Abstract

Τροποποιημένο γαγγλιοζίτες μπορούν να υπερεκφράζεται σε ορισμένους τύπους καρκίνου, έτσι, θεωρούνται ένας πολύτιμος στόχος σε ανοσοθεραπεία καρκίνου. Διαρθρωτικά γνώση της αλληλεπίδρασής τους με αντισώματα περιορίζεται επί του παρόντος, λόγω του μεγάλου μεγέθους και υψηλή ευελιξία αυτών των προσδεμάτων. Σε αυτή τη μελέτη, εφαρμόζουμε τεχνική χαρτογράφησης ιστοσελίδα προηγουμένως αναπτυχθεί μας να διερευνήσουμε την αναγνώριση των σχετιζόμενων με τον καρκίνο γαγγλιοσίδια με αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ένα δυναμικό γαγγλιοσιδίου μοτίβο σύνδεσης στα τέσσερα αντισώματα που μελετήθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανότητα διαρθρωτικών σύγκλισης στην αντι-γαγγλιοσίδης ανοσολογική απόκριση. Η δομική βάση της αναγνώρισης του γαγγλιοσιδίου-μιμητικά πεπτίδια είναι επίσης διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας χαρτογράφηση τόπου και σε σύγκριση με την αναγνώριση γαγγλιοσίδη. Τα πεπτίδια φαίνονται να ενεργούν ως δομικά μιμείται γαγγλιοζιτών μέσω αλληλεπίδρασης με πολλούς από τους ίδιους υπολειμμάτων θέση δέσμευσης όπως τα συγγενή επιτόπια υδατάνθρακα. Αυτές οι μελέτες παρέχουν σημαντικές ενδείξεις ως προς τη δομική βάση της ανοσολογικής μιμητισμού των υδατανθράκων

Παράθεση:. Agostino Μ, Yuriev Ε, Ramsland ΡΑ (2012) Αντίσωμα Αναγνώριση σχετίζονται με τον καρκίνο γαγγλιοζίτες και μιμείται τους διερευνηθεί με τη χρήση

in silico Ιστοσελίδα Mapping. PLoS ONE 7 (4): e35457. doi: 10.1371 /journal.pone.0035457

Επιμέλεια: Bostjan Κόμπε, το Πανεπιστήμιο του Queensland, Αυστραλία

Ελήφθη: 6 Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρτίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Agostino et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια μικρή επιχορήγηση από το Τμήμα Φαρμακευτικής και Φαρμακευτικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Monash, στο ΕΥ. ΜΑ είναι ο αποδέκτης του βραβείου Δημοσίευση Monash University Μεταπτυχιακό. PAR είναι ο Sir Zelman Cowen Senior Research Fellow (Sir Zelman Cowen Fellowship Ταμείο, Burnet Institute). Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη τη συμβολή σε αυτό το έργο της βικτωριανής Επιχειρησιακού Προγράμματος Ενίσχυσης Υποδομής που έλαβε από το Ινστιτούτο Burnet. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα γαγγλιοσίδια είναι γλυκοσφιγγολιπίδια τα οποία διαθέτουν ένα ή περισσότερα υπολείμματα σιαλικού οξέος. Είναι πιο συχνά συνδέεται με τη λειτουργία του νευρικού συστήματος, όπου παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας της μυελίνης και άξονες [1]. έχουν μεταβολές στις γαγγλιοσιδίου επίπεδα έκφρασης έχουν συσχετιστεί με αρκετές νευροεκφυλιστικές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της νόσου Alzheimer, της νόσου του Parkinson, νόσος του Huntington και HIV-άνοια [2]. Η παραγωγή αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα είναι ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά της βιοχημικής σύνδρομο Guillain-Barré, μια αυτοάνοση νευροπάθεια [3]. Ενώ η συγκεκριμένη αιτία του συνδρόμου είναι άγνωστη στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, είναι συνήθως προηγείται από λοίμωξη με

Campylobacter jejuni

[4], [5].

