Αφηρημένο

Εισαγωγή

Τα επίπεδα έκφρασης της

miR-146b-5P

και

-3p

microRNAs σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) συνδέονται με υποτροπή της νόσου μετά από χειρουργική επέμβαση. Για να το καταλάβουμε αυτό, η επίδραση του

miR-146b

υπερέκφραση μελετήθηκε σε Α549 ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων.

Μέθοδοι

κύτταρα Α549, κατασκευασμένο με φακοϊούς να υπερεκφράζουν την ανθρώπινη

προ-miR-146b

πρόδρομο microRNA, εξετάστηκαν για πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικιών επί πλαστικής επιφάνειας και σε μαλακό άγαρ, τη μετανάστευση και διεισδυτικότητα σε κυτταρική καλλιέργεια και in vivo σε ποντίκια, χημειοευαισθησία στη σισπλατίνη και η δοξορουβικίνη, και η παγκόσμια γονιδιακή έκφραση .

miR-146b

εκφράσεις αξιολογήθηκαν σε μικροτομή στρώμα και επιθήλια των ανθρώπινων όγκων NSCLC. Σύνδεσμος

miR-146b-5P

και

-3p

έκφραση σε πρώιμο στάδιο NSCLC με υποτροπή αναλύθηκε.

Κύρια Ευρήματα

Α549

προ-miR-146b

-overexpressors είχαν 3-8 φορές υψηλότερα επίπεδα των δύο

miR-146b

microRNAs από κύτταρα ελέγχου. Η υπερέκφραση δεν μετέβαλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χημειοευαισθησία, η μετανάστευση, ή διεισδυτικότητα? επηρεάζεται μόνο το 0,3% του μεταγραφικό mRNA? και, μείωσε την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες in vitro κατά 25%. Σε ανθρώπινους όγκους NSCLC, η έκφραση και των δύο

miR-146b

microRNAs ήταν 7-10 φορές υψηλότερη σε στρώμα από ό, τι σε καρκινικά επιθήλια και υψηλότερη

miR-146b-5P

αλλά χαμηλότερο

-3

επίπεδα p ήταν προγνωστική της υποτροπής.

Συμπεράσματα

Μόνο μια ελάχιστη επίδραση του

προ-miR-146b

υπερέκφραση στον κακοήθη φαινότυπο παρατηρήθηκε σε Α549 κύτταρα. Αυτό θα μπορούσε να είναι λόγω των αντίθετων αποτελεσμάτων των

miR-146b-5P

και

-3p

υπερέκφραση όπως προτείνεται από τα συγκρουόμενα επανεμφάνιση-προγνωστική αξία των δύο microRNAs, είτε γιατί

ΜΙΚ 146b

αλλαγές έκφραση σε μη-καρκινικά στρώμα και όχι καρκινικά επιθήλια των όγκων είναι υπεύθυνοι για την προγνωστική αξία του

miR-146b

η

Παράθεση:. Patnaik SK, KANNISTO Ε, Mallick R , Yendamuri S (2011) η υπερέκφραση του Καρκίνου του πνεύμονα-Προγνωστικοί

miR-146b

Τα microRNAs έχει ελάχιστη και αρνητική επίδραση στην κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων Α549 καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (7): e22379. doi: 10.1371 /journal.pone.0022379

Επιμέλεια: Boris Zhivotovsky, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 5η Μαΐου 2011? Αποδεκτές: 20 Ιουν 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Patnaik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα βραβείο Summer Internship από την αμερικανική Ένωση Θωρακοχειρουργική να RM, και βραβεία από το Ίδρυμα Buswell, καρκίνο και λευχαιμία Ομάδα Β, και Χειρουργικής θώρακος Ίδρυμα Έρευνας και Παιδείας να SY. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs είναι ultrashort μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν κυτταρικές διεργασίες από την ακολουθία-ειδική επιρροή τους στη σταθερότητα και τη μετάφραση των πολλαπλών αγγελιαφόρο RNA (mRNAs). Μελέτες των τελευταίων ετών έχουν δείξει τη σημασία αυτών των επιγενετικών ρυθμιστικών μορίων στον καρκίνο βιολογία [1], καθώς και τη χρησιμότητά τους ως βιοδείκτες της νόσου μελών [2]. Έχουμε προηγουμένως ποσοτικοποιηθεί η έκφραση του microRNAs σε 77 Ι μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ανθρώπινων όγκων στάδιο για τον εντοπισμό microRNAs τα επίπεδα της οποίας συνδέονται με υποτροπή της νόσου μετά από χειρουργική εκτομή [3]. Έκφραση του

miR-146b

microRNAs,

miR-146b-5P

και

miR-146b-3ρ

, στους όγκους διέφερε σημαντικά μεταξύ των περιπτώσεων που είχε μια υποτροπή και εκείνων ότι δεν το έκανε, με τη μέση τιμή

miR-146b-5P

υψηλότερο επίπεδο, αλλά η μέση τιμή

miR-146b-3ρ

χαμηλότερο επίπεδο στην πρώτη ομάδα. Επιπλέον, στην εσωτερική εγκάρσια επικυρώσεις,

miR-146b-3ρ

αναγνωρίστηκε ως ένα συχνό συστατικό των έξι microRNA μηχανές διανυσμάτων υποστήριξης ταξινομητές που θα μπορούσε να προβλέψει επανεμφάνιση με μέση ακρίβεια 69%. Υψηλότερη έκφραση του

miR-146b-5P

σε ανθρώπινους όγκους βρέθηκε επίσης να σχετίζεται με κακή συνολική επιβίωση στο στάδιο Ι-ΙΙΙ NSCLC σε μια μελέτη που επικεντρώνεται στην πλακωδών κυττάρων ποικιλία της νόσου, αλλά δεν εξέτασε

miR-146b-3ρ

[4]. Εκτός αυτού ο καρκίνος του πνεύμονα, ένα υψηλότερο επίπεδο

miR-146b-5P

σε όγκους συνδέεται επίσης με μια πιο κακοήθη νόσο στον άνθρωπο θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [5].

