;

Abstract

Η αντιγονική ομοιότητα μεταξύ όγκων και εμβρύων έχει εκτιμηθεί για πολλά χρόνια και αντανακλά την έκφραση των εμβρυϊκών γονιδιακών προϊόντων από καρκινικά κύτταρα ή /και τον καρκίνο-έναρξη βλαστικά κύτταρα. Εκμεταλλευόμενοι αυτή την ομοιότητα, έχουμε δοκιμαστεί ένα προφυλακτικό εμβόλιο κατά του καρκίνου του πνεύμονα που αποτελείται από αλλογενή ποντικού εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΟΚΕ). Αφελής C57BL /6 ποντίκια εμβολιάστηκαν με ESC μαζί με μια πηγή κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών (GM-CSF) με σκοπό την παροχή ανοσοδιεγερτική δραστικότητα ανοσοενισχυτικό. Τα εμβολιασμένα ποντίκια προστατεύονται από επακόλουθη πρόκληση με εμφυτεύσιμα καρκίνωμα πνεύμονα Lewis (LLC). ESC επαγόμενη ανοσία κατά του όγκου δεν οφειλόταν σε ένα μη ειδικό «αλλο-απόκρισης» όπως ο εμβολιασμός με αλλογενή εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού δεν προστατεύουν από την ανάπτυξη όγκων. αποτελεσματικότητα του εμβολίου συνδέθηκε με ισχυρή όγκο αντιδραστική πρωτοβάθμια και τη μνήμη CD8

+ Τ αποκρίσεις τελεστές, απόκριση Th1 κυτοκίνης, υψηλότερο εντός του όγκου CD8

+ T τελεστή /CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ αναλογία ρυθμιστικών Τ κυττάρων, και μειωμένη προέρχονται μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα στη σπλήνα. Πρόληψη της ογκογένεσης βρέθηκε να απαιτούν μια απόκριση CD8 διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL) επειδή

in vivo

εξάντληση των CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα κατήργησε εντελώς την προστατευτική επίδραση του εμβολιασμού. Σημαντικά, αυτή η στρατηγική εμβολιασμού κατέστειλε επίσης την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται από το συνδυασμό της χορήγησης καρκινογόνο και χρόνια πνευμονική φλεγμονή. Περαιτέρω βελτίωση αυτής της νέας στρατηγικής εμβολίου και την ταυτοποίηση των αντιγόνων από κοινού ESC /όγκου μπορεί να οδηγήσει σε ανοσοθεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και, ίσως το πιο σημαντικό, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα πρώτο βήμα προς την ανάπτυξη προφυλακτικών εμβολίων κατά του καρκίνου.

Citation : Yaddanapudi K, Μίτσελ RA, Στόκος K, Willer S, Sharma RK, Yan J, et al. (2012) Ο εμβολιασμός με εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα προστατεύει από τον καρκίνο του πνεύμονα: Είναι ένα ευρέος φάσματος προφυλακτικό εμβόλιο κατά του καρκίνου δυνατόν; PLoS ONE 7 (7): e42289. doi: 10.1371 /journal.pone.0042289

Επιμέλεια: Λουκία Gabriele, Istituto Superiore di Sanità, Ιταλία

Ελήφθη: 14, Μαρτίου, 2012? Αποδεκτές: 5 Ιουλ 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιούλη 2012

Copyright: © Yaddanapudi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ /NCRR P20RR018733 (KY), την αμερικανική ένωση πνευμόνων (JWE, RAM) και το Κεντάκι Καρκίνο του πνεύμονα Πρόγραμμα Έρευνας (RAM). JWE υποστηρίζεται από την Κοινοπολιτεία του Κεντάκι Έρευνας Ταμείο Challenge. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Οι ενέργειες που αναφέρθηκαν εδώ είναι το αντικείμενο που εκκρεμούν ΗΠΑ Επιστολές αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας για τα οποία δρχ. Mitchell και Eaton ονομάζονται ως αριθμός εφευρετών, αίτηση 60 /782.672 (ΗΠΑ PTO), με τίτλο «Μέθοδοι και υλικά για την ανοσοποίηση κατά του καρκίνου». Είναι κατατέθηκε 15 του Μαρτίου του 2007 (μετά την πρώτη κατάθεση 15 του Μάρτη του 2006). Για την καλύτερη γνώση των συγγραφέων, δεν υπήρξε καμία ενέργεια γραφείου σε αυτό και παραμένει μια εφαρμογή. Δεν υπάρχουν άλλα διπλώματα ευρεσιτεχνίας, προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Μια παλιά θεωρία σχετικά με ογκογένεση ήταν ότι ο καρκίνος προέκυψε από τις φωλιές των εμβρύου βλαστικά κύτταρα που υπάρχουν σε φυσιολογικούς ιστούς και διεγείρονται να αναπτυχθούν από κάποιο είδος ερεθισμού [1]. Παρά το γεγονός ότι η έννοια αυτή ήταν σε μεγάλο βαθμό αγνοηθεί για πάνω από έναν αιώνα, υπάρχουν πλέον ενδείξεις ότι μεταλλαγμένα, ιστο-ειδικά βλαστικά κύτταρα δρουν ως ανεξάρτητοι ανανέωση «του καρκίνου έναρξη κύτταρα», υπεύθυνη για την έναρξη των πολλών κακοηθειών [2]. Σε έμμεση υποστήριξη αυτής της ιδέας, υπάρχουν άφθονες αποδείξεις ότι οι περισσότεροι τύποι στερεού όγκου εκφράζουν εμβρυϊκά αντιγόνα σε διάφορους βαθμούς [3], [4], [5]. Για παράδειγμα, τα «καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνα», περιγράφηκε για πρώτη φορά στα μέσα της δεκαετίας του 1960, αντιπροσωπεύουν αντιγόνα μοιράζονται τα έμβρυα και οι όγκοι της πεπτικής οδού [6], [7]. Παρά την κάποια επιτυχία χρησιμοποιώντας αυτά τα αντιγόνα μοιράζονται εμβρυϊκά /όγκου ως στόχοι για ανοσοθεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο, μια επίμονη εμπόδιο για αυτές τις προσεγγίσεις είναι ότι προκαλούμενης από όγκο ανοσολογικής ανοχής [8].

