Αφηρημένο

Αν και μερικές μελέτες που περιγράφονται τα χαρακτηριστικά του καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) και ο ρόλος των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (ΠΕΑ) σε νεοαγγείωση, εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενο κατά πόσον υπάρχει αλληλεπίδραση ή όχι μεταξύ ΚΕΠ και ΠΕΑ. Στην παρούσα μελέτη, HCT116 και ΗΤ29 σφαίρα μοντέλα, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι τα κύτταρα εμπλουτίζοντας ΚΕΠ, καθιερώθηκαν για να διερευνήσει τους ρόλους αυτής της αλληλεπίδρασης στην ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε σύγκριση με τη γονική τους ομολόγους τους, σφαιροειδές κύτταρα απέδειξαν μεγαλύτερη χωρητικότητα της εισβολής, υψηλότερη ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό. Στη συνέχεια, η in vitro και in vivo σχέση μεταξύ ΚΕΠ και EPCs μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία σχηματισμού τριχοειδούς σωλήνα και τα μοντέλα ξενομοσχεύματος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σφαιροειδές κύτταρα θα μπορούσε να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και σωλήνας σχηματισμό EPCs μέσω έκκρισης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF). Εν τω μεταξύ, οι ΠΕΑ θα μπορούσαν να αυξήσουν ογκογόνο ικανότητα των κυττάρων σφαιροειδές μέσω της αγγειογένεσης. Επιπλέον, μεγαλύτερη πυκνότητα μικροαγγείων ανιχνεύθηκε στα εμπλουτισμού περιοχή καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε ιστό ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι σφαιροειδές κύτταρα διαθέτουν τα χαρακτηριστικά των καρκινικών βλαστικών κυττάρων, και η αλληλενέργεια των ΚΕΠ και ΠΕΑ μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Wei Β, Han ΧΥ, Qi CL, Zhang S, Zheng ZH, Huang Y, et al. (2012) αλληλενέργεια της σφαιροειδή βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν και τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (6): e39069. doi: 10.1371 /journal.pone.0039069

Επιμέλεια: Giovanni Camussi, Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Ιταλία

Ελήφθη: 25 Δεκεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 18η Μαΐου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Ιουνίου 2012

Copyright: © 2012 Wei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Νο 30872462 στο Χονγκ-Bo Wei, και Νο 81000960 έως Bo Wei). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, και το ποσοστό σχετικής επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 53,8 – 65,2%, παρά διαγνωστικές και θεραπευτικές εξελίξεις [1], [2]. Όγκου υποτροπής και μετάσταση είναι δύο κρίσιμα επιβίωση-παράγοντες που επηρεάζουν καρκίνου του παχέος εντέρου.

Πρόσφατα, όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι η έναρξη και μεταστάσεις όγκων εξαρτώνται από μια μικρή υπο-πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) που φέρει απεριόριστες δυνατότητες αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διαφορετικούς πληθυσμούς που περιλαμβάνουν έναν όγκο [3]. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, καρκινικά βλαστικά κύτταρα βρέθηκαν να διατηρήσουν την καρκινογένεση, μετάσταση, και την επανάληψη του ορθοκολικού καρκίνου.

Η ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου για πρώτη φορά αποδείχθηκε στο πλαίσιο της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας [4]. Η αρχή αυτή επεκτάθηκε περαιτέρω σε ορισμένους συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού, όγκοι του εγκεφάλου, και ο καρκίνος του πνεύμονα [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Διαλογή κυττάρων του υπο-πληθυσμού με βάση δεικτών κυτταρικής επιφάνειας και την επιβεβαίωση της δραστικότητας ογκογενή τους σε δοκιμασίες μεταμόσχευση ξενομοσχεύματος χρησιμοποιούνται συνήθως διαδικασίες για την απομόνωση και την ταυτοποίηση των ΚΕΠ από ιστούς όγκου ή κυτταρικές γραμμές [11]. Αν και CD133, CD44, EpCAM χρησιμοποιήθηκαν εκτενώς ως δείκτες κυτταρικής επιφάνειας για τον καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα, υπήρχαν ακόμη αμφιβολίες σχετικά με αυτούς τους δείκτες κυτταρικής επιφάνειας [12], [13]. Side πληθυσμό κυττάρων (SP) απομόνωση ήταν κάποτε χρησιμοποιούνται για τον εμπλουτισμό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Αλλά αρκετές μελέτες έδειξαν στοιχεία σε βάρος μιας σύνδεσης μεταξύ των κυττάρων SP και καρκινικά βλαστικά κύτταρα [14], [15], [16], [17]. Πρόσφατα, η αύξηση έρευνες έχουν αναφέρει ότι τα μη προσκολλημένα, τρισδιάστατο σφαίρες (3D) όγκου υπό συνθήκες χωρίς ορό θα μπορούσε αποτελεσματικά να εμπλουτίσει καρκινικά βλαστικά κύτταρα [18], [19], [20]

in vitro

. Ως εκ τούτου, αυτή η μέθοδος εφαρμόστηκε για τον εμπλουτισμό καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων στην παρούσα μελέτη.

Τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPCs), ένα μικρό υποπληθυσμό του μονοπύρηνων κυττάρων κλάσμα στο περιφερικό αίμα, προέρχονται κυρίως από το μυελό οστών κύτταρα με την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα [21], [22]. EPCs αφήνουν το μυελό των οστών και την πρόσληψη σε θέσεις που απαιτούν αγγειακό επισκευή ακόλουθες διαβαθμίσεις αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες που απελευθερώνονται στην κυκλοφορία από τραυματισμένους ιστούς ή όγκους, και στη συνέχεια συμβάλλουν στη σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων [23], [24]. Πρόσφατες αποδείξεις έδειξαν ότι κυκλοφορούντα EPCs παίζουν σημαντικό ρόλο στη νεοαγγείωση όγκου, ανάπτυξη όγκου, μετάσταση και [25], [26], [27], [28], [29].

Αν και η συμβολή του EPCs να νεοαγγείωση όγκου έχει αποδειχθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, η αλληλεπίδραση μεταξύ EPCs και βλαστικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου δεν έχουν αναφερθεί. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθορίσει τις βιονομία των βλαστικών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και του ρόλου του κοινού δράση των ΚΕΠ και ΠΕΑ στην ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα που αφορούν τα ανθρώπινα συμμετέχοντες (συμπεριλαμβανομένης της συλλογής των ανθρώπινων δειγμάτων αίματος του ομφάλιου λώρου και του παχέος εντέρου ομφάλιο) εγκρίθηκαν από το Medical Research Επιτροπή Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University, και διεξάγονται σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Όλοι οι συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη υπέγραψαν τις ενημερωμένες μορφές συναίνεσης και όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες. Και το έργο αυτό εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικών Ερευνών ζώων Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University.

Cell Culture

HCT116 (ATCC, CCL-247) και ΗΤ29 (ATCC, ΗΤΒ-38) κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% FBS, 200 U /ml πενικιλλίνη, 200 μg /ml στρεπτομυκίνη. Tumorsphere μέσα (που ονομάζεται επίσης ως μέσο ελεύθερο ορού, SFM) αποτελείτο από DMEM media /F12 συμπληρωμένο με 1 × Β27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), ρουτίνα ινσουλίνη (5 μg /ml, Invitrogen), 200 U /ml πενικιλλίνη, και 200 ​​μg /ml στρεπτομυκίνη. Για 3D καλλιέργεια εναιωρήματος, HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα αναπτύσσονται σε δύο διαστάσεων μονοστιβάδα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη, επαναιωρήθηκαν, και στη συνέχεια εμβολιάζεται σε πυκνότητα 2 × 10

6 κύτταρα σε SFM σε 100 mM εξαιρετικά χαμηλές πιάτα προσάρτησης (Corning) σε 37 ° C σε μια υγροποιημένη 5% CO2; 95% ατμόσφαιρα αέρα.

Ανίχνευση CD133 Έκφρασης με κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα που προέρχονται από καλλιέργειες μονοστιβάδας και σφαίρες αναστολής την 7η ημέρα μετά την κύρια καλλιέργεια ανιχνεύθηκαν για την έκφραση του CD133. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, και στη συνέχεια τα κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν στους 4 ° C με 1:10 FITC-συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντιανθρώπινο CD133 Ab (Miltenyi Biotec) για 45 λεπτά στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS με 1% BSA και επαναιωρήθηκαν σε 400 μΙ ψυχρού PBS με 1% BSA για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μέσα σε 1 ώρα.

Αυτο-ανανέωση και Multi-διαφοροποίηση Δοκιμασία

κύτταρα σφαιροειδείς διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα και απλώθηκαν σε πλάκες των 6-φρεατίων σε 100 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 2 ml SFM. Για την αξιολόγηση της αυτο-ανανέωση χωρητικότητα σφαιροειδούς κυττάρων, χρώση ανοσοφθορισμού των κυττάρων του Lgr5 και ΟΚ20 διεξήχθησαν μετά από την καλλιέργεια 7 ημερών. διαφοροποίηση των κυττάρων που προκαλείται από καλλιέργεια σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% FBS σε κοινές φιάλες. Τέσσερις εβδομάδες αργότερα, η ίδια χρώση των κυττάρων ανοσοφθορισμός και η έκφραση του CD133 καθορίστηκε από FCM όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Single-κυτταρικά εναιωρήματα των σφαιροειδές και προσκολλημένα κύτταρα παρασκευάστηκαν και σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων, και καλλιεργήθηκαν σε είτε SFM ή μέσου που περιέχει ορό επί 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτελέστηκε την ημέρα 1, 2, 3, 4, 5, 6, και 7 με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Ιαπωνία). Η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πλάκα διεξήχθη για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας των κυτταρικών στις τέσσερις ομάδες. Single-κυτταρικά εναιωρήματα επιστρώθηκαν σε 1 × 10

2 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, και καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν ορό στους 37 ° C σε 5% CO2 επί 2 εβδομάδες. Στη συνέχεια οι πλάκες βάφτηκαν με χρώση Giemsa-Ράιτ. Ο αριθμός των αποικιών σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές.