Στους ανθρώπους, τόσο

miR-146b-5P

και

-3p

microRNAs είναι προϊόντα του ίδιου

MIR146B

γονίδιο που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 10 στη θέση q24.32. Όπως τα περισσότερα ζεύγη 5p και 3p microRNAs, οι δύο

miR-146b

microRNAs δημιουργούνται από τις αντίθετες έλικες (5 ‘και 3’ βραχίονες) ενός δίκλωνου περιοχή στέλεχος ενός προδρόμου microRNA,

προ-miR-146b

, η οποία με τη σειρά της προέρχεται από την πρωτογενή

MIR146B

μεταγραφής RNA [6]. Η έκφραση του

miR-146b-5P

φαίνεται να είναι πανταχού παρούσα σε ανθρώπινους ιστούς, αν και τα υψηλότερα επίπεδα παρατηρήθηκαν σε πνεύμονα, θύμο και σπλήνα [7]. Μικρά RNA κλωνοποίηση και μελέτες βαθιά αλληλουχίας δείχνουν ότι η ποσότητα του

miR-146b-3ρ

στα κύτταρα είναι πολύ μικρότερη από εκείνη του

miR-146b-5P

[8], [9]. Μια τέτοια διαφορά παρατηρείται για πολλά ζευγάρια 5p και 3p microRNA, που αποτελούν την πλειοψηφία των microRNAs. Αυτή η προκατάληψη σκέλος πιστεύεται ότι είναι ένα αποτέλεσμα της θερμοδυναμικής επιδράσεις στην επεξεργασία microRNA που υπαγορεύεται από τις αλληλουχίες microRNA [10], [11], καθώς και τα επίπεδα των mRNAs στόχου στο κυτταρικό περιβάλλον [12], [13]. Ακόμα κι αν ένα από τα 5p και 3ρ microRNAs μπορεί να είναι πολύ λιγότερο άφθονο από το άλλο (και συχνά αναφέρεται ως το «microRNA *« είδη), μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στην κυτταρική κατάσταση [14], [15]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η φύση των προκατάληψη κλώνου μπορεί να ποικίλει spatiotemporally. Για παράδειγμα, το

miR-202

/

miR-202 *

αναλογία έκφρασης αλλαγές από -0,5 έως περίπου 0.9 κατά τη διάρκεια των γυναικών gonadogenesis σε έμβρυα κοτόπουλου [16], και το ποντίκι

ΜΙΚ 194-5p

είναι παρούσα σε υψηλότερο επίπεδο από ό, τι

miR-194-3p

στα νεφρά και το στομάχι, αλλά σε χαμηλότερο επίπεδο στον πνεύμονα και τη μήτρα [17].

Ένας αριθμός μελέτες έχουν εξετάσει το ρόλο του

miR-146b

microRNAs στον καρκίνο cEIL γραμμές. Σε μια μελέτη των ανθρώπινων κυττάρων γλοιοβλαστώματος U373, εισβολής και της μετανάστευσης μειώθηκε από υπερέκφραση των microRNAs και αυξήθηκε κατά νοκ ντάουν τους χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδια αντίθετης φοράς, και η στόχευση των αντιγράφων του

MMP16

γονίδιο μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας από

miR -146b-5P

εντοπίστηκε [18]. In vitro τη μετανάστευση και την εισβολή ενός άλλου ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος κυτταρική γραμμή, U87-MG, έχει επίσης δειχθεί να μειωθεί κατά

miR-146b-5P

υπερέκφραση [19]. Η microRNA δείχθηκε να στοχεύσει μεταγραφές του

EGFR

υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα γονίδιο που κωδικοποιεί.

EGFR

-targeting από

miR-146b-5P

έχει επίσης δειχθεί σε MDA-MB-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [20]. Όπως και στις μελέτες γλοιοβλάστωμα,

προ-miR-146b

υπερέκφραση στα κύτταρα μειώνεται μετανάστευσης και της εισβολής [20] Thier. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί σε μια άλλη μελέτη, η οποία πρότεινε επίσης ένα ρόλο για

miR-146b-5P

στη ρύθμιση αρνητικά τον παράγοντα-κΒ (NF-kB) μονοπατιού πυρηνικής [21]. Τέτοιες λειτουργικές μελέτες δεν έχουν διεξαχθεί σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Για να κατανοήσουμε τη σύνδεση των

miR-146b

microRNAs με την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα, επιδιώξαμε να μελετήσει τα αποτελέσματα της υπερεκφράζουν το

προ-miR-146b

πρόδρομο microRNA για την κακοήθη φαινότυπο του Α549 αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα κυτταρική σειρά.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Όλη η έρευνα που παρουσιάζεται εδώ εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Roswell Park Cancer Institute (RPCI). Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν μετά την έγκριση από το Ινστιτούτο Φροντίδας Ζώων RPCI και επιτροπή Χρήση υπό αριθμό πρωτοκόλλου 1132M.

