραματικές αποδείξεις για την αντίστροφη κατάσταση, δηλαδή ότι η GDF-15 επηρεάζει σηματοδότηση ΤΟΡ-β. Για παράδειγμα, μελέτες σε ποντίκια υποδεικνύουν ότι η GDF-15 μπορεί να δράσει ως ένα δυνητικό πρόσδεμα για τον TGFBR2 [26]. Επιπλέον, GDF-15 φαίνεται να ρυθμίζουν φωσφορυλίωση TGFBR2 ή σηματοδότηση όπως έχει αποδειχθεί σε αρουραίους παρεγκεφαλίδας νευρώνες κοκκίων [27]. Οι παρατηρήσεις αυτές δεν έρχονται σε αντίθεση αναγκαστικά τα ευρήματά μας, αλλά μάλλον θα μπορούσε να υποδείξει μια πιθανή ανάδραση του GDF-15 σε TGFBR2 μεσολάβηση σηματοδότησης.

(Α) Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού εμφανίζεται ως ο μέσος όρος των έξι επαναλήψεων. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των TGFBR2 εξαρτώμενη επίπεδα pSmad2. HCT116-TGFBR2 # 5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε απουσία και παρουσία ανθρώπινης ανασυνδυασμένης ΤΟΡ-SS1 (10 ng /ml) και GDF-15 για 1 ώρα. Smad2 υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.

Η

Από GDF-15 έχει και θετικά και τα αρνητικά του όγκου των δραστηριοτήτων ανάλογα με την κυτταρική και μικροπεριβάλλον πλαίσιο, η έκβαση της TGFBR2-εξαρτώμενη GDF-15 υπερέκφραση και την αύξηση της έκκριση είναι δύσκολο να προβλεφθεί. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι κυκλοφορούν GDF-15 σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο CRC και ότι τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (NSAIDs) μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο [28]. Αμφιλεγόμενα, υπάρχουν δημοσιεύσεις που αποδεικνύουν ότι αυτές NSAIDs επάγουν την έκφραση του GDF-15, το οποίο στη συνέχεια οδηγεί σε απόπτωση σε κύτταρα HCT116 [21, 29], η οποία είναι σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις που κάναμε σε αυτή τη μελέτη: TGFBR2 ανασύσταση αντιπροσωπεύει μάλλον την κατάσταση άγριου τύπου σε Ποια απ GDF-15 εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα, ενώ στην κατάσταση του όγκου (ανεπάρκεια TGFBR2) μείον GDF-15 εκφράζεται και εκκρίνεται και τα κύτταρα του όγκου μπορεί να διαφύγει της απόπτωσης.

Όσον αφορά τον τύπο II υποδοχείς που μετάγουν τα σήματα που προκαλούνται από την υπεροικογένεια TGF-β /Bone μορφογενετική πρωτεΐνη (ΒΜΡ) /συνδέτες Ακτιβίνης, τα δεδομένα πρωτεομική προέρχεται από TGF-β1 διεγείρεται και TGFBR2-ανασυσταθεί κυττάρων στην παρούσα μελέτη επιτρέπει την άμεση σύγκριση με τα δεδομένα πρωτεομική που αποκτήθηκε από προηγούμενες εργασίες μας για ακτιβίνη Α-διεγείρονται και ACVR2-ανασυσταθεί κύτταρα. Σε σύγκριση με το

de novo

proteome των κυττάρων HCT116-ACVR2 [14], δεν υπάρχει επικάλυψη με το διαφορικά εκφραζόμενο σύνολο υποψήφια γονίδια εντοπίστηκαν σε κύτταρα HCT116-TGFBR2. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο υποδοχείς είναι μέλη της ίδιας οικογένειας του τύπου II μετατροπέων σήματος και μετάδοση σημάτων τους μέσω κοινών πρωτεϊνών μεσολαβητή SMAD στην κανονική πορεία, η παρατηρούμενη έλλειψη επικάλυψης μπορεί να εν μέρει να οφείλεται σε σύνδεση με διαφορετικούς συνδετήρες.

Συνολικά, χρησιμοποιώντας ένα καλά χαρακτηρισμένο σύστημα μοντέλο που επιτρέπει επαγόμενη έκφραση ενός μεγάλου οδηγού της ογκογένεσης του παχέος εντέρου σε μια ισογενετικών υπόβαθρο, εντοπίσαμε ένα σύνολο

de novo

συντίθεται υποψήφιες πρωτεΐνες των οποίων η διαφορική έκφραση φαίνεται να ρυθμίζεται σε ένα TGFBR2-εξαρτώμενο τρόπο. Μεταξύ αυτών των υποψηφίων εντοπίσαμε τον TGF-β υπερ μέλος GDF-15 ως πιθανό νέο στόχο του οποίου mRNA, ενδοκυτταρικά και εκκρίνεται επίπεδα πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά TGFBR2 την ανασύσταση. Αυτή η σύνδεση TGFBR2-GDF15 θα μπορούσε να είναι ένα τμήμα μιας ρυθμιστικής βρόχου που περιλαμβάνει επίσης ένα σύνδεσμο που περιγράφηκε προηγουμένως GDF-15-TGFBR2 [27].