Αφηρημένο

E-cadherin είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των ιστών λόγω του ρόλου της στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. μεταλλάξεις E-καντερίνη είναι η γενετική αιτία της Κληρονομική Διάχυτη γαστρικός καρκίνος (HDGC) και νοηματικές μεταλλάξεις αντιπροσωπεύουν μια κλινική επιβάρυνση, λόγω της αβεβαιότητας των παθογόνων ρόλο τους. In vitro και in vivo, οι περισσότερες μεταλλάξεις οδηγούν σε απώλεια του κύκλου λειτουργίας, αν και η αιτιώδης παράγοντας είναι άγνωστος για την πλειοψηφία. Υποθέσαμε ότι η αποσταθεροποίηση θα μπορούσε να εξηγήσει την παθογένεια της Ε-καδερίνης νοηματικές μεταλλάξεις σε HDGC, και δοκιμάστηκαν υπόθεση μας χρησιμοποιώντας in silico και in vitro εργαλεία. FoldX αλγόριθμος που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό των επιπτώσεων της κάθε μετάλλαξης στο E-cadherin φυσική κατάσταση σταθερότητας, και η ανάλυση συμπληρώνεται με την εξελικτική διατήρηση, από SIFT. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ασθενείς HDGC υπόθαλψη βλαστικής σειράς E-cadherin αποσταθεροποίηση μεταλλάξεις παρουσιάσει μια νεαρότερη ηλικία κατά τη διάγνωση ή θανάτου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια της φυσικής κατάσταση σταθερότητας των λογαριασμών E-cadherin για το φαινότυπο της νόσου. Για να διευκρινιστεί η βιολογική σημασία της E-cadherin αποσταθεροποίηση στην HDGC, μελετήσαμε μια ομάδα που εντοπίσθηκαν πρόσφατα HDGC που σχετίζονται με μεταλλάξεις (E185V, S232C και L583R), εκ των οποίων L583R προβλέπεται να είναι αποσταθεροποιητική. Δείχνουμε ότι αυτή η μετάλλαξη δεν είναι λειτουργικό in vitro, επιδεικνύει μικρότερο χρόνο ημίσειας ζωής και δεν είναι σε θέση να ωριμάσει, λόγω της πρόωρης πρωτεασώματος εξαρτώμενη από αποικοδόμηση, ενός φαινοτύπου επανήλθε από σταθεροποίηση με την τεχνητή μετάλλαξη L583I (δομικά ανεκτή). Στο παρόν αναφέρουμε E-cadherin δομικά μοντέλα κατάλληλα για να προβλέψει τον αντίκτυπο της πλειοψηφίας του καρκίνου που σχετίζονται με μεταλλάξεις απουσίας και θα δείξουμε ότι E-cadherin αποσταθεροποίηση οδηγεί σε απώλεια-του-λειτουργία in vitro και αύξηση της παθογένειας in vivo.

Παράθεση: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Ολιβέιρα C, Serrano L, et al. (2012) Ε-καδχερίνη Αποσταθεροποίηση Λογαριασμοί για την παθογένεια της εσφαλμένης διευθύνσεως Μεταλλάξεις σε Κληρονομική διάχυτη γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 9 Νοεμ 2011? Αποδεκτές: 17 Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Μάρτη, 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Fundação para a Επιστημών e Tecnologia, την Πορτογαλία (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), ΕΜΒΟ (βραχυπρόθεσμα υποτροφία ASTF 60- 2009) και της ΕΕ Προοπτικές επιχορήγηση (ΥΓΕΙΑ-F4-2008-201648). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ε-καδερίνης είναι μια γλυκοπρωτεΐνη προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου αποτελείται από πέντε εξωκυτταρικές επαναλήψεις καντερίνης-τύπου, μία διαμεμβρανική περιοχή και μια εξαιρετικά διατηρημένη κυτταροπλασματική ουρά [1], [2]. E-cadherin εκφράζεται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα και είναι το κύριο συστατικό του ενώσεις προσφύσεως (AJ). Αυτά σύμπλεγμα κόμβους, μέσω ομόφιλη αλληλεπιδράσεων, μέσω των εξωκυτταρικών περιοχών των μορίων Ε-καδερίνης ασβέστιο-εξαρτώμενη, επί της επιφανείας των κυττάρων ομοτυπικό γείτονα.

Ο ρόλος της Ε-καδερίνης στην ανάπτυξη του όγκου περιγράφεται καλά, και του η απώλεια της έκφρασης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα σε καρκινώματα [3]. Πειραματικές μαρτυρίες υποστηρίζουν ένα ρόλο για το σύμπλοκο Ε-καδερίνης τόσο στην καταστολή σχηματισμού εισβολή και τη μετάσταση [4]. Η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης συχνά συνδέεται με γενετικές γεγονότα όπως θέση ματίσματος και οι μεταλλάξεις αποκοπής που προκαλούνται από παρεμβολές, διαγραφές, και μεταλλάξεις χωρίς νόημα, εκτός από την εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις [5]. Σε σποραδικές διάχυτη γαστρικό καρκίνο, οι αλλοιώσεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί Ε-καδερίνης (Cdh1) βρέθηκε κατά προτίμηση στα εξόνια 7 έως 9 [5], ενώ σε λοβιακό καρκίνους του μαστού που απλώνονται κατά μήκος του γονιδίου, με χωρίς προνομιακή hotspot [6]. Οι νοηματικές μεταλλάξεις που βρέθηκαν σε αυτούς τους δύο τύπους καρκίνου σποραδικές, αλλά και στο αρθρικό σάρκωμα [7].