Κυτταροκαλλιέργεια

αδενοκαρκινώματος Α549 ανθρώπινου πνεύμονα και BEAS-2Β φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών ήταν λαμβάνεται από ATCC® (Manassas, VA). TLA-ΗΕΚ293Τ ™, ένας ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από το 293Τ κυτταρική γραμμή, ελήφθη από Open Biosystems® (Huntsville, AL). Κύτταρα Α549 και TLA-ΗΕΚ293Τ ™ καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 90% υγρασία και 5% CO

2 σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (+ DMEM? Mediatech®, Manassas, VA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ Laboratories ®, Pasching, Αυστρία) σε θάλαμο επώασης Steri-Cult ™ (Thermo Fisher Scientific®, Waltham, ΜΑ). LHC-9 μέσο (Invitrogen®, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για κύτταρα BEAS-2Β. Κυτταρικές σειρές που δημιουργούνται σε αυτή τη μελέτη καλλιεργήθηκαν με την παρουσία 2 μg /ml πουρομυκίνη (Roche®, Indianapolis, ΙΝ). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.05% θρυψίνη με 0,25 mM αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό οξύ (Invitrogen®). Τα κύτταρα δεν καλλιεργήθηκαν για περισσότερο από έξι εβδομάδες και ταυτόχρονα-καλλιεργήθηκαν και παρομοίως ηλικίας κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν κατά τη σύγκριση των κυτταρικών σειρών. καλλιέργειες συντήρησης σε ημι-συρροή χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθεί πειράματα. Σκήπτρο ™ ηλεκτρονικό μετρητή (Millipore®, Billerica, ΜΑ) ή διαφάνειες μιας χρήσης αιμοκυτταρόμετρο (Incyto®, Ντύσελντορφ, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της κυτταρικής πυκνότητας της εκ νέου αιωρούμενα κύτταρα.

Δημιουργία σταθερά μεταγωγή κυττάρων -lines

Συμπληρωματικά, μονόκλωνο DNA ολιγονουκλεοτιδίων με την ανθρώπινη

προ-miR-146b

ακολουθία (miRBase [22] τον αριθμό προσχώρησης MI0003129) και τον περιορισμό προβόλους ενζύμου επιτόπου ελήφθησαν από Ολοκληρωμένη DNA Technologies® (Coralville, ΙΑ). Ολιγονουκλεοτίδια ελήφθησαν επίσης για μια σειρά παραλλαγή στην οποία αντάλλαξαν τα τμήματα για το

miR-146b-5P

και microRNAs

-3p

. Μετά τη συγκόλληση για να δημιουργήσει δίκλωνο DNA, τα ολιγονουκλεοτίδια συνδέθηκαν στο

Xho I-

και

Δεν

I (Invitrogen®) που είχε υποστεί φορέα pLemiR ™ (Open Biosystems®). TOP10 ™ αρμόδια

Ε. coli

(Invitrogen®) ήσαν θερμότητα μετασχηματίζονται με τα προϊόντα απολίνωσης. Το DNA πλασμιδίου παρασκευάστηκε από καλλιέργειες επιλεγμένων απλών κλώνων με χρήση ενός κιτ που παρέχεται από Qiagen® (Valencia, CA). Ταυτότητα των πλασμιδίων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA σε έναν πυρήνα εγκατάσταση κατά το Roswell Park Cancer Institute στο Buffalo, ΝΥ (RPCI). Κατασκευασμένα φακοϊούς παρασκευάστηκαν με επιμόλυνση πλασμιδίων σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ TLA-™ χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια και πρωτόκολλα που παρέχονται με το σύστημα συσκευασίας Trans-λεντοϊών GIPZ ™ (Open Biosystems®). Α549 κύτταρα σε μεταγωγή με ιούς για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλονται σε επιλογή έναντι 2 μg /ml πουρομυκίνη για περίπου δύο εβδομάδες για να δημιουργήσει κυτταρικές σειρές Α549 /VEC, Α549 /146b, και Α549 /v146b, χρησιμοποιώντας ιούς που δημιουργείται με ένα άδειο pLemiR ™ φορέα, ή με τον φορέα που φέρει το φυσικό ή την παραλλαγή

προ-miR-146b

αλληλουχία, αντίστοιχα.

η κυτταρομετρία ροής

κυτταρομετρία ροής του προσφάτως συγκομίζονται κύτταρα χρωματισμένα με 1 μg /ml του

7

-αμινο-ακτινομυκίνη D χρωστική βιωσιμότητας (Sigma®, St. Louis, ΜΟ) πραγματοποιήθηκε σε ένα μηχάνημα FACSCalibur (BD Biosciences®, San Jose, CA). Ορθοί και οι πλευρικές διασποράς, και ο φθορισμός στα κανάλια FL2 και FL4 καταγράφηκαν για 10.000 γεγονότα, και οι τιμές φθορισμού FL2 χαράχθηκαν μετά gating από τα νεκρά κύτταρα με το λογισμικό CellQuest Pro ™ (έκδοση 5? BD Biosciences®).

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μέτρησης κυττάρων Kit-8 δοκιμασία (CCK-8? Dojindo Molecular Technologies®, Rockville, MD), το οποίο χρησιμοποιεί την βιοαναγωγή του

2

-(

2

-methoxy-

4

-nitrophenyl)-

3

-(

4

-nitrophenyl)-

5

-(

2

,

4

-disulfophenyl)-2H τετραζολίου νάτριο (WST-8) προς πορτοκαλόχρουν φορμαζάνης για τη μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Εν συντομία, 100 μΐ κυττάρων σε 2-4×10

4 /ml κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 96 φρεατίων. Σε διάφορα χρονικά σημεία κατά τις επόμενες τέσσερις ημέρες, το μέσο καλλιέργειας σε φρεάτια εις τετραπλούν αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 5% CCK-8 αντιδραστηρίου και μετά από μια ώρα, η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε σε ένα Multiskan Plus (ΜΤΧ Lab Systems® , Βιέννη, VA) αναγνώστη πλάκας. Οι τιμές απορρόφησης διορθώθηκαν με αφαίρεση εκείνων των φρεατίων ελέγχου που δεν έχουν κύτταρα.