Μια εναλλακτική ανοσοποιητικού που βασίζεται αντι- στρατηγική για τον καρκίνο μπορεί να είναι προφυλακτικό εμβολιασμό έναντι αντιγόνων όγκου

πριν

προς την εμφάνιση του καρκίνου – και η σχετική ανοσολογικής ανοχής – αλλά η προσέγγιση αυτή είναι επίσης γεμάτη προβλήματα. Παρά το γεγονός ότι έχουμε τώρα κάποια αποτελεσματικά εμβόλια για καρκίνους που προκύπτουν από μολυσματικούς παράγοντες (π.χ., ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων [9]), καρκίνοι προκύπτουν από «αυτο» και η πλειονότητα των αντιγόνων που εμφανίζονται από τα κύτταρα του όγκου είναι επίσης παρούσα στα φυσιολογικά ενήλικα κύτταρα. Ωστόσο, φαίνεται τώρα ότι οι περισσότεροι όγκοι εκφράζουν ορισμένες εμβρύου αντιγόνα. Είναι σημαντικό ότι η έκφραση ορισμένων εμβρυϊκών αντιγόνων μπορεί να καταλήξει στο πρώτο ή το δεύτερο τρίμηνο της εγκυμοσύνης, πολύ πριν το ανοσοποιητικό σύστημα των θηλαστικών καθορίζει «εαυτό» έναντι «μη εαυτό». Κατά συνέπεια, τα προϊόντα γονιδίων που εκφράζονται από τα δύο έμβρυα και τα καρκινικά κύτταρα δεν μπορούν να συμπεριληφθούν στο «εαυτού» ρεπερτόριο και συνεπώς είναι πιθανώς ανοσογόνα.

Στις αρχές του 20ου αιώνα, αναφέρθηκε ότι πριν από την ένεση των ποντικών με εμβρυϊκών ιστών οδήγησαν στην απόρριψη της μεταφυτεύσιμων όγκων (αναθεωρούνται στο [10]). Klavins

κ.ά.

αργότερα ανέφεραν ότι αντιοροί αναπτύχθηκαν σε κουνέλια κατά ενός γαλακτωματοποιημένου πλήρες ανθρώπινο έμβρυο (6-7 εβδομάδες) -. Προσροφηθεί κατά των ενήλικων ανθρώπινων ιστών – αναγνωρίζεται μια μεγάλη ποικιλία τύπων ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος, των βρόγχων, της νεφρικής, κολονική, ηπατική, του πνεύμονα και του μαστού [11]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι ζώα ή ανθρώπους ανοσοποιηθεί έναντι εμβρυϊκών υλικό θα μπορούσε να είναι ικανό να αναγνωρίζει και να καταστρέφει νεοπλασματικά κύτταρα. Πολύ πρόσφατες μελέτες περιγράφουν τις δυνατότητες της ΟΚΕ για την προνομιακή αντικαρκινική ανοσία. Οι εκθέσεις αυτές έδειξαν ότι πολυδύναμα ESC επάγει μέτρια καθυστερήσεις στην ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα ποντικών μεταμοσχεύσιμων καρκίνωμα του παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα [12], [13].

ανοσοδιεγερτικών κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων των GM-CSF, η ιντερλευκίνη (IL) -2 , IL-12, και η ιντερφερόνη (IFN) -α απέδειξαν σημαντικές επιπτώσεις κατά του όγκου. Μεταξύ αυτών, ο GM-CSF είναι μία από τις πιο ισχυροί και ειδικοί επαγωγείς των αντι-καρκινικών συστημική ανοσία [14], [15]. GM-CSF προκαλεί επίδραση του διεγείροντας την ενεργοποίηση των επαγγελματικών κυττάρων παρουσίασης αντιγόνου (APC), δηλαδή δενδριτικά κύτταρα (DC) και μακροφάγα. Τα APCs με τη σειρά τους, να επεξεργάζονται και αντιγόνα που υπάρχουν καρκινικά να προειδοποιήσει βοηθητικά Τ κύτταρα και κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) [16], [17]. Αύξηση της τοπικής παραγωγής της GM-CSF από γενετικώς τροποποιημένα καρκινικά κύτταρα μπορεί να προκαλέσει ειδική αντι-όγκου κυτταρικής ανοσίας και

in vitro

και

in vivo

[15], [17], [18], [19]. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να βελτιώσουμε την κατάσταση των δυνατοτήτων του καρκίνου ανοσοθεραπευτική των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων αντιγονική διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με κακοήθη κύτταρα, σε μια προσπάθεια να εντοπίσει μια πιο αποτελεσματική ΟΚΕ με βάση το εμβόλιο κατά του καρκίνου.

Εδώ, αναφέρουμε ότι ο εμβολιασμός με ESC σε συνδυασμό με μια πηγή του GM-CSF είναι αποτελεσματική στην πρόληψη και εμφυτεύσιμο καρκινογόνο επαγόμενη όγκων του πνεύμονα χωρίς ανιχνεύσιμη τοξικότητα ή σημάδια αυτοανοσίας. Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του εμβολίου συνδυασμού ESC /GM-CSF συνδέθηκε με ισχυρή ογκο-ειδικό πρωτεύον και μακροπρόθεσμη μνήμη CD8

+ Τ αποκρίσεις τελεστή, διήθηση του CD8

+ Τ κυττάρων εντός του όγκου που οδηγεί σε αυξημένη εντός του όγκου CD8

+ T τελεστή /Τ αναλογία ρυθμιστικών κυττάρων και μειωμένη προέρχονται μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) στο σπλήνα. Συλλογικά, τα ευρήματά μας παρέχουν μια ισχυρή λογική για την περαιτέρω ανάπτυξη αυτής της νέας μορφής του εμβολίου ως ανοσοθεραπευτικό στρατηγική για την πρόληψη του καρκίνου.

