Abstract

αλληλεπικάλυψη του 20q βραχίονα χρωμοσωμικών εμφανίζεται σε προστάτη, του τραχήλου της μήτρας, του παχέος εντέρου, του στομάχου, του ουροδόχο κύστη, μελάνωμα, του παγκρέατος και του καρκίνου του μαστού, γεγονός που υποδηλώνει ότι 20q ενίσχυση μπορεί να διαδραματίσει έναν αιτιώδη ρόλο στην ογκογένεση. Σύμφωνα με μια εναλλακτική άποψη, χρωμοσωμικές ανισορροπία είναι κυρίως μια κοινή παρενέργεια της εξέλιξης του καρκίνου. Για να ελέγξετε αν μια συγκεκριμένη γενετική ανωμαλία θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ο καρκίνος έναρξη της εκδήλωσης, ιδρύσαμε ένα in vitro σύστημα ότι τα μοντέλα η εξελικτική διαδικασία πρώτα στάδια του σχηματισμού όγκων του προστάτη? φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη αθανατοποιημένα από την υπερ-έκφραση της ανθρώπινης τελομεράσης καταλυτικής hTERT υπομονάδα, και καλλιεργήθηκαν για 650 ημέρες μέχρι παρατηρήθηκαν αρκετές χαρακτηριστικά μετασχηματισμού. πρότυπα έκφρασης γονιδίων μετρήθηκαν και χρωμοσωμικές ανωμαλίες παρακολουθήθηκαν με φασματική ανάλυση καρυότυπου σε διαφορετικούς χρόνους. Αρκετές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, ιδίως η επικάλυψη των 20q χρωμοσωμικών βραχίονα, συνέβη νωρίς στη διαδικασία και έχουν καθοριστεί στα κυτταρικούς πληθυσμούς, ενώ άλλες ανωμαλίες εξαφανίστηκαν λίγο μετά την εμφάνισή τους. Ένα ευρύ φάσμα των εργαλείων βιοπληροφορικής, εφαρμόστηκε στα δεδομένα μας και σε δεδομένα από διάφορες βάσεις δεδομένων καρκίνο, αποκάλυψε ότι αυθόρμητη 20q ενίσχυση μπορεί να προωθήσει την έναρξη του καρκίνου. υπολογιστικό μοντέλο μας δείχνει ότι 20q ενίσχυση που προκαλείται από την απορρύθμιση των διαφόρων ειδικών κλάδων σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων της οδού ΜΑΡΚ, την οδό p53 και παράγοντες της ομάδας Polycomb. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του myc, AML, Β-κατενίνης και τους παράγοντες οικογένεια ETS μεταγραφής εντοπίστηκε ως σημαντικό βήμα για την ανάπτυξη του καρκίνου καθοδηγείται από 20q ενίσχυση. Τέλος, προσδιορίσαμε 13 «καρκίνος γονίδια κίνηση», που βρίσκεται στο 20q13, οι οποίες ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε πολλούς όγκους, με τα επίπεδα έκφρασης συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου και έκβαση που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια επάγουν την κακοήθη διαδικασία κατά 20q ενισχύσεως.

Παράθεση: Tabach Υ, Kogan-Sakin Ι, Buganim Υ, Solomon Η, Goldfinger Ν, Hovland R, et al. (2011) Ενίσχυση της 20q Χρωμοσωμικές βραχίονα εμφανίζεται νωρίς σε ογκογόνα Μετασχηματισμού και μπορεί να κινήσει τον καρκίνο. PLoS ONE 6 (1): e14632. doi: 10.1371 /journal.pone.0014632

Συντάκτης: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Ιουλ 2010? Αποδεκτές: 3 Δεκεμβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιαν 2011

Copyright: © 2011 Tabach et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Φιλανθρωπικό Ίδρυμα Leir και από κοινοτική χρηματοδότηση του 6ου ΠΠ. Μερική χρηματοδότηση που παρέχεται από το Κέντρο Γυναικείων Ερευνών Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μειωμένη η σταθερότητα του γονιδιώματος είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου [1]. έχουν αριθμό τοπικό αντίγραφο του DNA εκτροπές έχει αποδειχθεί ότι είναι προγνωστικά της έκβασης [2], [3], [4], ή της ανταπόκρισης στη θεραπεία [5], [6], [7] σε πολλές μορφές καρκίνου. Αν και οι περισσότεροι καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν κέρδος ή ζημία των χρωμοσωμικών περιοχών [8], εξακολουθεί να υπάρχει μια συζήτηση μεταξύ επιστημόνων αν γονιδιωματικής εκτροπές είναι απαραίτητες για την έναρξη του καρκίνου [9], [10] ή το αποτέλεσμα της ογκογόνο διαδικασία [11], [12 ], [13]. Ενώ μερικοί αναφορές δείχνουν ότι το κέρδος ενός επιπλέον χρωμοσώματος ασκεί αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα [14], [15], άλλοι υποστηρίζουν ότι ανευπλοειδία εκτροπές συμβαίνουν σε προκαρκινικές στάδιο [10], [16], [17], [18] με αποτέλεσμα την χρωμοσωμικές παραλλαγές και νεοπλασματικών φαινότυπο [9].