ευαισθησία φαρμάκου δοκιμασίας

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 50% -60% συρροή σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων σε quintuplicate όταν το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με εκείνη που περιέχει 0,5-2,0 μg /ml είτε δοξορουβικίνης υδροχλωρικής (Enzo ζωής Sciences®, Farmingdale, ΝΥ) ή σισπλατίνη (Calbiochem®, San Diego, CA) ή κανένα. Μετά από δύο ημέρες καλλιέργειας, βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας

Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας προσκολλημένα, 200 κύτταρα επιστρώθηκαν ανά 35 mm δίσκο καλλιέργειας εις τριπλούν και καλλιεργήθηκαν με αλλαγές μέσου κάθε 4-5 ημέρες. Μετά από 10-14 ημέρες, πιάτα βάφτηκαν με 0.2% μπλε του μεθυλενίου σε 40% μεθανόλη για 30 λεπτά. Για το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ, ένα πιάτο πρώτα επικαλύπτεται με 1,5 ml μέσου που περιέχει 0,7% άγαρ (Sigma®) πριν τα κύτταρα, σε 2 ml μέσου που περιέχει 0,35% άγαρ, προστέθηκαν σε 150 κύτταρα /τρυβλίο. Μετά τον πολυμερισμό του αγαρόζης σε περίπου 15 λεπτά, προστέθηκαν 2 ml μέσου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 6-7 εβδομάδες με αλλαγή μέσου κάθε 4-5 ημέρες, και στη συνέχεια χρωματίζονται με 2 mg /ml βρωμιούχο θειαζολυλο μπλε τετραζόλιο (Sigma®) για 4-8 ώρες σε επωαστήρα κυτταρικής καλλιέργειας. Βιτρώ πιάτα σαρώθηκαν σε Perfection V700 (Epson®, Long Beach, CA), και μια ελάχιστη έκταση για τις εικόνες που αντιστοιχούν σε 3778 ή 199 μm

2, αντίστοιχα, για τις προσκολλημένη και μαλακό δοκιμασίες άγαρ αποικία, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των αποικιών για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ ™ (έκδοση 10.2? Εθνικό Ινστιτούτο Ψυχικής Υγείας, Bethesda, MD).

In vitro δοκιμασία

τρυβλία καλλιέργειας Έξι και επούλωση των πληγών ήταν σημειώνεται με ένα σταυρό-μαλλιά μοτίβο στην εξωτερική επιφάνεια του πυθμένα τους. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε υψηλή πυκνότητα για να φθάσει το 100% συρροή την ημέρα αργότερα, όταν ένα περίπου 2 cm μήκους και 0.5 mm που πλάτους πληγής έγινε σύροντας ένα πλαστικό 10 μΐ πιπέτας-tip κατά μήκος μιας ευθείας ακμής με μέτρια και συνεπής πίεση για να χαράξει το μονοστοιβάδα κυττάρων. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε στη συνέχεια. Τα κύτταρα απεικονίζεται αμέσως και μετά από μια μέρα του πολιτισμού σε 50x μεγέθυνση στις ίδιες θέσεις κατά μήκος των γρατσουνιές.

μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες Transwell ™

Είκοσι-τέσσερις-φρεατίων Transwell ™ με ένα πολυανθρακικό μεμβράνης και ένα 8 μm μεγέθους πόρων ελήφθησαν από Corning® (Corning, ΝΥ). Ημι-συρρέοντα κύτταρα που είχαν νηστεία επί 16-20 ώρες με καλλιέργεια σε ελεύθερο ορού μέσο ϋΜΕΜ + συλλέχθηκαν από 10 πιάτα cm-καλλιέργειας, πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό ισότονο διάλυμα (PBS? 137 mM NaCl, 2.7 mM ΚΟΙ, 10 mM Na

2HPO

4 και 1.76 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4 σε ρΗ 7,4), και την εκ νέου αναστολή σε ελεύθερο ορού + μέσο DMEM σε 2-3 × 10

5 κύτταρα /ml. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε 0.1 ml ϋΜΕΜ + ανά Transwell ™, με τα φρεάτια πυθμένα που περιέχει 0,6 ml + ϋΜΕΜ μέσο με 15% ορό εμβρύου μόσχου. Ο ίδιος όγκος κυτταρικά εναιωρήματα ταυτόχρονα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε φρεάτια πλακών καλλιέργειας 24 φρεατίων για την αξιολόγηση έμμεσα πυκνότητα κυττάρου με μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από 8-16 ώρες, όπως περιγράφεται για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Για τις δοκιμασίες εισβολή, οι μεμβράνες Transwell ™ προ-επικαλύφθηκαν με είτε Cultrex ™ PathClear ™ εκχύλισμα βασικής μεμβράνης που παρασκευάστηκε από κύτταρα ποντικού όγκου Engelbreth-Holm-Swarm, ή το κολλαγόνο Ι από τις ουρές του αρουραίου (Trevigen®, Gaithersburg, MD). Η επικάλυψη πραγματοποιήθηκε με καταβολάδες 50 μl των πρωτεϊνών στα 1,5 mg /ml και 50 μg /ml, αντίστοιχα, σε μέσο ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ + και επιτρέποντας στα στρώματα να στεγνώσει κάτω από το 90% υγρασία στους 37 ° C για 1 ώρα και 16- 24 ώρες, αντίστοιχα. Αποξηραμένα στιβάδες ξεπλύθηκαν τρεις φορές με ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ + μέσο πριν απλώθηκαν τα κύτταρα. Μετά από 8 ή 16-20 ώρες, αντίστοιχα, για τις δοκιμασίες μετανάστευσης ή εισβολή, άνω επιφάνειες των μεμβρανών Transwell ™ ήταν σκουπίζεται με μπατονέτες για να αφαιρέσετε μη μετεγκατάσταση κύτταρα. Στη δοκιμασία μετανάστευσης, τα κύτταρα που παραμένουν στις μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν με 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη-και βάφτηκαν όλη τη νύκτα με 0.2% w /v κρυσταλλικό ιώδες (Sigma®) σε 2% αιθανόλη. Μετά από διεξοδική πλύση με νερό για την απομάκρυνση τυχόν μη ενσωματωμένα βαφή, 300 μΙ 10% οξικού οξέος προστέθηκαν σε κάθε Transwell ™ για την εκχύλιση δεσμευμένων βαφή με ανακίνηση των φρεατίων σε 100 περιστροφές /λεπτό για 20 λεπτά. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν για απορρόφηση στα 595 nm χρησιμοποιώντας 10% οξικό οξύ ως αναφορά. Στις δοκιμασίες εισβολής, κόκκινο εικόνες φθορισμού των κυττάρων στις μεμβράνες Transwell ™ αποκτήθηκαν σε 50χ μεγέθυνση σε τρεις διαφορετικές πεδίου απόψεων. Οι μετρήσεις απορρόφησης ή ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά πεδίο ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις μετρήσεις κυτταρικής βιωσιμότητας των κυττάρων που είχαν ταυτόχρονα τοποθετήθηκαν σε ξεχωριστές κουλτούρες.

