Abstract

Η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει την ανάπτυξη αρκετών καρκίνων μέσω διαμόρφωσης των διαφόρων οδών. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της genistein σχετικά με τη ρύθμιση των ογκογόνων microRNA-151 (miR-151) δεν έχουν αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε αν genistein θα μπορούσαν να μεταβάλουν την έκφραση των ογκογόνων miR-151 και γονιδίων-στόχων της, που εμπλέκονται στην εξέλιξη και τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη (PCA). Real-time RT-PCR έδειξε ότι η έκφραση του miR-151 ήταν υψηλότερη σε PC3 και DU145 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα RWPE-1. Θεραπεία της PC3 και DU145 κύτταρα με 25 μΜ genistein κάτω ρυθμίζεται η έκφραση του miR-151 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Αναστολή της miR-151 σε κύτταρα του προστάτη από γενιστεΐνη αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή.

In-silico

ανάλυση έδειξε ότι πολλά γονίδια (CASZ1, IL1RAPL1, SOX17, N4BP1 και ARHGDIA) πρότεινε να έχετε λειτουργίες καταστολής όγκων ήταν γονιδίων στόχων του miR-151. Λουσιφεράσης δημοσιογράφος ανέφερε ότι το miR-151 συνδέεται άμεσα με συγκεκριμένες τοποθεσίες στο 3’UTR των γονιδίων στόχων. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των πέντε γονιδίων στόχων σε PC3 και DU145 ήταν εμφανώς αλλάξει με miR-151 μιμείται και αναστολέα. Kaplan-Meier καμπύλες και δοκιμές log-rank αποκάλυψε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-151 είχε αρνητικές επιπτώσεις στην επιβίωση. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η genistein μεσολάβηση καταστολή ογκογόνων miRNAs μπορεί να είναι ένα σημαντικό διαιτητικό θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του προστάτη

Παράθεση:. Chiyomaru Τ, Yamamura S, Zaman MS, Majid S, Ντενγκ G, Shahryari V, et al. (2012) Γενιστεΐνη Καταστέλλει προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου μέσω της αναστολής των ογκογόνων microRNA-151. PLoS ONE 7 (8): e43812. doi: 10.1371 /journal.pone.0043812

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Ιούν 2012? Αποδεκτές: 26 του Ιούλη 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Αυγ 2012

Copyright: © Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας μέσω αριθμών Grant R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 και VA κριτική Αξιών και VA Έργου του Προγράμματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες μεταξύ των ανδρών και βρίσκεται στη δεύτερη θέση με τον καρκίνο του πνεύμονα σε θανάτους από καρκίνο σχετίζονται [1]. Μετά τη θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων. Προστάτη μπορεί πλέον να επαναληφθεί ως ανδρογόνο-ανεξάρτητες, μεταστατική ασθένεια που οδηγεί στο θάνατο μέσα σε μερικά [2] ετών. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπείες είναι διαθέσιμες για να θεραπεύσει ανεξάρτητου από ανδρογόνο PCa. Έτσι, οι νέες προγνωστικούς δείκτες και αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας χρειάζονται επειγόντως.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNA περίπου 22 νουκλεοτιδίων που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω της μεταφραστικής καταστολής και του mRNA διάσπαση [3]. Βιοπληροφορική δείχνουν ότι miRNAs ρυθμίζουν το 60% των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη [4]. Προς το παρόν, έχουν 1.527 ανθρώπινα miRNAs έχουν καταχωρηθεί στη βάση δεδομένων miRBase (https://microrna.sanger.ac.uk/). Τα miRNAs εμπλέκονται σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, της ανάπτυξης, και διαφοροποίηση, και να συμβάλλει στην ανάπτυξη των διαφόρων τύπων καρκίνου [5]. Πολλοί ανθρώπινοι καρκίνοι έχουν ανώμαλη έκφραση των miRNAs, η οποία μπορεί να λειτουργήσει είτε ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [6].

