Αφηρημένο

καρκίνο των χοληφόρων οδών (BTC) είναι συχνά δύσκολο να εντοπιστεί οριστικά, ακόμα και μέσα από ιστολογική εξέταση. Τα microRNAs (miRNAs) ρυθμίζουν μια ποικιλία φυσιολογικών διεργασιών. Κατά τα τελευταία έτη, έχει προταθεί ότι τα προφίλ για το κυκλοφορούν miRNAs, καθώς και εκείνες για miRNAs ιστό, έχουν το δυναμικό να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικά για τον καρκίνο βιοδείκτες. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να επιβεβαιώσει την ύπαρξη των miRNAs στην ανθρώπινη χολή και να αξιολογηθεί το δυναμικό τους ως κλινική βιοδείκτες για BTC. Εμείς δείγματος χολής από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χολική παροχέτευση για χοληφόρων ασθένειες όπως BTC και choledocholithiasis. PCR-based ανίχνευση miRNA και η κλωνοποίηση miRNA έγιναν για τον εντοπισμό της χολής miRNAs. Χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο μικροσυστοιχίες miRNA που βασίζεται στην PCR υψηλής απόδοσης, τα προφίλ έκφρασης των miRNAs 667 συγκρίθηκαν σε ασθενείς με κακοήθη νόσο (

n

= 9) και των ασθενών ίδιας ηλικίας με την καλοήθη choledocholithiasis ασθένεια (

n

= 9). Εμείς στη συνέχεια χαρακτηρίζεται χολή miRNAs από την άποψη της σταθερότητας και της τοπικής προσαρμογής. Μέσω της κλωνοποίησης και τη χρήση μεθόδων PCR, επιβεβαιώσαμε ότι υπάρχουν miRNAs στη χολή. Διαφορική ανάλυση της χολής miRNAs κατέδειξε ότι 10 από τα 667 miRNAs ήταν σημαντικά πιο υψηλά εκφράζεται σε κακοήθη ομάδα από ό, τι στην καλοήθη ομάδα στο

P

& lt? 0,0005. Ρύθμιση το όριο εξειδίκευση στο 100% έδειξε ότι ορισμένοι miRNAs (

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199α-3ρ

και

ΜΙΚ 222 *

) είχαν ένα επίπεδο ευαισθησίας του 88,9%, και ο δέκτης-λειτουργικό χαρακτηριστικό ανάλυση έδειξε ότι

miR-9

και

miR-145 *

θα μπορούσε να είναι χρήσιμο διαγνωστικό δείκτες για BTC. Επιπλέον, διαπιστώσαμε τη μακροπρόθεσμη σταθερότητα των miRNAs στη χολή, ένα χαρακτηριστικό που τα καθιστά κατάλληλα για διαγνωστική χρήση σε κλινικό περιβάλλον. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι τα χολικά miRNAs εντοπίζονται στην κακοήθη /καλοήθης χολική επιθήλια. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η χολή miRNAs θα μπορούσε να είναι κατατοπιστική βιοδείκτες για ηπατοχολική νόσο και ότι ορισμένοι miRNAs, ιδιαίτερα

miR

-9, μπορεί να είναι χρήσιμη στη διάγνωση και την κλινική διαχείριση των BTC

Παράθεση:. Shigehara Κ, Yokomuro S, Ishibashi O, Mizuguchi Υ, Arima Υ, Kawahigashi Υ, et al. (2011) Real Time-PCR Based-ανάλυση του ανθρώπινου χολή MicroRNAome Αναγνωρίζει

miR-9

ως πιθανό διαγνωστικό βιοδεικτών για καρκίνο των χοληφόρων οδών. PLoS ONE 6 (8): e23584. doi: 10.1371 /journal.pone.0023584

Επιμέλεια: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Ιταλία

Ελήφθη: 28 Δεκέμβρη 2010? Αποδεκτές: 21 Ιουλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 του Αυγ 2011

Copyright: © 2011 Shigehara et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-Aid και το Πρόγραμμα «Έρευνα Πυρήνας» για ιδιωτικό πανεπιστήμιο: Επιδότηση Ταμείο Matching (S0801034) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μεταξύ των ηπατοχολικό κακοήθη νεοπλάσματα, καρκίνο των χοληφόρων οδών (BTC), το οποίο περιλαμβάνει ενδο- και εξωηπατικές καρκίνο χολαγγειοκαρκίνωμα και της χοληδόχου κύστης [1], αυξάνεται σε συχνότητα. BTC προκύπτει από την επιθήλια των χοληφόρων οδών και συχνά προκαλεί στένωση ή απόφραξη του χοληδόχου πόρου [2]. Μια συνέπεια αυτής της απόφραξης είναι η διατήρηση της χολής, η οποία οδηγεί σε ίκτερο. Οι ασθενείς που υπάρχει υποψία ότι πάσχουν από BTC και παρουσιάζουν κλινικά συμπτώματα όπως ίκτερος συνήθως εξετάζονται με διαγνωστικές τεχνικές απεικόνισης, συμπεριλαμβανομένων υπερηχογράφημα, αξονική τομογραφία (CT), και χολαγγειοπαγκρεατογραφία μαγνητικού συντονισμού (MRCP). Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές έχουν περιορισμένη ευαισθησία για την ανίχνευση του BTC [3], και για τον καθορισμό μια ακριβή διάγνωση του καρκίνου στην κλινική είναι συχνά δύσκολη, επειδή πολλές καλοήθεις διαταραχές εμφανίζουν παρόμοια συμπτώματα. Το αποτέλεσμα είναι συχνά μια καθυστερημένη διάγνωση του BTC [4]. Η έγκαιρη ανίχνευση του BTC είναι κρίσιμη για το αποτέλεσμα του ασθενούς επειδή α) BTC συνδέεται με κακή πρόγνωση [4]? β) χαρακτηρίζεται από μη-αποκρισιμότητα /ασθενέστερη απόκριση σε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία? και γ) η μόνη θεραπευτική αγωγή είναι η χειρουργική εκτομή [5], [6]. BTC ασθενείς συχνά υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση πριν από την κατάστασή τους έχει οριστικά προσδιοριστεί να είναι κακοήθης [7]. Έτσι, βελτίωση της διαγνωστικής ακρίβειας για BTC είναι απαραίτητη, ιδιαίτερα υπό το φως της αυξανόμενης παγκόσμιας συχνότητα εμφάνισης της νόσου. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ετών, σημαντική πρόοδος έχει γίνει στην κατανόηση της παθογένεσης της BTC, και έχουν διάφορα γονίδια και τις πρωτεΐνες που συμβάλλουν με τους μοριακούς μηχανισμούς της καρκινογένεσης χοληφόρου οδού ταυτοποιηθεί [8], [9], [10], [11 ], [12].

τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενώς εκφράζονται, βραχυπρόθεσμα, μη κωδικοποιητική RNAs 18-25 νουκλεοτίδια σε μήκος που καταστέλλουν μετάφραση πρωτεΐνης με σύνδεση προς στόχευση mRNAs. Στον τομέα του καρκίνου, ένας αριθμός μελετών έχουν διεξαχθεί για miRNAs ιστό σε μια προσπάθεια για τη διαλεύκανση των μηχανισμών της νόσου και βελτιώνουν την τρέχουσα διαγνωστικές και προγνωστικές δεικτών [13], [14], [15]. Πρόσφατα, μελέτες σχετικά με την χρησιμότητα των miRNAs από εξωκυτταρικά συστατικά, κυρίως ορό και πλάσμα, έχουν αναφερθεί [16], [17], [18]. Για παράδειγμα, έχει δειχθεί ότι τα miRNAs πλακούντα που σχετίζεται με κυκλοφορούσα συσχετίζονται με την πρόοδο της κύησης [16]. Cogswell

et al.

Ανακτάται miRNAs από εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ανακάλυψαν συγκεκριμένες ασθένειες miRNA Αλτσχάιμερ αλλάζει συνεπείς με το ρόλο τους ως δυνητικές βιοδείκτες για την ασθένεια [19]. Melkonyan

et al.

Ανιχνεύεται μια ποικιλία των miRNAs στα ούρα, συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων απεκκρίνεται transrenally, και πρότεινε νέες διαγνωστικές δυνατότητες ανάλυσης transrenal νουκλεϊκών οξέων [20]. Αλλού, ο Michael

et al.

Εξάγεται miRNAs από εξωσώματα που προέρχονται από το σάλιο των υγιών και των ασθενών με σύνδρομο Sjögren [21]. Στο πλαίσιο του καρκίνου, έχουν miRNAs σε ορό από ασθενείς με καρκίνο του μαστού και διάχυτο μεγάλων Β-κυτταρικό λέμφωμα έχει αποδειχθεί ότι είναι σταθερό και εξαιρετικά προγνωστικά της κακοήθειας και την επιβίωση [17], [18]. Οι εκθέσεις αυτές υποδεικνύουν σημαντικούς ρόλους για εξωκυτταρικό miRNAs, επιπλέον εκείνων του miRNAs ιστού, στην ρύθμιση πολλών φυσιολογικών διεργασιών. Καθώς αυτό το πεδίο αναπτύσσεται, αυτά τα miRNAs μπορούν να γίνουν διαγνωστικές και θεραπευτικές στόχων σε κλινικά σχετικές καταστάσεις. Αυτές οι αναφορές μας προωθείται για να εικάζουν ότι miRNAs μπορεί να υπάρχουν και σταθερή στη χολή του ανθρώπου, όπως ακριβώς είναι και σε άλλα σωματικά υγρά, και ότι χολή που μεταδίδονται miRNAs θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως νέα βιοδείκτες για BTC.

Τα κύρια συστατικά της ανθρώπινης χολής είναι χολικών οξέων, χοληστερόλη, χολερυθρίνη, όξινα ανθρακικά, ηλεκτρολύτες και νερό. Η χολή παράγεται από ηπατοκύτταρα στο ήπαρ και ρέει μέσω του αγωγού χολή στο δωδεκαδάκτυλο, όπου βοηθά στην λιπιδική πέψη και την απορρόφηση [22]. Όπως αίμα, χολή μπορούν να συλλέγονται από ασθενείς που υποβάλλονται σε διαγνωστικές και /ή θεραπευτικές παροχέτευση χολής. Κάποιος μπορεί επομένως να κατανοήσουν τη χρησιμότητα ενός BTC βιοδείκτη στη χολή και /ή ορού. Μια χολή βιοδείκτη θα μπορούσε να επισπεύσει τη διάγνωση της BTC ωθώντας περαιτέρω ιστολογικές εξετάσεις, όπως η χολή κυτταρολογίας, κυτταρολογίας βούρτσα, και λαβίδα βιοψίας του χοληδόχου πόρου.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα αν υπάρχουν miRNAs και μπορεί να ανιχνευθεί στη χολή του ανθρώπου από τις μικρές αλληλουχίας βιβλιοθήκης RNA. Στη συνέχεια, προσδιορίζεται εάν η έκφραση ειδικών miRNAs στη χολή διαφέρει μεταξύ των ασθενών με καρκίνο και εκείνων χωρίς καρκίνο χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης πραγματικού χρόνου που βασίζεται στην PCR μικροσυστοιχίες έκφραση miRNA. Τέλος, θα αξιολογηθεί το δυναμικό της χολής miRNAs ως νέων βιοδεικτών για BTC.