Η οικογενής συνάθροιση Διάχυτη γαστρικός καρκίνος (DGC) αντιπροσωπεύει το 10% των περιπτώσεων του καρκίνου του στομάχου (GC), και μόνο 1-3% είναι κληρονομική [8]. Από αυτές τις οικογενείς περιπτώσεις, Κληρονομική Διάχυτη γαστρικός καρκίνος (HDGC) ορίζεται από αυστηρά κριτήρια που ορίζονται από το Διεθνές Καρκίνο γαστρική Linkage Consortium (IGCLC) το 1999: (1) δύο ή περισσότερες καταγεγραμμένες περιπτώσεις διάχυτη γαστρικού καρκίνου σε πρώτη /δεύτερη βαθμού συγγενείς, με τουλάχιστον ένα διαγνώστηκε πριν από την ηλικία των 50? ή (2), τρεις ή περισσότερες περιπτώσεις τεκμηριωμένων διάχυτη γαστρικού καρκίνου σε συγγενείς πρώτου /δεύτερου βαθμού, ανεξάρτητα από την ηλικία. Πρώιμη έναρξη Διάχυτη γαστρικός καρκίνος (EODGC) θεωρείται όταν ένα μεμονωμένο άτομο έχει διαγνωστεί με DGC με λιγότερο από 45 ετών. Οι μεταλλάξεις σπερματικής γραμμής Cdh1 βρέθηκε σε 30% των περιπτώσεων HDGC [9]. Η σύνδεση των μεταλλάξεων Cdh1 και οικογενή καρκίνο του στομάχου περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Guilford

κ.ά.

το 1998 [10] και από τότε πολλές μελέτες ανέφεραν διαφορετικούς τύπους μεταλλάξεων Cdh1 σε HDGC [11], [12], [13 ]. Μεταξύ όλων των αναφερόμενων

Cdh1

βλαστική μεταλλάξεις, 77,9% είναι ανοησίες, συναρμογής του ξενοδοχείου και μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου (προβλέπεται να παράγει πρόωρα κωδικόνια τερματισμού) και 22,1% έχουν εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις [9]. Οι μεταλλάξεις που παράγουν PTC είναι συνήθως επιβλαβή, οι ασθενείς θεωρούνται φορείς υψηλού κινδύνου, και συνιστάται να έχει προφυλακτική ολική γαστρεκτομή [14]. Η παθογένεια της νοηματικές μεταλλάξεις δεν είναι απλή, και αυτές οι αλλαγές συνήθως αναφέρεται ως μη ταξινομημένα παραλλαγές σειράς (USVs) λόγω της έλλειψης αυστηρών κριτηρίων για την αξιολόγηση του αντικτύπου τους. Αρκετές παράμετροι που λαμβάνονται υπόψη για την κατάταξη των USVs E-cadherin στην HDGC: 1) συν-διαχωρισμός της μετάλλαξης με DGC (μέσα γενεαλογία)? 2) συχνότητα μετάλλαξης στον υγιή πληθυσμό ελέγχου? 3) υποτροπή μετάλλαξη (σε ανεξάρτητες οικογένειες). Η ανάλυση διαχωρισμού είναι συχνά αδύνατη, με ένα μικρό αριθμό περιπτώσεων επηρεάζεται διαθέσιμα για μοριακή διάγνωση [15], και η απουσία κλινικών πληροφοριών είναι ένας περιοριστικός βήμα για να συναχθεί η παθογόνος σημασία αυτών των μεταλλάξεων. Να παρακάμψει τον περιορισμό αυτό έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν

in vitro

λειτουργικές δοκιμασίες για την αξιολόγηση της λειτουργικής επιπτώσεις της E-cadherin μεταλλάξεις βλαστικής σειράς εσφαλμένου νοήματος [16], [17]. Ωστόσο, τέτοιες μελέτες εμπλέκουν εργαστήριο συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες, ήτοι προσδιορισμούς κυτταρικής βιολογίας, και είναι χρονοβόρα για χρήση σε ρουτίνα.

Στο silico

προβλέψεις είναι αξιόπιστη και γρήγορη ανάλυση που μπορεί κανείς να χρησιμοποιήσει για να προβλέψει την επίδραση των σημειακών μεταλλάξεων, ειδικά όταν δομικές πληροφορίες είναι διαθέσιμες [18], [19].

Σε αυτό το έργο, διερευνήσαμε τις δυνατότητες της δομής με βάση το

in silico

προβλέψεις για την αξιολόγηση του αντίκτυπου των νοηματικές μεταλλάξεις E-cadherin, που βρέθηκαν στην κληρονομική και σποραδικό καρκίνο. Η ανάλυσή μας βασίστηκε στον υπολογισμό των αλλαγών σταθερότητας φυσική κατάσταση που προκαλείται από κάθε παραλλαγή (ΔΔΟ = ΔG

WT-ΔG

Mut), που λαμβάνεται από τον αλγόριθμο σχεδιασμού πρωτεΐνη FoldX [20], [21]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ομάδα των ασθενών που φέρουν αποσταθεροποίηση μεταλλάξεις (ΔΔΟ & gt? 0.8 kcal /mol) χαρακτηρίζεται από νεαρότερη ηλικία κατά τη διάγνωση ή θανάτου από DGC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια της E-cadherin φυσική κατάσταση σταθερότητας συμβάλλει με τον φαινότυπο της νόσου. Χρησιμοποιώντας ένα κυτταρικό μοντέλο, αναλύσαμε το φαινότυπο της Ε-καδερίνης αποσταθεροποίησης, και διαπίστωσαν ότι όταν μια μετάλλαξη επάγει μειωμένη φυσικής κατάστασης σταθερότητα, E-cadherin πρόωρα αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα, επιδεικνύει μικρότερο χρόνο ημίσειας ζωής, με αποτέλεσμα την απώλεια της κόλλας λειτουργία. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η αποσταθεροποίηση λογαριασμούς για την παθογένεια της νοηματικές μεταλλάξεις E-cadherin βρέθηκαν σε HDGC.