σχηματισμό Πνευμονική όγκου δοκιμασία

Το έργο εγκρίθηκε από διάφορες θεσμικές επιτροπές σε RPCI. Κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 70% συρροή συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση για τρία λεπτά, πλύθηκαν με PBS, και επανα-αιωρήθηκε σε παγωμένο + DMEM στους 5 × 10

6 κύτταρα /ml. Ένας τεχνικός εμπειρογνώμονας χρησιμοποίησε μια 1 ml-σύριγγα με μια βελόνα 27 G για την ένεση 0,2 ml κυττάρων σε φλέβα της ουράς με ανοσοανεπάρκεια, θηλυκό, 6-10 εβδομάδες ποντικών ηλικίας του CB-

Igh

–

1

β

/lcrTac-

Prkdc

scid

/στέλεχος Ros. Οι ποντικοί παρακολουθούνται δύο φορές την εβδομάδα για δύσπνοια, καθώς και για γενική αδιαθεσία και οποιαδήποτε ορατή εμφάνιση ενός καρκινικού βλάβης ή ανάπτυξη, και υποβάλλονται σε ευθανασία μετά από 12 εβδομάδες, ακόμη και αν κανένα από τα ποντίκια είχαν οποιοδήποτε από αυτά τα συμπτώματα ή σημεία. Πνεύμονες απομακρύνθηκαν, πλύθηκαν με PBS, σταθερό για μια ημέρα με 10% ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης-και ζυγίζεται μετά από κτύπημα μακριά περίσσεια υγρών με χαρτί κουζίνας.

σύλληψης Laser μικροδιατομής (LCM)

Αυτή η το έργο εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας σε RPCI, και εκτελούνται υπό την επίβλεψη ενός παθολόγος στο Τμήμα Παθολογίας του RPCI στους ιστούς από τις 12 περιπτώσεις του σταδίου Ι ΜΜΚΠ που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία στο ινστιτούτο. Φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένοι σε παραφίνη, χρησιμοποιήθηκαν 6-8 μm πάχους ιστού τομές με ιστό όγκου τουλάχιστον 70%, όπως επαληθεύεται από ιστολογική εξέταση από έναν παθολόγο. Tissue-τομές τοποθετήθηκαν σε γυάλινα πλακίδια επικαλύπτονται με μία μεμβράνη ναφθαλινικού πολυαιθυλενίου (Leica®, Wetzlar, Germany) και ξηραίνεται όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά de-παραφινοποίησης με ξυλόλιο ακολουθούμενη από σταδιακή επανυδάτωση όλη τη νύκτα χρησιμοποιώντας βαθμονομημένων αλκοολών, τα πλακίδια χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, και ξηραίνεται στον αέρα όλη τη νύκτα. LCM διεξήχθη σε ένα σύστημα LMD6000 (Leica®) σε μεγέθυνση 200χ με τις ρυθμίσεις λέιζερ δύναμη, την ταχύτητα και το δείγμα-ισορροπία των 80, 2 και 11, αντίστοιχα. Όγκου που περιέχουν περιοχές στις τομές που προσδιορίζονται από την αλλαγμένη κυτταρική μορφολογία των καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων. Τα στρωματικά και καρκινικών επιθηλιακών συστατικά τέτοιων περιφέρειες μικροτομή και συλλέχθηκαν σε ξεχωριστούς σωλήνες 0.5 ml. Για κάθε συστατικό, περιοχές 1-12 × 10

με 6 μm

2 (περίπου 0,5-7 × 10

4 κυττάρων-τμήματα) συλλέχθηκαν. Ο λόγος της περιοχής στρωματικά προς επιθηλιακά μεταβάλλεται από περίπου 0,6 έως 1.