Υλικά και Μέθοδοι

συλλογή χολή

Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ανθρωπίνων Δεοντολογίας της Nippon ιατρική Σχολή και η Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας της Nippon Medical School. Ασθενείς οι οποίοι υπέγραψαν μια γραπτή έντυπο συγκατάθεσης εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. δείγματα χολής συλλέχθηκαν από 18 ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο των χοληφόρων (συμπεριλαμβανομένων BTC και choledocholithiasis) που υποβλήθηκαν σε διαγνωστική ή /και θεραπευτική παροχέτευση πόρου μέσω διαδερμικής cholangiodrainage διηπατικής, διαδερμική διηπατική χοληδόχο κύστη αποστράγγισης, ή ενδοσκοπική nasobiliary αποστράγγισης. Εννέα ασθενείς διαγνώστηκαν ιστολογικά με αδενοκαρκίνωμα (επτά με χολαγγειοκαρκίνωμα και δύο με τον καρκίνο της χοληδόχου κύστης). Εμείς περιλαμβάνονται εννέα ασθενείς ελέγχου ίδιας ηλικίας έχουν διαγνωστεί με choledocholithiasis χωρίς τρέχουσα ή προηγούμενη κακοήθεια ή μια φλεγμονώδη κατάσταση (Πίνακας 1).

Η

Η επεξεργασία των δειγμάτων και RNA εξόρυξη

RNA εξήχθη από 5 ml της χολής από κάθε άτομο από την ίδια ημέρα με την συλλογή. Το κλάσμα νουκλεϊκού οξέος που λαμβάνεται με εκχύλιση σε φαινόλη-χλωροφόρμιο-ισοαμυλική αλκοόλη (25:24:1) που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης (-80 ° C για 30 λεπτά). Το συνολικό RNA ελήφθη χρησιμοποιώντας RNAiso Plus (Takara Bio, Tokyo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εκχυλίστηκε RNA δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Real-time PCR

Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας μη-ειδικούς εναρκτήρες /εκκινητές ειδικούς για κάθε mRNA /miRNA, αντίστοιχα . Τριπλά δείγματα του προκύπτοντος cDNA υποβλήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας TaqMan miRNA εκκινητές /ανιχνευτές (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) με ένα 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Μικρές RNA αλληλούχιση βιβλιοθήκη από τα χολικά miRNAs

μεθόδους miRNA κλωνοποίησης που περιγράφονται στην προηγούμενη έκθεσή μας [23]. Εν συντομία, ολικό RNA δείγματα εκχυλίζονται από χολή χρησιμοποιώντας RNAiso Plus (Takara Bio) (βλέπε παραπάνω) και διαχωρίζεται σε ένα αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Το κλάσμα 18-24-nt στη συνέχεια ανακτήθηκε. Στη συνέχεια, 5′- και 3′-προσαρμογείς απολινώθηκαν στους RNAs, και σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε. Ενίσχυση των θραυσμάτων του cDNA επιτεύχθηκε μέσω δύο διαδοχικούς γύρους PCR. Ειδικά πέψη ενζύμου περιορισμού των προσαρμογέων επιτρέπονται για concatemerization του cDNA σε μεγαλύτερα θραύσματα. Αυτά τα θραύσματα ακολούθως κλωνοποιήθηκαν σε έναν φορέα για τη δημιουργία μίας βιβλιοθήκης cDNA. Concatemerization αυξάνει τα μήκη των κατατοπιστική ακολουθίες που μπορούν να ληφθούν από κάθε κλώνο. Τα μικρά RNA αλληλουχίες αναλύθηκαν για ομολογία με γνωστές miRNAs. Σχολιασμός των miRNAs έγινε με τη χρήση του miRBase (τελευταία έκδοση) λειτουργία ανάλυσης ομολογίας.

Real-time PCR-based miRNA έκφραση προφίλ

Σύνολο miRNA (350 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Megaplex RT εκκινητές (Applied Biosystems). Τα προκύπτοντα cDNA ήταν προ-ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας Megaplex προενισχυτή Αστάρια (Applied Biosystems) και τα προ-ενισχυμένα προϊόντα εφαρμόζεται σε Array TaqMan Ανθρωπίνων microRNA Panel (Α και Β, v2.0). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 7900HT γρήγορο σύστημα Real-Time (Applied Biosystems). Τα δεδομένα PCR πραγματικού χρόνου που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Panel αναλύθηκαν με λογισμικό Applied Biosystems (SDS ver. 2.3 και RQ διευθυντής ver. 1.2). επίπεδα έκφρασης miRNAs για τον ασθενή M9 (βλέπε Πίνακα 1) τέθηκαν σε 1,0. miRNAs των οποίων η έκφραση δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε Μ9 ασθενή (βλέπε Πίνακα 1) αποκλείστηκαν από περαιτέρω ανάλυση. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, εφαρμόστηκε η σχετική μέθοδος CT (μέθοδος ΔΔCT). U6 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Για όλους τους 18 ασθενείς, αυτή η δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας πλαίσια Α και Β Προσδιορίσαμε την αποκοπής για σημαντικότητα χρησιμοποιώντας ένα δέλτα παράμετρος συντονισμού, που επιλέγονται με βάση ένα ψευδώς θετικό ποσοστό του μηδέν. Τα δεδομένα πίνακα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του δέκτη-λειτουργικό χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη με τη γραφική αναπαράσταση των σχέσεων μεταξύ των αληθές θετικών (ευαισθησία) και false positives (1 – ειδικότητα). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC), ένα μέτρο της ακρίβειας των διακρίσεων, επίσης υπολογίζεται.