Υλικά και Μέθοδοι

Συλλογή της σειράς E-cadherin παραλλαγές και PDBS

παραλλαγές E-cadherin που σχετίζονται με HDGC ή EODGC συλλέχθηκαν από τη βιβλιογραφία, και σωματικά παραλλαγές συλλέχθηκαν από τον Κατάλογο σωματικών μεταλλάξεων Καρκίνου (COSMIC) βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/κοσμικός/). Τρία νέα σειρά E-cadherin παραλλαγές, όπου αναφέρθηκε στο εργαστήριο μας για τη λειτουργική ανάλυση: E185V, S232C και L583R. Πρόσφατα, L583R αναφέρθηκε, με τις συνδεδεμένες λειτουργικά δεδομένα [22].

PDBS E-cadherin που σχετίζονται με ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την αυτόματη αναζήτηση με το ελβετικό μοντέλο Repository (https://swissmodel.expasy.org). ευθυγράμμιση αλληλουχίας της ανθρώπινης Ε-καδερίνης και κάθε μία από τις αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται για τα διάφορα μοντέλα διεξήχθη με M-καφέ [23], [24] (https://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Οι εικόνες που παρασκευάζονται με Pymol. Μετά την ανάλυση αλληλουχίας και δομική ομολογία, επιλέχθηκαν τρεις PDBS να χρησιμοποιήσετε ως μοντέλα:. Εξωτομέα Xenopus C-cadherin (ΠΣΠ 1L3W), το ποντίκι E-cadherin προ-πεδίο (ΠΣΠ 1OP4) και το ποντίκι β-κατενίνης αλληλεπιδρούν τομέα (ΠΠ 1I7X)

FoldX υπολογισμούς και να κοσκινίσει ανάλυση

Χρησιμοποιώντας την εντολή FoldX (https://foldx.crg.es/)

Buildmodel

χτίσαμε τρία διαφορετικά μοντέλα (προ-πεδίο, εξωκυτταρικό και κυτταροπλασματική)? οι τρεις δομές εξανθρωπίζεται με αντικατάσταση κάθε διαφορετικό αμινοξύ. Η προκύπτουσα δομή έχει βελτιστοποιηθεί χρησιμοποιώντας την εντολή

RepairPDB

και οι ενέργειες όπου αναλύονται με

Σταθερότητα ή

AnalyseComplex

εντολές. Οι μεταλλάξεις που σχετίζονται με τη νόσο παρήχθησαν με το

Buildmodel

εντολή, κάθε μετάλλαξη επαναλαμβάνεται σε πέντε τρεξίματα. Οι ενέργειες είναι μια αυτόματη έξοδος στο FoldX, και η αλλαγή της σταθερότητας μητρική κατάσταση, ΔΔΟ, μεταξύ WT και των μεταλλαγμένων (ΔΔΟ = ΔG

WT-ΔG

Mut) παράγεται επίσης σε ένα ξεχωριστό αρχείο, με το αντίστοιχο πρότυπο αποκλίσεις, και όλοι οι ενεργητικός κυρώσεις που σχετίζεται με κάθε μετάλλαξη. Μόνο οι μεταλλάξεις με ΔΔΟ & gt? 0.8 kcal /mol θεωρήθηκαν δηλητηριώδεις

Χρησιμοποιήσαμε SIFT (https://sift.jcvi.org/, Ταξινόμηση Δυσανεκτικοί Από ανεκτική) για την αξιολόγηση της διατήρησης του κάθε αμινοξέος υποκατάστασης, όπως στο παρελθόν. περιγράφεται [25], χρησιμοποιώντας τη λειτουργία αναλαμπή GI:. 31073. Μόνο μεταλλάξεις με βαθμολογία μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκαν ως μη ανεκτικές

PROP (https://www.cbs.dtu.dk/services /PROP /) [26] χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει εάν οι μεταλλάξεις θα μπορούσαν να έχουν επιπτώσεις στην προ-περιοχή διάσπασης.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμολύνσεις

E-cadherin WT cDNA κλωνοποιήθηκε στον φορέα pIRES2-EGFP σύμφωνα για την κατασκευή οδηγίες (Clontech, Takara Βιο) και μεταλλάξεις E185V, S232C, L583R και L583I HE-καντερίνης επάχθηκαν με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Το κενό φορέα (Mock) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος κύτταρα

CHO (Chinese Hamster Ovary) (αριθμός ATCC: CCL-61). Αναπτύχθηκαν σε μέσο Alfa-ΜΕΜ (Gibco, Invitrogen) συμπληρωμένου με εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (FBS? Gibco, Invitrogen) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco, Invitrogen). Τα κύτταρα σποραδικά αξιολογήθηκαν για μυκόπλασμα μόλυνση από ανοσοφθορισμού με DAPI. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1 μα καθενός από τους φορείς που κωδικοποιούν τις διάφορες μορφές της Ε-καδερίνης (WT, E185V, S232C, L583R και L583I) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με την διαδικασία κατασκευής. Για σταθερή εγκατάσταση κυτταρική γραμμή, τα κύτταρα επιλέγονται από την αντοχή στα αντιβιοτικά σε 5 μg /ml βλαστισιδίνη (Gibco, Invitrogen). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C

Λειτουργικές δοκιμασίες

Παροδικά διαμολυσμένα CHO (Ωοθήκης Κινεζικού Χάμστερ) κύτταρα (ATCC αριθμός:. CCL -61) υποβλήθηκαν σε ροή citometry, χρησιμοποιώντας μέτρηση φθορισμού GFP, για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, πριν από κάθε πείραμα. Για τη δοκιμασία αργή συσσωμάτωση, φρεάτια 96 φρεατίων πλάκα επικαλύφθηκαν με 50 μΙ διαλύματος άγαρ (100 mg Bacto-Agar σε 15 ml στείρου PBS). Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη και αιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας. Ένα εναιώρημα από 1 × 10

5 κύτταρα /ml παρασκευάσθηκε και 2 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο με 5% CO

2 για 48 ώρες. Η συσσωμάτωση αξιολογήθηκε σε ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (4 χ μεγέθυνση) και φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή.