Αποτελέσματα

εμβολιασμού ΟΚΕ εμποδίζει την απόφυση ενός εμφυτεύονται αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα

αρχικές μελέτες μας επιχείρησαν να αξιολογηθεί η σχετική προστατευτική επίδραση του εμβολίου ESC απουσία οποιωνδήποτε ανοσοδιεγερτικών ανοσοενισχυτικών. Η ανοσοποίηση των ποντικών με ακτινοβολημένα ESC μόνη δεν είχε καμία επίδραση στον χρόνο έναρξης του καρκίνου του πνεύμονα Lewis (LLC) έκφυση του όγκου αλλά είχε ως αποτέλεσμα σε μια μέτρια μείωση στην αρχική φορτίο όγκου σε σύγκριση με όγκους σε μη ανοσοποιημένους ποντικούς μάρτυρες (

δεν δεδομένα φαίνεται

) συνεπές με προηγούμενες μελέτες [12], [13]. Προκειμένου να ενισχυθεί η επίδραση του εμβολίου ESC με GM-CSF συν-χορήγηση, επιχειρήσαμε πρώτα να υπερεκφράζουν ποντικού GM-CSF στην κυτταρική γραμμή ES-D3 ES χρησιμοποιώντας ρετροϊική μεταγωγή όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για τα εμβόλια Β16 μελάνωμα /GM-CSF [15]. Ωστόσο, λόγω των δυσκολιών στην επίτευξη αισθητά έκφραση GM-CSF χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση – πιθανόν να οφείλεται σε ρετροϊικό στοιχείο προαγωγού φίμωση σε ESC [20] – εμείς αντί σταθερώς υπερ-εκφράζεται GM-CSF σε ινοβλάστες STO τα οποία συνήθως χρησιμοποιούνται ως τροφοδοτικά στρώματα για ES -θ3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, ψευδο ινοβλάστες μολύνθηκαν STO εκφράζεται αμελητέα ποντικού GM-CSF, ενώ ο GM-CSF ινοβλαστών σε μεταγωγή με ρετροϊό STO εκφράζουν και εκκρίνουν υπερ-φυσιολογική ποσότητες της κυτοκίνης. Χρησιμοποιώντας ένα σχήμα τυπικό χρονισμό εμβολιασμού (Εικ. 1Β), αφελείς C57BL 6 ποντίκια /ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρες 0 και 14) με HBSS (έλεγχος), τα ακτινοβολημένα ΟΚΕ συγχορηγείται με ινοβλάστες STO εκφράζουν GM-CSF (ESC /STO-GM ), ή κύτταρα STO-GM και μόνο. Επτά ημέρες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση, οι ποντικοί προκλήθηκαν με ζωντανά κύτταρα LLC και παρακολουθούνται για ανάπτυξη όγκου ως μία συνάρτηση του χρόνου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C, ο εμβολιασμός ποντικών με ESC /STO-GM ήταν 70% αποτελεσματικό στην πρόληψη την ανάπτυξη όγκων, ενώ όλα τα μη εμβολιασμένα ζώα ελέγχου είχαν αναπτύξει ψηλαφητών όγκων μέχρι την ημέρα 24 μετά την πρόκληση. Σημαντικά, ακτινοβολημένα STO-GM κύτταρα δεν παρείχε προστασία κατά της έκφυση των όγκων LLC (Εικ. 1C) που υποδηλώνει ότι η παρατηρούμενη προστασία με ESC /STO-GM δεν οφείλεται σε μη-ειδικές ανοσοαποκρίσεις έναντι αλλογενών ολικού κυττάρου αντιγόνα. Τέλος, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι όγκοι LLC που είχε αναπτυχθεί στο ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια (η = 3) ήταν σημαντικά μικρότερες και μεγάλωσε έξω με πολύ βραδύτερο ρυθμό από ό, τι εκείνες που αναπτύσσονται σε μη-εμβολιασμένα ποντίκια ελέγχου (n = 10) (Σχ. 1D). Στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν στρατηγική εμβολιασμού μας παρέχει προστασία έναντι του απόφυση άλλων C57BL /6 που προέρχεται από όγκους. Προς το σκοπό αυτό, αμφισβητήθηκε ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια με συγγενή Β 16F0 μελανώματος κυτταρική γραμμή που προέρχεται από C57BL /6 ποντικούς και παρακολουθήθηκε η ανάπτυξη του όγκου συναρτήσει του χρόνου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, ESC /STO-GM εμβολιασμός μείωσε αποτελεσματικά το μέγεθος των όγκων μελανώματος και επίσης προκάλεσε σημαντική καθυστέρηση στην outgrowh όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο, μη εμβολιασμένα ποντίκια.