miRNA δοκιμασία σταθερότητας

Για να αξιολογηθεί η σταθερότητα της ενδογενούς miRNAs στη χολή, μετρήσαμε τα επίπεδα miRNA στη χολή από τρία άτομα που είχαν επωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 0 ​​έως 24 ώρες. Εν συντομία, 5 ml από κάθε δείγμα χολής επωάστηκε, και miRNAs εκχυλίστηκαν και καθαρίστηκαν στα προγραμματισμένα χρονικά σημεία με χρήση της μεθόδου που περιγράφεται παραπάνω. RNA δείγματα στη συνέχεια μεταγράφεται ανάστροφα και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο PCR. Για τη μέτρηση της σταθερότητας του εξωγενούς miRNA, ένα συνθετικό

Caenorhabditis elegans

miRNA (

cel-miR-39

) προστέθηκε σε κάθε δείγμα χολή κατά την έναρξη της περιόδου επώασης (0 ώρες) και υποβάλλεται στις ίδιες διαδικασίες εκχύλισης και ποσοτικοποίηση. Για την κανονικοποίηση των δεδομένων, το συνθετικό

C. elegans

miRNA

cel-miR-238

προστέθηκε στο κλάσμα νουκλεϊκών οξέων αμέσως πριν από την αντίστροφη μεταγραφή για να χρησιμεύσει ως εσωτερικός έλεγχος στην PCR πραγματικού χρόνου.

Η χολή κλασματοποίηση

η χολή φέρεται να κλασματωθεί σε τέσσερα εξαρτήματα, αυξάνοντας τόσο την φυγόκεντρο δύναμη και τη διάρκεια της φυγοκέντρησης [24]. Για να εκτιμηθεί χολή miRNA εντοπισμού, εμείς κλασματοποιήθηκαν δείγματα χολής 12-ml από τρία άτομα με διαφορική φυγοκέντρηση [25] και συγκρίθηκαν το επίπεδο έκφρασης των miRNAs σε κάθε κλάσμα (Σχ. 1). Τα σχετικά μεγάλα συστατικά όπως ολόκληρα κύτταρα, πυρήνες και κυτταρικά ιζήματα cytoskeletons σε

χαμηλή ταχύτητα

(1000 ×

g

για 10 λεπτά). Σφαιρίδια που περιέχουν μιτοχόνδρια, λυσοσώματα, και υπεροξειδιοσώματα ελήφθησαν σε

μέση ταχύτητα

(20.000 ×

g

για 20 λεπτά), και μικροσώματα και μικρές κύστεις σε

υψηλής ταχύτητας

( 80.000 ×

g

για 1 ώρα). Τέλος, τα μικρότερα συστατικά (π.χ., ριβοσώματα, ιούς και μεγάλα μακρομόρια) συλλέχθηκαν σε ένα

πολύ υψηλή ταχύτητα

με μια μακρά περίοδο φυγοκέντρηση (150.000 χ

g

για 3 h) ( Εικ. 1). RNA εκχυλίστηκε από κάθε σφαιρίδιο χρησιμοποιώντας RNAiso Plus (Takara Bio) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και η έκφραση ορισμένων αυθαίρετα επιλεγμένων miRNAs μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου όπως περιγράφεται παραπάνω. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA που κωδικοποιεί την χολική επιθηλιακά δείκτη Cytokeratin 7 (CK-7) μετρήθηκε επίσης να βεβαιωθείτε ότι η κλασματοποίηση είχε διεξαχθεί σωστά [26], [27], [28], [29].

Ανθρώπινα χολή υποβλήθηκε σε επαναλαμβανόμενη φυγοκέντρηση σε προοδευτικά υψηλότερες ταχύτητες για το διαχωρισμό των κυττάρων και οργανιδίων. Οι συνθήκες φυγοκέντρησης (βαρύτητα και χρόνος) ήταν ως ακολούθως: χαμηλή ταχύτητα, 1000 × g για 10 λεπτά? μέτρια ταχύτητα, 20.000 × g για 20 λεπτά? υψηλή ταχύτητα, 80.000 χ g για 1 ώρα? πολύ υψηλή ταχύτητα, 150.000 × g για 3 ώρες.

Η

Αποτελέσματα

Η επιβεβαίωση της ύπαρξης των miRNAs στην ανθρώπινη χολή

Μέχρι σήμερα, δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση σχετικά με την παρουσία miRNAs στη χολή. Η πρώτη μας προτεραιότητα ήταν να διαπιστωθεί αν υπάρχουν miRNAs στη χολή και, αν ναι, για τον εντοπισμό τους. Real-time PCR με ειδικούς εκκινητές /ανιχνευτές έδειξαν ότι το

miR-21

ήταν παρούσα στη χολή (Εικ. 2Α). Χρησιμοποιώντας χολή ως το αρχικό υλικό, μικρό αλληλούχιση βιβλιοθήκη RNA επαλήθευσε την παρουσία πολλών miRNAs, με

ας-7b

είναι το πιο συχνά κλωνοποιηθεί (Σχ. 2Β και 2C). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι miRNAs είναι παρόντες στη χολή και ότι χολή είναι ένα ελκυστικό βιολογικό υλικό προς ανάλυση miRNA.

