Abstract

ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου (CRC) σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια έχουν μεγάλο δυναμικό για την επιτάχυνση της μελέτη της βιολογίας και της θεραπείας των όγκων. Αξιολογήσαμε ξενομοσχευμάτων ιδρύθηκε το NOD /SCID /ποντίκια IL2Rγ-null από τις πρωτογενείς ή μεταστατικούς όγκους των 27 ασθενών με CRC για την εκτίμηση της ικανότητάς τους για την επέκταση των καρκινικών κυττάρων για

in vitro

μελέτες και να εκτιμήσει πόσο πιστά θα ανακεφαλαιώνει το μεταγραφικό προφίλ της γονικής όγκων τους. RNA-seq ανάλυση της γονικής ανθρώπινων όγκων CRC και τα παράγωγα τους ξενομοσχεύματα έδειξαν ότι αναπαραγώγιμες μεταγραφική αλλαγές χαρακτηρίζουν τη ανθρώπινου όγκου σε μετάβαση ξενομοσχεύματος ποντικού. Στις περισσότερες αλλά όχι σε όλες τις περιπτώσεις, τα ανθρώπινα στρώμα, αγγείωση, και τα στοιχεία αιμοποιητικών συστηματικά αντικατασταθεί από ανάλογα ποντικού, ενώ η συνιστώσα καρκίνωμα επέμενε. Μόλις καθιερωθεί ως ξενομοσχεύματα, ανθρώπινα κύτταρα CRC που θα μπορούσε να διαδοθεί με αύξοντα μεταμόσχευση παρέμεινε μεταγραφικά σταθερή. Τρία ιστολογικά άτυπα ξενομοσχεύματα, που ιδρύθηκε από ασθενείς με περιτοναϊκή μεταστάσεις, περιέχονται στοιχεία στρωματικά άφθονη ανθρώπινη και αιμοφόρων αγγείων εκτός από ανθρώπινα κύτταρα όγκου. Οι transcriptomes αυτών των μικτών ξενομοσχευμάτων όγκου /στρωματικών δεν μοιάζουν πολύ με εκείνα της γονικής όγκους τους, και προσπαθεί να διαδώσει όπως ξενομοσχευμάτων με βάση τον αύξοντα μεταμόσχευση ήταν ανεπιτυχείς. Σταθερή έκφραση πολλών γονιδίων που έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως στόχους ως υψηλής προτεραιότητας για ανοσοθεραπεία παρατηρήθηκε στις περισσότερες ξενομοσχεύματος καταγωγές. Παρατηρήθηκε επίσης παρεκκλίνουσα έκφραση σε κύτταρα CRC των ανθρώπινων γονιδίων που κανονικά εκφράζεται μόνο σε αιμοποιητικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα ανθρώπινα κύτταρα CRC επεκτάθηκε σε ποντικού ξενομοσχεύματα έχουν μεγάλη χρησιμότητα για τις μελέτες της ανοσοβιολογίας όγκου και στοχευμένες θεραπείες, όπως η ανοσοθεραπεία, αλλά και τον εντοπισμό πιθανών περιορισμών

Παράθεση:. Chou J, Fitzgibbon MP, Mortales C-LL, Towlerton ΑΜΗ, Upton MP, Yeung RS, et al. (2013) Η φαινοτυπική και Μεταγραφική Fidelity των προερχόμενων από ασθενή καρκίνου του παχέος εντέρου ξενομοσχεύματα σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. PLoS ONE 8 (11): e79874. doi: 10.1371 /journal.pone.0079874

Επιμέλεια: Siu Tim Cheung, του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 22 Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 26η Σεπτεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Νοέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Chou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μεταδιδακτορικός υπότροφος στην ανοσολογία του καρκίνου από την Irvington Ινστιτούτο του Ινστιτούτου Έρευνας καρκίνου (JC) (www.cancerresearch.org), τον J. Orin Edson Ταμείο για την ανοσοθεραπεία, Κλινικός βραβείο Επιστήμονας στη μεταγραφική έρευνα (# 1007475) από το Ταμείο Burroughs Wellcome (ΕΜΕ) (www.bwfund.org), επιχορήγηση από το Υπουργείο άμυνας (W81XWH-12-0349) (MPF και MWM) (cdmrp.army.mil), και επιχορηγήσεις από το NCI /NIH: SAIC σύμβαση # HHSN261200800001E (MPF και MWM), U01 CA176270 (MWM και ΕΜΕ), και Ρ30 DK56465 (στο Β Torok-Storb) (www.nih.gov). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Φρέσκο ​​εκτομή πρωτογενείς και μεταστατικούς καρκίνους του παχέος (CRC) [1], [2], όπως και πολλά άλλα είδη ανθρώπινων αιματολογικών και συμπαγών όγκων, μπορεί να καθιερωθεί ως ξενομοσχεύματα σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια, όπως το NOD /

scid

/IL2Rγ – /- (NSG) στέλεχος και πολλαπλασιάζονται μακροπρόθεσμα μέσω σειριακής μεταμόσχευση. CRC ξενομοσχεύματα παρέχουν ένα ελκυστικό σύστημα μοντέλο στο οποίο να μελετήσει τη βιολογία και τη θεραπεία των όγκων. Σε αντίθεση με τις κυτταρικές σειρές CRC ιδρύθηκε από φρέσκα χειρουργικά ιστούς συχνά χάνουν σημαντικά χαρακτηριστικά της γονικής ανθρώπινων όγκων τους αφού έχουν προσαρμοστεί σε αυτά, και έχει διαδοθεί σε,

in vitro

πολιτισμό, τον ασθενή που προέρχεται CRC ξενομοσχευμάτων αναπαράγουν πολλά από τα φαινοτυπική και γονοτυπική χαρακτηριστικά των γονικών όγκων από τα οποία προέρχονται [1] – [17]. Ανάλυση των ασθενών που προέρχονται από ξενομοσχεύματα CRC έχει προχωρήσει σε βάθος κατανόηση της αρχιτεκτονικής του όγκου, ετερογένεια, και άλλες κρίσιμες πτυχές της βιολογίας των όγκων. CRC ξενομοσχεύματα έχουν επίσης εξαιρετικό δυναμικό για χρήση ως μοντέλο συστήματα στα οποία να διερευνήσει θεραπεία με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [9] – [13], [17], καθώς και νέες μορφές της στοχευμένης θεραπείας CRC όπως ανοσοθεραπεία [11], [17], [18]. Επιπλέον, η ικανότητα να διαδίδουν την ανθρώπινη CRC σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια μπορεί δυνητικά να παρέχουν μια ανανεώσιμη προμήθεια των κυττάρων CRC για χρήση σε

in vitro

μελέτες.