(Α) ιστόγραμμα που δείχνει έκφραση GM-CSF σε μη μεταγωγή και ρετροϊό μεταγωγή ινοβλάστες STO. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, P & lt? 0,05? σε σχέση με το μη μεταδιηγερμένα κύτταρα STO?

t

τεστ. (Β) Το καθεστώς της ανοσοποίησης. Αρσενικά C57BL 6 ποντίκια /ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρες 0 και 14) με HBSS (έλεγχος), ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 GM-CSF που εκφράζουν STO ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών (STO -GM) sc στο δεξιό πλευρό. Επτά ημέρες μετά την αναμνηστική δόση, οι ποντικοί προκλήθηκαν με 1 × 10

5 κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Lewis (LLC) s.c. στο αριστερό πλευρό. (C) C57BL /6 ποντίκια (10 /ομάδα) ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρες 0 και 14) με HBSS (έλεγχος), ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 STO-GM, ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 κύτταρα STO-GM και μόνο sc στη δεξιά πλευρά πριν από s.c. πρόκληση με LLC την ημέρα 21. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά σε όλα τα ζώα μέχρι τη θυσία λόγω όγκοι υπερβαίνουν το 5% του σωματικού βάρους. Η εμβολιασμένα χωρίς όγκο ποντικών παρέμεινε έτσι μέχρι και 4 μήνες αργότερα χωρίς εμφανή σημάδια αναστάτωσης ή αυτοανοσία. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **

σ

& lt? 0.001? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου? δοκιμασία log-rank. (ΡΕ). Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε 2η ή 3η ημέρα και ο όγκος όγκοι χαράσσονται ως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των όγκων του όγκου των 10 ποντίκια /ομάδα ελέγχου και 3 ποντίκια /ESC /STO-GM της ομάδας και είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM.

Η

εμβολιασμού ΟΚΕ προκαλεί όγκου των κυττάρων-ειδικών CD8-εξαρτώμενη απόκριση κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων

Οι περισσότερες επιτυχημένες ανοσοθεραπεία του καρκίνου απαιτούν μια ισχυρή CD8-εξαρτώμενη απόκριση CTL [21 ], [22]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο ESC /STO-GM εμβολιασμός προκαλεί αντιδράσεις CD8, σπληνοκύτταρα από ESC /STO-GM εμβολιασμένων και μη εμβολιασμένων (έλεγχος) ποντίκια αξιολογήθηκαν για

in vitro

καρκινικό κύτταρο σκοτώνει δέκα ημέρες μετά την ανοσοποίηση. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την παρουσία ενός CTL απόκριση μετά την ESC /STO-GM εμβολιασμό (Σχ. 2Α). Σημαντικά, αυτή η θανάτωση είναι ειδική για κύτταρα όγκου (και ESC) στο εν λόγω καμία κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε έναντι πρωτογενούς ενηλίκων ινοβλάστες ποντικού πνεύμονα ή ινοβλαστών STO (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

). Εξετάσαμε επιπλέον δείκτες φαινοτυπικά σε CD8

+ σπλήνας από ESC /STO-GM εμβολιασμένα και τα ποντίκια ελέγχου. Granzyme Β είναι ένα κυτταρολυτικό μόριο τυπικά εκφράζεται από τελεστή, αλλά όχι αφελείς ή μνήμη, CD8

+ σπληνοκύτταρα [23], [24]. Σπληνοκύτταρα ελήφθησαν από μη εμβολιασμένα /όγκου αμφισβητηθεί (ομάδα ελέγχου), εμβολιασμένα /όγκου αμφισβητηθεί και ποντίκια /μη-όγκου αμφισβήτησε εμβολιασμένα και βάφονται άμεσα

ex vivo

, χωρίς καμία επαναδιέγερση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα των CD8

+ σπληνοκύτταρα απομονώνονται από μη ανοσοποιημένους ποντικούς ελέγχου εκφράζεται γρανζύμου Β, ενώ 25,6% των CD8

+ σπληνοκύτταρα από τα εμβολιασμένα /όγκου προκλήθηκαν ποντίκια εκφράσει αυτή τελεστή CTL (n = 6 /ομάδα?

t

δοκιμής,

ρ

& lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου? Σχήμα 2Β, D).. Επιπλέον, διαφορές στα ποσοστά των CD8

+ granzymeB

+ κύτταρα παρατηρήθηκαν σε σπληνοκύτταρα απομονώνονται από εμβολιασμένα ποντίκια που δεν προκλήθηκαν με κύτταρα LLC σε σύγκριση με τα εμβολιασμένα ποντίκια /όγκου προκλήθηκαν (Σχ. 2C), παρέχοντας πρόσθετη απόδειξη ότι η αυξημένη απόκριση γράνζυμο Β παρατηρούμε σε εμβολιασμένα /όγκου προκλήθηκαν ποντικούς είναι ειδικά για τα καρκινικά κύτταρα. Ως περαιτέρω δοκιμασία της σημασίας των CD8-εξαρτώμενο CTL-προκαλούμενα αποτελέσματα κατά του όγκου, CD4

+ ή CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα εξαντλημένα

in vivo

χρησιμοποιώντας αντι-CD4 ή αντι-CD8 μονοκλωνικών αντισωμάτων [25]. Ενώ οι ποντικοί εξαντλούνται από CD4

+ λεμφοκύτταρα, τουλάχιστον εν μέρει προστατεύονται από την απόφυση του LLC, CD8

+ εξάντληση των κυττάρων Τ κατήργησε εντελώς την προστατευτική επίδραση των ESC /STO-GM εμβολιασμό (Πίνακας 1).

(Α) C57BL /6 ποντίκια (5 /ομάδα) ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρες 0 και 14) με HBSS (έλεγχος) ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 STO-GM κύτταρα sc στο δεξιό πλευρό. Δέκα ημέρες μετά ώθηση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι σπλήνες αφαιρέθηκαν. Σπληνοκύτταρα από εμβολιασμένους ποντικούς και ελέγχου προστέθηκαν σε φρεάτια προ-seeded με κύτταρα LLC και συν-καλλιεργήθηκαν για άλλες 16 ώρες με τις υποδεικνυόμενες αναλογίες κύτταρο τελεστή-προς-στόχο, με την απώλεια του τελευταίου παρακολουθείται σε μια συσκευή ανάγνωσης ηλεκτρικής σύνθετης αντίστασης ACEA. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τέσσερα ανεξάρτητα φρεάτια για κάθε μπαρ λόγου και του λάθους τελεστή-προς-στόχο αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. (Β-Δ) C57BL 6 ποντίκια /ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρες 0 και 14) με HBSS (έλεγχος) ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 κύτταρα STO-GM υποδορίως στο δεξιό πλευρό. Επτά ημέρες μετά την τελευταία ανοσοποίηση, οι ποντικοί προκλήθηκαν με 1 × 10