(Α) σε πραγματικό χρόνο με βάση την PCR ανίχνευση miRNA του

miR-21

. TaqMan miRNA πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ανιχνευτή /εκκινητές ειδικούς για

miR-21

πραγματοποιήθηκε σε τρία δείγματα χολής και ένα δείγμα μάρτυρα χωρίς πρότυπο (NC). Σημειώστε την έλλειψη ενός προϊόντος PCR στον αρνητικό έλεγχο (NC). (Β) Εκπρόσωπος χρωματογράφημα των αποτελεσμάτων αλληλουχίας μετά την κλωνοποίηση των χολικών miRNA. Οριζόντιες μπάρες πάνω από το χρωματογράφημα δείχνουν κάθε miRNA και συνδέτη (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). (Γ) Ο πίνακας δείχνει τα miRNAs που προσδιορίζονται από την κλωνοποίηση, σε σχέση με τη συχνότητά τους, και εάν έχουν κλωνοποιηθεί από BTC ή καλοήθεις περιπτώσεις.

Η

υψηλής απόδοσης και ποσοτικών χαρακτηριστικών έκφραση microRNA της χολής από ασθενείς με χοληφόρων οδών καρκίνος

Για τον εντοπισμό χολή miRNAs που εκφράζονται ανώμαλα σε νοσήματα των χοληφόρων οδών, ειδικά καρκίνων των χοληφόρων οδών, αναλύσαμε δείγματα χολής από όλους τους 18 ασθενείς με έκφραση miRNA πραγματικού χρόνου που βασίζεται στην PCR προφίλ (Σχ. 3Α και τον πίνακα S1 ). Σχετική ποσοτικοποίηση των δεδομένων έδειξε ότι 335 από τα 667 miRNAs ήταν σημαντικά πιο υψηλά εκφράζεται σε κακοήθη ομάδα σε σχέση με την καλοήθη ομάδα (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 3Α και τον πίνακα S1). Από αυτές, τονίζεται 10 miRNAs (

miR-9

,

miR-145 *

,

miR-105

,

miR-147b

,

ας-7f-2 *

,

ας-7θ *

,

miR-302c *

,

miR-199α-3ρ

,

miR -222 *

και

miR-942

) των οποίων η έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε

P

& lt?. 0.0005 (Σχήμα 3Α). Τον καθορισμό του ορίου εξειδίκευση στο 100% [17], [30] έδειξε ότι

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199α-3ρ

, και

miR-222 *

είχε επίπεδο ευαισθησία 88,9%, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα miRNAs μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιολογικοί δείκτες για καρκίνο χοληφόρων οδών (Σχ. 3Β). Το επίπεδο ευαισθησίας για

miR-145 *

,

miR-105

, και

miR-942

ήταν 77,8%, και ότι για το

miR-147b

,

ας-7f-2 *

, και

ας-7θ *

ήταν 66,7% (Σχ. 3Β). Επιπλέον, η περιοχή κάτω από την ανάλυση ROC καμπύλη έδειξε ότι

miR-9

και

miR-145 *

μπορούσε να είναι εξαιρετική διαγνωστικοί δείκτες για BTC (Σχ. 3C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η χολή miRNAs,

κυρίως miR-9

, έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό δείκτες για καρκίνο των χοληφόρων οδών.

(Α) miRNA θερμότητας έκφραση χάρτη, με miRNAs ταξινομούνται ανάλογα με τους

P

-τιμές. Τα δείγματα φαίνονται σε σειρές, και miRNAs σε στήλες. έκφραση miRNA σε M9 ασθενή (βλέπε Πίνακα 1), ορίστηκε σε 1,0. Πλήρη αποτελέσματα μικροσυστοιχιών μπορεί να βρεθεί στις συμπληρωματικές πληροφορίες. (Β) Dot γραφική παράσταση που δείχνει τα επίπεδα έκφρασης των 10 miRNAs που ήταν σημαντικά περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε κακοήθη ομάδα σε σχέση με την καλοήθη ομάδα (

P

& lt? 0,0005). Ο κάθετος άξονας δείχνει λογαριθμική σχετικές τιμές ποσοτικοποίηση λαμβάνονται σε μια δοκιμασία συστοιχία TaqMan. Τον καθορισμό του ορίου ειδικότητα 100% έδειξε το επίπεδο ευαισθησίας για να είναι 88,9% για το

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199α-3ρ

, και

miR-222 *

? 77,8% το

miR-145 *

,

miR-105

, και

miR-942

? και 66,7% το

miR-147b

,

ας-7f-2 *

, και

ας-7θ *

. ○, μέση τιμή. Ανάλυση καμπύλη (C) ROC. Το προφίλ έκφρασης για κάθε miRNA χρησιμοποιήθηκε ως είσοδος για την λειτουργία χαρακτηριστική ανάλυση δέκτη (ROC). Η καμπύλη ROC απεικονίζει την ευαισθησία έναντι 1 – ειδικότητα. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC), ένα μέτρο της ακρίβειας των διακρίσεων, επίσης υπολογίζεται.