Οι διαφορές μεταξύ των ανθρώπινων όγκων CRC και τα παράγωγα τους ξενομοσχεύματα, ωστόσο, δεν υπάρχουν. Πιο σημαντική είναι η συνεπής παρατήρηση που CRC ξενομοσχεύματα υποστηρίζονται από ποντικού, αντί του ανθρώπου, στρώμα [7], [9], [15], [16]. Κατά συνέπεια, CRC ξενομοσχεύματα προσφέρουν μια ευκαιρία για την αξιολόγηση της μεταγραφικό ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του χωριστά από τη στήριξη των ανθρωπίνων στρώμα τους. Βαθιά ανάλυση της μεταγραφής του CRC ξενομοσχευμάτων μπορεί συνεπώς να βοηθήσει με την ερμηνεία των δημοσιευμένων μεταγραφική αναλύσεις πρόσφατα εκτομή όγκων στον άνθρωπο CRC, που αντιπροσωπεύουν ένα μίγμα και των δύο ανθρώπινο στρώμα και το καρκίνωμα [19], [20]. Ο βαθμός στον οποίο η αλληλεπίδραση με στρώμα ποντικού και επιρροές αγγείωση η μεταγραφική προφίλ των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων στο ξενομόσχευμα δεν έχει εξεταστεί μέχρι σήμερα με τις μεθόδους που επιτρέπουν την σαφή διάκριση μεταξύ των ανθρώπινων μεταγραφημάτων που προέρχονται από τα κύτταρα του όγκου και του ποντικού μεταγραφές προέρχονται από το στρώμα και αγγείωση. Ως εκ τούτου, ανέλαβε μια ολοκληρωμένη μελέτη της μορφολογίας και μεταγραφικό προφίλ ενός πάνελ ξενομοσχευμάτων εγκατεστημένοι σε ποντίκια NSG από φρέσκα εκτομή πρωτογενείς και μεταστατικούς καρκίνους του ανθρώπου άνω και κάτω τελεία, για να αξιολογήσει την πιστότητα με την οποία οι ξενομοσχεύματα ανακεφαλαιώνει τα μεταγραφικά προφίλ και μοναδικά μοριακά χαρακτηριστικά της γονικής ανθρώπινους όγκους από το οποίο προήλθαν. Η μεταγραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με RNA-seq, το οποίο επιτρέπει τον προσδιορισμό της ανθρώπινης ή μυϊκής προέλευσης των μεταγραφών με υψηλό βαθμό βεβαιότητας. Για να αξιολογηθεί η σταθερότητα αυτών των χαρακτηριστικών μέσω σειριακής μεταμόσχευση, εκτελέσαμε επίσης λεπτομερή ανάλυση της μεταγραφής ενός γενεαλογίας ξενομοσχεύματος που καθιερώθηκε από ένα μόνο πρωτογενή ανθρώπινα όγκου κόλου και στη συνέχεια έχει διαδοθεί μέσα από δέκα γενιές των αποδεκτών NSG. Έχουμε προσδιορίσει ότι ξενομεταμόσχευση ανθρώπινων όγκων του παχέος εντέρου χαρακτηρίζεται από αναπαραγώγιμη βιολογική και μεταγραφικές αλλαγές που χαρακτηρίζουν την ανθρώπινη να ποντικού μετάβασης, η οποία στις περισσότερες περιπτώσεις την επιλογή ενός μεταγραφικά σταθερό πληθυσμό καρκινικών υποστηρίζεται από στρώμα και αγγείωση ποντικού. Επιπλέον, εντοπίσαμε το γονίδιο σύνολα εκφράζεται επιλεκτικά στο επιθηλιακό (καρκίνωμα) ή συστατικά στρωματικά του CRC ξενομοσχεύματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Χειρουργική δείγματα πρωτογενών ή μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου ελήφθησαν από αποχαρακτηριστούν δότες μέσω της Συνεργατικής Ανθρώπινο Δίκτυο ιστών (CHTN, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Nashville, ΤΝ), ή από άτομα που υποβάλλονται σε θεραπεία στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον (UW) Ιατρικό Κέντρο (Seattle, WA), οι οποίοι έδωσαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του UW /Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson Center (FHCRC) Cancer Consortium. Διερεύνηση των ανθρώπινων δειγμάτων διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις που βρέθηκαν στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, 8

ου Edition (Εθνικό Συμβούλιο Ερευνών, Εθνικό Ακαδημίες Press). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του FHCRC. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό τριβρωμοαιθανόλη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Μεταφορά και Επεξεργασία των δειγμάτων ιστού