5 κύτταρα LLC s.c. στο αριστερό πλευρό. 18-21 ημέρες μετά την πρόκληση του όγκου, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι σπλήνες αφαιρέθηκαν. Επιπλέον, μία σειρά από ποντίκια εμβολιάστηκαν με ESC /STO-GM μόνο και δεν αμφισβήτησε με όγκο. Σπληνοκύτταρα από εμβολιασμένους /όγκου αμφισβητηθεί, εμβολιασμένων /μη-όγκου προκλήθηκαν και ποντίκια ελέγχου πλύθηκαν, Fc υποδοχείς είχαν μπλοκαριστεί, και χρωματίστηκαν για έκφραση επιφανείας CD8 και ενδοκυτταρική έκφραση γρανζύμου Β και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Β, D) Ποσοστό των CD8

+ κυττάρων που εκφράζουν γράνζυμο Β σε σπληνοκύτταρα που προέρχονται από εμβολιασμένα /όγκου αμφισβήτησε και τα ποντίκια ελέγχου (6 /ομάδα). (C) Ποσοστό CD8

+ κύτταρα που εκφράζουν γρανζύμου Β σε σπληνοκύτταρα λαμβάνεται από εμβολιασμένα /μη-όγκου προκλήθηκαν ποντικούς (6 /ομάδα). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά της πύλης CD8

+ σπλήνας (*, p & lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου?

t

test). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD.

Η

εμβολιασμού ΟΚΕ προκαλεί όγκου των κυττάρων-ειδικό, Th1 απάντησης με τη μεσολάβηση κυτοκίνης σε CD8

+ Τ κύτταρα

επόμενο καθορίζεται η ικανότητα του CD8

+ Τ κύτταρα από ποντικούς εμβολιασμένους να παράγουν κυτοκίνες τελεστή που απαιτούνται για την αποτελεσματική αντι-ογκική κυτταρολυτική δράση. Σε απάντηση προς την εκ νέου διέγερση με LLC κυτταρολύματος, σημαντικά υψηλότερη συχνότητα IFN-γ, TNF-α και IL-2 που παράγει CD8

+ σπληνοκύτταρα ελήφθησαν από ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια σε σύγκριση με το μη εμβολιασμένη ομάδα ελέγχου (n = 6 /ομάδα? ANOVA,

ρ

& lt? 0,05? σχέση με τον έλεγχο ομάδα? Σχ. 3Α-D). Ελλείψει LLC επαναδιέγερση, καμία αύξηση της παραγωγής κυτοκινών παρατηρήθηκε σε CD8

+ σπληνοκύτταρα από εμβολιασμένους ποντικούς σε σύγκριση με μη διεγερμένα, τον έλεγχο μη-εμβολιασμένων ποντικών (Σχ. 3Ε, F). Κατά την ανάλυση των ανεξάρτητων εισφορές των ΟΚΕ και STO-GM εμβολιασμούς σε CD8

+ Τ κυτταρικές λειτουργίες τελεστή, παρατηρήσαμε ότι ESC μόνο του ή STO-GM θεραπείες και μόνο απέτυχε να προκαλέσει μια σημαντική αύξηση στα ποσοστά του σπληνός CD8

+ TNF-α

+ και CD8

+ ΙΡΝγ

+ κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-εμβολιασμένων ποντικών (Σχ. 3C). Για να προσδιορίσετε αν ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια προκάλεσε παρόμοιες CD8

+ Τ αποκρίσεις τελεστή σε άλλες /6 προέρχεται καρκινικά κύτταρα C57BL, πραγματοποιήσαμε

in vitro

ανάλυση κυτοκίνης με λύματα που προέρχονται από Β 16F0 κύτταρα μελανώματος. Όπως ήταν αναμενόμενο, σε απόκριση προς την εκ νέου διέγερση με Β16 κυτταρολύματος, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα των IFN-γ και TNF-α που παράγουν CD8

+ σπληνοκύτταρα από ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια σε σύγκριση με επαναδιεγέρθηκαν σπληνοκυττάρων καλλιέργειες που λαμβάνονται από μη εμβολιασμένη ομάδα αναφοράς (Σχήμα S2).

C57BL /6 ποντίκια (6 /ομάδα) ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρα 0 και 14) με HBSS (έλεγχος) ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC μόνο, ή ακτινοβοληθεί 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 STO-GM, ή ακτινοβοληθεί 1 × 10

6 STO-GM κύτταρα μόνο, sc στο δεξιό πλευρό. Δέκα ημέρες μετά την αναμνηστική δόση, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι σπλήνες αφαιρέθηκαν. Σπληνοκύτταρα από εμβολιασμένους και ελέγχου ποντικούς συν-καλλιεργήθηκαν με LLC λύμα (50 μg /ml) για ένα επιπλέον χρόνο 4 ημερών. Οι τελεστές συλλέχθηκαν και διεγέρθηκαν για 4 ώρες με ΡΜΑ (50 ng /ml) και ιονομυκίνη (500 ng /ml) παρουσία του Brefeldin Α (1 μl /ml). Μετά την επαναδιέγερση, τελεστές συλλέχθηκαν, Fc υποδοχείς είχαν μπλοκαριστεί, και χρωματίστηκαν για έκφραση επιφανείας του CD4, CD8 και ενδοκυτταρική έκφραση κυτοκινών και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Α, Β) Dot οικόπεδα δείχνει ΤΝΡ-α και η έκφραση ΙΡΝ-γ σε CD8