πολλά χρωμοσωμικές επαναλήψεις έχουν συχνά παρατηρηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου. Μεταξύ αυτών, υποτροπιάζουσες κέρδος και ενίσχυση του μακρύ βραχίονα του χρωμοσώματος 20 (20q) έχει παρατηρηθεί στο 90% των παγκρεατικών κυτταρικών σειρών [19], 15-83% των παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα [20], περίπου το 70% της πρωτογενούς γαστρικών καρκίνων [21] και του καρκίνου του παχέος εντέρου [18], [22], το 50% των ωοθηκών και του τραχήλου της μήτρας και του 90% του μαστού [23] καρκίνους. Κέρδος του 20q χρωμοσωμικού βραχίονα αποδείχθηκε επίσης ότι είναι ένα πολύ συχνό συμβάν σε πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης του προστάτη [24], [25]. Επιπλέον, αύξηση της 20q χρωμοσωμικής περιοχής παρατηρήθηκε παροδικά στις αρχές αποθέματα πέρασμα του ανθρώπινου μαστού ινοβλαστών, αθανατοποιημένα με hTERT και SV40 μεγάλου όγκου ογκοπρωτεϊνης [26]. Αισθητά, σχεδόν σε όλες αυτές τις μελέτες 20q είναι η πιο συχνή ενίσχυση, και διαγραφή αυτής βραχίονα είναι πολύ σπάνια. Επιπλέον, διάφορες μελέτες δείχνουν ότι η ενίσχυση του 20q συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [27], επιθετική φαινοτύπου του όγκου, της προόδου [28] και το σχηματισμό μετάστασης [19], [29], [30].

Η αξιολόγηση αν χρωμοσωμική ανισορροπίες παίζουν αιτιολογικό ρόλο στην ογκογένεση, σε αντίθεση με την παρευρισκομένων είναι ένα δύσκολο έργο. Μελέτες που έχουν γίνει σε κλινικά δείγματα, και των δύο χρωμοσωμικές ανωμαλίες και γονιδιακή έκφραση, εμποδίζονται από μία ποικιλία παραγόντων σύγχυσης, οι οποίες απορρέουν από διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο των ασθενών, μεταβλητό και μη χαρακτηρισμένα μεταλλάξεις σε όγκους, και τα ανεξέλεγκτης μολύνσεις από φλεγμονώδεις, ενδοθηλιακά και στρωματικά κύτταρα. Για να ξεπεραστούν αυτά τα εμπόδια, θα έχει προηγουμένως συσταθεί μία in vitro μοντέλο μετασχηματισμού βασίζεται στις ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα, WI-38, που οδήγησαν στον προσδιορισμό των υπογραφών γονιδιακής έκφρασης [31], [32], [33] που συνδέονται με γενετικές ανωμαλίες [ ,,,0],34]. Επιπλέον, τα ανθρώπινα συμπαγείς όγκους λαμβάνονται συνήθως από εκτομές πραγματοποιούνται σε μια εποχή όταν ο όγκος έχει ήδη αναπτυχθεί πλήρως, γεγονός που αποκλείει την πρόσβαση σε κρίσιμες πληροφορίες σχετικά με την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου.

Για να αποκτήσουν νέες γνώσεις για την πρώιμα στάδια της μεταμόρφωσης και τα γενετικά δίκτυα που σχετίζονται με χρωμοσωμικές ανωμαλίες, χρησιμοποιήσαμε μία in vitro μοντέλο του προστάτη κυτταρικού μετασχηματισμού. Σε αυτό το μοντέλο πρωτογενούς προστάτη επιθηλιακά κύτταρα τα οποία είχαν προηγουμένως αθανατοποιηθούν με την εισαγωγή της καταλυτικής υπομονάδας τελομεράσης, hTERT (EP156T) [35] αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Ο ειδικός σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει την υπόθεση ότι μια συγκεκριμένη γονιδιωματική εκτροπή που συμβαίνουν σε πρώιμο στάδιο της καρκινογένεσης συνοδεύεται από αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως κινητήρια δύναμη για την ογκογένεση. Μετά από 650 ημέρες στην κουλτούρα των παραγώγων EP156T κύτταρα μοιράζονται αρκετές φαινοτυπική, χρωμοσωμικές και μεταγραφική χαρακτηριστικά με δείγματα καρκίνου του προστάτη. Αναφέρουμε εδώ για δύο κύρια συμπεράσματα. Η πρώτη είναι η εξέχουσα και στις αρχές του ρόλου των 20q ενίσχυση στην ανάπτυξη της κυτταρικής καλλιέργειας in-vitro μας προς μια προ-κακοήθη φαινότυπο, με αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Δεύτερον, θα εξηγήσουμε τον κακοήθη δυναμικό των 20q αλληλοεπικάλυψη με τον εντοπισμό 13 «καρκίνος γονίδια κίνηση», που βρίσκεται στο 20q13, που υπερ-εκφράζεται σε διάφορα είδη καρκίνου, και των οποίων η έκφραση συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου και έκβαση.

Υλικά και Μέθοδοι

Παρασκευή κυτταρικών γραμμών

Κανονικά ανθρώπινα προστατικά κύτταρα αθανατοποιημένα με εισαγωγή τελομεράσης [35] αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια για 650 ημέρες, κατά την οποία αναλύθηκαν για το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων, χρωμοσωμικής μετατροπές και προφίλ έκφρασης. hTERT επιμηκύνει χρωμοσωμικών άκρων πρόληψη αντιγραφική γήρανση των διαφόρων ειδών φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα [36]. Τα hTERT αθανατοποιημένα κύτταρα EP156T ορίστηκαν εδώ ως Ν γραμμή (σχήμα 1). Οι γραμμές C, G και Μ προήλθαν από το Ν γραμμή (σχήμα 1) μετά από 25 περάσματα (που ισοδυναμεί με περίπου 150 ημέρες). για το σκοπό αυτό, μία μετάλλαξη του ρ53 καταστολέα όγκου (p53R175H) κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα ρετροϊού PLXSN εισήχθη εντός της γραμμής Ν. τα νέα κύτταρα, που εκφράζουν σταθερά το μεταλλαγμένο p53R175H, ορίστηκαν από τη γραμμή Μ. Παράλληλα κύτταρα Ν επίσης μολυνθεί με το φορέα PLXSN περιέχει την αλληλουχία που κωδικοποιεί GSE56 για ένα μικρό πεπτίδιο που αδρανοποιεί το ογκοκατασταλτικό γονίδιο ρ53 σε ένα κυρίαρχο αρνητικό τρόπο [37], η οποία έδωσε αφορμή για τη γραμμή G. Το κενό πλασμίδιο PLXSN χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος παράγει την γραμμή C. Οι ογκογόνοι H-RasV12 κλωνοποιήθηκε στο pBabe-hygro ρετροϊικό πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε για τη μόλυνση από C, G και Μ γραμμές λίγο πριν το πέρασμα 80 που παράγει το C8R, το G8R και τα κύτταρα M8R, αντίστοιχα. Πρόσθετες γραμμές δημιουργήθηκαν από τη μόλυνση αργά πέρασμα Ν κυττάρων με πλασμίδιο που κωδικοποιεί PLXSN είτε ο μεταλλαγμένος p53R175H (N8M), ο GSE56 (N8G) ή με το κενό πλασμίδιο (N8C) (Σχήμα 1). Η μόλυνση ακολουθήθηκε από διατήρηση των κυττάρων επί δύο εβδομάδες με την παρουσία 400 μg /ml νεομυκίνη (για κύτταρα που έχουν μολυνθεί με τον φορέα PLXSN) ή με 50 μg /ml υγρομυκίνη (για κύτταρα μολυσμένα με τον pBabe-hygro φορέα), προκειμένου να επιλέξτε για τη σταθερή έκφραση των εισαχθέντων πλασμιδίων. Η ρετροϊική μόλυνση διαδικασία περιγράφεται λεπτομερώς στο [32]. συνθήκες ανάπτυξης και τα συστατικά των μέσων ενημέρωσης αναφέρονται λεπτομερώς στο [35].