Η

Χαρακτηρισμός της χολής miRNAs

Για χολή miRNAs να χρησιμοποιηθούν διαγνωστικά σε κλινικό περιβάλλον, που χρειάζονται για να είναι σταθερή. Λαμβάνοντας υπόψη αποικοδόμησης φύση του, ήταν σημαντικό να καθορίσει πόσο καιρό miRNA ακεραιότητας θα μπορούσε να διατηρηθεί στη χολή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, επιβεβαιώσαμε ότι οι ενδογενείς miRNAs χολή

miR-21

,

ας-7c

, και

miR-9

ήταν σταθερά στη χολή και ότι τα επίπεδα έκφρασης τους παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα , ειδικά μέσα σε 4 ώρες από 24 ώρες επώασης. Ωστόσο, το εξωγενές miRNA

cel-miR-238

ήταν αμέσως υποβαθμισμένη όταν προστίθεται στα τρία μεμονωμένα δείγματα χολής (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ενδογενής miRNAs χολή είναι σε σταθερή μορφή που μπορεί να αντέξει δυσμενείς συνθήκες, όπως ισχυρή δραστικότητα RNase και ισχυρή οξύτητα, που προκαλούν εξωγενή miRNAs να υποβαθμίζεται. Επιπλέον, οι αναλύσεις έδειξαν κλασμάτωση ότι, για όλα τα τρία δείγματα που εξετάστηκαν, όλες miRNAs, συμπεριλαμβανομένων

miR-9

, ανιχνεύθηκαν στο συστατικό που περιέχει χολικά επιθηλιακά κύτταρα, πυρήνες και cytoskeletons, υποδεικνύοντας ότι τα χολικά miRNAs βρίσκονται κυρίως στο εσωτερικό κυττάρων και πυρήνων. (Εικ. 5).

Τα ενδογενή miRNAs χολή του ανθρώπου

HSA-miR-21

,

HSA-ας-7c

, και

HSA-miR-9

είναι σχετικά σταθερή. Αντίθετα, το συνθετικό εξωγενές miRNA

cel-miR-39

αποικοδομήθηκε γρήγορα όταν προστίθενται σε χολή.

Η

Τα επίπεδα του mRNA και miRNAs σε κάθε κλάσμα υπολογίστηκαν από τα αποτελέσματα των πραγματικών -Time PCR και ο όγκος του συνολικού RNA να συγκρίνει την απλοποιημένη απόλυτη ποσότητα σε κάθε συστατικό. (Α) mRNA που κωδικοποιεί την χολική CK δείκτη επιθήλιο 7 ήταν κυρίως ανιχνεύθηκε στο υποκυτταρικό συστατικό, η οποία περιελάμβανε ολόκληρα κύτταρα, πυρήνες, και κυτταρική cytoskeletons. (Β) Η miRNAs

miR-21

,

miR-9

, και

RNU6B

έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο, υποδεικνύοντας ότι τα περισσότερα miRNAs στη χολή προήλθαν από τα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων . Τα κλάσματα που λαμβάνονται μέσω χαμηλής ταχύτητας (1), μέσης ταχύτητας (2), υψηλής ταχύτητας (3)? και πολύ φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας (4).

Η

Συζήτηση

Εδώ, θα υποβάλει έκθεση σχετικά με την παρουσία και τη σταθερότητα της χολής miRNAs, σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης τους, όπως μετρήθηκε με υψηλής απόδοσης PCR πραγματικού χρόνου, και οι διαφορές στα προφίλ miRNA μεταξύ των δειγμάτων χολής από ασθενείς με καλοήθη και κακοήθη ασθένεια των χοληφόρων οδών. Μετά την επιβεβαίωση της ύπαρξης των miRNAs στη χολή χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές miRNA, πραγματοποιήσαμε μια πιο ολοκληρωμένη ανάλυση χρησιμοποιώντας miRNA microarrays, η οποία μας επέτρεψε να δοκιμαστεί για την παρουσία 667 ειδών miRNA. Αν και αυτό είναι μια μικρή μελέτη, έχουμε την πεποίθηση ότι η αντίληψή μας για τη χρήση miRNAs να διακρίνει καλοήθη /κακοήθη νοσήματα των χοληφόρων οδών θα επικυρώνονται ως περισσότερο οι μεγάλης κλίμακας μελέτες που διεξάγονται στο μέλλον. Εκτός από την προτείνει τη διαγνωστική χρήση της χολής miRNAs, έχουμε αναπτύξει αξιόπιστες μέθοδοι για την εκχύλιση και την αξιολόγηση των miRNAs που είναι συμβατά με την κλινική δοκιμή. Συγκριτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης εντοπίστηκαν 10 miRNAs των οποίων τα επίπεδα διαφέρουν μεταξύ των κακοήθεις και καλοήθεις καταστάσεις (

P

& lt? 0,0005) (Εικ. 3Β). ανάλυση ROC εντοπίστηκαν δύο από αυτές τις miRNAs ως κατάλληλη για χρήση ως BTC βιοδείκτες (Σχ. 3C). Αξίζει να σημειωθεί ότι,

miR-9

έδειξε αξιόπιστη διαγνωστική ειδικότητα και ευαισθησία.