Η ομοιογένεια και Δοκιμασία ετερογένεια πρόσφυσης

Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων να ECM ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ινονεκτίνη (FN) -επικαλυμμένα πλάκες 96-φρεατίων (Corning) . Single-κυτταρικά εναιωρήματα του σφαιροειδούς και προσκολλημένα κύτταρα τοποθετήθηκαν (10

5 /φρεάτιο), και επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες, μετά πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση των μη-συγκολλητικό κύτταρα. Delt OD του μήκους κύματος 570 nm ήταν αποφασισμένος να αντικατοπτρίζει τις FN-προσκολλημένα κύτταρα με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Ιαπωνία). Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων σε ομογενή κύτταρα δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας πλάκες 96 φρεατίων μονοστιβάδα κυττάρων-στρωμένος. Σφαιροειδές και προσκολλημένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε 10

5 ανά φρεάτιο, και επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά, 90 λεπτά, και 120 λεπτά. Στη συνέχεια, οι μη συγκολλητικές κύτταρα μετρήθηκαν και ομοτυπική συγκολλητική δραστικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο:. Ομοτυπική προσκόλληση (%) = (συνολικός αριθμός των κυττάρων – μη συγκολλητικό κύτταρα) /ολικά κύτταρα χ 100%

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν σε θαλάμους πλάκα transwell 24 φρεατίων με 8 μπι-πόρων ένθετα φίλτρο πολυανθρακικό (Corning). Ένα σύνολο 5 × 10

4 ή 10

5 διίσταται σφαιροειδές ή προσκολλητικά κύτταρα σπάρθηκαν σε μη επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα σε 100 μΙ ένθετα μέσου χωρίς ορό για τη μετανάστευση ή την εισβολή δοκιμασίες αντίστοιχα. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 0.5 ml 10% FBS θρεπτικό μέσο συμπληρωμένο /F12 DMEM. Μετά από 24 ώρες ή /και 48 ώρες, τα κύτταρα στην άνω πλευρά του φίλτρου απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του ενθέματος σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός βαμμένων κυττάρων μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Ανάλυση Western Blot

Τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε πολυβινυλιδενοφθορίδιο μεμβράνης (Millipore) για ICAM-1, CXCR4 και ανίχνευση VEGF. Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween (TBST, που αποτελείται από 10 mM Tris-HCl, ρΗ 8, 150 mM NaCl, και 0,05% Tween 20), δεσμεύτηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με 5% άπαχο γάλα σε TBST, και έπειτα ανιχνεύθηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnologies), αντι-CXCR4 (Abcam), αντι-VEGF (BD Pharmingen) και αντι-GAPDH (Peprotech). Μετά την επώαση με δευτερογενές αντίσωμα χρένο υπεροξείδιο-συζευγμένο, ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με σύστημα ανίχνευσης ECL (Millipore). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (ThermoScientific Biosciences).

Απομόνωση και Εκτίμηση των EPCs

Τα μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας από αίμα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου και καλλιεργήθηκαν σε φιμπρονεκτίνη -επικαλυμμένα φιάλη χρησιμοποιώντας Μ199 συμπληρωμένο με 20% FBS και 1% εκχυλίσματα του εγκεφαλικού ιστού ποντικού. EPCs καθαρίστηκαν βασίζοντας σε διαφορετικό ρυθμό προσκόλληση, και μη προσκολλημένα κύτταρα μέσα σε 24 ώρες μεταφέρθηκαν σε άλλη φιάλη φιμπρονεκτίνη με λεπτό υμένιο. Μετά από καλλιέργεια για 14 ημέρες, ΚΠΑ επωάστηκαν με ΡΕ-CD133, FITC-CD34, ΡΕ-VEGFR2 ή IgG ελέγχου ισότυπο και προσδιορίζονται με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Κυττάρου πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ΚΠΑ

Single-κυτταρικό εναιώρημα EPCs σπάρθηκε στα 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων, και καλλιεργήθηκαν σε Μ199 που περιέχει 0, 20% και 40% υπερκείμενο από σφαιροειδές ή προσκολλημένων κυττάρων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτελέστηκε την ημέρα 1, 2, 3, 4, 5, 6, και 7 με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Ιαπωνία). δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν για την αξιολόγηση πρόσληψης του ΠΕΑ από σφαιροειδές ή προσκολλημένων κυττάρων. Single-κυτταρικό εναιώρημα EPCs εμβολιάστηκε σε 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ένθετα σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 0.5 ml ϋΜΕΜ /Ρ12 που περιέχει 40% υπερκείμενο σφαιροειδές ή προσκολλημένων κυττάρων. Μετά από 24 ώρες, μετανάστευσαν κύτταρα μετρήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

In vitro

τριχοειδή σχηματισμό Tube

Τα υπερκείμενα του ΗΤ29, ΗΤ29 σφαίρα, HCT116 και HCT116 Σφαίρα προστέθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων (Corning Inc ) επικαλυμμένα με αυξητικό παράγοντα μειώνεται Matrigel (BD Biosciences). Για να φανεί εάν ικανότητα σχηματισμού σωλήνα των EPCs μπορεί να επηρεαστεί από το κλείδωμα του VEGF, bevacizumab (Avastin, ένα VEGF monoclone αντίσωμα, Genentech Inc) προστέθηκε σε υπερκείμενο κυττάρων σφαιροειδούς σε συγκέντρωση 0,25 mg /ml ως άλλες δύο ομάδες [30], [31]. Στη συνέχεια, ένα σύνολο 5 × 10

4 EPCs σπάρθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO2 για 3 έως 30 ώρες. Μετά από 24 ώρες, τριχοειδείς σωλήνες μετρήθηκαν σε τυχαία πεδία από κάθε φρεάτιο. Οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ELISA

VEGF έκκρισης

Για να αποδείξει το ένα παρακρινή επίδραση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου και να επιβεβαιώσει το αποτέλεσμα της ανίχνευσης του VEGF από την ανάλυση Westerm Blot, ερευνήσαμε από καρκινικά βλαστικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ποσοτική μέθοδος. συγκέντρωση VEGF σε υπερκείμενο του σφαιροειδούς /προσκολλημένων κυττάρων προσδιορίστηκαν με ELISA (R &? D Systems) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Και, επίσης, το πείραμα εκτελέστηκε τρεις φορές.