Σχηματική αναπαράσταση των κύριων παράγωγων πολιτισμών των επιθηλιακών κυττάρων EP156T προστάτη. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει την υποκαλλιέργεια δημιουργούνται in vitro με εισαγωγή συγκεκριμένων γενετικών τροποποιήσεων. Ο άξονας χ αντιπροσωπεύει τον αριθμό των διόδων σε καλλιέργεια (περίπου μία εβδομάδα ανά διαδρομή). Τα σύμβολα αντιπροσωπεύουν τσιπ σημεία στα οποία τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το RNA τους υβριδοποιήθηκαν με μικροσυστοιχίες? ο κώδικας για το προκύπτον δείγμα, π.χ. G5, αντιπροσωπεύει τη γραμμή (G) και ο κατά προσέγγιση αριθμός (50) των διόδων σε καλλιέργεια διαιρείται με δέκα. Το σύμβολο του χρωμοσώματος δείχνει μια μέτρηση SKY.

Η

Η γονιδιακή έκφραση προφίλ κατά μήκος της διαδικασίας εξέλιξης των πολιτισμών που προέρχονται EP156T

Για την έκφραση του γονιδίου προφίλ, ελήφθησαν δείγματα σε 32 σημεία κατά μήκος της διαδικασίας καλλιέργειας και υβριδοποιήθηκαν με τον 2,0 Array GeneChip Human Genome U133A (Σχήμα 1). Οι μικροσυστοιχίες ήταν έτοιμη τροφή χρησιμοποιώντας RMA [38] και ομαλοποιημένη. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμβατό? Τα ακατέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων GEO. Ο αριθμός ρεκόρ GEO είναι- GSE23038. Οι 5.000 πιο ποικίλα γονίδια κατατάσσονται σύμφωνα με τον αλγόριθμο SPIN [39] και συγκεντρωμένα χρησιμοποιώντας SPC [40] για τον εντοπισμό 2 κύριες σταθερές συστάδες γονιδίων με ένα συσχετίζεται μοτίβο έκφρασης.

Φασματική Καρυότυπος Ανάλυση (SKY)

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα επωάστηκαν με κολσεμίδη (0,1 μg /ml) για όλη τη νύχτα, σε επεξεργασία με θρυψίνη, λύθηκαν με υποτονικό ρυθμιστικό, και σταθερό σε παγόμορφο οξικό οξύ /μεθανόλη (1:03). Τα χρωμοσώματα ταυτοχρόνως υβριδοποιήθηκαν με 24 συνδυαστικά επισημασμένους ανιχνευτές ζωγραφική χρωμόσωμα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα SD200 φασματική bioimaging (Applied Spectral Imaging Ltd., Migdal Haemek, Ισραήλ).

ανάλυση S-φάση

Υποσυρρέουσες καλλιέργειες σημάνθηκαν για μία ώρα με 10 μΜ BrdUrd (Sigma). Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη, και υποβάλλεται σε επεξεργασία ως εξής (πλύσεις PBS μεταξύ κάθε στάδιο): 2 Μ HCl και 0,5% Triton Χ-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου? 0.1 Μ Na

2Br

4O

7 σε pH 8,5? FITC-συζευγμένο αντι-BrdUrd (Becton Dickinson) αραιωμένο 1:03 σε PBS /1% BSA /0,5% Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου? και, τέλος, ιωδιούχο προπίδιο 5 μg /ml και 0,1 mg /RNase Α Δείγματα ml αναλύθηκαν με ροή δισδιάστατη κυτταρομετρία για την ανίχνευση τόσο φθορεσκεΐνη και προπίδιο φθορισμού ιωδιούχο χρησιμοποιώντας φθορισμό ενεργοποιημένων διαλογέα κυττάρου (FACS) (Becton Dickinson). Τουλάχιστον 10.000 κύτταρα αναλύθηκαν ανά δείγμα.