Απομόνωση RNA

στήλες σίλικα, αντιδραστήρια και πρωτόκολλα που παρέχονται με το Purelink ™ RNA (Invitrogen®), ή υψηλής καθαρότητας ™ microRNA (Roche®) και FFPE RNA (Norgen Biotek®, Thorold, Καναδάς) σετ, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση σύνολο από 2-5 χ 10

6 καλλιεργημένα κύτταρα ή από πρωτεϊνάση μικροδιατομή κύτταρα Κ-θεραπεία. συγκέντρωση νουκλεϊκών οξέων στα παρασκευάσματα εκτιμήθηκε με φασματοφωτομετρία απορρόφησης στο Ultrospec II (ΕΚΒ Biochrom®, Cambridge, UK) ή NanoDrop ™ 1000 μέσα (Thermo Fisher Scientific®). Ένα φθορομετρική δοκιμασία χρησιμοποιώντας Quant-iT ™ RiboGreen (Invitrogen®) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων στις παρασκευές από τις μικροδιατομή κύτταρα. Ολικό RNA από MCF-7 ανθρώπινου καρκίνου του μαστού και ML-2 ανθρώπινης οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας ήταν ευγενική προσφορά, αντίστοιχα, τις ερευνητικές ομάδες των Drs. Gokul Das και Eunice Wang της RPCI.

Ημι-ποσοτικοποίηση των microRNAs με αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT-PCR)

Ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της ανθρώπινης microRNAs

ας-7α

,

miR-30a-5P

,

miR-146b-5P

και

miR-146b-3ρ

, και η μικρή πυρηνισκικός RNA

RNU6B

ήταν γίνεται με RT-PCR που βασίζεται σε TaqMan ™ microRNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems®, Foster City, CA? δοκιμασία αναγνωριστικά 377, 417, 1097, 2361 και 1093, αντίστοιχα). Εν συντομία, ένα RNA-ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο, και τα αντιδραστήρια που παρέχονται με το TaqMan ™ microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®) χρησιμοποιήθηκαν για να αντίστροφη μεταγραφή 10 ng ολικού RNA από κύτταρα, ή 5 μl 0,5-2000χιλ fM συνθετικών ώριμη microRNAs

miR-146b-5P

και

-3p

με 5 ‘φωσφορικό και 3’ υδροξυλίου τέρματα που προέρχονται από Invitrogen®. Το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε 40 κύκλο-PCR αντιδράσεις σε 7900HT πραγματικού χρόνου PCR μηχάνημα (Applied Biosystems®). Για κάθε αντίδραση, ο κύκλος ποσοτικοποίησης (C

q) τιμή, περίπου αντιστρόφως ανάλογη προς log

2 τιμή της συγκέντρωσης του αναλύτη RNA, ελήφθη με λογισμικό SDS ™ (Applied Biosystems® ? έκδοση 2.3). Ο μέσος όρος των C

q

τιμές των εις τριπλούν αντιδράσεις PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση. Όταν απαιτείται, C

q

τιμές για microRNAs ομαλοποιήθηκαν με αφαίρεση της τιμής για τον μικρό πυρηνισκικό

RNU6B

RNA.

ανάλυση γονιδιακής έκφρασης με τη χρήση της τεχνολογίας BeadChip ™

το συνολικό RNA, απομονωμένο από vec και Α549 /146Β κύτταρα Α549 /σε δύο πειράματα για την βιολογική επικάλυψη, παρασχέθηκε στον κοινόχρηστο εγκατάσταση γονιδιακής έκφρασης των RPCI για τις αναλύσεις. Απορρόφηση φασματοφωτομετρία και ηλεκτροφόρηση σε NanoDrop ™ 1000 και Bioanalyzer ™ 2100 (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA), αντίστοιχα, έδειξε ότι τα παρασκευάσματα RNA είχε 260 αναλογίες nm /280 nm απορρόφηση στην κλίμακα 1,9-2,0, 260 nm /230 nm αναλογίες απορρόφηση & gt? 1.8, και RNA αριθμούς ακεραιότητα & gt? 7. Illumina® TotalPrep RNA Amplification κιτ (Ambion®, Autin, ΤΧ) χρησιμοποιήθηκε για να μετατρέψει 500 ng RNA σε cDNA, το οποίο στη συνέχεια μεταγράφηκε ίη vitro για να παράγουν βιοτίνη σημασμένο RNA. αντιδραστήρια υβριδισμός αναμίχθηκαν με 750 ng του επισημασμένου RNA, και το μίγμα υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα στους 58 ° C για να BeadChips Έκφραση HumanRef-8 3.0 ™ array (Illumina®, San Diego, CA) που έχει ανιχνευτές για την ανίχνευση 24526 σχολιασμένα ανθρώπινη μεταγραφές . Μετά την πλύση και χρώση με χρωστική Cy3 στρεπταβιδίνη σημασμένη, BeadChips ™ απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το BeadArray Reader (Illumina®). Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν με το λογισμικό GenomeStudio ™ (έκδοση 2010.1? Illumina®), και στη συνέχεια σε επεξεργασία για φόντο διόρθωσης, μετασχηματισμός διακύμανση σταθεροποίησης, και στη συνέχεια ισχυρή splines-κανονικοποίηση μεταξύ συστοιχιών χρησιμοποιώντας το πακέτο lumi Bioconductor (έκδοση 1.14) για το R γλώσσα (έκδοση 2.11.1) με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Πρώτες και επεξεργασμένα στοιχεία μπορούν να βρεθούν στη NCBI Gene Expression Omnibus αποθετήριο με αριθμό ένταξης GSE29496. Η καλή ποιότητα των στοιχείων επιβεβαιώθηκε από την εξέταση διαφόρων πτυχών των δεδομένων, όπως συνιστάται από Illumina®. Multi-δοκιμές με ένα αντιστοιχισμένο t-test με συγκρατημένη στατιστικές t και διόρθωση Benjamini-Hochberg για ψευδή ρυθμό ανακάλυψη έγινε στα επεξεργασμένα δεδομένα χρησιμοποιώντας το πακέτο limma Bioconductor (έκδοση 3.4.5).