γαγγλιοσιδών έχουν ταυτοποιηθεί ως όγκος -associated αντιγόνα υδατάνθρακα (Tacas), μια ομάδα η οποία περιλαμβάνει Lewis Υ, Lewis Χ, Thomsen-Friedenreich και Thomsen-Nouvelle [6]. Οι γαγγλιοζίτες συχνότερα βρίσκονται στο νευρικό σύστημα είναι GM1, GD1a, GD1b και GT1b [1], ωστόσο, οι γαγγλιοζίτες θεωρούνται για το εμβόλιο και στόχευση που βασίζονται σε αντισώματα είναι γενικά βιοσυνθετικά ενδιάμεσα αυτών, όπως GM2, GM3, GD2 και GD3 [ ,,,0],7], [8], [9], [10] (Σχήμα 1). Ενώ βρίσκονται σε χαμηλές ποσότητες στο νευρικό σύστημα, συχνά εμφανίζονται σε μεγάλες πυκνότητες σε μία ποικιλία καρκινικών κυτταρικών τύπων [11], [12], [13]? Έτσι, είναι ελκυστικοί στόχοι για ανοσοθεραπεία καρκίνου. Εκτός από αυτά, γαγγλιοσίδια που καταλήγουν σε

N

-glycolylneuraminic οξύ (Neu5Gc), όπως

N

-glycolyl GM3 (Neu5Gc-GM3), είναι επίσης χρήσιμοι στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου [14] , [15]. Σε αντίθεση με

N

-ακετυλνευραμινικό οξύ, Neu5Gc δεν μπορεί να συντεθεί από τον άνθρωπο, λόγω της έλλειψης ενός λειτουργικού υδροξυλάσης σιαλικού οξέος [16]. Η εμφάνιση των Neu5Gc σε ανθρώπινα κύτταρα πιστεύεται ότι προέρχεται περίπου μέσω ενζυμικής ενσωμάτωση από τη διατροφή [17]. Δεδομένου ότι η έκφραση Neu5Gc περιορίζεται κυρίως στα κύτταρα του καρκίνου στον άνθρωπο, με στόχο Neu5Gc τερματισμού γαγγλιοσίδια είναι πιθανό να επιτευχθεί μια εξαιρετικά επιλεκτική θεραπευτικό αποτέλεσμα

γαγγλιοσίδια ΚΝΣ: Α. GT1b. Β GD1a. Γ GD1b. Δ GM1. Σχετίζονται με τον καρκίνο γαγγλιοσίδια: Ε GD2. ΣΤ GD3. Γ GM3. Η Neu5Gc-GM3. Δεδομένου ότι κάθε δομή διαφοροποιείται από την απομάκρυνση ενός ή περισσοτέρων υπολειμμάτων από GT1b, οι γλυκοσιδικές συνδέσεις που προσδιορίζονται στον GT1b εφαρμόζονται σε όλες τις δομές, συμπεριλαμβανομένων Neu5Gc-GM3. Υδατάνθρακες σύμβολα ακολουθούν την ονοματολογία της Κοινοπραξίας για Λειτουργική Glycomics [63]:

Ν

-ακετυλνευραμινικό οξύ – μοβ διαμάντι? γαλακτόζη – κίτρινο κύκλο?

Ν

-acetylgalactosamine – κίτρινο τετράγωνο? γλυκόζης – μπλε κύκλο?

Ν

-glycolylneuraminic οξύ -. Γαλάζιο διαμάντι

Η

Οι υδατάνθρακες θεωρούνται κανονικά κυττάρων-ανεξάρτητα αντιγόνα Τ, συνήθως ανίκανος να επάγει μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση [18], [19]. Ένας τρόπος για να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα είναι μέσω της ανάπτυξης μιμητικών υδατάνθρακα, ικανό να επάγει μία αντι-υδατάνθρακα ανοσολογική απόκριση. Πεπτίδια εξετάστηκαν για το σκοπό αυτό ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα των στόχων [20]. Το πεπτίδιο μιμείται του GD2 [21], [22], [23] και GD3 [24], [25] γαγγλιοζίτες έχουν ταυτοποιηθεί, τυπικά με εμφάνιση φάγου έναντι αντι-γαγγλιοσίδης αντισώματα. Ορισμένες από αυτές έχουν βρεθεί να επάγουν αντι-γαγγλιοσιδικά ανοσοαποκρίσεις [23], [25], [26]. Πεπτιδικά μιμητικά αντι-Neu5Gc-GM3 αντισώματα δεν είναι σήμερα γνωστό, ωστόσο, τα αντι-ιδιοτυπικά αντισώματα εναντίον αυτών των αντισωμάτων έχουν ταυτοποιηθεί [27], [28].