Φρέσκο ​​εκτομή μεταστατικού όγκου ή /και του πρωτογενούς όγκου του παχέος δείγματα καρκίνου που λαμβάνεται από το CHTN (23 μοναδικές ασθενείς, 24 δείγματα) ή τοπικά (27 μοναδικές ασθενείς, 33 δείγματα) τοποθετήθηκαν σε μέσο μεταφοράς που αποτελείται από DMEM /F12 μέσο (Hyclone) συμπληρωμένο με 10 μg /mL ciprofloxacin (Bayer), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη ( 10.000 U /mL πενικιλλίνη, 10 mg /mL στρεπτομυκίνη) (Invitrogen), και 0,5 μg /mL αμφοτερικίνη Β (Invitrogen). Είχαν αποσταλεί διάρκεια της νύχτας σε πάγο για την επεξεργασία της επόμενης ημέρας (CHTN όγκους) ή μεταφέρονται μέσα σε μία ώρα για την επεξεργασία την ίδια ημέρα (UW όγκοι). Μικρά τμήματα του κάθε όγκου καταψύχθηκαν flash ή τοποθετούνται σε RNAlater (ϋίβ Technologies) και επίσης τοποθετήθηκαν σε φορμαλίνη. Το υπόλοιπο του κάθε όγκου ξεπλύθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (Invitrogen), στη συνέχεια μειώνεται σε ένα μόνο κυτταρικό εναιώρημα μέσω μηχανική διάσπαση, και ενζυματική πέψη επί 1-2 ώρες στο /F12 μέσο μεταφοράς που βασίζεται σε DMEM συμπληρωμένο με 4,66 μg /mL ηπαρίνη νάτριο (Sigma), 2% συμπλήρωμα Β27 (Invitrogen), και 5% Αντικατάσταση νοκ-άουτ ορού (Invitrogen), 1 mg /mL κολλαγενάση Ι (Sigma), 0,1 mg /mL Υαλουρονιδάσης, και 0.1 mg /mL DNase Ι (Worthington Biochemical) . Υποστεί πέψη κύτταρα πλύθηκαν με ένζυμο μέσο ελεύθερο και επαναιωρήθηκαν σε 30-50 μί Matrigel (BD Biosciences) πριν από την ένεση.

Πρωτογενής ξενομοσχεύματα καθορίστηκαν με έγχυση απλού κυττάρου εναιωρήματα (1 × 10

4-2 × 10

6 κύτταρα) που παρασκευάζεται από ορθοκολικό καρκίνο δείγματα είτε κάτω από την κάψα του νεφρού [21] (από n = 14 μοναδικό ασθενείς) ή /και υποδορίως στα πλευρά (n = 46 ασθενείς) 6-12 εβδομάδων ηλικίας αρσενικό ή θηλυκό υποθανατηφόρως γ-ακτινοβολημένα (250 cGy σε 20 cGy /min) NSG ποντίκια που τέθηκαν κατά τη Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson Center. Το διάστημα μεταξύ χειρουργική εκτομή και ένεση ποντικός ήταν 24-30 ώρες για τους όγκους του παχέος εντέρου που λαμβάνεται από το CHTN και 3-6 ώρες για όγκους που λαμβάνονται σε τοπικό επίπεδο. Πέντε δείγματα χωνευμένη όγκων ήταν εμπλουτισμένα για CD133

+ κυττάρων πριν από την ένεση, χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα σε αντι-CD133 αντίσωμα (Miltenyi Biotec) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποντικοί που φέρουν προοδευτικά διευρύνεται όγκοι αφέθηκαν να επιβιώσουν μέχρι οι όγκοι έφθασαν μια διάμετρο 2 cm, που εκδηλώνεται οποιαδήποτε σημάδια της ταλαιπωρίας, ή υπέστησαν απώλεια βάρους 20%, σε ποιο σημείο έγινε ευθανασία για συγκομιδή του όγκου. Κομμάτια που συγκομίζονται ξενομοσχεύματος αμέσως καταψύχθηκε ή να τοποθετηθούν σε RNAlater, τοποθετήθηκαν σε φορμόλη για μετέπειτα ιστολογίας, και τοποθετήθηκαν σε μέσο μεταφοράς και επεξεργασία κατά τον ίδιο τρόπο με το αρχικό ανθρώπινο όγκο για σειριακή μεταμόσχευση σε άλλο υποδοχής NSG.

Ανοσοϊστοχημεία και μικροσκοπία

φορμαλίνη σταθερό, τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη από εκτομή τα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου ή ξενομοσχευμάτων παρασκευάστηκαν για μικροσκοπία με χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη ή με αντισώματα εναντίον ανθρώπινου αντιγόνου λευκοκυττάρων (HLA) τάξης Ι (MBL Corporation), καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA) (Novus), κυτοκερατίνη 20 (ΟΚ20) (Dako), Ki-67 (Dako), CD31 (Dako), επιθηλιακό κύτταρο μόριο προσκόλλησης (EpCAM) (Novus), Ε-καδερίνης (Cell Marque ), προγραμματισμένος θάνατος-1 (PD1) (Cell Marque), βιμεντίνη (Dako), ινονεκτίνη (Dako), CD4 (Novacastra), CD8 (Novacastra), και CD3 (Novacastra) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι διεξήχθησαν για κάθε αντίσωμα. Διαφάνειες παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο Nikon E800 Eclipse, και οι εικόνες αποκτήθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή της Olympus SP Magnafire και λογισμικού Magnafire (Optronics).

κυτταρομετρίας ροής

Ένα απλό εναιώρημα κυττάρων παρασκευάζεται από ένα ξενομόσχευμα που προέρχεται από D61540.T2 βάφτηκε με Qdot 525 νανοκρυστάλλου (Invitrogen) για τα ζωντανά και νεκρά κυτταρική διαφοροποίηση, ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης αντι-Ρϋ-1 αντίσωμα (BD Biosciences), και φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-CTLA-4 αντισώματος (BD Biosciences). Τα δεδομένα αποκτήθηκαν σε μια ροή FACSCanto II κυτταρομετρίας (BD Biosciences) και αναλύθηκαν με λογισμικό Καλούζα (Beckman Coulter).