(Α) προφίλ έκφρασης του miR-151 σε κυτταρικές γραμμές PCa (LNCaP, DU145 και PC3) και φυσιολογική επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1). PCR πραγματικού χρόνου έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-151 ήταν πάνω ρυθμισμένα σε ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές προστάτη (DU145 και PC3). έκφραση του miR-151 ομαλοποιήθηκε σε RNU48. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SE. επίπεδα (Β) Έκφραση miR-151 μετά από θεραπεία με γενιστεΐνη (25 μΜ). έκφραση miR-151 βρέθηκε να είναι μειωμένη κατά 15-45% σε κύτταρα κατεργασμένα genistein. *, P & lt?. 0.05

Η

miR-151 αντιστοιχίζεται σε μια περιοχή του χρωμοσώματος 8q. Που έχει βρεθεί να ενισχύεται συχνά σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου της ουροδόχου κύστης, του νεφρού, του προστάτη, του μαστού, του πνεύμονα, του στομάχου και του καρκίνου του ορθού [7] – [13]. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι χρωμοσωμική κέρδος του τόπου 8q24.3, όπου κατοικεί ογκογόνο γονίδιο LY6K, μπορεί να έχει ένα κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης [7]. Ένα χαρτί έδειξε ότι ο αριθμός αντιγράφων κέρδος του γονιδίου miR-151 στο 8q24.3 στον προστάτη συσχετίζεται με μετάσταση [14].

Η γενιστεΐνη (4 ‘, 5,7-τριυδροξυισοφλαβόνη), ένα σημαντικό συστατικό των ισοφλαβονών σόγια και τα προϊόντα σόγιας, έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν ισχυρή αντικαρκινική αποτελέσματα επί προστάτη [15], [16]. Τα επιδημιολογικά στοιχεία δείχνουν ότι τα ποσοστά εμφάνισης και θνησιμότητας του προστάτη είναι σημαντικά χαμηλότερη στην Ασία σε σχέση με τις Ηνωμένες Πολιτείες [17]. Η μέση συγκέντρωση της γενιστεΐνης σε ασιατικές άνδρες ορού ήταν υψηλότερη από εκείνη του πληθυσμού των ΗΠΑ [18] και αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η πρόσληψη ισοφλαβόνης συσχετίστηκε με μείωση του προστάτη του κινδύνου [19] – [22]. Η γενιστεΐνη έχει πολλαπλές μοριακούς στόχους συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων, των ενζύμων, και τα μονοπάτια σηματοδότησης [15]. Η genistein έχει επίσης δειχθεί να καταστέλλουν την ανάπτυξη πολλών καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

και

in vivo

, μειώνοντας την έκφραση αρκετών ογκογόνο miRNAs. Μέχρι σήμερα, οι επιπτώσεις της genistein σχετικά με τη ρύθμιση του miR-151 δεν έχουν αναφερθεί. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε αν genistein θα μπορούσαν να αλλάξουν την έκφραση του miR-151 και γονιδίων-στόχων που συμμετέχουν στην εξέλιξη και τη μετάσταση του προστάτη.

(Α) Νοκ ντάουν του miR-151a-5P αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων. Μετά την επιμόλυνση (48 ώρες), ένα τραύμα σχηματίστηκε με ξύσιμο και το τραύμα μετρήθηκαν μετά από 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πληγών δοκιμασία επούλωσης παρουσιάζεται στο x200 μεγέθυνση. ** P & lt? 0,0001 (Β) Νοκ ντάουν του miR-151a-5P μειώθηκε σημαντικά κυτταρική εισβολή. Αντιπροσωπευτικά εικόνες της ανάλυσης εισβολής εμφανίζονται σε x200 μεγέθυνση. ** P & lt?. 0.0001

Η

Αποτελέσματα

miR-151 είναι Up-ρυθμίζεται στην ΣΕΣΣ και Γενιστεΐνη Θεραπεία Μειώθηκε miR-151

Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης του miR-151 σε κύτταρα PCa, εκτελέσαμε TaqMan ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ανάλυση εξαρτώμενων από ανδρογόνα (LNCaP) και ανεξάρτητου από ανδρογόνα (PC3, DU145) κυτταρικές σειρές και σε σύγκριση αυτών με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1). miR-151 αποτελείται από δύο ώριμη miRNAs? miR-151a-5P και miR-151a-3P (miRBase). Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση miR-151 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές προστάτη σε σύγκριση με RWPE-1 κύτταρα (MIR-151α-5P? PC3 4,02-πλάσια, DU145 1,36 φορές) (MIR-151α-3ρ? PC3 5.14 φορές, DU145 2,25 φορές) (Εικόνα 1Α)

θεραπεία γενιστεΐνη σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται το σχετικό επίπεδο έκφρασης του miR-151 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος (miR-151a-5P?.. PC3 15% μείωση , DU145 14% μείωση) (miR-151a-3ρ? PC3 44% μείωση, DU145 32% μείωση) (Εικόνα 1Β)