In vivo

Ογκογένεση

Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα σφαιροειδές είναι πιο ογκογόνο από προσκολλημένη ομολόγους τους

in vivo

και αν ΚΠΑ προώθηση ογκογόνο ικανότητά τους με την αύξηση της αγγειογένεσης των όγκων, θα πραγματοποιηθεί την ανάπτυξη των όγκων και πειράματα μετάσταση στο ήπαρ. Μεμονωμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS. Και στη συνέχεια 100 αναστολές μl που περιέχει 2 × 10

6 προσκολλημένα κύτταρα, σφαιροειδές κύτταρα, ή κύτταρα σφαιροειδές συν 2 × 10

5 ή 2 × 10

4 ΠΕΑ (τα κύτταρα σφαιροειδές και αναλογία ΚΠΑ του 10:01 και 100:1) εγχύθηκαν υποδορίως (sc) στα πλευρά του 4- έως 6-εβδομάδων αρσενικούς BALB /C ηυ-ποντικού, που λήφθηκε από το Εργαστήριο Jackson. Υποδόρια διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν με ένα ψηφιακό παχύμετρο κάθε δύο ή τρεις ημέρες, και ο όγκος του όγκου σε mm

3 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: Όγκος = πλάτος

2 × μήκος × 0,52. Στη συνέχεια, 3 ή 4 εβδομάδες αργότερα, οι ποντικοί θανατώθηκαν και τα τμήματα κατεψυγμένου ιστού (6 μm) υποδόριων όγκων έγιναν για χρώση ανοσοφθορισμού να παρατηρηθεί η αγγειογένεση σε κάθε ομάδα. Εδώ χρησιμοποιούμε ένα μη ειδικό αντίσωμα πολυκλωνικό CD31 για την ανίχνευση της νεοαγγείωσης του υποδόριου όγκου, και ένα άλλο μονοκλωνικό ανθρώπινο αντίσωμα ειδικό για CD31 για τη συνεισφορά ΠΕΑ να angiogoiesis.

In vivo

μετάσταση στο ήπαρ

ήπατος μεταστατικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του μεταστατικού δυναμικού των σφαιροειδές κυττάρων και κατά πόσον ΚΠΑ προωθήσει αυτή την ικανότητα με την αύξηση της αγγειογένεσης των όγκων. Ηπατικές μεταστάσεις παράχθηκαν από ενδοσπληνική ένεση 4 × 10

6 προσκολλημένα κύτταρα, σφαιροειδές κύτταρα, ή speroid κύτταρα συν 4 × 10

5 ή 2 × 10

4 ΠΕΑ (η αναλογία των 10:01 ή 100 :1), και στη συνέχεια διεξήχθη σπληνεκτομή 10 λεπτά μετά ενδοσπληνική ένεση για να αποφύγετε μετάσταση Splend. Η συνολική κατάσταση της υγείας καταγράφηκε λεπτομερώς μία φορά την ημέρα. Εστιών στο ήπαρ μετάσταση εξετάστηκαν και μετρήθηκαν. Και το τμήμα του ιστού έγινε για HE χρώση για να επιβεβαιώσετε την παθολογική πηγή.

Κλινική αποδεικτικά στοιχεία που προκύπτουν από χρώση ανοσοφθορισμού

Κατεψυγμένα τμήματα (6 μm) των ιστών του καρκίνου του παχέος εντέρου και φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (n = 15 , από τον ίδιο ασθενή) σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη /PBS, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μικροκύματα για 10 min για χρώση ανοσοφθορισμού. Το αντι-CD31 Ab (Fisher Scientific), το αντι-CD133 Ab (Abcam), το αντι-Lgr5 Ab (Abcam), και το αντι-ΟΚ20 Ab (Santa Cruz Biotechnologies) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντιχρωματισμός πυρήνων με ϋΑΡΙ (Invitrogen) διεξήχθη επίσης. Οι τομές επωάστηκαν με δευτερεύον σύμφωνα DeLight448- ή 555-συζευγμένο αντι-ποντικού ή κουνέλι Ab (Abcam) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Εικόνες συνελήφθησαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο Zeiss (LSM-710). Εδώ, σε όλη αυτή χειρόγραφο, τα δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα έχουν αναλυθεί για να επαληθεύσει την αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni μετά δοκιμή hoc για πολλαπλές συγκρίσεις ή t-test του Student. Για όλες τις δοκιμές, η P & lt? 0,05 ή & lt? 0,01 θεωρήθηκε σημαντική ή πολύ σημαντική στατιστικά

Αποτελέσματα

Δημιουργία και Χαρακτηρισμός των Colonospheres

Τόσο HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. μεγάλωσε σε μεγάλα στρογγυλά, ασύνδετος αποικίες επιπλέοντα σφαιροειδές (ονομάζεται colonospheres) όταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένου με 1 × Β27, 20 ng /ml EGF, 10 ng /ml bFGF (Εικόνα 1). Η συχνότητα των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας προσδιορίστηκε εκτελώντας μια ακραία περιοριστική ανάλυση αραίωσης (ΕΛΔΑ) για τη γονική και colonospheres προερχόμενα κύτταρα ΗΟΤ-116. Η συχνότητα για το σχηματισμό σφαίρες βρέθηκε να είναι 5,5 φορές υψηλότερη για τα κύτταρα που προέρχονται από colonospheres από εκείνες από τις γονικές κυτταρικές σειρές.