RNA-επόμενα προετοιμασία των δειγμάτων και αλληλουχίας

Το RNA που εξάγεται από τα δείγματα χρησιμοποιώντας RNeasy Plus Mini ή AllPrep RNA /κιτ DNA (QIAGEN). Η ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε σε Agilent 2100 Bioanalyzer. Δείγματα με αριθμό ακεραιότητα RNA (RIN) μεγαλύτερη από 7 αραιώθηκαν σε 50 ng /μL για παρασκευή βιβλιοθήκης αλληλούχιση με τον TruSeq Δείγμα Kit Παρασκευή (Illumina). Ξεκινώντας με περίπου 1 μα ολικού RNA, το mRNA απομονώθηκε με σφαιρίδια δέσμευσης ολιγο-άΤ, τότε κατακερματισμένη και μετατράπηκε σε cDNA με τυχαία εξαμερή γεμάτοι αντίστροφη μεταγραφή και δεύτερου κλώνου σύνθεση. Τα προκύπτοντα cDNAs ήταν κατακερματισμένη με κατεργασία υπερήχων και το μέγεθος επιλεγμένων για μόρια ~ 300 bp. Η πρόσδεση του γραμμοκώδικα προσαρμογείς αλληλούχιση στη συνέχεια διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τα δείγματα cDNA υποβλήθηκαν σε πολλαπλή αλληλούχιση, με ένα έως τέσσερα δείγματα ανά λωρίδα, από την Illumina HiSeq 2000 για να αποδώσει αντιστοιχισμένο-άκρο αλληλουχίες 50 bp. Αυτή η διαδικασία απέδωσε μεταξύ 54,6 Μ και 367,0 Μ ακολουθίες περνώντας τις προεπιλεγμένες Illumina φίλτρα ελέγχου της ποιότητας.

Ποσοτική PCR

κρυοσυντηρημένα κύτταρα από P2726.Ov υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα κιτ Dead αφαίρεση κυττάρων (Miltenyi Biotec) και στη συνέχεια ταξινομούνται σε EpCam

– και EpCam

+ τα κλάσματα με μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα με ανθρώπινα EpCAM-ειδικό αντίσωμα (Miltenyi Biotec). RNA εκχυλίστηκε από κάθε κλάσμα, και cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ και τυχαία εξαμερή εκκινητήρια μόρια από το First Strand cDNA Synthesis kit (Roche). Οι ‘και 3’ εκκινητές 5 για ποσοτική PCR (qPCR) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας είτε qPrimerDepot [22] ή Primer-BLAST [23] (Πίνακας S1 σε S4 File). Πρότυπο SYBR Green (Roche) qPCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ Prism 7900HT χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση μεταγραφών γονιδίων. Τα δεδομένα φθορισμού αναλύθηκαν σε LinRegPCR [24], και η εκτιμώμενη συγκέντρωση εκκίνησης (N

0) του κάθε γονιδίου κανονικοποιήθηκε έναντι εκείνη του γονιδίου housekeeping

GAPDH

. Η ανθρώπινη προέλευση των PCR αμπλικονίων από ξενομοσχεύματα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση καμπύλης διαχωρισμού.

RNA-επόμενα Ανάλυση Δεδομένων

Για κάθε δείγμα, όλα σε συνδυασμό διαβάζει διέρχεται από τα φίλτρα της ποιότητας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την splice- ΤΟΡΗΑΤ C γνωρίζει aligner μικρής ανάγνωση [25]. Για τα δείγματα ξενομοσχεύματος, χρησιμοποιήσαμε μια απλή συντηρητική στρατηγική φιλτραρίσματος για το διαχωρισμό του ανθρώπου διαβάζει, που προκύπτουν από τις εμφυτευμένα ανθρώπινα κύτταρα όγκου, από το ποντίκι διαβάζει αναμένεται να γίνει δειγματοληψία από την υποστήριξη ποντικού ιστό. Σε αυτή τη στρατηγική, ΤΟΡΗΑΤ C χρησιμοποιήθηκε για να ευθυγραμμίσει διαβάζει τόσο για την ανθρώπινη (hg19) και ποντικού (mm9) συγκροτήματα γονιδίωμα αναφοράς. Αναφέρει ότι ταιριάζει το ανθρώπινο γονιδίωμα με μεγαλύτερη πιστότητα (λιγότερες αναντιστοιχία βάσεις) διατηρήθηκαν ως ανθρώπινα διαβάζει. Εκείνοι που συμπλήρωσαν το γονιδίωμα του ποντικού με μεγαλύτερη πιστότητα κρατήθηκαν ως ποντικού. Διαβάζει ταιριάζουν και τα δύο γονιδιώματα με την ίδια πιστότητα τοποθετήθηκαν σε μια τρίτη «διφορούμενη» τάξη και δεν εξετάζεται περαιτέρω. Για να καταστεί δυνατή χρήσιμη σύγκριση μεταξύ ανθρώπινα νεοπλασματικά δείγματα (δωρεάν από την κατασκευή από μολυσματικά ακολουθίες του ποντικού) και προέρχεται ξενομοσχεύματα, έχουμε επεξεργαστεί τα ανθρώπινα δείγματα μέσω του ίδιου αγωγού φιλτραρίσματος. Λιγότεροι από το 0,2% των διαβάζει από αυτά τα αποκλειστικά ανθρώπινα δείγματα είχαν εσφαλμένα επισημαίνονται ως καταγωγής ποντίκι, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στρατηγική φιλτράρισμα μας έχει χαμηλό ποσοστό εσφαλμένης ταξινόμησης. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει την απόδοση της αλληλουχίας, που κυμαίνονται από τουλάχιστον 5 GB σε πάνω από 30 GB ανά δείγμα, μαζί με το ποσοστό του διαβάζει σε κάθε δείγμα ταξινομείται ως ανθρώπου, ποντικού, ή διφορούμενος. είναι δεδομένα αλληλουχίας που διατίθενται στην Ακολουθία Διαβάστε Αρχείο NCBI (προσχώρηση #: SRP028952).