Απομόνωση ολικού RNA

Το συνολικό RNA για το πείραμα μικροσυστοιχιών και για ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (QRT-PCR) απομονώθηκε χρησιμοποιώντας NucleoSpin κιτ εκχύλισμα RNA (Macherey -Nagel), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ποσοτική Real Time PCR (QRT-PCR)

Ένα δείγμα 2 μ§ του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας MMLV RT (Promega) και τυχαία εξαμερών εκκινητών. QRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο SYBR-Πράσινο PCR Master Mix (Applied Biosystems) σε ένα όργανο ΑΒΙ 7300 (Applied Biosystems). Το επίπεδο έκφρασης για κάθε γονίδιο κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του γονιδίου GAPDH οικοκυρική στο ίδιο δείγμα. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με τη χρήση του λογισμικού Primer Express. Primer ακολουθίες είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

Η Εκδήλωση Καρυότυπος

Τα δεδομένα έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως για να συμπεράνουμε χρωμοσωμικές ανωμαλίες [41], [42]. υπόθεση εργασίας μας είναι ότι οι αλλαγές στον αριθμό των αντιγράφων του DNA ενός πλήρους χρωμοσώματος ή μέρος αυτής αντικατοπτρίζεται στην έκφραση του γονιδίου. Η διαγραφή ενός χρωμοσώματος προκαλεί, κατά μέσο όρο, κάτω ρύθμιση στην έκφραση των γονιδίων της εν λόγω χρωμόσωμα, ενώ η επικάλυψη θα πρέπει να αντανακλάται από ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης. Για τον εντοπισμό χρωμοσωμικής ανισορροπιών, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που βρίσκονται σε κάθε χρωμοσωμική βραχίονα, σε κάθε δείγμα, με ένα δείγμα αναφοράς φυσιολογικών κυττάρων (N0), και αναζήτησαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης. Εισαγάγαμε εδώ μια μέθοδος για χρωμοσωμικές Ανισορροπία Analysis, βασίζεται σε ένα paired t-test, για να αντλήσει πληροφορίες αριθμού χρωμοσωμικό αντίγραφο από τα δεδομένα έκφρασης. Η μέθοδος Ανισορροπία Ανάλυση Χρωμοσωμικές περιγράφεται, δοκιμαστεί και σε σύγκριση με προηγούμενα προέρχεται τεχνική [42] με τη συμπληρωματική Κείμενο S1, βλέπε σχήματα S1 και S2.

Η σύγκριση των δύο υπολογιστικών μεθόδων με SKY

Δύο μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση «καρυότυπος έκφραση» σε δείγματα. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση Ανισορροπία Χρωμοσωμικές υπολογίσαμε, για κάθε δείγμα

s

, η P-τιμή για κάθε χρωμόσωμα να ελέγξετε εάν η μέση διαφορά μεταξύ των γονιδίων σε N0, σε σύγκριση με το δείγμα

s

, είναι διαφορετικό από το μηδέν. Η διωνυμική προσέγγιση [42] καθορίζει αν ένα σημαντικό κλάσμα των γονιδίων στο χρωμόσωμα υπερεκφράζεται σε

s

έναντι N0 (ή υπό-εκφράζεται). Για λεπτομέρειες σχετικά με τις διαφορές μεταξύ των δύο προσεγγίσεων δείτε συμπληρωματική S1 Κείμενο.

Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από το Sky, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η προβλεπτική ικανότητα των δύο υπολογιστικές μεθόδους, αναλύθηκαν ως ακολούθως. Εάν παρατηρήθηκε μία χρωμοσωμική ανωμαλία σε περισσότερο από το 50% των κυττάρων καρυοτυπήθηκαν, θεωρήθηκε ως μια πραγματική εκτροπή? διαφορετικά ερμηνεύτηκε ως θόρυβος και να απομακρύνονται από την ανάλυση. Χρησιμοποιώντας αυτόν τον ορισμό των αποτελεσμάτων SKY ως την «αλήθεια έδαφος», συγκρίναμε την απόδοση των δύο υπολογιστικές μεθόδους, χρησιμοποιώντας την ανάλυση του δέκτη λειτουργικά χαρακτηριστικά (ROC) (βλέπε Εικόνα S2). Οι παραστάσεις των δύο μεθόδων ήταν παρόμοια, και υιοθετήσαμε την Ανάλυση Αποκλίσεων Χρωμοσωμικές εδώ.

Η χρωμοσωμική συσχέτιση Ανισορροπία Ανάλυση

Δηλώνουν από

E

GS

το επίπεδο έκφρασης (μετά το log και κατωφλίου) της probeset

g

στο δείγμα

s

. Για κάθε probeset g του δείγματος

s

υπολογίζουμε Δ

E

GS

=

E

GS

–

E

g

N0. Υπολογίστε για κάθε δείγμα

s

η διάμεση τιμή της Δ

E

GS

για τη σημαντική αλλαγή probeset από 20q (όπως ορίζεται στη συμπληρωματική Κείμενο S1 για χρωμοσωμική ανάλυση Ανισορροπία), για να πάρει

M

s

. Για κάθε probeset

g

από 20q υπολογίζουμε τη συσχέτιση Pearson μεταξύ των δύο σύνολα αριθμών:

E

GS

και

M

s

, και κλήση Αυτή η ανάλυση Ανισορροπία η χρωμοσωμική συσχέτιση της probeset

g

(με τον καρυότυπο έκφραση του 20q).

Κατασκευάζοντας τον καρυότυπο εξελικτικό δέντρο

Εμείς κατασκευάσαμε ένα «καρυότυπο εξελικτικό δέντρο» συνδυάζοντας στοιχεία από τα αποτελέσματα SKY και καρυοτύπου έκφρασης. Οι φυσιολογικό καρυότυπο «είδη» (46, ΧΥ) ήταν η ρίζα /πρόγονος όλων των εξελίχθηκε καρυότυποι. Το δέντρο κατασκευάστηκε με το χέρι χρησιμοποιώντας τα δεδομένα τόσο από το καρυότυπο έκφρασης και SKY. Εάν τα δεδομένα από καρυότυπος έκφραση δεν ήταν σύμφωνες με τα στοιχεία SKY σε ένα συγκεκριμένο σημείο, έχουμε παρεμβολή τη συμπεριφορά των δύο γειτονικών σημείων, υποθέτοντας ότι είχαμε να κάνουμε με μια συνεχή διαδικασία.