Τόσο HCT116 και ΗΤ29 μπορούν να σχηματίσουν μεγάλα στρογγυλά, ασύνδετος κυμαινόμενο colonsphere 50-100 μm όταν καλλιεργούνται σε SFM. Όταν σφαιροειδές κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS μέσο που περιέχει τα κύτταρα επιπλέοντα σφαιροειδές συνδέονται με το πλαστικό, σταδιακά μετανάστευσαν από colonspheres και μετασχηματίζεται σε προσκολλημένα κύτταρα.

Η

Τα κύτταρα σφαιροειδές έδειξαν υψηλότερα επίπεδα CD133 και Lgr5 (γνωστή ως δείκτες του παχέος εντέρου CSC), αλλά χαμηλότερα επίπεδα των διαφοροποιημένων επιθηλιακών κυττάρων ΟΚ20 δείκτη από τα αντίστοιχα γονικά κύτταρα. Η αναλογία των θετικών κυττάρων CD133 βρέθηκε να είναι λιγότερο από 1% σε γονικές κυτταρικές σειρές, αλλά περισσότερο από το 80% που παρατηρήθηκε σε σφαιροειδές κύτταρα (Σχήμα 2). Όταν οι colonospheres υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού για Lgr5, προφανής χρώση Lgr5 παρατηρήθηκε στην επιφάνεια των περισσοτέρων κυττάρων σφαιροειδούς υποδεικνύοντας την παρουσία ΚΕΠ σε colonosphere (Σχήμα 2). Όταν τα κύτταρα σφαιροειδές καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS μέσο που περιέχει, αυτοί συνδέονται με το πλαστικό, σταδιακά μετανάστευσαν από σφαίρες του παχέος εντέρου και μετατράπηκε σε προσκολλημένα κύτταρα μορφολογικά. Η κυτταρομετρία ροής και η εξέταση ανοσοφθορισμού έδειξε κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση CD133 και Lgr5 με ρυθμισμένα προς τα πάνω ΟΚ20 μετά από 4 εβδομάδες καλλιέργειας (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΚΕΠ ήταν αποτελεσματικά εμπλουτισμένο σε σφαιροειδές κύτταρα και έχουν την ικανότητα της αυτο-ανανέωση και πολυ-διαφοροποίηση.

CD133 (γνωστό και ως δείκτης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων) έκφραση αυξάνεται από ≤1.2% έως 60 % -80%, όταν καλλιεργούνται σε SFM, αλλά μειώνεται στο 5% -10%, όταν ο colonsphere άλλαξε πάλι σε προσκολλημένα κύτταρα. Η ίδια αλλαγή των Lgr5 (γνωστό και ως δείκτης κρύπτη των βλαστοκυττάρων) έκφραση μπορεί να βρεθεί, ενώ η έκφραση ΟΚ20, ο δείκτης των διαφοροποιημένων επιθηλιακών κυττάρων, έδειξε την αρνητική μεταβολή.

Η

σφαιροειδές κύτταρα επιδεικνύουν μεγαλύτερη χωρητικότητα της διάδοσης των πυρηνικών όπλων και κλώνος Σχηματισμός

Είμαστε αποφασισμένοι περαιτέρω εάν τα κύτταρα σφαιροειδές έχουν την ικανότητα της τριτοβάθμιας κυτταρικού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας CCK-8 δοκιμασία. Οι πολλαπλασιασμοί του σφαιροειδούς κυττάρων ήταν μεγαλύτερη από εκείνη της γονικής ομολόγου τους μετά από μια περίοδο προσαρμογής σε ορό που περιέχει μέσο (Σχήμα 3Α και 3Β). Και η ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε σφαιροειδές ομάδες κυττάρων ήταν υψηλότερη από εκείνη της γονικής ομόλογό τους (Σχήμα 3C και 3D).

(Α-Β) Πολλαπλασιασμός των HCT116 και ΗΤ29 σφαιροειδή κύτταρα ήταν υψηλότερη από εκείνη της γονικής τους ομολόγους μετά από μια περίοδο προσαρμογής σε ορό μέσο που περιέχει. (C-D) Η ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε σφαιροειδές ομάδες κυττάρων ήταν υψηλότερη από εκείνη της γονικής ομόλογό τους.

Η

σφαιροειδές κύτταρα επιδεικνύουν Κάτω πρόσφυση αλλά Ανώτατης

in vitro

μεταναστευτικών /επεμβατική χωρητικότητα

για να διερευνηθεί η κακοήθης προφίλ των σφαιροειδές κυττάρων, που διεξάγονται in vitro δοκιμασίες για να αξιολογήσει την πρόσφυση και μεταναστευτικών /επεμβατική ικανότητα των κυττάρων σφαιροειδές σε σύγκριση με τα προσκολλημένα ομολόγους τους. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας προσκόλλησης κυττάρου έδειξαν ότι σφαιροειδές κύτταρα έχουν χαμηλότερες ικανότητες τόσο προσκόλληση στην FN (ένα από τα βασικά συστατικά ECM) και προσκόλληση σε ομοιογενή γείτονές τους, σε σύγκριση με γονικά κύτταρα τους (Σχήμα 4Α και 4Β). Στη συνέχεια, CXCR4 και ICAM-1 έκφραση σε κύτταρα HCT116 σφαιροειδές /ΗΤ29 εξετάστηκε και συγκρίθηκε με γονικά κύτταρα τους. Το επίπεδο ICAM-1 ήταν μετρίως κάτω-ρυθμιζόμενη, ενώ η έκφραση CXCR4 ήταν ρυθμισμένη σε κύτταρα HCT116 σφαιροειδές /ΗΤ29 όταν συγκρίνονται με κύτταρα HCT116 μονοστιβάδα /ΗΤ29 αντιστοίχως (Σχήμα 4C).