Άλλες

η EOS 450D ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Canon®, Lake Success, ΝΥ) και ένα μικροσκόπιο Axio ™ Παρατηρητής (Zeiss®, Maple Grove, ΜΝ) χρησιμοποιήθηκαν για μικροφωτογράφισης. Εκτός αν ορίζεται διαφορετικά, οι χημικές ουσίες που προμηθεύονται από Sigma® ή Thermo Fisher Scientific®. RNA πρόβλεψη δευτερογενούς δομής χρησιμοποιώντας mfold [23] με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις διεξήχθη σε απευθείας σύνδεση στην https://mfold.rna.albany.edu. Στατιστικές αναλύσεις και γραφική παράσταση του έγιναν με το λογισμικό Prism ™ (έκδοση 5.0c? GraphPad Software®, La Jolla, CA). Όλα τ δοκιμασίες ήταν αμφίδρομες, υποτίθεται ίσες διακυμάνσεις, και χρησιμοποιείται 0,05 ως το cut-off για τη λήψη απόφασης σημασία.

Αποτελέσματα

Δημιουργία κυτταρικών σειρών Α549 που υπερεκφράζουν

miR-146b

microRNAs

για να μελετηθεί η επίδραση της

miR-146b

υπερέκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, τα ανθρώπινα Α549 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα είχαν κατασκευαστεί για να υπερεκφράζουν την ανθρώπινη

προ-miR-146b

πρόδρομο microRNA. Ο φορέας λεντοϊού pLemiR ™, το οποίο φέρει ένα γονίδιο για αντίσταση πουρομυκίνης, τροποποιήθηκε με εισαγωγή DNA για την αλληλουχία προ-microRNA στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του γονιδίου που κωδικοποιεί για την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη TurboRFP και καθοδηγείται από τις μόνιμα ενεργών κυτταρομεγαλοϊού (CMV ) προαγωγό. Μετά μεταγωγή με φακοϊούς, και την επιλογή πουρομυκίνη, ένας σταθερός πληθυσμός κυττάρων που ονομάζεται Α549 /146b παρήχθη. Το Α549 /VEC κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας φορέα pLemiR ™ χωρίς ένθετο. Κύτταρα Α549 /v146b παρήχθησαν χρησιμοποιώντας τον φορέα με μία παραλλαγή ανθρώπινης

προ-miR-146b

αλληλουχία. Στην παραλλαγή, τα τμήματα νουκλεϊκών οξέων που αντιστοιχούν στο

miR-146b-5P

και –

3ρ

ακολουθίες microRNA μετατράπηκε (σχήμα 1Α) με την ιδέα ότι η διακύμανση μπορεί να οδηγήσει σε μια σχετικά υψηλότερη έκφραση του

miR-146b-3ρ

, δεδομένου ότι, μεταξύ των ανθρώπινων microRNAs, αυτά που δημιουργούνται από τα 5p χέρια του προ-microRNAs τείνουν να εκφράζονται περισσότερο από ό, τι εκείνων που προέρχονται από τις 3ρ όπλων [11]. Η mfold [23] RNA-αναδίπλωση αλγόριθμος προβλέπει ότι σαν φυσικό

προ-miR-146b

, η παραλλαγή προ-microRNA έχει πάρα μορφή στελέχους-βρόχου (σχήμα 1Α), με ΔΟ -31.9 kcal /mol η οποία είναι 5,2 kcal /mol περισσότερο από εκείνη του φυσικού προ-microRNA.

A

. Οι περισσότεροι σταθερό mfold-προβλεπόμενη δευτεροταγή δομή του ανθρώπινου

προ-miR-146b

και μια παραλλαγή προ-microRNA εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τα άκρα 5 ‘και 3’, θέσεις νουκλεοτιδίων, και τα τμήματα που αντιστοιχούν σε ώριμα

miR-146b-5P

και

-3p

ακολουθίες (

5p

και

3ρ

) υποδεικνύονται.

Β

. Ιστογράμματα για κόκκινο φθορισμό ποσοτικοποιείται με κυτταρομετρία ροής του Α549 και Α549 που προέρχονται από κυτταρικές σειρές σταθερά μεταγωγή με φακοϊούς φέρουν κατασκευάσματα μηχανικής για έκφραση των ανθρώπινων

προ-miR-146b

(

Α549 /146b

) ή παραλλαγή του φαίνεται στο

Μια

(

Α549 /v146b

), ή ούτε (

Α549 /vec

).

C

. Σύγκριση των

miR-146b-5P

και

-3p

επίπεδα (

5p

και

3ρ

), κανονικοποιημένη με εκείνη του

RNU6B

μικρό πυρηνισκικός RNA, στα Α549 προερχόμενα κυτταρικές σειρές όπως αξιολογείται χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή ακολουθούμενη από PCR (RT-PCR). Μέσα και τυπικά σφάλματα τους για τις μετρήσεις από τρία διαφορετικά πειράματα παρουσιάζονται.

D

. Τυπικές καμπύλες που δείχνουν τη σχέση μεταξύ του κύκλου ποσοτικοποίησης (

C

q

) την αξία και τη συγκέντρωση του RNA στο

miR-146b-5P

και

-3p

(

5p

και

3ρ

) προσδιορισμούς RT-PCR των συνθετικών

miR-146b-5P

και

-3p

RNA, αντίστοιχα. Ένα

λογαριθμική κλίμακα 2 χρησιμοποιείται για τον άξονα Χ.

E

. Ημι-ποσοτικοποίηση των σχετικών ποσοτήτων του

miR-146b-5P

και

-3p

στο RNA του 293Τ, BEAS-2B, MCF-7, και ML-2 (μέσα, μόνο τα πειράματα ), και τα τρία Α549 προερχόμενα κυτταρικές σειρές, (μέσα και τυπικά σφάλματα τους για τις μετρήσεις από τρία διαφορετικά πειράματα) δείχνεται.