Αντιγραφή ανάλυση αριθμό

Ultra-υψηλής ανάλυσης Affymetrix Genome-Wide συστοιχίες ανθρώπινη SNP 6.0 χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί αποκτήσει αριθμό γονιδιωματικής αντίγραφο αλλαγές και την απώλεια της ετεροζυγωτίας των κυττάρων EP156T. Γονιδιωματικό DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το DNAkit Tissue (Cat. # D3396-02, EZNA, ΩΜΕΓΑ Biotek). prehandling DNA και υβριδοποίησης συστοιχία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (P /N 702504, Αναθ.3, Affymetrix, Santa Clara, CA), και σαρώνονται σε ένα σαρωτή 3000. Ποιοτικός έλεγχος Affymetrix GeneChip, γονότυπο κλήση, ομαλοποίηση επίπεδο καθετήρα και τον αριθμό αντιτύπου εξομάλυνση για την παραγωγή log

2 αναλογίες έγιναν στο Affymetrix GeneChip® Γονοτυπικές Console v3.0.1. Χρησιμοποιήθηκε ένα αρχείο αναφοράς για in-house δημιουργήθηκε από 59 υγιείς δότες αίματος. Η ανάλυση των δεδομένων και την απεικόνιση διεξήχθη στο χρωμόσωμα σουίτα ανάλυση με κατώτατο όριο των ελάχιστων 100 kb και 20 δείκτες. Οι εκτροπές ανέφερε σύμφωνα με την ονοματολογία ICSN και NCBI χτίσει 36.

Δίκτυα και γραφικές παραστάσεις

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του Ingenuity Pathways Ανάλυση (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Το δίκτυο είναι μια γραφική αναπαράσταση των μοριακών σχέσεων μεταξύ των προϊόντων των γονιδίων /γονιδίου. Τα γονίδια ή προϊόντα γονιδίων που παριστάνεται ως κόμβοι, και η βιολογική σχέση μεταξύ δύο κόμβων παριστάνεται ως μία ακμή (γραμμή). Όλες οι ακμές που υποστηρίζεται από τουλάχιστον ένα αναφοράς από τη βιβλιογραφία, από ένα βιβλίο ή από κανονική πληροφορίες που είναι αποθηκευμένες στο Ingenuity Pathways Γνωσιακής Βάσης. Τα ανθρώπου, ποντικού, και αρουραίου ορθόλογα ενός γονιδίου που αποθηκεύονται ως ξεχωριστά αντικείμενα στο Ingenuity Pathways Knowledge Base, αλλά εκπροσωπούνται ως ένα ενιαίο κόμβο του δικτύου. Οι κόμβοι εμφανίζονται με διάφορα σχήματα που αντιπροσωπεύουν την λειτουργική κατηγορία του γονιδιακού προϊόντος.

Αποτελέσματα

Μια in vitro μοντέλο για τις αρχές του προστάτη καρκινογένεση

Για να ακολουθήσει την αρχική εξέλιξη στάδια προς την κακοήθεια στην καρκινογένεση του προστάτη, έχουμε δημιουργήσει ένα σύστημα που βασίζεται σε hTERT-απαθανάτισε επιθηλιακά καλοήθη προστάτη (EP156T) κύτταρα [35]. Αυτά τα αθανατοποιημένα κύτταρα χαρακτηρίζονται εδώ ως Ν γραμμή. Στο πέρασμα 25, Ν κύτταρα χειρισμό για να υπερεκφράζουν αντιδραστήρια τα οποία απενεργοποιούν το ογκοκατασταλτικό ρ53. Για το σκοπό αυτό, p53R175H μετάλλαξης του ρ53 καταστολέα όγκου κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα ρετροϊού PLXSN εισήχθη εντός της γραμμής Ν παράλληλα με την GSE56, ένα πεπτίδιο ρ53-αδρανοποίησης, κλωνοποιήθηκε στον φορέα PLXSN, και με ένα άδειο PLXSN πλασμίδιο ως μάρτυρα . Οι τέσσερις αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των κανονικών (Ν), σε μεταγωγή με GSE56 (G), με mutant- p53R175H (Μ) και με ένα άδειο φορέα για τον έλεγχο (C) καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 500 ημέρες ίη vitro. Το σχήμα 1 αναπαριστά σχηματικά το μοντέλο αυτό. Σε όλη αυτή την χειρόγραφο, τα δείγματα υποδηλώνονται με LX, όπου L = N, G, M ή Ο και ο αριθμός Χ δείχνει τον αριθμό των διόδων (± 3) στην οποία πραγματοποιήθηκε η ειδική δείγμα, διαιρούμενο με δέκα (π.χ. G4 αντιπροσωπεύουν δείγμα που λαμβάνεται από την GSE γραμμή στο πέρασμα ~ 40). Λίγο πριν το πέρασμα 80, ογκογόνος Ras (H-RasV12) εισήχθη στις γραμμές C, M και G αποδίδοντας C8R, M8R και γραμμές G8R, αντιστοίχως όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Για το σκοπό αυτό, το ογκογονίδιο H-RasV12 κλωνοποιήθηκε σε pBabe- Hygro ρετροϊικός φορέας χρησιμοποιήθηκε. Επιπλέον, οι ρετροϊικοί αντιδραστήρια που περιγράφονται παραπάνω χρησιμοποιήθηκαν για να υπερ-εκφράζουν το GSE56 και μεταλλαγμένα p53R175H στα κύτταρα της γραμμής Ν σε μεταγενέστερο πέρασμα, δημιουργώντας το N8G, N8M και N8C γραμμές (Σχήμα 1). Ένα ρετροϊική μόλυνση ακολουθήθηκε από δύο εβδομάδες επιλογής φαρμάκου για την επαγωγή σταθερής έκφρασης (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Για να αποκτήσετε μια ολοκληρωμένη εικόνα των εξελικτικές αλλαγές κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης καλλιέργεια των κυτταρικών καλλιεργειών, θελήσαμε να συνδυάσει τις αναλύσεις του ρυθμού κυτταρικής ανάπτυξης, χρωμοσωμικές ανωμαλίες και η έκφραση προφίλ μήκος 650 ημέρες στην κουλτούρα των γραμμών Ν, C, G και Μ. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, τα κύτταρα του δείγματος κατά μήκος αυτής της περιόδου και οι αναλύσεις του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, γονιδιακή έκφραση και καρυότυπου (Σχήμα 1).