Η

Gene-επίπεδο διαβάσετε μετρήσεις που δημιουργούνται από ανθρώπινες και ποντικού ευθυγραμμίζονται διαβάζει χρησιμοποιώντας το πακέτο HTSeq (http: //www- huber.embl.de/users/anders/HTSeq). Διαβάστε μετράει δημιουργήθηκαν με το σενάριο htseq-μετράνε για κάθε ανθρώπου και ποντικού γονιδιακό τόπο σε μια ένωση του REFSEQ και UCSC συλλογές KnownGenes που σχετίζονται με την ανθρώπινη hg19 και mm9 συνελεύσεις. Αναγνώσει πλήρως περιέχεται εντός κάθε εξόνιο ενός μοντέλου γονίδιο αποδόθηκαν στο εν λόγω γονίδιο. Οι μετρήσεις ανάγνωσης για κάθε γονίδιο κανονικοποιήθηκαν διαιρώντας τους από το συνολικό αριθμό των διαβάζει, σε εκατομμύρια, που λαμβάνεται για την εν λόγω δείγμα.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε στο περιβάλλον R για στατιστικούς υπολογιστών και Microsoft Excel. Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ανάλυση συστάδων δεδομένων γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το περιβάλλον R για στατιστικούς υπολογισμούς. Η edger πακέτο 3.0.2 [26] χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε δύο ή περισσότερα δείγματα. διασπορές Tagwise υπολογίστηκαν για κάθε γονίδιο χρησιμοποιώντας την γενικευμένη μέθοδος γραμμικό μοντέλο, και οι δοκιμές του λόγου πιθανοφάνειας υπολογίστηκαν μεταξύ ζευγών σύνολα δειγμάτων. Γονίδια με ψευδή ποσοστά ανακάλυψη & lt? 0,05 μετά την προσαρμογή Benjamini-Hochberg [27] για πολλαπλές συγκρίσεις ορίστηκαν ως διαφορικά εκφρασμένων. Υπερ- ή υπο-εκπροσωπούνται σύνολα γονιδίων μεταξύ διαφορικά εκφρασμένα γονίδια ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο R goseq 1.10.0 [28], με την κανονική διαδρομή και χημικές και γενετικές σειρές γονιδίων διαταραχές από τη βάση δεδομένων Μοριακής υπογραφές (MSigDB) v3.0 [29] . Η Wallenius μη-κεντρική μέθοδο υπεργεωμετρική κατανομή χρησιμοποιήθηκε για την προσέγγιση της κατανομής των μελών σετ γονιδίων μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων.

καμπύλες ανάπτυξης των όγκων προσαρμόζονται σε εξίσωση με το χρόνο διπλασιασμού ορίζονται ως και την καλοσύνη της προσαρμογής μετράται από το συντελεστής προσδιορισμού R

2. ακριβής δοκιμασία Οι δύο ουρά του Fisher χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις των κατηγορικών δεδομένων μεταξύ των δύο ομάδων, ενώ δύο-tailed t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για τις συγκρίσεις των ποσοτικών δεδομένων μεταξύ των δύο ομάδων.

Αποτελέσματα

Εμπειρία με την Παραγωγή και εμπορία πολλαπλασιαστικού CRC Ξενομοσχεύματα

ένα πλεονέκτημα της ξενομεταμόσχευσης είναι ότι ενδεχομένως να παρέχει μια μέθοδο για να διαδώσει τα κύτταρα CRC επ ‘αόριστον και πιστά αναπαράγει το αρχικό γονικό ανθρώπινου όγκου. Επιδιώξαμε να αναπτύξει ένα πρωτόκολλο που θα επιτευχθεί πιο αποτελεσματικά αυτό το στόχο. Φονικά ακτινοβολημένων ποντικών NSG εγχύθηκαν με εναιωρήματα απλού κυττάρου που παρασκευάζονται από δείγματα όγκων χωρίς παρατεταμένη παρεμβαίνουν

in vitro

καλλιέργεια που θα μπορούσαν δυνητικά να επιλέξει για προσαρμογές δεν υπάρχουν στο αρχικό ανθρώπινου όγκου. Ένα σύνολο 33 από τα 57 χειρουργικά δείγματα που λαμβάνονται από 27 από 50 μεμονωμένους ασθενείς με είτε τοποπεριοχική και /ή μεταστατικό CRC (Πίνακας S2 σε S4 File) έχουν επιτυχώς καθιερωθεί ως ξενομοσχεύματα.

Αρχικά, έγχυση των κυττάρων όγκου CRC εμπλουτισμένο πριν από την εμφύτευση για κύτταρα που εκφράζουν το υποτιθέμενο CRC βλαστικών κυτταρικό δείκτη CD133

+ συγκρίθηκε με ένεση χύμα, μη ταξινομημένα κύτταρα όγκου για τον καθορισμό ξενομοσχεύματα επειδή ο προηγούμενος έχει συσχετισθεί με υψηλότερη πιθανότητα μεταμόσχευσης [1], [2] . Όποτε είναι δυνατόν, ο μέγιστος αριθμός των CD133

+ – ταξινομημένα κύτταρα ή χύμα, μη ταξινομημένα κύτταρα μπορεί να ληφθεί από έναν όγκο εγχύθηκε σε δόση έως 2 × 10

6 κύτταρα. Παρά το γεγονός ότι ένεση 1 × 10

4 CD133

+ – ταξινομημένα κύτταρα ήταν σε ορισμένες περιπτώσεις επαρκείς για τη δημιουργία ενός ξένου μοσχεύματος (πίνακες S2 και S3 στην S4 File), τα συνολικά ποσοστά της μεταμόσχευσης για CD133

+ – ταξινομημένο κύτταρα δεν ήταν σημαντικά καλύτερα από ό, τι για χύμα, μη ταξινομημένα κύτταρα (2/5 έναντι 25/45, αντίστοιχα). Δεδομένου ότι και οι δύο CD133