Επίδραση του miR-151 Νοκ ντάουν επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στη μετανάστευση και εισβολή στην.. προστάτη των κυττάρων Γραμμές

Για να εξετάσει τις λειτουργικές τους ρόλους του miR-151, πραγματοποιήσαμε μελέτες απώλειας λειτουργίας χρησιμοποιώντας αναστολέα αντι-miR miRNA επιμολύνονται σε PC3 και DU145 κύτταρα. Η έκφραση του miR-151 ήταν σημαντικά κατασταλεί σε αντι-miR miRNA αναστολέα μορφομετατροπείς (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και παρατηρήσαμε παρόμοια βιωσιμότητα των κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει ότι knockdown miR-151 δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τραύματος δοκιμασία επούλωσης κατέδειξαν σημαντική αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης σε αντι-miR miRNA-151α-5P επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές προστάτη σε σύγκριση με τους ομολόγους τους (Εικ. 2Α). Ωστόσο, σημαντική αναστολή παρατηρήθηκε με αντι-miR miRNA-151α-3ρ διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές PCa. Η δοκιμασία εισβολή Matrigel έδειξε ότι ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν μειώθηκε σημαντικά σε αντι-miR μορφομετατροπείς miRNA-151α-5P σύγκριση με τους ομολόγους τους (Σχ. 2Β). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι miR-151a-5P παίζει με σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου και την εισβολή. Να αξιολογήσει τις ταυτόχρονες επιδράσεις του miR-151a-5P και miR-151a-3ρ, απώλεια-του-λειτουργία μελέτες με τη χρήση αναστολέα miRNA συν-επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών προστάτη πραγματοποιήθηκε. Δεν υπήρξε καμία επιπλέον επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων με miR-151α-5P και miR-151a-3ρ συν-επιμόλυνσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

κύτταρα PC-3 διαμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR miRNA πρόδρομος ή αντι-miR miRNA αναστολέα ή αρνητικό μάρτυρα, που ακολουθείται από παροδική επιμόλυνση με άγριου-τύπου πλασμίδια 3’UTR αναφοράς ή μεταλλαγμένες πλασμίδια 3’UTR για 24 ώρες. δραστηριότητα ανταποκριτή 3’UTR μετρήθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης και ομαλοποιήθηκε ως προς δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt?. 0.05

Η

Αναγνώριση του miR-151a-5P γονιδίων στόχων με ανάλυση In-silico

Για τον εντοπισμό πιθανών γονιδίων στόχων του miR-151a-5P, χρησιμοποιήσαμε TargetScan και microRNA.org να εντοπίσει περιοχές όπου αυτά τα miRNAs προσδένονται. Τα προγράμματα αυτά προσδιόρισε πέντε γονίδια που περιέχουν υποθετικές θέσεις στόχους για miR-151a-5P στο 3’UTR (N4BP1 τους: πρωτεΐνη NEDD4 δεσμευτική 1, CASZ1: καστορέλαιο δάκτυλο ψευδαργύρου 1, IL1RAPL1: ιντερλευκίνης 1 υποδοχέα βοηθητική πρωτεΐνη-όπως 1, SOX17: SRY ( φύλο προσδιορισμού περιοχή Υ) -κουτί 17 και ARHGDIA:.. αναστολέας διαστάσεως Rho ΑΕΠ (GDI) άλφα Αυτά τα γονίδια ταυτοποιήθηκαν με τους δύο αλγορίθμους και βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε ότι μπορεί να έχουν λειτουργία καταστολέα όγκου σε διάφορους καρκίνους [23] – [27]

(Α) (Β) (γ) (δ) Τα επίπεδα mRNA του πέντε γονιδίων στόχων του miR-151a-5P (Ε) προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις μετά από επιμόλυνση με μιμείται miR-151α-5P , αναστολέας miR-151α-5P και αρνητικού μάρτυρα σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145). Τα επίπεδα mRNA του πέντε γονιδίων στόχων του miR-151a-5P (F) προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις μετά τη θεραπεία με γενιστεΐνη ( 25 μΜ) σε κυτταρικές σειρές προστάτη Τα επίπεδα πρωτεΐνης των γονιδίων στόχων του miR-151a-5P (DU145). (G) προσδιορίστηκαν με αναλύσεις στυπωμάτων western μετά από επιμόλυνση με μιμείται miR-151a-5ρ, αναστολέας miR-151α-5P και αρνητικά ελέγχου σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt?. 0.05