κηλίδωση Western

κυτταρολύματα ελήφθησαν με Catenin ρυθμιστικό λύσης (1% Triton Χ-100, 1 % Nonidet Ρ-40 σε PBS), συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) και το κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (Sigma). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση έγινε με μία τροποποιημένη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad). Για κάθε δείγμα, 25 μα πρωτεΐνης φορτώθηκε, διαχωρίζεται σε 7,5% SDS-PAGE, και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare Life Sciences). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα και 0.5% Tween-20 σε PBS. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (1:1000? BD Biosciences), ακτίνη (1:1000? Santa Cruz Biotechnology), και α-τουμπουλίνης (1:10000? Sigma). Προβάτου αντι-ποντικού (GE Healthcare Life Sciences) ή γαϊδάρου αντι-κατσίκας (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα, που ακολουθείται από την ανίχνευση ECL (GE Healthcare Life Sciences). Τα ανοσοστυπώματα ποσοτικοποιήθηκαν σε Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad).

ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS)

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μία συρρέουσα μονοστοιβάδα, ανεξάρτητο με Versene (Gibco, Invitrogen) και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS με 0.05 mg /ml CaCl

2. Ένα εναιώρημα 5 × 10

5 κυττάρων φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 1500 rpm στους 4 ° C, και πλύθηκαν σε PBS με 0.05 mg /ml CaCl

2 3% BSA. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 60 λεπτά με ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι Ε-καδερίνης, HECD1 (Zymed Laboratories) σε 1:100 αραίωση. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ποντικού με βιοτίνη (Dako) σε 1:100 αραίωση. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και στη συνέχεια επωάζονται με στρεπταβιδίνη ΡΕ-CY5 (BD Pharmingen) σε αραίωση 1:40. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ PBS, και 50.000 κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής (Coulter Epics XL-MCL). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό WinMDI.

χρώση ανοσοφθορισμού

για ανοσοφθορισμό και μικροσκοπία, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων και αναπτύχθηκαν σε περίπου 80% συρροή, σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένη μεθανόλη για 15 λεπτά, πλένονται 2 φορές με PBS και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα, αραιωμένο σε PBS 5% BSA, επί 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται: μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-Ε-καδερίνης (BD Biosciences)? κουνελιού αντι-καλνεξίνη (Stressgen). Δευτερεύουσα αντισώματα που χρησιμοποιούνται: Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού (1:500? Invitrogen)? Alexa Fluor 594 αντι-λαγού (1:500? Invitrogen). Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες, χρησιμοποιώντας Vectashield με DAPI για πυρηνικό εντοπισμό (Vector Laboratories). απόκτησης εικόνας έγινε σε μέρη Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 Μ φθορισμού μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας 40 × στόχους. Οι εικόνες ελήφθησαν με AxioCam HRm κάμερα και υποβάλλονται σε επεξεργασία από το λογισμικό Axiovison έκδοση 4.8.

κύτταρα θεραπείες

Για την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ του κυκλοεξιμιδίου για 8 ώρες και 16 ώρες, και η ποσότητα της συνολικής Ε-καδερίνης αναλύθηκε με WB όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Για τη δοκιμασία αναστολής πρωτεασώματος, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, αναπτύχθηκαν σε περίπου 80% των συρροής και επωάστηκαν για 16 ώρες με 10 μΜ MG132 (Calbiochem). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με WB όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Αποτελέσματα

1. E-cadherin δομικά μοντέλα

Υπάρχουν διαθέσιμες μερικές ανθρώπινης Ε-καντερίνης (HE-cad) δομές, και καλύπτουν μόνο μικρά τμήματα της πρωτεΐνης (Πίνακας S1). Χρησιμοποιώντας την αυτόματη αναζήτηση του ελβετικού μοντέλου Repository, βρήκαμε ότι ΠΣΠ 1L3W, σχολιασμένο για την πλήρη μήκους εξωκυτταρική περιοχή του Xenopus ΕΡ-καντερίνη (ΕΡ-cad), είναι εξαιρετικά ομόλογο στον ίδιο τομέα σε ανθρώπινο E-cadherin. Αναλύσαμε ομολογία αλληλουχίας με την ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας Μ-καφέ, μια πολλαπλή ευθυγράμμιση ακολουθίας που συνδυάζει την παραγωγή πολλών πακέτων πολλαπλών ευθυγράμμιση ακολουθία (PCMA, Poa, Mafft, των μυών, T-καφέ, ΟΙυδίβίνν, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Το Σχήμα 1Α δείχνει την ευθυγράμμιση των δύο αλληλουχιών εξωκυτταρικής περιοχής. Οι κόκκινες περιοχές τούβλο αντιπροσωπεύει τέλεια συμφωνία μεταξύ των μεθόδων που χρησιμοποιούνται, που αντιπροσωπεύουν πολύ παρόμοιες ακολουθίες. Για την κατασκευή του μοντέλου δομής, εμείς απομακρυσμένες περιοχές χωρίς ομοιότητα (Εικόνα 1Α, αστέρια), και περιορίζεται το μοντέλο σε περιοχές με αξιόπιστα ευθυγράμμισης (μαύρο βέλος, Σχήμα 1Α). Η δομή Xenopus ήταν εξανθρωπίζεται όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι και σχήμα 1Β δείχνει τη δομική ευθυγράμμιση των HE-cad τομείς EC1-EC2 (ΠΣΠ 2O72) και οι τομείς EC1-EC2 του Xenopus που προέρχεται δομικό μοντέλο. Οι δύο δομές είναι σχεδόν επάνω, υποδεικνύοντας ότι η ομοιότητα μεταξύ των εξωκυτταρικών περιοχών του ανθρώπινου Ε-καδερίνης και Xenopus ΕΡ-καντερίνη δεν είναι μόνο στο επίπεδο της αλληλουχίας αλλά και σε δομικό επίπεδο. Το μοντέλο δομής της ανθρώπινης E-CAD παρουσιάζει συμβατό πηγών ενέργειας με τη δομή από Xenopus, με μια ελαφρά μείωση της ελεύθερης ενέργειας (ΔG) που λαμβάνεται για το μοντέλο (ΔG