+ κυττάρων σε καλλιέργειες σπληνοκυττάρων που λαμβάνονται από τον έλεγχο και την ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Οι αριθμοί σε τεταρτημόρια αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά του κάθε υποπληθυσμό. (C, D) Μπαρ γραφήματα που δείχνουν τα ποσοστά των CD8

+ TNF-α

+, CD8

+ IFN-γ

+, και CD8

+ IL2

+ κύτταρα σπληνοκυττάρων καλλιέργειες που προέρχονται από τον έλεγχο, ESC μόνο, STO-GM μόνο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. *, P & lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου? ANOVA. (Ε, F) μη διεγερμένα κύτταρα σπλήνας από εμβολιασμένα και ελέγχου ποντικοί άμεσα σε επεξεργασία με ΡΜΑ /ιονομυκίνη /Brefeldin Α και χρωματίστηκαν για έκφραση ενδοκυτταρικών κυτοκινών. Δύο ανεξάρτητες δοκιμασίες κυτταροκαλλιέργειας διεξήχθησαν με κύτταρα που απομονώθηκαν από 6 ποντικούς ανά ομάδα? δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό ποσοτικό προσδιορισμό δείχνεται. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD.

Η

εμβολιασμού ΟΚΕ μειώνει μυελοειδή που προέρχονται κατασταλτικά κύτταρα, αλλά δεν μεταβάλλει τα ρυθμιστικά κύτταρα Τ στη σπλήνα

Για να μελετήσει περαιτέρω τα ανοσοτροποποιητικά αποτελέσματα της ESC /ΣΤΟ -GM εμβολιασμός, αναλύσαμε το φαινότυπο των σπληνοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Έχει αποδειχθεί ότι CD11b

+ Gr1

+ μυελοειδή που προέρχονται κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) και CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Τ

regs) είναι οι δύο πληθυσμοί καταστολέα που εμποδίζουν τις αντι-καρκινικές αποκρίσεις τελεστή στον σπλήνα [26], [27]. Βρήκαμε ότι το ποσοστό των MDSCs μειώθηκε σημαντικά από 33,8% σε 9,8% στις σπλήνες ποντικών εμβολιασμένων με ESC /STO-GM και προκλήθηκαν με κύτταρα LLC, σε σύγκριση με μη εμβολιασμένα, LLC προκλήθηκαν ποντίκια ελέγχου (η = 5 /ομάδα ?

t

δοκιμής,

ρ

& lt? 0,05? σχέση με τον έλεγχο ομάδα? Σχ. 4Α, Β). ESC /STO-GM εμβολιασμό, ωστόσο, δεν μείωσε τα ποσοστά των σπληνικών Τ

regs (Εικ. 4C) ή επάγουν οποιαδήποτε αλλαγή στην αναλογία των CD8

+ Τ κύτταρα σε Τ

regs στη σπλήνα (Εικ. 4D). Επιπλέον, εμείς δεν παρατηρούμε σημαντικές διαφορές στα ποσοστά των CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα (Εικ. 4Ε) ή σε απόλυτο αριθμό τους (

δεν φαίνεται

) στις σπλήνες από εμβολιασμένα και τον έλεγχο ποντίκια.

C57BL /6 ποντίκια ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρες 0 και 14) με HBSS (έλεγχος) ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 κλεμμένα κύτταρα GM sc στο δεξιό πλευρό. Επτά ημέρες μετά την τελευταία ανοσοποίηση, οι ποντικοί προκλήθηκαν με 1 × 10

5 κύτταρα LLC s.c. στο αριστερό πλευρό. 18-21 ημέρες μετά την πρόκληση του όγκου, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι σπλήνες αφαιρέθηκαν. Σπληνοκύτταρα από εμβολιασμένους ποντικούς και ελέγχου πλύθηκαν, Fc υποδοχείς είχαν μπλοκαριστεί, και χρωματίστηκαν για έκφραση επιφανείας των διαφορετικών δεικτών και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Α) Dot οικόπεδα που δείχνει τα ποσοστά του σπληνός CD11b

+ GR1

+ μυελοειδή που προέρχονται κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) στον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Οι αριθμοί σε τεταρτημόρια αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά του κάθε υποπληθυσμό. (Β) Μπαρ γραφήματα που δείχνουν τα ποσοστά των CD11b

+ GR1

+ MDSCs σε σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. *, P & lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου?

t

τεστ. (C) Μπαρ γραφικές παραστάσεις που δείχνουν τα ποσοστά των CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Τ

reg) σε σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. (Δ) Η αναλογία των CD8

+ Foxp3

– με CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

κύτταρα reg ήταν υπολογίζονται και συγκρίνονται με σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. (Ε) Μπαρ γράφημα που δείχνει τα ποσοστά των CD4

+ T και CD8

+ Τ κύτταρα σπλήνας που λαμβάνονται από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. Τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με κύτταρα που απομονώθηκαν από 5 ποντικούς ανά ομάδα? δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό ποσοτικό προσδιορισμό δείχνεται. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD.