Η

λουσιφεράσης αναλύσεις που χρησιμοποιούν διανύσματα περιέχουν 3’UTR τοποθεσίες της Υποθετικά γονιδίων στόχων

CASZ1, IL1RAPL1 και ARHGDIA το καθένα έχει ένα Δεσμευτική προβλεπόμενη θέση πρόσδεσης για ΜΙΚ 151α-5P στο 3’UTRs τους, ενώ N4BP1 και SOX17 το καθένα έχει δύο θέσεις προβλέψει δεσμευτική (Εικ. 3). Εμείς κλωνοποιημένα τις υποτιθέμενες στόχους 3’UTRs miR-151a-5P σε λουσιφεράσης φορέα δοκιμασία ρεπόρτερ. δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή απέδειξαν ότι miR-151a-5P μειώθηκε τις σχετικές δραστηριότητες λουσιφεράσης των CASZ1, IL1RAPL1 και ARHGDIA (Σχ. 4Α, 4Β και 4Ε). δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξαν επίσης ότι η καταστολή του miR-151a-5P αύξησε τις σχετικές λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ δραστηριότητες. Μετάλλαξη του υποθετικές θέσεις σε αυτές τις 3’UTRs δεσμευτική miR-151a-5P μείωσε την απάντηση miR-151a-5P. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-151a-5P συνδέεται άμεσα με τις 3’UTRs της CASZ1, IL1RAPL1 και ARHGDIA. δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξαν επίσης ότι το miR-151a-5P μείωσε τις σχετικές λουσιφεράσης δραστηριότητες, και νοκ ντάουν του miR-151a-5P αύξησε τις σχετικές λουσιφεράσης δραστηριότητες με τόσο άγριου τύπου SOX17 3’UTRs (θέση 472-478 και θέση 769-776) (Σχ. 4C και 4D). N4BP1 3’ΙΙΤΡ Θέση 3383 – 3389 δεν έδειξε λουσιφεράσης αλλαγή δραστηριότητας είτε με μιμείται miR-151a-5P ή αναστολέα miR-151a-5P. Η άλλη θέση στόχο (Θέση 4077-4083) έδειξαν ότι miR-151a-5P μειώθηκε αισθητά τη σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης και η καταστολή της miR-151a-5P σημαντικά αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης με την 3’UTR άγριου τύπου. Έτσι, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το miR-151a-5P συνδέει απευθείας σε μία ιστοσελίδα (Θέση 4.077 έως 4.083) για την 3’UTR της N4BP1 mRNA.

(Α) miR-151 έκφρασης σε κλινικά δείγματα (BPH, n = 17? PCa, n = 30). ** P & lt?. 0,0001 (Β) Καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier που δείχνουν τη συνολική επιβίωση από την έκφραση του miR-151a-5P (P = 0.0944)

Η

Κανονισμός του συστήματος Target Gene Expression σε προστάτη γραμμές κυττάρων από miR -151a-5P

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των πέντε γονιδίων στόχων σε PC3 και DU145 ήταν σημαντικά κατασταλεί στα επιμολυσμένα miR-151a-5P σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 5Α -ΜΙ). Επιπλέον, η έκφραση του mRNA από τα πέντε γονίδια στόχους σε PC3 και DU145 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στα επιμολυσμένα αναστολέα miR-151a-5P σύγκριση με τους ελέγχους. Αξιολογήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της γενιστεΐνης στην έκφραση του mRNA των στόχων miR-151a-5P. Αυτά τα γονίδια-στόχους ήταν σχεδόν up-ρυθμίζεται με genistein θεραπεία σε κυτταρικές σειρές DU145 (Εικ. 5F). Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του SOX17 και ARHGDIA μειώθηκαν σημαντικά στα επιμολυσμένα miR-151a-5P σε σύγκριση με τους ελέγχους και up-ρυθμίζεται στα επιμολυσμένα αναστολέας miR-151a-5P (Εικ. 5G).