πραγματικό = 559,99 kcal /mol και ΔG

μοντέλο = 531,77 kcal /mol), υποδεικνύοντας ότι ο εξανθρωπισμός δεν εισάγει επιπλέον συγκρούσεις. Πρόσφατα, μια δομή από το εξωκυττάριο τμήμα του ποντικιού κυκλοφόρησε (ΠΠ 3Q2V, Πίνακας S1), και χρησιμοποιούνται επίσης αυτή τη δομή ως πρότυπο, ως ένας τρόπος για να βελτιώσετε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με το μοντέλο Xenopus.

Α) ευθυγράμμιση αλληλουχίας των εξωκυτταρικών περιοχών του ανθρώπινου E-CAD και Xenopus ΕΡ-cad. Οι εξωκυπαρικές αλληλουχίες ελήφθησαν σε UniProt με τις αντίστοιχες παραπομπές (ανθρώπινης Ε-καντερίνης, P12830? Xenopus ΕΡ-καδερίνης, P33148). M-καφέ τακτική χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει την ευθυγράμμιση, ένα πακέτο που συνδυάζει διαφορετικές μεθόδους ευθυγράμμισης. Κόκκινες περιοχές τούβλο είναι σε τέλεια συμφωνία σε όλες τις μεθόδους, πράσινο και κίτρινο περιοχές είναι περιοχές που δεν υπάρξει συμφωνία μεταξύ των διαφόρων μεθόδων ευθυγράμμισης. Ο μέσος όρος συνοχή που ελήφθη ήταν 98, επιβεβαιώνοντας την αξιοπιστία της ευθυγράμμισης. Τα μπλε αστέρια προσδιορίσει τα αμινοξέα που είχαν αφαιρεθεί από τη δομή 1L3W πριν εξανθρωπισμού. Το μαύρο βέλος δείχνει το τέλος του δομικού μοντέλου που λαμβάνονται. Β) Η ανθρώπινη δομή των τομέων EC1-EC2 (ΠΣΠ 2O72, μπλε) ευθυγραμμίστηκε με τις ίδιες περιοχές του ανθρώπινου μοντέλου που παράγεται από τη δομή του Xenopus (ΠΠ 1L3W, κόκκινο). Εικόνα που δημιουργείται με Pymol. C) Σχηματική αναπαράσταση των ανθρώπινων τομέων E-cadherin, τονίζοντας την κάλυψη των τριών διαφορετικών δομικών μοντέλων που λαμβάνονται με FoldX (μοντέλα προ-πεδίο, εξωκυτταρικό τομέα και η Catenin Τομέα Binding).

Η

Ιδρύσαμε δύο άλλα μοντέλα, που καλύπτουν το προ-πεδίο (ΠΣΠ 1OP4, από ποντικό Ν-καδερίνης) και το β-κατενίνης κυτταροπλασματική περιοχή (ΠΣΠ 1I7X, από ποντικό Ε-καδερίνης), χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία. Συνολικά, τα τρία μοντέλα καλύπτουν το μεγαλύτερο μέρος της δομής της πρωτεΐνης (Σχήμα 1C): το μοντέλο προπεριοχή καλύπτει τις θέσεις 28 έως 117, οι εξωκυτταρικές μοντέλα θέσεις 155 έως 697 και η κυτταροπλασματική περιοχή β-κατενίνης καλύπτει 782 έως 838. Στο επίπεδο της παραμεμβρανική περιοχή, μία δομή σχολιασμένο, που περιλαμβάνει την αλληλεπιδρώντας επιφάνεια μεταξύ της Ε-καδερίνης και ρ120 [28]. Η δομή αυτή περιέχει ένα μικρό, 18 αμινοξέα πεπτίδιο μήκους (που καλύπτουν τις θέσεις 756 – 773 για HE-cad), με πολύ χαμηλό δομικό περιεχόμενο, παράγοντες που μειώνουν την αξιοπιστία των υπολογισμών ενέργειας, έτσι ώστε να απορρίπτεται αυτή τη δομή από την ανάλυση.

2.

Στο silico

πρόβλεψη των επιπτώσεων του καρκίνου που σχετίζονται με E-cadherin USVs

μεταλλάξεις E-καντερίνη δεν είναι μόνο η γενετική αιτία της HDGC, αλλά βρίσκονται επίσης συχνά σε διαφορετικούς τύπους των σποραδικών καρκίνους. Αναλύσαμε

in silico

τον αντίκτυπο όλων των μεταλλάξεων E-cadherin εσφαλμένου νοήματος σχετίζονται με τον καρκίνο που εντοπίζεται στις περιοχές που καλύπτονται από τα διαρθρωτικά μοντέλα που παράγονται: 22 μεταλλάξεις βλαστικής σειράς που βρέθηκαν στις ρυθμίσεις του HDGC και EODGC, και 57 βρίσκονται σε σποραδικούς καρκίνους. Βλαστικής σειράς USVs E-καντερίνη συλλέχθηκαν από τη βιβλιογραφία, και μερικά είναι προσωπικές επικοινωνίες του εργαστηρίου μας. Μερικές μεταλλάξεις HDGC /EODGC δεν είναι δυνατόν να μοντέλο, λόγω της έλλειψης των δομικών πληροφοριών (π.χ. αυτές που εντοπίζεται στην παραμεμβρανική περιοχή του Ε-καδερίνης), και δεν συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα ανάλυση. Σωματικές μεταλλάξεις συλλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων Cancer Γονιδιώματος, και περιέχουν μεταλλάξεις που βρέθηκαν στα γαστρικά και λοβιακό καρκίνο του μαστού (οι μόνοι δύο τύποι καρκίνου που σχετίζεται με HDGC), αλλά και άλλες μορφές καρκίνου, όπως αρθρικό σάρκωμα ή καρκίνωμα του χοληφόρου πόρου (Πίνακας S2 ).