(Α-Γ) σφαιροειδές κύτταρα έχουν χαμηλότερες ικανότητες των δύο συμφύσεων στην FN (Α) και να ομογενής γείτονές τους (Β), σε σύγκριση με γονικά κύτταρα τους. Η έκφραση ICAM-1 σε speroid κυττάρων ήταν μετρίως κάτω-ρυθμιζόμενη, ενώ η έκφραση CXCR4 ήταν ρυθμισμένη σε σύγκριση με κύτταρα μονοστοιβάδας HCT116 /ΗΤ29 αντίστοιχα (C). (Δ και Ε) κύτταρα σφαιροειδές HCT116 /ΗΤ29 έδειξε 3.8-φορές (ρ & lt? 0,01) και 4-φορές (ρ & lt? 0.001) αύξηση στην χημειοτακτικές δυναμικού στις 24 ώρες (D). Περισσότερα κύτταρα σφαιροειδές προφανώς παρατηρηθεί να εισβάλουν Matrigel σε σύγκριση με τη γονική τους ομολόγους τους (p & lt? 0.001 και p & lt? 0,05, αντίστοιχα, Ε).

Η

Χρησιμοποιώντας θαλάμους μετανάστευσης Transwell, βρήκαμε ότι τα κύτταρα σφαιροειδές εμφανιστεί ένα σημαντική αύξηση στην κυτταρική κινητικότητα. Σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα HCT116 /ΗΤ29, κύτταρα σφαιροειδές HCT116 /ΗΤ29 έδειξε 3.8-φορές (ρ & lt? 0,01) και 4-φορές (ρ & lt? 0.001) αύξηση στην χημειοτακτικές δυναμικού στις 24 ώρες, αντίστοιχα (Εικόνα 4D). Αυτά τα κύτταρα έδειξαν επίσης μεγαλύτερη ικανότητα να εισβάλουν Matrigel επικαλυμμένα με ένθετα σε θαλάμους μετανάστευσης Transwell. Περισσότερα κύτταρα HCT116 /ΗΤ29 σφαιροειδή ήταν προφανώς παρατηρήθηκαν να εισβάλουν Matrigel σε σύγκριση με τα αντίστοιχα προσκολλημένα κύτταρα (ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0,05, αντιστοίχως) (Σχήμα 4Ε). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα σφαιροειδή κύτταρα προικισμένο με μικρότερη πρόσφυση, αλλά υψηλότερες μεταναστευτικές /επεμβατική ικανότητα, ένα λειτουργικό φαινότυπο που σχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου.

σφαιροειδές κύτταρα προωθεί τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την Tube Σχηματισμός ΠΕΑ Μέσω Up-ρυθμίζει την έκφραση του VEGF

τα καθαρισμένα ΠΕΑ ελήφθησαν από αίμα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι EPCs σε μεταγενέστερο στάδιο εμφανίζεται ένα ορισμένο έκφραση του CD34 και CD133, αλλά υψηλό επίπεδο έκφρασης του VEGFR2 (Σχήμα 5Α-5C). κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ΠΕΑ που προκαλείται από τα υπερκείμενα των κυττάρων σφαιροειδές ήταν υψηλότερες από ό, τι τους ομολόγους τους (Σχήμα 5D και 5Ε). Η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα έδειξαν ότι περισσότερο σωλήνες που σχηματίζονται στο σφαιροειδές ομάδα κυττάρων από την ομάδα προσκολλημένα κύτταρα. Επιπλέον, όταν προστέθηκαν 0,25 mg /ml bevacizumab (Avastin, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα VEGF) σε υπερκείμενο του σφαιροειδούς κυττάρων, η ικανότητα σχηματισμού σωλήνα EPCs κατεστάλη (Σχήμα 6Α). Στη συνέχεια, οι εκκρίσεις VEGF σε υπερκείμενα σφαιροειδούς /προσκολλημένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγκέντρωση του VEGF σε υπερκείμενο προσκολλημένων κυττάρων ήταν χαμηλότερο από σφαιροειδές κύτταρα (Σχήμα 6Β). Η έκφραση του σφαιροειδούς /προσκολλημένων κυττάρων αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα 6C). Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ότι ο VEGF μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην επίδραση της σφαιροειδούς κυττάρων στο ΚΠΑ, το οποίο πρότεινε ότι σφαιροειδές κύτταρα μπορεί να προάγει την αγγειογένεση του ΠΕΑ μέσω ανάντη ρύθμιση της έκφρασης του VEGF.

(AC) ΠΕΑ τηρούν Fn- επικαλυμμένο φιάλη μετά από 72 ώρες και οι κλώνοι EPCs μπορεί να δει κανείς μετά από μία εβδομάδα (Α), και παρουσιάζουν κροκάλες-σαν σημάδι μετά από δύο εβδομάδες (Β). ΠΕΑ σε μεταγενέστερο στάδιο εμφανίσει μια ορισμένη έκφραση του CD34 και CD133, αλλά υψηλό επίπεδο έκφρασης του VEGFR2 (C). (D, E) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων (D) και τη μετανάστευση (Ε) του ΠΕΑ αντιμετωπίζονται από τα υπερκείμενα των κυττάρων σφαιροειδές ήταν υψηλότερες από ό, τι ομόλογό τους.