Η

εμβολιασμού ΟΚΕ αυξάνει την αναλογία των CD8

+ Τ κύτταρα τελεστές σε Τ

regs στον όγκο

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ESC /STO-GM-επαγόμενη λειτουργία τελεστή κατά του όγκου κατά κύριο λόγο διαμεσολαβείται από CD8

+ Τ κύτταρα. Ως εκ τούτου, μελέτησαν την επίδραση αυτού του σχήματος του εμβολίου για τη λειτουργία της εντός του όγκου CD8

+ κυττάρων και την αλληλεπίδρασή τους με το T

regs. Αξιοποιώντας τις μικρό αριθμό ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια που έκαναν αναπτύσσουν βλάβες LLC – (Σχ. 1C, D) αν και σε μια καθυστερημένη μόδας, όγκοι από τους ελέγχους και εμβολιασμένα ποντίκια συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των προφίλ υποσύνολο που διηθούν όγκο λεμφοκύτταρα (TILs). κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις CD45.2

+ TILs αποκάλυψαν μια μείωση στο ποσοστό των CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

regs στον όγκο διηθήσεις από εμβολιασμένα ποντίκια

έναντι

ελέγχους (Σχ. 5Α). Αν και ακόμα παρατηρήσαμε την παρουσία του Τ

regs σε αυτούς τους όγκους, η αναλογία των CD8

+ Τ κύτταρα σε Τ

regs αυξήθηκε σημαντικά σε όγκο διεισδύει από ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια (η = 3 /ομάδα?

t

δοκιμής,

ρ

& lt? 0,05? σχέση με τον έλεγχο ομάδα? Σχ. 5Β, C). Για να εκτιμηθεί η ποιότητα των CD8

+ Τ κυττάρων όγκου διηθήσεις παρακάτω ESC /STO-GM εμβολιασμό, αναλύσαμε την έκφραση του CD25 δείκτη ενεργοποίησης και του τελεστή κυτταροκινών IFN-γ. CD8

+ κυττάρων στα διηθήματα ESC /STO-GM όγκος είχε αυξημένη έκφραση CD25 και ήταν ικανά να παράγουν υψηλότερες ποσότητες ΙΡΝ-γ σε απόκριση προς την εκ νέου διέγερση με ΡΜΑ /ιονομυκίνη (n = 3 /ομάδα?

t

δοκιμής,

σ

& lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου? Σχ. 5D, E). Έτσι, η ΟΚΕ και εμβόλιο STO-GM συνδυασμός αυξάνει σημαντικά την αναλογία των CD8

+ Τ κυττάρων σε Τ

regs και τα ποσοστά των CD8

+ CD25

+ και CD8

+ IFN- γ

+ κυττάρων-δραστών εντός των όγκων και υποδηλώνουν αποτελεσματικού εμβολίου που επάγεται, όγκος ανοσιακές πλήρωσης του συστήματος.

C57BL /6 ποντίκια ανοσοποιήθηκαν δύο φορές (ημέρα 0 και 14) με HBSS (έλεγχος) ή ακτινοβολημένα 1 × 10

6 ESC + ακτινοβολημένα 1 × 10

6 κύτταρα STO-GM SC στο δεξιό πλευρό. Επτά ημέρες μετά την αναμνηστική δόση, οι ποντικοί προκλήθηκαν με 1 × 10

5 Lewis κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα s.c. στο αριστερό πλευρό. 18-21 ημέρες μετά την πρόκληση του όγκου, τα καρκινικά κύτταρα που διηθούν συλλέχθηκαν από τον έλεγχο και την ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Α) Τα ιστογράμματα δείχνουν τα ποσοστά των CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

regs στο CD45.2

+ διηθούν όγκο κύτταρα που λαμβάνονται από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια . (Β) Dot οικόπεδα που δείχνει τα ποσοστά των CD8

+ και Foxp3

+ υποπληθυσμών στο CD45.2

+ κυττάρων που διηθούν όγκο. (C) Μπαρ γράφημα που δείχνει την αναλογία των CD8

+ Foxp3

– να CD8

-Foxp3

+ κύτταρα σε 1 από 2 εκπρόσωπο πειράματα με 3 ανεξάρτητα αναλύονται ποντίκια /ομάδα. *, P & lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου?

t

τεστ. (D, E) εμβολιασμός ESC αυξάνει τη συχνότητα των λειτουργικών CD8

+ Τ κυττάρων σε όγκους. (Δ) Μπαρ γράφημα που δείχνει τα ποσοστά των CD25

+ CD8

+ σε CD45.2

+ καρκινικά κύτταρα διηθούν που λαμβάνονται από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. (Ε) όγκου διηθητικά κύτταρα επαναδιεγέρθηκαν με ΡΜΑ και ιονομυκίνη και αναλύθηκαν για την έκφραση της ενδοκυτταρικής IFN-γ. ιστογράμματα που δείχνουν τα ποσοστά των CD8

+ IFN-γ

+ σε διηθούν όγκο των κυττάρων από τον έλεγχο και ESC /STO-GM εμβολιασμένα ποντίκια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα από 2 ανεξάρτητα πειράματα με 3 ποντικούς /ομάδα. *, P & lt? 0,05? σε σχέση με την ομάδα ελέγχου?

t

τεστ. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD.

Η

ESC εμβολιασμού που προκαλείται από CD8

+ Τ κυττάρων με τη μεσολάβηση οι απαντήσεις τελεστές διατηρούνται σε μακροπρόθεσμη επιζώντα ζώα

Στη συνέχεια εξετάσαμε την αποτελεσματικότητα της στρατηγικής εμβολιασμού ESC μας στη διατήρηση των CD8

+ πισίνα μνήμης Τ-κυττάρων και παραγωγή δευτερογενών απαντήσεων χρησιμοποιώντας ποντίκια που είχαν εμβολιαστεί επιτυχώς /προστατευμένη 60 ημέρες νωρίτερα. Οι έλεγχοι περιελάμβαναν αφελή, μη εμβολιασμένα ποντίκια που προκλήθηκαν με κύτταρα LLC. 80% των ποντικών προηγουμένως εμβολιαστεί με ESC /STO-GM δεν είχαν αναπτύξει όγκους 90 ημέρες μετά όγκου εκ νέου τον εμβολιασμό, ενώ το 0% των ελέγχων ίδιας ηλικίας παρέμεινε ελεύθερο όγκων (n = 10 /ομάδα? Log-rank test,