Κατά την εγκατάσταση των in vitro μοντέλο μετασχηματισμού μας, ήταν σημαντικό να αξιολογηθεί εάν το σύστημα αυτό μπορεί να αντιπροσωπεύει in-vivo ανθρώπινου καρκίνου με αξιόπιστο τρόπο. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε αν κατά μήκος των 650 ημέρες καλλιέργειας, τα κύτταρα EP156T αποκτήθηκαν μοριακή και φαινοτυπική χαρακτηριστικά τυπικά των πραγματικών όγκων. Όπως κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι το βασικό χαρακτηριστικό των καρκινικών μετασχηματισμού, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων και το ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (i. E., Κυττάρων στην S-φάση του κυτταρικού κύκλου), αξιολογήθηκαν. Πράγματι, η αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων ήταν εμφανής καθώς η καλλιέργεια κυττάρων προχωρούσε (Σχήμα 2Α). Σε συμφωνία με αυτό, ένα μεγαλύτερο ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων ανιχνεύθηκε σε μεταγενέστερα περάσματα, όπως κρίνεται από την επισήμανση με BrdU και ανάλυση FACS (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου καταστολής των όγκων p16INK4a μειώθηκε με τον χρόνο σε καλλιέργεια σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2C). Μειωμένα επίπεδα p16INK4a παρατηρούνται συχνά σε προχωρημένους όγκους του προστάτη [43] και βρέθηκαν να είναι ένα από τα κεντρικά γεγονότα σε μια in vitro διαδικασία μετασχηματισμού της ανθρώπινης WI-38 ινοβλάστες [31], [32], [33]. Στη συνέχεια, θελήσαμε να εξετάσουμε αν το πρότυπο γονιδιακής έκφρασης των πολιτισμών EP156T που προέρχονται μοιάζει με εκείνη του in vivo όγκων. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, η ανάλυση που ακολουθεί διεξήχθη. Μετά γονίδιο προφίλ έκφρασης των κυττάρων EP156T, μια ανάλυση ομαδοποίηση έγινε για τον εντοπισμό των γονιδίων με συσχετισμένες μοτίβο έκφρασης. Τα πρότυπα έκφρασης των δύο πιο γνωστά συμπλέγματα παρουσιάζονται στις Εικόνες 2D και 2Ε. Η πρώτη ομάδα (Σχήμα 2D) περιείχε 177 μεταγραφές που έγιναν μέχρι ρυθμίζονται πάροδο του χρόνου σε καλλιέργεια. Κατά την εξέταση του εμπλουτισμού Gene Ontology (GO) χρησιμοποιώντας το λογισμικό David [44], βρήκαμε ότι αυτά τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Έτσι, αυτό το σύμπλεγμα ονομάζεται το «σύμπλεγμα πολλαπλασιασμό» κατά μήκος του χειρογράφου. Αυτή η τάση της έκφρασης επικυρωθεί από QRT-PCR σε τρεις αντιπροσωπευτικές γονίδια (Σχήμα S3). Η δεύτερη ομάδα (Σχήμα 2Ε) περιείχε 296 μεταγραφές προσκόλλησης κυττάρου γλυκοπρωτεΐνη και το μόριο και η έκφραση τους συσχετίζεται αρνητικά με το σύμπλεγμα πολλαπλασιασμό. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον αυτές οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μπορεί να σχετίζεται με τη διαδικασία μετασχηματισμού των κυττάρων EP156T, εξετάσαμε την έκφραση των γονιδίων και των δύο σχηματισμών σε ένα σύνολο δεδομένων των 99 δειγμάτων, που λαμβάνονται από κανονικό προστάτη, του όγκου και της μετάστασης των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [45 ]. Εντυπωσιακά, η έκφραση των γονιδίων και των δύο συστάδων συσχετίζεται σημαντικά με την έκφρασή τους σε αυτό το σύνολο δειγμάτων κλινικής εξέλιξης του καρκίνου (Σχήμα 2D και 2Ε, κάτω). Η διαπίστωση ότι, το πρότυπο έκφρασης γονιδίου μας in vitro μοντέλο μοιάζει με εκείνη του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη, υποδεικνύει ότι το μοντέλο αυτό ανακεφαλαιώνει τα μοριακά γεγονότα που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της in vivo κακοήθη μετασχηματισμό του προστάτη αδένα. Η λεπτομερής ανάλυση αυτών των συσπειρώσεων και τη σύγκριση με τα in vivo δεδομένα που παρέχονται στο Κείμενο S1. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης in vitro καλλιέργεια EP156T προστάτη αθάνατα κύτταρα, μια διαδικασία επιλογής πραγματοποιήθηκε ευνοούν την επιβίωση των κυττάρων με υψηλότερη πολλαπλασιαστικές δυνατότητες που θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα μετασχηματισμένο φαινότυπο.