Up- οργανωμένη έκφραση του miR-151-5p στον προστάτη δείγματα

Εμείς αξιολογήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του miR-151-5p στο προστάτη (n = 30) και του καρκίνου του προστάτη καλοήθη (ΚΥΠ) (n = 17) των ιστών. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-151-5p ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σύγκριση με PCa ιστούς ΒΡΗ (Ρ = 0,0001? Εικ. 6Α). Για να προσδιοριστεί αν τα επίπεδα του miR-151a-5P σε ιστούς όγκων συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών προστάτη, μετρήσαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης miR-151a-5P σε δείγματα ανθρώπινου όγκου (Σχ. 6Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του miR-151a-5P είχαν χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης από εκείνες με χαμηλή έκφραση 151α-5P, αν και τα αποτελέσματα δεν ήταν στατιστικά σημαντική (P = 0.0944). Επίσης δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση με άλλα κλινικο-παθολογικών παραγόντων (το στάδιο του όγκου και Gleason Score) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η miR -151 εκφράζεται υψηλά σε ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές προστάτη και ότι κυτταρική κινητικότητα και διεισδυτικότητα μειώνονται σε miR-151a-5P knockdown κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145). miR-151 αποτελείται από δύο ώριμη miRNAs? miR-151a-5P και miR-151a-3ρ. Δύο ώριμη miRNAs αποκόπηκε από το ίδιο στέλεχος-βρόχο πρόδρομος-miR-151a. Έτσι miR-151a-5P και miR-151a-3ρ έχουν διαφορετικές ακολουθίες και ως εκ τούτου απευθύνονται σε διαφορετικές mRNA. Επούλωση των πληγών δοκιμασία προσδιορισμού και της εισβολής απέδειξαν ότι νοκ ντάουν του miR-151a-5P, αλλά όχι miR-151a-3ρ, μειώθηκε σημαντικά η μετανάστευση προστάτη των κυττάρων και εισβολή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι λειτουργίες miR-151a-5P ως ογκογονίδιο με την αύξηση της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή στην ΣΕΣΣ. Αντίθετα, δεν υπήρξε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του αναστολέα miR-151a-5P επιμολυσμένα κύτταρα του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-151a-5P δεν εμπλέκεται σε δραστηριότητες διάδοσης. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miR-151a-5P σε όγκους έχει σχέση με τη μείωση επιβίωση των ασθενών προστάτη, ωστόσο αυτά τα αποτελέσματα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά είτε με αυτήν την παράμετρο ή άλλες κλινική-παθολογικά χαρακτηριστικά. Δεδομένου ομάδα μας δεν ήταν μεγάλη (n = 30) και περιλαμβάνεται μόνο πέντε δείγματα του προχωρημένου καρκίνου (πάνω από ρΤ3) και τρία δείγματα με Δείκτη Gleason 8 ή περισσότερο, οι μελέτες σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων με μια ισορροπημένη παθολογική φόντο θα έχουν να διενεργηθεί για πιο ακριβή στατιστική αξιολόγηση.

Υπολογιστική βιοπληροφορική και 3 ‘δοκιμασίες λουσιφεράσης δείχνουν ότι το miR-151a-5P έχει πολλά πιθανά γονίδια-στόχους (CASZ1, IL1RAPL1, SOX17, N4BP1 και ARHGDIA). CASZ1, μια νευρωνική γονίδιο διαφοροποίησης, έχουν δειχθεί ότι έχουν δραστικότητα καταστολέα όγκων. Σε κλινικές πρωτογενείς sumples όγκου, η έκφραση του CASZ1 είναι σημαντικά μειωμένη σε επιθετικές νευροβλάστωμα σύγκριση με τις ευνοϊκές όγκους [28]. Η αποκατάσταση της έκφρασης CASZ1 αναστέλλει τη μετανάστευση των όγκων