Χρησιμοποιώντας τα δομικά μοντέλα που περιγράφηκαν προηγουμένως, χρησιμοποιήσαμε FoldX να παράγουν κάθε μία από τις καρκίνου που σχετίζονται USVs, και αξιολογείται η μητρική κατάσταση σταθερότητά τους, ΔG (που συνήθως αναφέρονται ως το σύνολο της ενέργειας για λόγους απλότητας) [20]. Η ενεργειακή διαφορά μεταξύ της αναφοράς WT και το αντίστοιχο μεταλλαγμένο (ΔΔΟ = ΔG

WT-ΔG

Mut) υπολογίστηκε για τις 22 HDGC /EODGC USVs E-cadherin εντοπίζεται στις περιοχές που καλύπτονται από τις μοντέλο δομές, και η τα αποτελέσματα παρατίθενται στον πίνακα 1. Όταν ΔΔΟ είναι αρνητικό, αυτό αντανακλά μια αύξηση της φυσικής κατάστασης σταθερότητα στην μεταλλαγμένη μορφή? όταν είναι θετικό, υπονοεί ότι ο μεταλλάκτης είναι λιγότερο σταθερή, τότε η αναφορά WT. Προηγούμενες μελέτες σε άλλες πρωτεΐνες έχουν δείξει ότι οι αλλαγές σταθερότητα υπολογίζεται με αλγόριθμο FoldX κάτω του 0,8 kcal /mol είναι εντός του αλλαγή σφάλμα του λογισμικού, και συνεπώς θεωρούνται ότι είναι μη σημαντικές [21]. Ως εκ τούτου, μπορούμε μόνο θεωρούνται οι μεταλλάξεις να είναι αποσταθεροποιητική όταν προκαλείτε ενέργειας αλλαγές πάνω από 0,8 kcal /mol. Στο Σχήμα 2Α, μεταλλάξεις πάνω από το σύστημα είναι αποσταθεροποιητική, ενώ οι κάτω αυτά τα δομικά ανεκτή. Είναι σαφές ότι αποσταθεροποιούν μεταλλάξεις Ιπτάμενο κατά μήκος της πρωτεΐνης, χωρίς προνομιακή περιοχή επηρεάζεται.

Α) Σχηματική αναπαράσταση των πεδίων E-cadherin, χαρτογραφώντας όλα τα διαμορφώθηκε μεταλλάξεις βλαστικής σειράς που βρίσκονται στο περιβάλλον του HDGC ή EODGC. Πάνω από το σύστημα είναι οι μεταλλάξεις που είχαν ως αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση, όπως προβλέπεται από FoldX (ΔΔΟ & gt? 0,8 kcal /mol) και κάτω από το σχήμα όλων των μη αποσταθεροποιούν μεταλλάξεις (ΔΔΟ & lt? 0,8 kcal /mol). Τα πρόσφατα εντοπίστηκαν μεταλλάξεις υπογράμμισε. Β) FoldX και να κοσκινίσει χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιπτώσεων των μεταλλάξεων που υπάρχουν στο Α) και οι προβλέψεις είχαν ταξινομηθεί ως: True Positive (TP) όταν το λογισμικό προβλέπει υψηλό αντίκτυπο και η μεταλλάξεις εμφανίζουν in vitro απώλεια της λειτουργίας? Αληθινή Αρνητικό (TN), όταν το λογισμικό προβλέπει καμία επίδραση και η μετάλλαξη είναι λειτουργική in vitro? False Positive (FP), όταν το λογισμικό προβλέπει υψηλό αντίκτυπο, αλλά οι μεταλλάξεις είναι λειτουργική in vitro? και ψευδώς αρνητικό (FN), όταν το λογισμικό προβλέπει καμία επίπτωση και τις μεταλλάξεις εμφανίζει in vitro απώλεια της λειτουργίας. Τα αποτελέσματα από τις δύο παράγοντες πρόβλεψης ως αποτέλεσμα το 70% αλληλοεπικάλυψη με λειτουργία της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης δοκιμάζονται in vitro (ΤΡ + ΤΝ). Γ) Box-οικόπεδο που αντιπροσωπεύει την μέση και διατεταρτημοριακά σειρές των αλλαγών σταθερότητας φυσική κατάσταση (ΔΔΟ) της αποσταθεροποιητικής και μη αποσταθεροποίηση μεταλλάξεις, όπως προβλέπεται από FoldX. Δ) Box-οικόπεδο που αντιπροσωπεύει την μέση και διατεταρτημοριακά σειρές των ηλικιών γαστρικού ανίχνευσης του καρκίνου ή σχετίζονται θάνατο, που αντιστοιχούν στις αποσταθεροποιητικές και μη αποσταθεροποίηση μεταλλάξεις φορείς. Όλα τα δεδομένα συλλέχθηκαν από τη βιβλιογραφία. Η ομάδα των ασθενών που φέρουν αποσταθεροποίηση μεταλλάξεις χαρακτηρίζεται από σαφή νεότερη ηλικία διάγνωσης ή θανάτου, γεγονός που υποδηλώνει τη συμβολή της E-cadherin αποσταθεροποίησης για τον φαινότυπο της νόσου.