Α. Αριθμός διπλασιασμούς πληθυσμού των καλλιεργειών EP156T προερχόμενων (C, G και Μ) που υπολογίζεται σε διαστήματα 50 ημερών κατά τη διάρκεια της περιόδου καλλιέργειας 650 ημέρες μετά τη μόλυνση hTERT, παράλληλα με τον αριθμό των διπλασιασμών πληθυσμού που εκτελούνται από μη μολυσμένα EP156 κύτταρα στο πρώτο 50 ημέρες στην κουλτούρα και τα κύτταρα του EP156T (Ν) κατά τη διάρκεια των επόμενων 100 ημέρες στην καλλιέργεια. B. Ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (S-φάση) μετρήθηκε με σήμανση BrdU πρόωρης διόδου (C4) και τα κύτταρα αργά δίοδο (C8). Γ πραγματικό χρόνο QRT-PCR για την έκφραση p16INK4a στα διάφορα δείγματα του συστήματος EP156T. Δ Top: Έκφραση μήτρα ενός συμπλέγματος των γονιδίων των οποίων η έκφραση αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μετασχηματισμού. Μέσα σε κάθε γραμμή δείγματα παραγγείλει από νωρίς έως αργά περάσματα. Κάτω πίνακας: η μέση πρότυπο έκφρασης αυτών των γονιδίων σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [45]. Η ρ-τιμή για την διαφορά στην έκφραση μεταξύ φυσιολογικού και του καρκίνου είναι ρ = 0,00024 και από την κανονική και καρκίνο σε μετάσταση είναι ρ = 0,00013. Ε Top: Cluster των γονιδίων που περιέχουν υπερεκπροσωπούνται γονίδια εξωκυττάριας περιοχής γλυκοπρωτεΐνη και, τα δείγματα για κάθε γραμμή διέταξε από νωρίς έως αργά περάσματα. Το σύμπλεγμα ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μετασχηματισμού. Το κατώτερο γράφημα παρουσιάζει την μέση έκφραση των γονιδίων του συμπλέγματος σε δείγματα καρκίνου του [45]. Η ρ-τιμή για την διαφορά στην έκφραση μεταξύ φυσιολογικού και του καρκίνου είναι ρ = 0,00013 και από την κανονική και καρκίνο σε μετάσταση είναι ρ = 0,00023.

Η

Η εξωγενής εισαγωγή τελομεράσης οδήγησε την αθανατοποίηση των κυττάρων EP156T λόγω επιμήκυνση των τελομερών που ήταν εμφανής μετά τη διατήρηση των κυττάρων για μακρά περίοδο in vitro [35]. Επιπλέον, η υπερέκφραση της μεταλλαγμένης μορφής του καταστολέα όγκων ρ53 και ρ53 του πεπτιδίου αδρανοποίησης GSE56 διατηρήθηκαν επίσης για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την εισαγωγή τους στα κύτταρα. Μια λεπτομερής ανάλυση των συγκεκριμένων λειτουργιών του μεταλλαγμένου p53R175H υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα EP156T παρουσιάζεται στο [46]. Η διατήρηση της τελομεράσης και αλλαγμένων μορφών της ρ53 σε κύτταρα EP156T την πάροδο του χρόνου υποδεικνύει ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να παίζουν ένα ρόλο στη διατήρηση του μετασχηματισμού.

20q ενίσχυση προκύψει και κυριάρχησε στο κυτταρικό πληθυσμό σε πρώιμα στάδια της διαδικασίας

χρωμοσωμικές ανωμαλίες.

Εμείς γύρισε για να εξετάσει τα χρωμοσωμικό αντίγραφο παραλλαγές αριθμού των κυττάρων μας, όπως αυτά έχουν βρεθεί να σχετίζονται με φαινοτύπους καρκίνου. Για το σκοπό αυτό, εκτιμάται ότι το σχέδιο εκτροπής χρωμοσωμική σε επίπεδο πληθυσμού, χρησιμοποιώντας υπολογιστική ανάλυση των δεδομένων έκφρασης (βλέπε Μέθοδοι), και στο επίπεδο των μεμονωμένων κυττάρων με τη βοήθεια των φασματικών καρυότυπο (SKY). Χρησιμοποιήσαμε τα δεδομένα μας να ακολουθούν την χρονική εξέλιξη του «καρυοτύπου έκφραση» – δηλαδή τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες, όπως αυτές αντικατοπτρίζονται στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης. Τα δεδομένα μας αποτελούν πραγματικό χρόνο σειρά, η οποία μας δίνει σημαντικά πλεονεκτήματα για τον προσδιορισμό της εξέλιξης των κυρίαρχων χρωμοσωμικών ανωμαλιών.

Η «καρυότυπος έκφραση» αποκάλυψε σημαντική χρονική διακύμανση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων πολλών χρωμοσωμικών όπλα για οι διαφορετικές γραμμές (Σχήμα 3). βραχίονα Χρωμοσωμικές 20q έδειξε τις πιο έντονες αλλαγές της έκφρασης και συνδέθηκε με τις πιο σημαντικές ρ-τιμές σε όλες τις γραμμές. Σε σύγκριση με N0, η έκφραση του 20q έδειξε περίπου 1,5 φορές αύξηση στη γραμμή Ν και στις αρχές της δεκαετίας περάσματα των γραμμών Μ, G και C. Είναι ενδιαφέρον ότι, στα τέλη της δεκαετίας περάσματα των γραμμών Μ, G, και Ο αυτό φορές μεταβολής αυξήθηκε σε ~ 1.8. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα με τρισωμία του 20q κυριάρχησε τον κυτταρικό πληθυσμό σε πρώιμα στάδια της διαδικασίας, και στη C, G και Μ γραμμές δευτερογενών γεγονότων που ακολουθείται και δημιούργησαν περισσότερα από 3 αντίγραφα του 20q βραχίονα. Πρόσθετες παρεκκλίσεις που παρατηρήθηκαν ήταν ενισχύσεις των 9Q και 13q στη γραμμή Ν? της 7ρ, 7q, 18q και, στη συνέχεια της διαδικασίας, της 3P στη γραμμή C? ενίσχυση της 9p, 11p και, σε μικρότερο βαθμό, των 13q στη γραμμή G? στη γραμμή Μ εντοπίσαμε, εκτός από ενισχύσεις του 13q και 20p, επίσης εξαλείψεις 10p και χρωμοσώματος 16 (μετά το πέρασμα 60).