Στο πλαίσιο της βιολογίας του καρκίνου, παρεκκλίνουσα έκφραση

miR-9

έχει συσχετιστεί με μετάσταση [31 ], [32], [33], [34]. Η

miR-9

οικογένειας ρυθμίζεται προς τα πάνω [32], [33] ή μειωτικά [31], [35] σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους. Η διαφορά στο

miR-9

έκφραση δει εδώ μπορεί να είναι παρόμοιο με το στάδιο ειδική ρύθμιση που επιδείχθηκε για

miR-200

στον καρκίνο του ήπατος [36]. Νωρίς, όταν τα καρκινικά κύτταρα καθίστανται επεμβατική και υφίστανται επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση,

miR-200

ρυθμίζεται προς τα κάτω, αλλά αργότερα ρυθμίζεται αυξητικά κατά τη διάρκεια της επανα-επιθηλίωσης του άπω μεταστάσεων όταν κύτταρα υφίστανται μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση [36]. Ο μηχανισμός του

miR-9

απορύθμιση στη μελέτη μας παραμένει άγνωστη, αλλά μπορεί να περιλαμβάνουν μη φυσιολογική μεθυλίωση του είναι υποστηρικτής περιοχής [31], [34], [37] ή την ενεργοποίηση στ του μεταγραφικού παράγοντα MYC /MYCN [32 ]. Περαιτέρω λειτουργικές μελέτες του

miR-9

στην BTC χρειάζονται.

Στη συνέχεια διερευνήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά των miRNAs στη χολή. Πλάσμα έχει αναφερθεί ότι δείχνουν ισχυρή δραστικότητα RNase [38]. Mitchell

et al.

Επιβεβαίωσε αυτή την δραστικότητα ριβονουκλεάσης και απέδειξαν ότι γυμνός miRNAs υπόκεινται σε αποικοδόμηση, ενώ η ενδογενής miRNAs παρέμεινε σταθερή στο πλάσμα, ακόμη και με την παρουσία ισχυρή δραστικότητα RNase [39]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε παρόμοιες διαφορές στη σταθερότητα μεταξύ ενδογενών και εξωγενών miRNAs στη χολή (Εικ. 4). Η σταθερότητα του ενδογενούς miRNAs χολής καθιστά κατάλληλο ως αξιόπιστη βιοδεικτών σε κλινικές καταστάσεις.

Πώς ενδογενούς miRNAs αντέχουν στις συνθήκες μετουσίωσης της χολής δεν έχει ακόμη εξηγηθεί. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα περισσότερα από τα κυκλοφορούντα miRNAs βρίσκονται σε εξωσώματα, τα οποία τα προστατεύουν από την αποικοδόμηση και είναι υπεύθυνα για την εξαιρετική σταθερότητά τους [40], [41], [42]. Εξωσώματα είναι κυστίδια μεμβράνης 40-100-nm της ενδοκυτταρικής προέλευσης που περιέχουν τόσο mRNA και miRNA. Εξωσώματα μπορούν να μεταφερθούν από το ένα κύτταρο στο άλλο, και τα συστατικά τους μπορεί να λειτουργήσει στο νέο περιβάλλον. Αρκετές miRNA profiling μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με εξωσώματα που κυκλοφορούν στο αίμα [40], [41], [42]. Αρχικά τεκμαίρεται ότι η σταθερότητα των ενδογενών χολικών miRNAs προέκυψαν από την παρουσία τους σε εξωσώματα. Ωστόσο, αντίθετα με τις προσδοκίες μας, τα πειράματα κύτταρο κλασματοποίηση αποκάλυψε ότι οι περισσότεροι από τους χολής miRNAs δεν βρέθηκαν σε μικρά κυστίδια αλλά σε ακέραια κύτταρα και οι πυρήνες (Εικ. 5). Αν και δεν υπάρχει απόδειξη ότι τα χολικά miRNAs έχουν τις ίδιες λειτουργίες με εκείνες στον ορό ή το πλάσμα, τα ευρήματά μας από μελέτες κλασματοποίηση και την ανάλυση PCR του CK-7 υποδηλώνουν ότι οι miRNAs προέρχονται από χολή που προέρχονται κυρίως από ανέπαφα επιθηλιακά κύτταρα ή κακοήθη κύτταρα που έχουν κατεστραμένα από τη χολή σωλήνα. Ετσι, ενδογενής miRNAs παραμένουν σταθερά στη χολή μέχρι αποικοδόμηση των απολεπισμένα κύτταρα στα οποία περιέχονται. Μόλις τα miRNAs απελευθερώνονται από αυτές τις δομές στη χολή, είναι πιθανό απαξίωσαν με γρήγορους ρυθμούς.

Υπάρχει πραγματική ανάγκη για καινοτόμα εργαλεία για την ακριβή διάγνωση BTC. Επί του παρόντος, η παρουσία του καρκινοεμβρυονικού αντιγόνου (CEA) και υδατάνθρακα 19-9 (CA 19-9) σε ορό χρησιμεύσει ως πρότυπο για την κλινική διάγνωση της BTC. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, ωστόσο, η ευαισθησία της δοκιμής αυτής δεν είναι τόσο υψηλή όσο εκείνη που επιτυγχάνεται με ανάλυση miRNA μας. Σε οκτώ από τα εννέα BTC περιπτώσεις, τα επίπεδα CEA στον ορό δεν αύξησαν, παρότι ο καρκίνος ήταν παρούσα. Επιπλέον, ο ορός CA-19-9 επίπεδα αυξήθηκαν μόνο σε ορισμένους ασθενείς, πιθανώς λόγω της χολόσταση. Οι διαγνωστικές τεχνικές φαντασία, όπως η ενδοσκοπική υπερηχοτομογραφία (EUS) και ενδοπορικού υπερηχογράφημα χρησιμοποιείται όταν υπάρχει υποψία BTC. EUS επιτρέπει μια καλή άποψη του άπω εξωηπατικών χοληφόρων δέντρο, τη χοληδόχο κύστη, περιφερειακούς λεμφαδένες και αγγείωση [5]. Rösch

et al.