Η

Η προ-πεδίο των HE-CAD διασπάται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης, και αν αυτό δεν επιτυγχάνεται, κόλλα Ε-καδερίνης λειτουργία είναι μειωμένη [29], [30]. Για τις μεταλλάξεις εντοπίζονται σε αυτόν τον τομέα, θα αξιολογηθεί η επίπτωση στη συνολική ενέργεια με FoldX, τη διατήρηση με SIFT, και αξιολογήθηκαν επίσης αν η παρέμβαση με τη θέση διάσπασης προ-πεδίου με PROP (λεπτομέρειες στα Υλικά και Μέθοδοι). Βρήκαμε ότι και οι δύο κληρονομική (G62V και T118R) και σποραδικές (P30T, G62D, H92Y, H121R και H123Y) μεταλλάξεις εντοπίζονται σε E-cadherin προπεριοχής είναι δομικά ανεκτή, όπως προβλέπεται από FoldX (Πίνακας S3). Όταν αναλύουμε τις επιπτώσεις με βάση τη διατήρηση χρησιμοποιώντας SIFT, βρήκαμε επίσης ότι καμία από τις μεταλλάξεις που θεωρήθηκε επιβλαβή, επειδή ο βαθμός διατήρησης είναι χαμηλή (Πίνακας S3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παθογένεια του USVs Ε-καδερίνης εντοπισμένη στην προπεριοχή δεν είναι πιθανό εξαρτάται από την αποσταθεροποίηση. Επίσης βρήκαμε καμία επίδραση στην διάσπαση του προπεπτιδίου, όπως προβλέπεται από PROP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι η παθογένεια των μεταλλάξεων E-cadherin σε αυτόν τον τομέα μπορεί να προκύψει από την παρεμβολή με τον ελλιμενισμό των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επεξεργασία προ-πεδίο, αδύνατο να προβλεφθεί

in silico

.

Κληρονομική E -cadherin USVs εκτείνονται σε όλο το μήκος της εξωκυττάριας περιοχής, ενώ οι σποραδικές μεταλλάξεις που βρίσκονται κυρίως σε EC2-EC3, όπως σύμφωνα με τη δυναμική ζώνη που περιγράφηκε προηγουμένως στα εξόνια 7-9 [5]. Από το σύνολο των 18 βλαστική μεταλλάξεις HDGC /EODGC εντοπίζεται στον τομέα αυτό, βρήκαμε ότι 10 έχουν σημαντική διαρθρωτική επίπτωση στην πρωτεΐνη (Πίνακας 1). Περίπου οι μισές από τις σποραδικές μεταλλάξεις επίσης αποσταθεροποιούν (Πίνακας S3), ανεξάρτητα από τον τομέα ΕΚ όπου εντοπίζονται, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μητρική κατάσταση αποσταθεροποίησης μπορεί να συνδέεται με ένα σημαντικό τμήμα των σποραδικών καρκίνων που αφορούν απώλειες E-cadherin από σημειακή μετάλλαξη.

Μόνο τρεις μεταλλάξεις εντοπίζονται στην περιοχή χαρτογραφήθηκε από το μοντέλο της κυτταροπλασματικής περιοχής δέσμευσης β-κατενίνης (P799R, V832M, S838G): τα δύο πρώτα προσδιορίζονται στην ρύθμιση HDGC /EODGC και το άλλο σποραδικές, βρέθηκε σε κύτταρα ωοθηκών καρκίνωμα [31]. Για αυτές τις μεταλλάξεις αναλύσαμε την ενέργεια δέσμευσης μεταξύ Ε-καδερίνης και β-κατενίνης και διαπίστωσε ότι κανένας από αυτούς δεν μεταβάλλει σημαντικά την συγγένεια πρόσδεσης του β-κατενίνης, σύμφωνα με την πρόβλεψη FoldX. Αυτό είναι σύμφωνο με το

in vitro

αποτελέσματα που δείχνουν ότι η κληρονομική μετάλλαξη V832M δεσμεύει αποτελεσματικά β-κατενίνης, καθώς και την παθογένεια της φαίνεται να εξαρτάται από την ανικανότητα του συμπλόκου Ε-καδερίνης /β-κατενίνης να δεσμεύουν α κατενίνης [32], [33].

Έχουμε συλλέξει όλες τις προβλέψεις και λειτουργική

in vitro

δεδομένων των μεταλλάξεων HDGC /EODGC και ανέλυσε την αξιοπιστία των προγνωστικών που χρησιμοποιούνται (Πίνακας 1). Είμαστε κατατάσσονται τα αποτελέσματα από τις προβλέψεις ως: True Positive (TP) όταν η μετάλλαξη έχει προβλεφθεί ως επιβλαβή

in silico

(είτε με FoldX ή SIFT) και εκθεσιακό απώλεια της λειτουργίας

in vitro

? Αληθινή Αρνητικό (TN), όταν η μετάλλαξη έχει προβλεφθεί ως ανεκτή

in silico

και λειτουργική

in vitro

? False Positive (FP), όταν η μετάλλαξη έχει προβλεφθεί ως επιβλαβή

in silico

αλλά είναι λειτουργικό

in vitro

? και ψευδώς αρνητικό (FN), όταν η μετάλλαξη έχει προβλεφθεί ως ανεκτή

in silico

αλλά εκθέματα

in vitro

απώλεια της λειτουργίας. TP και TN είναι θετικά αποτελέσματα, πράγμα που σημαίνει ότι οι προγνωστικοί παράγοντες είναι σε θέση να ανιχνεύσει την επίδραση μετάλλαξη σε λειτουργία? FP και FN αντιπροσωπεύουν το βαθμό της βλάβης. Βρήκαμε ότι και οι δύο αλγόριθμοι είναι σε θέση να προβλέψει τη λειτουργική κρούση έως το 70% των βλαστικής σειράς μεταλλάξεων HDGC /EODGC (11 από 16 μεταλλάξεις), με τις προβλέψεις επικάλυψη για το ήμισυ των μεταλλάξεων (Πίνακας 1, Σχήμα 2Β).