Η

(Α) σχηματισμό του μετρό της ΠΕΑ αντιμετωπίζονται από τα υπερκείμενα της σφαιροειδούς κύτταρα ήταν υψηλότερη από τους ομολόγους τους. Και ο σχηματισμός σωλήνα της ΠΕΑ κατεστάλη όταν θα εμποδίσει τη λειτουργία του VEGF με bevacizumab. (Β) Οι συγκεντρώσεις VEGF σε υπερκείμενα σφαιροειδούς κυττάρων ήταν υψηλότερες από εκείνες των προσκολλημένων κυττάρων. (C) Υψηλότερη έκφραση VEGF παρατηρήθηκε στα κύτταρα σφαιροειδές σε σύγκριση με τους ομολόγους τους.

Η

σφαιροειδές κύτταρα έχουν Ανώτατης Ογκογονικά και μεταστατικό δυναμικό

in vivo

και ΠΕΑ μπορεί να αυξήσει αυτές τις Ικανότητες

Τα κύτταρα σφαιροειδές παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι tumorigencity προσκολλημένα κύτταρα (Εικόνα 7Α, 7Β και 7Ε). Όταν 2 × 10

6 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε γυμνά ποντίκια, όλα τα ποντίκια ανέπτυξαν όγκους. Μεταμοσχευθούν όγκοι επιβεβαιώθηκαν οι καρκίνοι του παχέος εντέρου με χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Και οι όγκοι των υποδόριων όγκων σε σφαιροειδές ομάδες κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των προσκολλημένων ομάδες κυττάρων. Επιπλέον, οι όγκοι του υποδόριου όγκου σε σφαιροειδή κύτταρα συν 1/10 ομάδες EPCs ήταν υψηλότερη από εκείνη των καθαρών κυττάρων σφαιροειδούς ομάδες (Σχήμα 7C, 7D και 7F). Αλλά δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ καθαρού κύτταρα σφαιροειδές και σφαιροειδή κύτταρα συν 1/100 EPCs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, η πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων σε ιστούς όγκων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού CD31. Πιο αιμοφόρα αγγεία βρέθηκαν σε σφαιροειδές ομάδα κυττάρων σε σύγκριση με τα προσκολλημένα κύτταρα ομάδα, και ακόμη περισσότερο της αγγειογένεσης στον ιστό του όγκου παρατηρήθηκε στην ομάδα συνδυασμένης του HCT116 σφαίρας συν 1/10 EPCs (Σχήμα 7G-7J). Και η MVD μετρήθηκαν σύμφωνα με τη μη-ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα CD31. Προκειμένου να προσδιοριστεί η συμβολή EPCs, εκτελέσαμε χρώση IF χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά CD31 αντίσωμα ανθρώπου-ειδικό. Το αποτέλεσμα έδειξε περισσότερα αιμοφόρα αγγεία στη συνδυασμένη ομάδα των HCT116 σφαίρας συν ΠΕΑ από το καθαρό σφαιροειδές κύτταρα (Σχήμα 7K-L).

(Α-ΣΤ) Το σφαιροειδές κύτταρα έδειξαν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι tumorigenecity προσκολλημένα κύτταρα (Α, Β, Ε). Και οι όγκοι των υποδόριων όγκων σε σφαιροειδή κύτταρα συν EPCs ομάδες ήταν μεγαλύτερα από εκείνα του σφαιροειδούς κυττάρων ομάδων (C, D, F). (G-J) πυκνότητα μικροαγγείων (MVD) του όγκου που αναπτύχθηκαν από κύτταρα HCT116 σφαιροειδές (H) ήταν υψηλότερο από εκείνο των HCT116 (G). Η υψηλότερη MVD μεταξύ αυτών των ομάδων βρέθηκε σε καρκινικό ιστό που αναπτύχθηκε από HCT116 σφαίρα συν 1/10 EPCs (i, j). Και πιο αιμοφόρων αγγείων αναπτύχθηκε από την ανθρώπινη ΠΕΑ σε HCT116 σφαίρα συν ομάδα ΠΕΑ (L) βρέθηκαν από εκείνη της καθαρής ομάδα κυττάρων σφαιροειδές (K). (Μ) Τα HCT116 σφαιροειδές κύτταρα αναπτύσσονται πιο ήπατος μεταστατικές εστίες από HCT116.

Η

Όπως αφορά την μετάσταση στο ήπαρ, τέσσερα ποντίκια (4/5) ανέπτυξε μετάσταση στο ήπαρ σε σφαιροειδές ομάδα κύτταρα, αλλά μόνο ένα ποντίκι (1/5) έκανε στην προσκολλημένη ομάδα. Μεταστατικούς όγκους επιβεβαιώθηκαν επίσης οι καρκίνοι του παχέος εντέρου με χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (όχι αριθμός που εμφανίζεται). Το αποτέλεσμα της καταμέτρησης του ήπατος μεταστατικών εστιών έδειξε τα παρόμοια αποτελέσματα (Εικόνα 7 Μ). Οι συνολικές συνθήκες από τα ποντίκια στο σφαιροειδές ομάδα κύτταρα είναι χειρότερα από εκείνα προσκολλημένη ομάδα κυττάρων, και μερικοί από αυτούς ανέπτυξαν ασκίτη και σοβαρή απίσχνανση. Και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων σφαιροειδές συν ΠΕΑ (με αναλογία 10:01 και 100:1) ομάδες και ομάδες κυττάρων σφαιροειδές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κλινικές ενδείξεις καρκινικά βλαστικά κύτταρα προάγουν την αγγειογένεση στο Ανθρώπινο οι καρκίνοι του παχέος εντέρου