Αν και πριν δομικές μελέτες για την αναγνώριση των γαγγλιοσιδίων και έχουν μιμείται τους από αντισώματα έχουν πραγματοποιηθεί [21], [29], [30], [31], αυτές έχουν γενικά χρησιμοποιούνται απλές μεθοδολογίες μοριακής σύνδεσης. Έχουμε αναπτύξει προηγουμένως την τεχνική χαρτογράφησης site, το οποίο έχουμε δείξει ότι είναι αποτελεσματικές για τη μελέτη υδατάνθρακα-αντισώματος [32], [33] και υδατανθράκων λεκτίνη αναγνώρισης [34], όπως επίσης και το πεπτίδιο-αντισώματος αναγνώρισης [35], [36 ], [37], [38]. Εδώ, αξιολογούμε μια σειρά προγραμμάτων μοριακών σύνδεσης για την ικανότητά τους να προβλέψουν τις δεσμευτικές λειτουργίες των όξινων σακχάρων σε αντισώματα και να εφαρμόσει την τεχνική χαρτογράφησης site μας για να μελετήσουμε την αναγνώριση αντισώματος των όξινων σακχάρων (Πίνακας 1). Η υπολογιστική προσέγγιση πλέον κατάλληλη για τις περιπτώσεις επικύρωσης στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να διερευνήσει την αναγνώριση των υδατανθράκων επιτόπων των γαγγλιοσιδίων από τέσσερις αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα: R24, ME36.1, chP3 και 14F7 (Πίνακας 2). Ενώ υπάρχουν πειραματικά λύνονται μητρική δομές όλων των αντισωμάτων που ενδιαφέρουν είναι διαθέσιμα, η δομή του ενός από αυτά τα αντισώματα, chP3, λείπει ένα μικρό τμήμα του κλειδιού βρόχου HCDR3. Έτσι έχουμε επεκταθεί η τεχνική χαρτογράφησης site για να εξετάσει πολλαπλές διαμορφομερή πρωτεΐνη, σε μια διαδικασία που ονομάζεται «δυναμική χαρτογράφηση χώρο». Τέλος, η τεχνική χαρτογράφησης θέση χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση αναγνώριση αντισώματος της γαγγλιοσιδίου-μιμητικά πεπτίδια, η οποία συγκρίνεται με την αναγνώριση των καθοριστικών παραγόντων υδατανθράκων των γαγγλιοσιδίων.

Η

Μέθοδοι

Validation και τα συστήματα δοκιμών

Για την επικύρωση της μεθόδου, συγκροτήματα υψηλής ανάλυσης (& lt? 2.5 α) της αντιχλαμυδιακή αντισώματα S25-2, S73-2 και S25-39 με πολυ-Kdo (ketodeoxyoctulosonic οξύ) ελήφθησαν αντιγόνα από το Protein Data Bank (PDB) (Πίνακας 1). Τα συστήματα δοκιμών εξετάζονται οι (αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα και συνδέτες τους) συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Αντισώματα ήταν αριθμημένα και CDRs ορίζονται μετά το μοναδικό σύστημα αρίθμησης IMGT [39].