Αναλύσαμε τα διαθέσιμα για τις βλαστική HDGC /EODGC μεταλλάξεις φορείς και τα δεδομένα, παρόλο που οι πληροφορίες είναι περιορισμένες, βρήκαμε ότι το πιο πλήρες σύνολο των δεδομένων είναι η ηλικία έναρξης της νόσου ή θανάτου που συνδέονται με DGC. Όταν box-οικόπεδο αυτά τα δεδομένα, την ομαδοποίηση «αποσταθεροποίηση» και «μη αποσταθεροποίηση» φορείς μετάλλαξης, παρατηρούμε μια εμφανή νεότερη ηλικία εμφάνισης της νόσου (διάγνωση ή θανάτου) για την πρώτη ομάδα (Σχήμα 2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μητρική κατάσταση αποσταθεροποίησης λογαριασμούς για την προηγούμενη ανάπτυξη DGC.

3. Βιολογική σημασία της E-cadherin αποσταθεροποίηση

Για να προσδιοριστεί η βιολογική σημασία της E-cadherin αποσταθεροποίησης, θα χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο σύστημα τριών πρόσφατα εντοπίστηκαν μεταλλάξεις απουσίας E-cadherin βλαστική αναφερθεί στο εργαστήριο μας για λειτουργικό χαρακτηρισμό: E185V, S232C και L583R, ο αργότερα περιγράφηκε πρόσφατα στην βιβλιογραφία [22]. Η

in silico

ανάλυση που περιγράφεται προηγουμένως πραγματοποιήθηκε για αυτές τις τρεις νέες μεταλλάξεις και τα αποτελέσματα περιλαμβάνονται στον Πίνακα 1 (κάτω από τη σκοτεινή γραμμή). Μεταλλάξεις E185V και S232C είναι δομικά ανεκτή, με ΔΔΟ = 0,29 kcal /mol και -0,9 kcal /mol αντίστοιχα (Πίνακας 1), θεωρείται ασήμαντη όσον αφορά τον αντίκτυπο στη δομή. Μετάλλαξη S232C προωθεί μια ελάττωση της ενέργειας, τη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης, και αυτό οφείλεται στην απώλεια της υψηλής ενέργειας ενός Σερίνη θαμμένο ΟΗ ομάδα, η οποία δεν εμπλέκεται σε H-δεσμού, και με την στέγαση της πλευρικής αλυσίδας της κυστεΐνης. Μετάλλαξη L583R προκαλεί αποσταθεροποίηση, με ΔΔΟ = 2,72 kcal /mol, αντανακλώντας τη δραματική αλλαγή από ένα υδρόφοβο σε υδρόφιλο αμινοξύ, που οδηγεί σε ένα αργινίνη δεν είναι σε θέση να σχηματίσουν H-ομόλογα, που δυσμενώς θαφτεί.

n vitro

λειτουργικές δοκιμασίες διεξήχθησαν για τις προαναφερθείσες μεταλλάξεις HDGC /EODGC, και βρήκαμε μια τέλεια συσχέτιση μεταξύ της λειτουργικότητας

in vitro

και την παρουσία /απουσία διαρθρωτικές επιπτώσεις: E185V και S232C διατηρούν η συγκολλητική λειτουργία του Ε-καδερίνης, και είναι σε θέση να σχηματίσουν σφιχτό κυτταρικά συσσωματώματα, ενώ L583R παρουσιάζει ένα σαφές πρότυπο διάσπαρτα, που μοιάζει με Mock κύτταρα (Σχήμα 3Α), υποδεικνύοντας ότι E185V και S232C είναι μη-παθογόνα και L583R είναι παθογόνος.

κύτταρα CHO ήταν παροδικά (Α) ή σταθερά (Β-Ο) επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα (Mock) ή WT, E185V, S232C, L583R E-cadherin cDNA. Α) λειτουργική δοκιμασία συσσωμάτωσης διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. L583R κύτταρα εμφανίζουν απώλεια Ε-καδερίνης της λειτουργίας, με αποτέλεσμα ένα διάσπαρτα μοτίβο, που μοιάζει με Mock κύτταρα. ΔΔΟ υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο FoldX και είναι μηδέν για την αναφορά WT? Β) συνολική κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και Ε-καδερίνης ανιχνεύθηκε με Western Blot χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης. Αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η έκφραση της L583R μειώνεται και μετατοπίζεται σε υψηλότερου μοριακού βάρους, ενδεικτικά να διατηρούνται ως ανώριμα (περίπου 130 kDa). C) έκφραση Ε-καδερίνης στην πλασματική μεμβράνη (ΡΜ) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, μετά από χρώση με ένα εξωκυτταρικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Ε-καδερίνης. L583R είναι λιγότερο εκφράζεται στη ΜΠ.

Η

Όταν αναλύσαμε την έκφραση Ε-καδερίνης στις διάφορες κυτταρικές σειρές, βρήκαμε ότι το συνολικό ποσό των μεταλλαγμένων L583R είναι χαμηλότερη ότι η έκφραση WT υπό τις ίδιες συνθήκες, ενώ μεταλλάξεις E185V και S232C, διατηρούν φυσιολογικά επίπεδα (Σχήμα 3Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η ταινία που αντιστοιχεί εις L583R συγκρατείται στη γέλη, υποδεικνύοντας ότι L583R δεν είναι σε θέση να ωριμάσει σωστά (ανώριμη μορφή της Ε-καδερίνης είναι 130 kDa, ώριμη είναι 120 kDa) και κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα δείχνουν ότι είναι λιγότερο εκφρασμένη σε ο μεμβράνη πλάσματος (Σχήμα 3C).

Όταν ωρίμανση πρωτεϊνών αποτύχει, αυτό οδηγεί συνήθως σε Ενδοπλασμικό δίκτυο (ER) διατήρηση των ανώριμων πρωτεΐνης.