in vitro

και κατέστειλε ογκογενετικότητας

in vivo

[23]. Το γονίδιο IL1RAPL1 βρίσκεται σε μία περιοχή του χρωμοσώματος Χ και την πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό το γονίδιο είναι ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέα της ιντερλευκίνης 1 και είναι παρόμοια με την ιντερλευκίνη 1 βοηθητικές πρωτεΐνες [29]. IL1RAPL1 έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πολλές κυτταρικές σειρές όγκων εγκεφάλου και ξενομοσχεύματα συγκρίθηκε με φυσιολογικούς ιστούς [24] υποδηλώνοντας ότι μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου [30]. Το γονίδιο κωδικοποιεί ένα SOX17 μέλος της οικογένειας SOX μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης και στον προσδιορισμό του κυτταρικού μοίρα [31]. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR έδειξε ότι η έκφραση SOX17 ήταν χαμηλότερη σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς από εκείνες σε φυσιολογικούς ιστούς [32]. SOX17 αναφέρθηκε ότι είναι ένα υποψήφιο γονίδιο καταστολής όγκου που αναστέλλει την κανονική WNT /β-κατενίνης οδό σηματοδότησης σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [25], [33]. N4BP1 έχει αναγνωριστεί ως ένα υπόστρωμα για μονο ubiquitylation από Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης Nedd4 [34]. Έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με N4BP1 και αρνητικά ρυθμίζει δραστικότητα ITCH Ε3 κατευθύνεται προς τα υποστρώματα της, συμπεριλαμβανομένων των c-Jun και ρ53 που σχετίζονται με πρωτεΐνες καταστολής όγκου (ρ73 και ρ63) [35]. ARHGDIA είναι μία κυτταρική ρυθμιστική πρωτεΐνη η οποία δεσμεύει και αρνητικά ρυθμίζει πλέον GTPases Rho συμπεριλαμβανομένων RhoA, Rac1, και Cdc42 [36]. Απώλεια ARHGDIA ενισχύει τη μετάσταση και η αντίσταση στην ταμοξιφαίνη στον καρκίνο του μαστού [37] και η απώλεια της έκφρασης ARHGDIA προάγει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του προστάτη [27]. Σε thisb μελέτη έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των γονιδίων αυτών των πέντε όγκου στόχου καταστολέα στο PC3 και DU145 ήταν εμφανώς αλλάξει στον πειραματισμό με μιμείται miR-151a-5P και ο αναστολέας miR-151a-5P, υποδεικνύοντας ότι miR-151-5p άμεσα στόχων αυτά τα γονίδια.

η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει την ανάπτυξη πολλών καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

και

in vivo

, μειώνοντας την έκφραση των ογκογόνων miRNAs, όπως miR -21 [38], miR-27a [39], miR-221 και miR-222 [40]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η genistein θεραπεία σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται το σχετικό επίπεδο έκφρασης των ογκογόνων miR-151. Πρόσφατα, η ομάδα μας έδειξε ότι η genistein ανέστειλε την έκφραση του miR-21 σε καρκινικά κύτταρα νεφρού και στους όγκους που σχηματίζονται μετά την έγχυση αντιμετωπίζονται genistein νεφρού καρκινικών κυττάρων σε γυμνά ποντίκια, μαζί με την αναστολή του σχηματισμού όγκου [38]. miR-27a έχει αναφερθεί να είναι ένα ογκογόνο miRNA σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, και η έκφραση και το γονίδιο του στόχου επίπεδα (ZBTB10) ήταν εξαρτώμενη από τη δόση της γενιστεΐνης [39]. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι η genistein απορυθμίζεται γονίδιο ΑΡΧΗ ογκοκατασταλτικό με ρύθμιση προς τα κάτω miR-221 και miR-222 στο προστάτη [40]. Η genistein έχει επίσης αναφερθεί ότι καταστέλλει την ανάπτυξη αρκετών καρκίνων με την αύξηση της έκφρασης των καταστολείς όγκων, miR-146a [41] και miR-1296 [42]. Θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με τις ενώσεις ισοφλαβόνης (συμπεριλαμβανομένων 70.54% γενιστεΐνη), αυξημένη έκφραση miR-146a, προκαλώντας ρύθμιση προς τα κάτω του EGFR, ΜΤΑ-2, IRAK-1, και ΝΡ-κΒ, οδήγησε σε αναστολή της κυτταρικής εισβολής [41]. Έχουμε επίσης αναφερθεί ότι η genistein αυξημένη miR-1296 έκφραση (3 έως 5 φορές) σε κύτταρα προστάτη και μειωτικά σημαντικά την έκφραση του MCM2 το οποίο είναι στόχος της miR-1296 [42].

Σε αυτή τη μελέτη, έχουν δείξει ότι το miR-151 στοχεύει άμεσα αρκετές ογκοκατασταλτικών γονιδίων και συμμετέχουν στην εξέλιξη και τη μετάσταση του προστάτη. Επιπλέον, αυτή είναι η πρώτη έκθεση για να δείξει ότι η genistein ρυθμίζει προς τα κάτω miR-151 έκφρασης που υποδηλώνει ότι η genistein μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα σημαντικό διαιτητικό θεραπευτικό μέσο για τη θεραπεία του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινική προστάτη δείγματα

Όλα τα slides ιστού εξετάστηκαν από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγο για τον εντοπισμό των εστιών του προστάτη του καρκίνου, καθώς και παρακείμενο φυσιολογικό αδενικό επιθήλιο. Όλοι οι ασθενείς με καρκίνο είχαν αυξημένα επίπεδα του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) και είχαν υποβληθεί σε ριζική προστατεκτομή από το 1999 έως το 2004. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα μη καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από ασθενείς ΒΡΗ που είχαν υποβληθεί σε προστατεκτομή ή διαουρηθρική εκτομή. Πληροφορημένη συναίνεση ελήφθη από όλους τους ασθενείς.