– και CD133

+ κύτταρα από μεταστατικούς όγκους CRC έχουν τη δυνατότητα να καθορίσει ξενομοσχεύματα [6], και, προκειμένου να συλλάβει την ετερογένεια του αρχικού όγκου ανθρώπινου όσο το δυνατόν περισσότερο, η απόφαση ήταν έκανε να χρησιμοποιήσει μη ταξινομημένα καρκινικά κύτταρα CRC για ξενομεταμόσχευση σε όλα τα επόμενα πειράματα. Μπορούμε επίσης σε σύγκριση εμφύτευση των κυττάρων του όγκου κάτω από την κάψα του νεφρού με υποδόρια εμφύτευση, εν όψει των δημοσιευμένων εκθέσεων των υψηλών ποσοστών ενοφθαλμισμό κυττάρων CRC μετά υπονεφρική ένεση κάψουλα [1]. Όταν ταυτόχρονες ενέσεις από ίσο αριθμό κυττάρων CRC από τον ίδιο όγκο έγιναν στο πλευρό και κάτω από την κάψουλα του νεφρού του 3 διαφορετικούς ποντικούς, τα προκύπτοντα υποδόριων όγκων ήταν πολύ μεγαλύτερες από εκείνες που αναπτύχθηκαν στο νεφρό. Επιπλέον, υποδόρια ένεση των κυττάρων στο πλευρό συσχετίστηκε με υψηλότερο ποσοστό εγκαταστάσεως ξενομοσχεύματος από ένεση subcapsular (3/14 έναντι 26/45,

σ

= 0,03 με την δίπτυχη επακριβή δοκιμή Fisher) (Πίνακες S2 και S3 σε S4 File), και συνδέθηκε με λιγότερη νοσηρότητα και πρόωρη θνησιμότητα, με πρόωρων θανάτων σε ≤1 εβδομάδα που συμβαίνουν σε 14 από 30 ποντικούς που έλαβαν ενέσεις subcapsular και 6 του 208 ποντίκια που έλαβαν υποδόρια εμφυτεύματα μόνο (

p

= 0.0001).

Με βάση αυτές τις προκαταρκτικές παρατηρήσεις, υποδόρια ένεση χύμα, μη ταξινομημένα κύτταρα CRC στο πλευρό χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα επόμενα πειράματα για τη δημιουργία CRC ξενομοσχεύματα. Τα ξενομοσχεύματα καθορίζονται με τον τρόπο αυτό είχαν αναδρομικά αναλύθηκαν για χαρακτηριστικά τα οποία θα μπορούσαν να σχετίζονται με το προτιμώμενο μεταμόσχευση. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της επιτυχίας εμφύτευση και τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών από τους οποίους ελήφθησαν οι όγκοι (Πίνακας S4 στο S4 File). Αντρας ασθενής συνδέθηκε με μια τάση προς την ανώτερη μεταμόσχευση (

σ

= 0,06). Ο μέσος αριθμός των κυττάρων που εγχέεται σε επιτυχημένες και αποτυχημένες απόπειρες μεταμόσχευση ήταν σημαντικά διαφορετική -1.2 × 10

6 (εύρος: 2 × 10

5-2 × 10

6) κύτταρα στην επιτυχή ενέσεις έναντι 8,8 × 10

5 (εύρος: 1 × 10

4-2 × 10

6) σε αποτυχημένες προσπάθειες (

σ

= 0.04)

Serial ξενομοσχεύματα καθιερώθηκαν από. 18 από 26 πρώτης γενιάς, 11 από 14 δεύτερης γενιάς, και 8 από 8 ξενομοσχευμάτων τρίτης γενιάς. Μερικά ξενομοσχεύματα δεν περάστηκαν λόγω του μικρού μεγέθους (≤1 mm σε διάμετρο), ο απροσδόκητος θάνατος του ποντικιού πριν από τη συγκομιδή του όγκου, ή της μη διαθεσιμότητας του παραλήπτη ποντίκια NSG. Από τις 26 ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς για την οποία επιχειρήθηκε σειριακό πέρασμα, εκείνοι που είχαν αποδειχθεί εκθετική αύξηση παρουσίασαν υψηλότερο ποσοστό μοσχεύματος στο δεύτερης γενιάς από εκείνες που δεν το έκανε (16/20 έναντι 2/6, αντίστοιχα, em

σ

= 0,05), και κανένα από τα ξενομοσχευμάτων που απέτυχαν να δείξουν εκθετική ανάπτυξη θα μπορούσε να περνιούνται επιτυχώς πέραν της δεύτερης γενιάς. Όλες οι γραμμές ξενομοσχεύματος που πέρασαν πέρα ​​από τη δεύτερη γενιά απέδωσε σημαντική όγκων & gt? 5 χιλιοστά, και θα μπορούσε να αυξηθεί στο μέγιστο επιτρεπόμενο μέγεθος του όγκου των 2 εκατοστών. Ένα πρωτοπαθούς όγκου του παχέος εντέρου (D55949) και ένα μεταστατικό όγκο (P2726) και οι δύο σειριακά μεταμοσχεύθηκαν μέσα από 10 γενεές. Η ενίσχυση του αριθμού ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών κατέστη δυνατή από ξενομεταμόσχευση ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις τουλάχιστον 50-πλάσια από την αρχική δόση κυττάρων για κάθε γενεά, επιτρέποντας την αποτελεσματική και ταχεία επέκταση των κυττάρων CRC.