η

ισχυρή και σταθερή έκφραση της προ-microRNA που φέρουν γονίδιο TurboRFP σε & gt? 90% των κυττάρων από κάθε κυτταρική γραμμή επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής φθορισμού (σχήμα 1 Β και δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πολλαπλές παρασκευάσματα κυτταρικού RNA υποβλήθηκαν σε δοκιμασία για

miR-146b-5P

και

-3p

ώριμη microRNAs με RT-PCR. Η υπερέκφραση του

miR-146b

microRNAs παρατηρήθηκε και στις δύο Α549 /146Β και Α549 /κυτταρικές σειρές v146b (σχήμα 1Γ). Σε σύγκριση με το Α549 /VEC,

miR-146b-5P

και

-3p

έκφρασης, κανονικοποιημένη με εκείνη του 45 βάσεων μήκους, καθαριότητα μικρό γονίδιο πυρηνισκικός RNA

RNU6B

, ήταν αντίστοιχα κατά μέσο όρο 4.9- και 6.6-φορές υψηλότερη σε κύτταρα Α549 /146b. Σε Α549 /v146b, ήταν αντίστοιχα κατά μέσο όρο 2.6- και 6,5 φορές υψηλότερες, γεγονός που υποδηλώνει την παραλλαγή προ-microRNA που εκφράζεται από αυτό υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε ώριμα

miR-146b-5P

και

-3p

microRNAs. Για να ποσοτικοποιηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια την επίδραση της μεταβολής από την αναλογία των ποσών των

miR-146b-5P

και

-3p

στα κύτταρα, συνθετικά

miR-146b-5P

και

-3p

RNAs χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθούν πρότυπες καμπύλες για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ των μετρήσεων RT-PCR (C

q

αξίες) και ανέρχεται RNA. Αν και αναλύσεις για τις δύο microRNAs είχαν παρόμοιες κινητικές RT-PCR, με κάθε ημερολόγιο

2 αλλαγής της μονάδας στην είσοδο του RNA που παράγουν περίπου μια αλλαγή της μονάδας στην C

q

αξία σε μια περιοχή αραίωσης των 12 log

2 μονάδες, η ευαισθησία του

miR-146b-5P

δοκιμασία ήταν υψηλότερα κατά περίπου 3,6 C

q

της μονάδες (εικόνα 1D). Ως εκ τούτου,

miR-146b-3ρ

C

q

τιμές προσαρμόστηκαν αφαιρώντας 3.6 προκειμένου να συγκριθούν τα ποσά των

miR-146b-5P

και

-3p

RNA. Σε όλες τις τρεις Α549 που προέρχονται από κυτταρικές σειρές,

miR-146b-5P

microRNA ήταν παρόν σε μια ποσότητα που ήταν περίπου 4-6 φορές υψηλότερη από εκείνη του

-3p

microRNA (1Ε σχήμα). Η μεταβολή στην προ-microRNA ακολουθία βρέθηκε να έχει σημαντική επίδραση στην αναλογία των ποσών των

miR-146b-5P

και

-3p

στα Α549 κύτταρα /v146b σε σύγκριση με το κύτταρα Α549 /146b. Εξέταση του RNA από το ανθρώπινο 293Τ εμβρυϊκού νεφρού, BEAS-2Β φυσιολογικό βρογχικό, MCF-7 καρκίνου του μαστού, και ML-2 οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας, έδειξαν ότι σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές επίσης,

miR-146b-5P

είναι παρόν σε μια 4-22 φορές υψηλότερη μοριακή περίσσεια από

-3

p (σχήμα 1 Ε). Έτσι, η ώριμη microRNA που παράγεται από την 5ρ σκέλος του

προ-miR-146b

φαίνεται να είναι πολύ πιο διαδεδομένη από ό, τι το ένα από το 3ρ σκέλος, όπως προτείνεται από άλλες μελέτες [8], [9]. Έκφραση του miR-146b-5P στο 293Τ, BEAS-2B, MCF-7 και κύτταρα ML-2 ήταν 23.8-, 0.7-, 0.6- και 2,8 φορές του ότι σε Α549 /VEC.

Η υπερέκφραση του

miR-146b

microRNAs έχει μικρή μόνο επίδραση στο φαινότυπο Α549 κυττάρων

Τα Α549 που προέρχονται από κυτταρικές σειρές εξετάστηκαν για να προσδιορίσουν ένα αποτέλεσμα της

miR-146b

υπερέκφραση επί των κυττάρων Α549. Μετρήσεις κυττάρων βιωσιμότητα συναρτήσει του χρόνου δείχνει ότι, σε σύγκριση με Α549-VEC, τόσο Α549 /146b και Α549 /v146b πολλαπλασιάστηκαν ομοίως σε κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 2Α). Αυξημένη

miR-146b

επίπεδα δεν φαίνεται να επηρεάζει την ευαισθησία των κυττάρων σε είτε cisplatin ή doxorubicin σε συγκεντρώσεις του φαρμάκου που κυμαίνονται από 0,5 έως 2 μg /ml, ακόμη και αν τα φάρμακα ήταν σαφώς κυτταροτοξική για τα κύτταρα κατά τη υψηλότερη συγκέντρωση (σχήμα 2Β). Και οι δύο είναι αντικαρκινικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία NSCLC. Ωστόσο, με την υπερέκφραση του microRNA, τόσο Α549 /146b και Α549 /κυττάρων v146b σχηματίζεται μόνο το 80% και 65%, αντίστοιχα, ως πολλές αποικίες ως Α549 /VEC έκανε από μεμονωμένα κύτταρα σε καλλιέργεια προσκολλητικών κυττάρων στην πλαστική επιφάνεια του ιστού πλάκες καλλιέργειας (t test τιμές Ρ 0,04 και & lt? 0,01, αντίστοιχα).