Συνέκρινε την διαγνωστική ακρίβεια της ενδοσκοπικής ανάδρομης χολαγγειοπαγκρεατογραφία (ERCP), MRCP, CT, και EUS σε 50 ασθενείς με χολική στενώματα. Η ευαισθησία /ειδικότητα της διάγνωσης της κακοήθειας ήταν 85% /75% για ERCP, 85% /71% για MRCP, 77% /63% για CT, και 79% /62% για EUS [43]. Σε μια προοπτική μελέτη ασθενών με υποψία χολαγγειοκαρκίνωμα, EUS είχε μια διαγνωστική ευαισθησία 79% και ειδικότητα 62% [44]. Επιπλέον, σε μια πρόσφατη μετα-ανάλυση, EUS είχε ευαισθησία 78% και ειδικότητα 84% [45]. Ενδοπορικού υπερηχογραφία με σύρμα-καθοδηγούμενη, λεπτή-διαμετρήματος, ανιχνευτές υψηλής συχνότητας πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια της ERCP, και σε προηγούμενες μελέτες έδειξαν ποσοστά ακρίβειας για τη διάκριση καλοήθων και κακοήθων στενώσεων του 76-90% [46], [47], [48]. Εκτός από τις τεχνικές απεικόνισης, ιστολογικών μεθόδων όπως χολικά κυτταρολογία, κυτταρολογία βούρτσα, και λαβίδα βιοψίας είναι υποχρεωτικές για οριστική διάγνωση. Η χολή κυτταρολογίας και κυτταρολογίας πινέλο έχουν μόνο μέτρια ποσοστά ακρίβειας για τον καθορισμό κακοήθεια, που κυμαίνονται από 30 έως 70% στις περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες [5], [49], [50], [51], [52], [53]. Λαβίδα βιοψίας, η οποία έχει υψηλότερο ποσοστό ακρίβειας από τις άλλες ιστολογικές εξετάσεις (43 σε 81%), δεν χρησιμοποιείται ευρέως επειδή απαιτεί μια εξειδικευμένη συσκευή και τεχνική [54], [55], [56]. Παρομοίως, η πιο εξειδικευμένη EUS-καθοδηγούμενη με λεπτή βελόνα βιοψίας αναρρόφηση, με διαγνωστική ευαισθησία της 43 σε 86% για χοληφόρων στενώσεις [7], [57], [58], [59], [60], [61], χρησιμοποιείται σήμερα μόνο για παγκρεατικών όγκων και στενώσεις αγωγού κατώτερης χολή και δεν έχει εγκριθεί για χρήση σε άλλες συνθήκες. Η χαμηλή διαγνωστική ακρίβεια μερικών από τις δοκιμές που χρησιμοποιούνται σήμερα επιβεβαιώνει ότι BTC μπορεί να είναι δύσκολο να εντοπιστεί. Εν όψει της κακής πρόγνωσης για BTC [4], είναι επιθυμητό να βελτιωθεί η ευκολία και η ακρίβεια της δοκιμής. Τα αποτελέσματα της έρευνάς μας δείχνουν ότι η μέτρηση της χολής miRNAs μπορούν να βελτιώσουν την ταχύτητα και την ακρίβεια της διάγνωσης BTC. Επιπλέον, η ανάλυση της χολής είναι εφικτή, επειδή χολή miRNAs είναι σταθερά και μπορούν εύκολα να εξαχθούν και να αναλυθούν σε κλινικό περιβάλλον.

Περαιτέρω έρευνες με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών και των διαφορετικών πληθυσμών της μελέτης, καθώς και μελέτες της διαφορικής εμφάνισης μεταξύ BTC και προ οι -malignant ασθένειες όπως πρωτοπαθή σκληρυντική χολαγγειίτιδα απαιτούνται για την επίτευξη κλινική αποδοχή. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η μέτρηση των χολικών επιπέδων miRNA είναι μια πρακτική προσέγγιση για την υποβοήθηση της αξιολόγησης του BTC και είναι συγκρίσιμη με πολλά τρέχοντα διαγνωστικές μεθόδους, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρολογίας. Ως εκ τούτου, καταλήγω στο συμπέρασμα ότι η μέτρηση της έκφρασης miRNA στη χολή θα ήταν χρήσιμη στη διάκριση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων συνθηκών, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις που παραμένουν αδιάγνωστοι. Αξίζει να σημειωθεί ότι, χολή

miR-9

έχει μεγάλες δυνατότητες για χρήση ως κλινικός δείκτης των καρκίνων των χοληφόρων οδών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

επίπεδα έκφρασης του miRNAs στη χολή. Ένας χάρτης θερμότητα κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα από τις μικροσυστοιχίες miRNA χρησιμοποιούνται για την ανάλυση δειγμάτων χολής από ασθενείς με κακοήθεις και καλοήθεις ασθένεια. έκφραση miRNA σε M9 ασθενή (βλέπε Πίνακα 1), ορίστηκε σε 1,0. Β, ανάλυση της χολής από έναν ασθενή με καλοήθη ασθένεια? Μ, η ανάλυση της χολής από έναν ασθενή με κακοήθη νόσο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023584.s001

(XLSX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Takuji Kosuge και Yoshimi Hinohara για εξειδικευμένη τεχνική βοήθεια τους.