Για την υποστήριξη των πειραματικών ευρημάτων μας, εξετάσαμε αν ο καρκίνος του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα προάγουν την αγγειογένεση κατά ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου, και η κανονική βλεννογόνο από τον ίδιο ασθενή ως μάρτυρες. Η χρώση ανοσοφθορισμού των CD133 /Lgr5 (δείκτης κόλου καρκίνος βλαστικών κυττάρων) και των αιμοφόρων αγγείων δείκτη ΕΚ CD31 διεξήχθησαν. Όπως όλοι γνωρίζουμε, υπάρχουν περισσότερα μικροαγγείων σε καρκινικό ιστό από το φυσιολογικό ιστό. Εκτός από αυτό, βρήκαμε ότι

(Α) παρατηρήθηκαν μεγαλύτερη πυκνότητα μικροαγγείων στην περιοχή εμπλουτίζοντας καρκινικά βλαστικά κύτταρα στα φρέσκα δείγμα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 8).

Περισσότερες μικροαγγείων σε καρκινικό ιστό από το φυσιολογικό ιστό με ανοσοφθορίζουσα χρώση των CD133 και CD31 του φυσιολογικού βλεννογόνου και του παχέος εντέρου. Και υψηλότερες MVD βρέθηκαν στην περιοχή εμπλουτίζοντας CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα στον ιστό του καρκίνου του παχέος εντέρου. (Β) Ανώτατη MVD (CD31

+) βρέθηκαν στην περιοχή εμπλουτίζοντας Lgr5

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα στον ιστό του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Η

Συζήτηση

Στην δεκαετία του ’70 του περασμένου αιώνα, Fidler IJ et al. [32] προτείνει την έννοια της ετερογένειας των όγκων, τα οποία προϋποθέτουν υπήρχαν διαφορετικούς φαινοτύπους στον ιστό του όγκου. Η θεωρία του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων διαμορφώθηκε με βάση αυτή την ιδέα. Καρκίνος βλαστοκυττάρων γενικά ορίζεται ως ένα μικρό υπο-πληθυσμό των κυττάρων όγκου που φέρουν αυτο-ανανέωση και το δυναμικό πολλαπλών κατευθύνσεων διαφοροποίηση [11]. Μέχρι σήμερα, η ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου έχει επιβεβαιωθεί σε πολλές συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, το μικρό υποπληθυσμό των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου ήταν φέρουν το σύνολο χαρακτηριστικό της κακοήθειας, συμπεριλαμβανομένων άπειρη πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση, την υποτροπή και την αντίσταση στη θεραπεία.

Σήμερα, η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για την απομόνωση ή τον εμπλουτισμό παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων είναι διαλογή κυττάρων βασίζεται σε δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, όπως CD133, Musasai-1, CD44, EpCAM, Lgr5, κλπ Ricci-Vitiani L et al. ανέφεραν οι

+ κύτταρα CD133 το οποίο αντιπροσωπεύει περίπου το 2,5% των κυττάρων του όγκου είναι tumorgenic κυττάρων στον καρκίνο του παχέος εντέρου [33]. Η υποδόρια ένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου CD133

+ κύτταρα αναπαράγονται εύκολα τον αρχικό όγκο σε ανοσοανεπάρκεια ποντικούς, ενώ CD133

– κύτταρα δεν ανέπτυξαν όγκους. Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν πολλές διαφορετικές απόψεις για αυτούς τους δείκτες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. Για παράδειγμα, Shmelkov SV πρότεινε ότι η έκφραση CD133 δεν περιορίζεται σε βλαστικά κύτταρα, και οι δύο CD133

+ και CD133

– μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα κινήσει όγκους [12]. Ορισμένοι ερευνητές ανέφεραν η χρωστική-effluxing κύτταρα πλευρά πληθυσμού εκφράζουν ABCG2, ένα ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτα μισή μεταφορέα, θα μπορούσε να απομονωθεί ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα [34], [35], [36]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έδειξαν στοιχεία σε βάρος μιας σύνδεσης μεταξύ των κυττάρων του πληθυσμού SP και το στέλεχος του καρκίνου. SP κύτταρα που απομονώνονται από ΜΚΝ28 γαστρικά καρκινικά κύτταρα δεν παρήγαγαν όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος [37]. Επιπλέον, SP και μη SP κύτταρα των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου αποδείξουν ισοδύναμη πολυδύναμα ικανότητα διαφοροποίησης και παρόμοια ογκογονικότητα σε μοντέλο ξενομοσχεύματος [38].

Στην παρούσα μελέτη, σφαιρίδια που αποκτήθηκαν όγκου από HCT116 και ΗΤ29 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρο γραμμές με καλλιέργεια αυτών των κυττάρων σε μέσο ελεύθερο ορού [39], [40]. Και η ακόλουθη ανάλυση έδειξε ότι CD133 και Lgr5 έκφραση αυτών των κυττάρων σφαιροειδές ήταν υψηλότερη από τη γονική ομόλογό τους, ενώ η έκφραση ΟΚ20 ήταν χαμηλότερο ποσοστό που αντιπροσωπεύει τη διαφοροποιημένη ενδοθηλιακών κυττάρων. Οι αντιφατικές φαινότυποι ανιχνεύθηκαν όταν τα κύτταρα σφαιροειδή προκλήθηκαν προς διαφοροποίηση σε μέσο που περιέχει FBS.