Ιστολογία του CRC Όγκοι και παράγωγα ξενομοσχεύματα τους

πιο ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς κατέδειξε μεταβλητά αδενικό μορφολογία με καλά καθορισμένα επιθηλιακών και στρωματικών συνιστωσών, που μοιάζει με τα γονικά ανθρώπινων όγκων (PHTs) από το οποίο προήλθαν (Σχήματα 1 και Σχ S1 S2 Σχήμα). Ομογενής έκφραση της ανθρώπινης τάξης Ι μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (MHC) παρατηρήθηκε σε όλες χειρουργικά δείγματα CRC αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη, ανεξάρτητα από προέλευση τους από πρωτογενείς όγκους ή από υποτροπιάζοντα /μεταστατικές αλλοιώσεις. Η έκφραση του ανθρώπινου κατηγορίας Ι MHC σε ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς, ωστόσο, έδειξε δύο διαφορετικά πρότυπα. Όλα τα ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς που προέρχονται από πρωτογενείς όγκους του παχέος εντέρου και όλες εκτός από τρεις από αυτές που προέρχονται από υποτροπιάζοντα /μεταστατικές αλλοιώσεις έδειξε ομογενή έκφραση της ανθρώπινης τάξης Ι MHC στα επιθηλιακά συστατικά αλλά απουσία έκφρασης στα συστατικά στρωματικά (Σχήματα 1 και Σχ S1 Σχ S2 ), γεγονός που υποδηλώνει ότι το στρώμα σε αυτές τις ξενομοσχεύματα ήταν προέλευσης μυοειδούς, όπως έχει προηγουμένως αναφερθεί [7], [9]. Αυτά τα ξενομοσχεύματα θα αναφέρεται ως ξενομοσχεύματα καρκινώματος (CXS). Σε αντίθεση, τα ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς που προέρχονται από τρεις διαφορετικούς ασθενείς (P2726, P2750, και P2825) ήταν κυρίως στρωματικά στη μορφολογία και έδειξε έκφραση της ανθρώπινης τάξης Ι MHC τόσο επιθηλιακών και στρωματικών συστατικά τους, αποδεικνύοντας ότι το στρώμα σε αυτές τις ξενομοσχεύματα ήταν τουλάχιστον εν μέρει αποτελείται από ανθρώπινα κύτταρα (Σχήματα 1 και Σχ S3). Και οι τρεις από αυτούς τους ασθενείς είχαν περιτοναϊκή εξάπλωση της νόσου τους. Αυτά τα στρωματικά ξενομοσχεύματα (SxS) προήλθαν από τις περιτοναϊκές μεταστάσεις ασθενών P2750 και P2825 και από τον κακοήθη ασκίτη ρευστό του P2726 ασθενούς, από του οποίου ωοθηκών μετάσταση πολλαπλών σειρών CX με το τυπικό ανθρώπινο όγκο /σύνθεση στρώμα ποντικού δημιουργήθηκαν επίσης. Η ανοσοϊστοχημική χρώση με αντισώματα ειδικά για την ανθρώπινη βιμεντίνη, μια πρωτεΐνη στρωματικά, επιβεβαίωσε την παρουσία άφθονων ανθρώπινης βιμεντίνης στις τρεις SxS, ενώ χρώση με ανθρώπινης Ε-καντερίνης-ειδικά αντισώματα αποκάλυψε ότι τα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου περιελάμβανε ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων σε αυτά τα SxS ( Τα σχήματα 1 και Σχ S3)

Κάθε σειρά στο (Α) -. (C) περιλαμβάνει μικροφωτογραφίες τομών ιστού από ένα απλό πατρικό ανθρώπινο όγκο ή ποντικού ξενομοσχεύματος. (Α) αριστερή στήλη: τομές ιστού χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η + Ε). Μεταγενέστερες στήλες, από αριστερά προς τα δεξιά: τομές ιστού χρωματίστηκαν για ανθρώπινη τάξη αντιγόνο λευκοκυττάρων Ι (HLA-ABC), επιθηλιακά δείκτη Ε-καδερίνης, μεσεγχυματικά βιμεντίνη δείκτη, ενδοθηλιακά PECAM1 δείκτη, και δείκτη Τ-κυττάρων CD3. Οι σειρές, από πάνω προς τα κάτω, δείχνουν τα ιστολογικά χαρακτηριστικά της γονικής ανθρώπινων όγκων από D61540, P2726, και P2750, σε συνδυασμό με ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς τους. Η ιστολογία του ξενομοσχεύματος στρώμα-κυρίαρχο αναπτύχθηκε από υγρό ασκιτών P2726 παρουσιάζεται επίσης στην πέμπτη σειρά? το λευκό βέλος στην μικρογραφία Ε-καδερίνης σε αυτήν τη σειρά δείχνει ένα μικρό εστίαση των καρκινικών κυττάρων. Αιχμές βελών στη μικρογραφία PECAM1 για το ξενομόσχευμα P2750.Tu.X1 υποδεικνύουν περιοχές με PECAM-1-ανοσοαντιδρώντων κυττάρων. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 200χ. Λευκή γραμμή κλίμακας στην επάνω αριστερή μικρογραφία αντιπροσωπεύει 200 ​​μm.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) έδειξαν επίσης ότι οι αγγειώσεις της CXS και SxS, όπως συμβαίνει με τα στρωματικά στοιχεία τους, ήταν αποκλίνουσες προέλευσης. Ένα υποσύνολο των γονικών ανθρώπινων όγκων σε συνδυασμό με ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς τους εξετάσθηκαν για έκφραση ανθρώπινων αιμοπεταλίων μορίου ενδοθηλιακής κυτταρικής προσκόλλησης (PECAM-1? CD31), το οποίο εκφράζεται επιλεκτικά στα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και υποσύνολα των αιμοποιητικών κυττάρων. Ανοσοαντιδραστικότητα των ανθρωπίνων PECAM-1 παρατηρήθηκε σε όλες τις PHTs, όπως αναμενόταν, αλλά όχι σε παράγωγα CXS τους. Και οι δύο SxS, ωστόσο, έδειξε έκφραση της ανθρώπινης PECAM-1, αν και η κατανομή των ανθρώπινων PECAM-1-ανοσοαντιδρώντων κυττάρων στο SxS ήταν κάπως ακανόνιστη και δεν ανακεφαλαιώνουν τέλεια την κατανομή αυτών των κυττάρων που τυπικώς παρατηρήθηκε στις PHTs ( Τα σχήματα 1 και Σχ S3). Η παρουσία του ανθρώπινου στρώματος σε SxS, αλλά η απουσία του από το CXS αντικατοπτρίστηκε από ένα παρόμοιο μοτίβο έκφρασης ανθρώπινου CD3. IHC αποκάλυψε ότι CXS δεν είχε, σε γενικές γραμμές, περιέχει κύτταρα που χρωματίστηκαν με αντισώματα κατά του ανθρώπινου CD3 και CD8, σύμφωνα με την απώλεια ανθρώπινων διηθούν CD3