σ

& lt? 0.001? σε σχέση με αφελείς ομάδα ελέγχου? Εικ. 6Α). Σημαντικά, τα εμβολιασμένα ζώα με όγκους εξαλειφθεί LLC διατηρούνται μακροχρόνια ανοσολογική μνήμη, όπως εκτιμάται από την αυξημένη παραγωγή ΙΡΝ-γ από σπληνικά

+ κύτταρα CD8 (η = 4 ποντικοί /ομάδα?

t

δοκιμής,

σ

& lt? 0,05? σε σχέση με αφελείς ομάδα ελέγχου? Εικ. 6Β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση της σπληνικής CD8

+ CD44

hi κύτταρα μνήμης σε μακροχρόνια εμβολιασμένα ποντίκια επανα-προκλήθηκαν με κύτταρα όγκου LLC σε σύγκριση με αφελή όγκου προκλήθηκαν ποντικούς. (N = 4 ποντικοί /ομάδα?

t

δοκιμής,

σ

& lt? 0,05? Σε σχέση με αφελείς ομάδα ελέγχου? Σχ. 6C, D).

Μακροπρόθεσμη επιζών ποντίκια από την ομάδα ESC /STO-GM εκ νέου πρόκληση sc με 1 × 10

5 κύτταρα LLC 60 ημέρες μετά την αρχική εμβολιασμό του όγκου. (Α) Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά σε όλα τα ζώα μέχρι τη θυσία λόγω όγκοι υπερβαίνουν το 5% του σωματικού βάρους. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα άθροισμα των δύο ανεξάρτητα πειράματα με 10 ποντίκια /ομάδα. **, P & lt? 0.001? σε σχέση με αφελείς ελέγχου? δοκιμασία log-rank. (Β-D) Σπλήνες απομονώθηκαν από εμβολιασμένα επιζώντες και ελέγχουν αφελή ποντίκια 10 ημέρες μετά την ένεση του όγκου. (Β) Σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν και διεγέρθηκαν για 4 ώρες με ΡΜΑ (50 ng /ml) και ιονομυκίνη (500 ng /ml) παρουσία του Brefeldin Α (1 μl /ml). Μετά την επαναδιέγερση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, Fc υποδοχείς είχαν μπλοκαριστεί, και χρωματίστηκαν για ενδοκυτταρική έκφραση των κυτοκινών, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. γραφήματα ράβδων που δείχνει το ποσοστό της ενδοκυτταρικής έκφρασης IFN-γ σε CD8

+ κύτταρα (*,

ρ

& lt? 0,05? σχέση με αφελείς ελέγχου?

t

τεστ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. (C) Dot οικόπεδα που δείχνει τα ποσοστά των CD44

+ και CD8

+ κύτταρα σπλήνας που προέρχονται από τη μακροπρόθεσμη επιζών ΟΚΕ εμβολιαστεί και τον έλεγχο αφελή ποντίκια. Οι αριθμοί στα τεταρτημόρια αντιπροσωπεύουν ποσοστά της κάθε υποπληθυσμό. (Δ) γράφημα ράβδων που δείχνει τα ποσοστά των CD44

+ CD8

+ κύτταρα (*,

σ

& lt? 0,05? Σε σχέση με αφελείς ελέγχου?

t

test). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των συνολικών κυττάρων. Δεδομένα για Β-D είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων με 4 ποντικοί /ομάδα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD.

Η

εμβολιασμού ΟΚΕ καταστέλλει την 3-μεθυλχολανθρενίου ξεκίνησε, βουτυλοϋδροξυτολουόλιο προωθείται πνεύμονα καρκινογένεση

Πρόληψη της έκφυσης των εμφυτεύσιμων όγκων του πνεύμονα με τη χρήση αυτής της στρατηγικής εμβολιασμού δεν προβλέπουν αποτελεσματικότητα σε

in vivo

πνευμονική καρκινογένεση. Για να δοκιμαστεί το τελευταίο, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ποντικού που περιλαμβάνει καρκινογόνο χορήγηση που ακολουθείται από χρόνια πνευμονική φλεγμονή η οποία πιστεύεται ότι μιμείται το κάπνισμα συνδέεται πνεύμονα καρκινογένεση [28]. Αρσενικοί ποντικοί Balb /c εκτέθηκαν σε μια εφ ‘άπαξ 3-μεθυλοχολανθρένιο (πειραματική εβδομάδα 1) και επαναλαμβανόμενες χορήγηση βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ? Εβδομάδας 3-8). Αυτά τα ζώα στη συνέχεια εμβολιάστηκαν (εβδομάδα 4, 6 και 8) είτε με μόνη HBSS ή ESC /STO-GM. Σε αυτό το μοντέλο, πολλαπλούς όγκους του πνεύμονα αποτελούν προβλέψιμα μέσα σε τέσσερις έως έξι μήνες μετά την έναρξη. 18 εβδομάδες μετά την αρχική δόση 3-μεθυλοχολανθρένιο, οι πνεύμονες συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν. Η αρχική χονδρική εξέταση των πνευμόνων αποκάλυψε ότι έλεγχος εμβολιαστεί πνεύμονες ποντικού όλα είχαν όγκους επιφάνεια με ένα μέσο όρο 1.6 μεγάλες αλλοιώσεις ανά ποντικό (Σχ. 7Α). Αντίθετα, μόνο το 1/8 ποντίκια που εμβολιάστηκαν με ESC /STO-GM είχε μια ορατή επιφάνεια του όγκου δίνοντας κατά μέσο όρο περίπου 0,2 όγκων του πνεύμονα /ποντίκι (n = 8?

t

δοκιμής,

p

& lt? 0,05? σχέση με τον έλεγχο ομάδα? Εικ. 7Α). Συνολική μάζα όγκου πνεύμονα αξιολογήθηκε περαιτέρω σε 3 ζώα της κάθε ομάδας με εξέταση διαδοχικών τομών των πνευμόνων. Όπως φαίνεται στο Σχ.