Cell Culture

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη, LNCaP, PC-3 και DU145 και ένα μη-κακοήθεις επιθηλιακή κυτταρική σειρά προστάτη, RWPE-1, ήταν αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα στους 37 ° C. RWPE-1 κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε μέσο ανάπτυξης κερατινοκυττάρων συμπληρωμένο με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και 0.05 mg /mL εκχύλισμα βόειας υπόφυσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). κύτταρα Υποσυρρέουσες (60% -70% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (25 μmol /L? Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) διαλυμένη σε διμεθυλοσουλφοξείδιο και τα κύτταρα σε αγωγή με φορέα (διμεθυλοσουλφοξείδιο) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. μέσων κυττάρων και γενιστεΐνη αλλάχθηκαν κάθε μέρα και αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες.

RNA Extraction

RNA εκχυλίστηκε από FFPE ανθρώπινα δείγματα χρησιμοποιώντας ένα miRNeasy σταθεροποιημένο με φορμαλίνη kit εμπεδωθεί με παραφίνη (Qiagen, Valencia, CA, USA) μετά από μικροδιατομή. Για να αφομοιώσουν το DNA, χρησιμοποιήθηκε το Qiagen RNase-free kit DNase. Ολικό RNA εκχυλίστηκε επίσης από κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και μη κακοηθών κυτταρική σειρά επιθηλιακών προστάτη χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy mini (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Εκχυλίστηκε το ολικό RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και ένα κιτ TaqMan microRNA αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη με ένα Applied Biosystems Prism7500 Fast Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας TaqMan καθολικής PCR μάστερ μιξ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το 7500 γρήγορο σύστημα SDS έκδοση λογισμικού 1.3.1 (Applied Biosystems). Ποσοτική παράμετροι της PCR για το ποδήλατο ήταν ως ακολούθως: 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι PCR στους 95 ° C για 3 δευτερόλεπτα, και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Όλες οι αντιδράσεις έγιναν σε ένα 10-μι όγκος αντίδρασης εις τριπλούν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη δέλτα-δέλτα μέθοδος Ct για τον υπολογισμό της πολλαπλής μεταβολής. ανιχνευτές TaqMan και εναύσματα για CASZ1 (ID δοκιμασία: Hs00214901_m1), IL1RAPL1 (ID δοκιμασία: Hs00990788_m1), SOX17 (ID δοκιμασία: Hs00751752_s1), N4BP1 (ID δοκιμασία: Hs00206373_m1), ARHGDIA (ID δοκιμασία: Hs00366348), GAPDH (ID δοκιμασία: Hs02758991_g1), miR-151a-5P (ID δοκιμασία: 002642), miR-151a-3ρ (ID δοκιμασία: 002254), RNU48 (δοκιμασία ID: 001006) ελήφθησαν από την Applied Biosystems. GAPDH και RNU48 χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι.

Ανάλυση Western Blot

Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Pierce, Brebieres, Γαλλία) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Sigma). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ BCA προσδιορισμού πρωτεϊνών (Pierce). Protein λύμα (30 μg) διαχωρίστηκε με 4% έως πηκτές SDS πολυακρυλαμιδίου 20% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Ένα αντίσωμα έναντι SOX17 αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Αντισώματα έναντι ARHGDIA και GAPDH αγοράστηκαν από GeneTex (Irvine, CA, USA). Η μεμβράνη πλύθηκε και κατόπιν επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα σε υπεροξειδάση (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA). Ειδικά σύμπλοκα κατέστησαν ορατά με το σύστημα ανίχνευσης echochemiluminescence (ECL) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), και το επίπεδο έκφρασης αυτών των γονιδίων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (ver 1.43?. https://rsbweb.nih.gov/ij /index.html).