επίπεδο έκφρασης του κάθε γονιδίου σχολιασμένα σε μια συγκεκριμένη χρωμοσωμική βραχίονα συγκρίθηκε με του επίπεδο έκφρασης στο δείγμα N0 (EP156 πρωτογενή κύτταρα σε δίοδο 8), που αντιπροσωπεύει την γονική καλλιέργεια των τεσσάρων γραμμών. Για κάθε μία από τις γραμμές Ν, C, G και Μ (βλέπε κείμενο) το άνω πάνελ δείχνει τις συντονισμένες αλλαγές στην διάμεση τιμή της έκφρασης γονιδίων σχολιασμένα σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές, διαιρούμενο με διάμεση έκφραση τους σε N0. Το κατώτερο πάνελ είναι η -log

10 (p-value) του paired t-test μεταξύ των γονιδίων σε N0 και τα άλλα δείγματα (χ-άξονας) σε μια συγκεκριμένη χρωμοσωμική βραχίονα. Το σχήμα παρουσιάζει τα στατιστικά σημαντική χρωμοσωμικές όπλων (τιμή p σε κάθε εξετάσαμε μεταξύ 4-10 κυττάρων (τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1). SKY, σε συμφωνία με τον καρυότυπο έκφραση, που προσδιορίζονται επανάληψη των χρωμοσωμάτων 20, 3, 7, 9, 18 και διαγραφής των 16 κατά μήκος των διαφορετικών γραμμών. Επιπλέον, οι μετατοπίσεις που αφορούν τα χρωμοσώματα 10, 11 και 20 που εντοπίστηκαν από το Sky, αναγνωρίστηκαν ως διαγραφές /επαναλήψεις από τον καρυότυπο έκφρασης (όπως θα συζητηθεί παρακάτω).

Η

Σε πολλά σημεία τα αποτελέσματα SKY δεν συμπεριφέρονται σύμφωνα με τις προσδοκίες μας (Πίνακας 1). Για να εκτελέσει την ανάλυση SKY, τα κύτταρα αποψύχθηκαν και επανα-αναπτύχθηκαν σε αρκετά σημεία και όχι χρησιμοποιώντας ακριβώς την ίδια πληθυσμό που ελήφθη για μικροσυστοιχίες. Έτσι επιδράσεις ιδρυτής μπορεί να είναι υπεύθυνη για ασυνέπειες μεταξύ των διαφορετικών αποτελεσμάτων SKY (π.χ. η επικάλυψη του χρωμοσώματος 7 το πέρασμα 41 είναι ασυμβίβαστη με περάσματα 31 και 52), καθώς και μεταξύ ουρανού και καρυοτύπου έκφραση που παρατηρείται σε ορισμένα σημεία (π.χ. την επικάλυψη του χρωμοσώματος 18 στο γραμμή C ή οι διαγραφές των χρωμοσωμάτων 13 και 5 N8 δείγμα).

Ο καρυότυπος εξελικτικό δέντρο.

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις εξελικτικές διεργασίες που έλαβαν χώρα κατά τη διάρκεια του πειράματος μας, κατασκευάσαμε ένα «καρυότυπος εξελικτικό δέντρο» (Σχήμα 4) που συνδυάζει δεδομένα από τα αποτελέσματα SKY και έκφρασης. Όπως και σε άλλες εξελικτικών δέντρων, η «καρυότυπος εξελικτικό δέντρο» μας επιτρέπει να κατανοήσουμε καλύτερα ποια καρυότυπος «είδη» αναδύονται, να εξελιχθούν ή να εξαφανιστεί κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Το εξελικτικό δέντρο επισημαίνει το χαρακτηριστικό (στην περίπτωσή μας η συγκεκριμένη προσθήκη, διαγραφή ή εκτροπή) που δίνει το επιλεγμένο πλεονέκτημα ανάπτυξης καρυότυπο σε σχέση με άλλες καρυότυποι. Εάν τα δεδομένα από το καρυότυπο έκφραση δεν ήταν σύμφωνα με τα δεδομένα από την ανάλυση SKY σε ένα συγκεκριμένο σημείο, με παρεμβολή της συμπεριφοράς των δύο γειτονικών σημείων (βλέπε Μέθοδοι). Για παράδειγμα, τα αποτελέσματα SKY στη γραμμή C έδειξε κύτταρα με συνδυασμούς επιπλέον ενισχύσεις και διαγραφές. Παρά το γεγονός ότι αρκετές πιθανές κατασκευές του δέντρου γραμμής C ήταν δυνατόν, τα στοιχεία τόσο από το καρυότυπο έκφρασης και από SKY πρότεινε ότι η πιο κυρίαρχη επίδραση σε αυτά τα κύτταρα ήταν η επανάληψη του χρωμοσώματος 7 (στο πέρασμα 40) που ακολουθείται από επικάλυψη των χρωμοσώματος 18, η οποία αργότερα ήταν που ακολουθείται από επικάλυψη των χρωμοσώματος 3. από την άλλη πλευρά ο καρυότυπος έκφραση σε δείγματα C6 και C7 έδειξε απροσδόκητη μείωση στο μέσο πολλαπλές μεταβολές όλων των παρεκκλίνουσα χρωμοσώματα (βλέπε Σχήμα 3). Πιστεύουμε ότι SKY αντιπροσωπεύει με μεγαλύτερη ακρίβεια την πραγματική καρυότυπο σε αυτά τα χρονικά σημεία.

Το σχήμα δημιουργήθηκε με βάση τα 24 αποτελέσματα SKY κατά μήκος της διαδικασίας μετασχηματισμού του καρκίνου του προστάτη και τον καρυότυπο έκφρασης. ανθρώπινα κύτταρα Κανονική προστάτη (αριστερή πλευρά του σχήματος) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία 4 αθανατοποιημένες διαφορετικές γραμμές: GSE, μάρτυρα, φυσιολογικό, και το μεταλλαγμένο ρ53 (βλέπε κείμενο) που πολλαπλασιάζονται κατά την διάρκεια 80 περάσματα (χ-άξονας).