+ και CD8

+ κυττάρων από παράγωγο ξενομοσχεύματα τους. Κάπως εκπληκτικά, τα δύο από τα SxS, ωστόσο, περιείχε κύτταρα που εξέφραζαν ανθρώπινο CD3 και CD8 και ήταν πιο πιθανό υπολειμματικά ανθρώπινα Τ κύτταρα που είχαν συν-ένεση με το κύτταρο όγκου ενοφθαλμίσματος, επέμενε στα SxS, και διείσδυσε τα ξενομοσχεύματα εκτενέστερα από TIL από ΨΝΘ (Σχήματα 1 και Σχ S3, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

τα ιστολογικά χαρακτηριστικά δευτερευουσών και μετέπειτα γενιάς CXS ήταν γενικώς αρκετά παρόμοια με εκείνα των CXS προηγούμενης γενιάς από το οποίο προήλθαν . Το επιθηλιακό συστατικό των περισσότερων σειρών CX διατήρησε ισχυρή έκφραση τόσο EpCAM και CEA μέσω σειριακής μεταμόσχευση, καθώς και τον αριθμό και την κατανομή των κυττάρων που εκφράζουν το Ki-67 παρομοίως παρέμεινε σταθερή (Εικόνα S2A). Το στρώμα και αγγείωση των εν λόγω σειρών CX ήταν σταθερά αρνητικά για έκφραση της ανθρώπινης τάξης Ι MHC (Σχήμα S2A), γεγονός που υποδηλώνει ότι είχαν σταθερώς υποστηρίζονται από στρώμα και τα αιμοφόρα αγγεία ποντικού.

Παγκόσμια Μεταγραφική ανάλυση των ορθοκολικών όγκων και Ξενομοσχεύματα

RNA-seq χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει το ανθρώπινο και, για ξενομοσχεύματα, ποντικού μεταγραφική προφίλ των δειγμάτων καρκίνου του κόλου 4 -2 πρωτογενείς όγκους και μεταστατικούς όγκους 2, 11 ξενομοσχεύματα ιδρύθηκε από αυτά τα δείγματα όγκων, και ένα δείγμα από φυσιολογικό κόλον δίπλα σε έναν από τους μεταστατικούς όγκους (P2750) (Αρχεία S1 και S2). Για να εκτιμηθεί η αναπαραγωγιμότητα των RNA-seq ανάλυση των δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου και των παράγωγων ξενομοσχεύματα τους, συγκρίναμε τις μεταγραφικές προφίλ των δύο μισά μιας διχοτομείται πρωτογενούς όγκου κόλου από D61540 ασθενή. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε σφιχτά συσχέτιση (Pearson συντελεστής r = 0,985) μεταξύ των επιπέδων έκφρασης όλων των ανθρώπινων γονιδίων στα δύο μισά του δείγματος (Σχήμα 2Α). Μια παρομοίως σφιχτό συσχέτιση (r = 0,975) παρατηρήθηκε μεταξύ των μεταγραφικών προφίλ των συγχρονισμένα εκτομή αλλά μη συνεχόμενες μεταστάσεις των ωοθηκών και επιπλοϊκά από P2726 ασθενή (Σχήμα 2Α).

οικόπεδα Scatter εμφανιστούν οι κανονικοποιημένες αριθμήσεις μεταγραφής (σε μετρήσεις ανά εκατομμύριο) για μεμονωμένα ανθρώπινα γονίδια στα δύο δείγματα που αναφέρονται στο

x

– και

y

-axes. Κόκκινο σταυροί δείχνουν γονίδια καθαριότητας συναίνεση [50]. Τα γονίδια μη-καθαριότητας που υποδεικνύεται από βιολετί κύκλους ή κίτρινο τρίγωνα: μοβ κύκλοι αντιπροσωπεύουν γονίδια που εκφράζονται σε κάποιο επίπεδο και στα δύο δείγματα, και κίτρινα τρίγωνα κατά μήκος των αξόνων αντιπροσωπεύουν γονίδια που εκφράζονται σε ένα δείγμα, αλλά όχι το άλλο. Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson σε όλα τα γονίδια για κάθε σύγκριση ανά ζεύγος υποδεικνύεται σε μαύρο χρώμα πάνω από την πάνω αριστερή γωνία του κάθε οικοπέδου? η συσχέτιση για το υποσύνολο των γονιδίων housekeeping υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα. Η διαγώνιος γραμμή είναι ο τόπος των σημείων για τα οποία x = y. (Α) Οι συγκρίσεις του επιπέδου έκφρασης των ανθρώπινων γονιδίων στα δύο μισά της διχοτομείται ορθοκολικού όγκου από D61540 (αριστερό πάνελ) και στα ωοθηκών και επιπλοϊκά μεταστάσεις από P2726 (δεξί πάνελ). (Β) Οι συγκρίσεις του επιπέδου έκφρασης των ανθρώπινων γονιδίων σε τρία γονική ανθρώπινους όγκους (D61540.T2, P2726.Ov, και P2750.Tu, από αριστερά προς τα δεξιά) και σε ξενομοσχεύματα πρώτης γενιάς τους (D61540.T2.X1, P2726 .Ov.X1, και P2750.Tu.X1). (Γ) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου ανθρώπινης στην άτυπη ξενομόσχευμα στρώμα-κυρίαρχο εγκατεστημένος από P2750 και σε πρώτης γενιάς ξενομοσχεύματος του. (D) Μέση κινητική ανάπτυξης του CXS (n = 5) που προέρχονται από τα ωοθηκών και επιπλοϊκά μεταστάσεις του P2726 (P2726.Mets.X1) υποδεικνύονται με μαύρα διαμάντια που συνδέονται με την έντονη γραμμή, σε σύγκριση με την κινητική ανάπτυξης του SX που προέρχεται από το ρευστό ασκίτη των P2726 (P2726.As.X1) υποδεικνύεται από τα γκρι τετράγωνα που συνδέονται με την γκρίζα γραμμή. Όλα τα ξενομοσχεύματα καθορίστηκαν με ένεση 2 χ 10

6 κυττάρων στο πλευρό ενός NSG ποντίκι. Πίνακας S1. Πίνακας S2. Πίνακας S3. Πίνακας S4. Πίνακας S5.