Η επιμόλυνση

Pre-miR πρόδρομα miRNA και αρνητικού ελέγχου (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα κέρδος-of-λειτουργία, ενώ Anti-miR miRNA αναστολέα και αρνητικού ελέγχου (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα απώλειας λειτουργίας. PC3 και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Mock επιμολύνσεις, με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Κυττάρων πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, και εισβολή Δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας CellTiter 96 Υδατικό One Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μετρήσεις απορρόφησης στα 490 nm χρησιμοποιώντας SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). δραστικότητα μετανάστευσης των κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία έξι φρεατίων, και οι κυτταρικές μονοστοιβάδες αποξέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας Ρ-20. Το πλάτος της αρχικής διάκενο (0 h) και το υπολειμματικό κενό 24 ώρες μετά τον τραυματισμό υπολογίστηκαν από μικροφωτογραφίες. Μια δοκιμασία κυττάρων εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας τροποποιημένο Boyden τμημάτων που αποτελούνται από transwell-προεπικαλυμμένα Matrigel ένθετα φίλτρο μεμβράνης με πόρους οκτώ micron σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 24 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA). Ελάχιστο βασικό μέσο που περιέχει 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο χρησίμευσε ως χημειοελκυστικό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

Πρόβλεψη microRNA Στόχοι

Οι προβλεπόμενες γονιδίων στόχων και miRNA θέση πρόσδεσης περιοχές σπόρους τους προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας TargetScan (αφήστε 5.2, http:. //www.targetscan. org /) και microRNA.org (Αύγουστος απελευθέρωση του 2010, https://www.microrna.org/microrna/home.do). Οι ακολουθίες των προβλεπόμενων ώριμη miRNAs επιβεβαιώθηκαν από miRBase (αφήστε 18,0? https://microrna.sanger.ac.uk/).

Κατασκευή πλασμιδίου και Dual-λουσιφεράσης Reporter

Για 3 ‘δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης UTR, PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέα έκφρασης που χρησιμοποιείται (Promega). Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίου (άγριου τύπου) που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα S1. Κατασκευάσαμε επίσης μεταλλαγμένο ολιγονουκλεοτίδια για κάθε ένα από τα ολιγονουκλεοτίδια φυσικού τύπου (Πίνακας S1). Σε ένα συνολικό όγκο 25 μΙ, 1 μΙ από έκαστο 100 μΜ εμπρόσθιο και ανάστροφο ολιγονουκλεοτίδιο, 2.5 μΐ 10 Χ ρυθμιστικού διαλύματος συγκολλήσεως (100 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 1 Μ NaCl και 10 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ) και 20.5 μΐ νερού ήταν επωάζονται στους 95 ° C για 3 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν στους 37 ° C για 15 λεπτά. Τα ολιγονουκλεοτίδια συνδέθηκαν εντός της θέσης PmeI-Xbal της Έκφρασης pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέα. Για δοκιμασία λουσιφεράσης 3 ‘UTR, του καρκίνου του προστάτη κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με Pre-miR πρόδρομος miRNA ή αντι-miR miRNA αναστολέα και pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Φορείς Έκφρασης χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) και το αντιδραστήριο Χ-tremeGENE ΗΡ DNA Επιμόλυνσης ( Roche Διάγνωση, Βασιλεία, Ελβετία, Η.Π.Α.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Luciferase Reporter (Promega) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Στατιστική Ανάλυση

Η σχέση μεταξύ δύο μεταβλητών και τις αριθμητικές τιμές που λαμβάνονται με πραγματικού χρόνου RT -PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το μη παραμετρικό Mann-Whitney U ή το paired t-test. Η σχέση μεταξύ των τριών μεταβλητών και τις αριθμητικές τιμές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Bonferroni προσαρμοσμένο Mann-Whitney U test. Σύνδεσμος έκφραση miR-151 με συνολική επιβίωση εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι προκύπτουσες καμπύλες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ log rank. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ειδικών StatView (έκδοση 4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Στη σύγκριση μεταξύ των τριών μεταβλητών, μια μη προσαρμοσμένο στατιστικό επίπεδο σημαντικότητας P & lt? 0,05 αντιστοιχεί σε Bonferroni προσαρμοσμένο επίπεδο της P & lt?. 0,0167

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων

Primer (άγριου τύπου και μεταλλαγμένα).

doi: 10.1371 /journal.pone.0043812.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Ρότζερ Erickson για την υποστήριξη και τη βοήθειά του με την προετοιμασία του χειρογράφου .