Μοριακή βάση σύνδεσης

Glide 5.6 [40], [41], GOLD 4.1.1 [42], ΑυΤΌϋΟΟΚ 4.2 [43] και DOCK 6.4 [44] αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να αναπαράγουν το κρυσταλλογραφικό τρόπος συνδέσεως σε καθένα από τα συστήματα επικύρωσης. Οι ρυθμίσεις που χρησιμοποιούνται για τα προγράμματα αυτά αναφέρονται λεπτομερώς αλλού [34], [45]. Εν συντομία, οι συνδετήρες υποβλήθηκαν σε αγωγή με ευελιξία από κάθε πρόγραμμα σύνδεσης, με την εξαίρεση των δακτυλίων πυρανόζης, οι οποίες διατηρούνται σε διαμορφώσεις καρέκλα. Στις περιπτώσεις επικύρωσης, όλες οι κρυσταλλογραφικές νερά και μόρια ρυθμιστικού, καθώς επίσης και ιόντα, απομακρύνθηκαν από τις δομές. Η πρωτεΐνη Wizard Προετοιμασία στο Maestro 9.2 [46] χρησιμοποιήθηκε για να προσθέσετε υδρογόνων και να καθορίσει τις πιο πιθανές πρωτονίωση κράτη της ογκομετρουμένων υπολειμμάτων πρωτεϊνών σε όλες τις περιπτώσεις.

χαρτογράφηση ιστοσελίδας

εφαρμόστηκε η διαδικασία χαρτογράφησης ιστοσελίδα στα συστήματα δοκιμής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στο top 100 κατετάγη πόζες που λαμβάνονται από τη μοριακή βάση για αντιστοιχούσε, σύμφωνα με το υπόλειμμα πρωτεΐνη με την οποία συνέβησαν και το είδος της αλληλεπίδρασης που λαμβάνει χώρα (δηλαδή, δεσμός υδρογόνου ή van der Waals αλληλεπίδραση). Οι Ετικέτα κανονικοποιήθηκε με διαίρεση του αριθμού των αλληλεπιδράσεων που παρατηρήθηκαν με ιδιαίτερη υπόλειμμα με το συνολικό αριθμό των αλληλεπιδράσεων που παρατηρήθηκαν. Κανονικοποίηση γίνεται ξεχωριστά για δεσμούς υδρογόνου και van der Waals αλληλεπιδράσεις. Οι κανονικοποιημένες Ετικέτα ταξινομημένο από τη μεγαλύτερη σε τουλάχιστον συνεισφορά, και το άθροισμα υπολογίζεται. Όλα τα υπόλοιπα που εμφανίζονται πάνω από ένα συγκεκριμένο άθροισμα αποκοπής θεωρείται σημαντική για την αναγνώριση.

Οι μετρήσεις της αναπαραγωγής και της ορθότητας χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ποιότητας χάρτη της τοποθεσίας. Η αναπαραγωγή υπολογίζεται ως ο αριθμός των κρυσταλλογραφικών αλληλεπιδράσεων που προσδιορίζονται από το χάρτη της ιστοσελίδας διαιρείται με τον αριθμό των κρυσταλλογραφικών αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν. Ορθότητα υπολογίζεται ως ο αριθμός των κρυσταλλογραφικών αλληλεπιδράσεων που προσδιορίζονται από το χάρτη της τοποθεσίας διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των χαρτογραφηθεί αλληλεπιδράσεων. Αναπαραγωγή και την ορθότητα τιμές γύρω στο ένα δείχνουν ότι η παραγόμενη ιστοσελίδα χάρτες προσδιορίσει με ακρίβεια τις κρυσταλλογραφικές αλληλεπιδράσεις, χωρίς τη συμπερίληψη των εσφαλμένων επαφών. Το προϊόν της αναπαραγωγής και της ορθότητας χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ποιότητας της χαρτογράφησης? μεγαλύτερες τιμές δείχνουν βέλτιστη αναπαραγωγή και την ορθότητα. Το σωρευτικό ποσό αποκοπής βελτιστοποιήθηκε για τα συστήματα επικύρωσης από την εκτίμηση της μέσης προϊόν της αναπαραγωγής και της ορθότητας σε διαστήματα αποκοπής 10% από 0-100%. Η οριακή τιμή που προβλέπεται το μεγαλύτερο μέσο όρο προϊόν για τη σειρά των περιπτώσεων επικύρωσης (Πίνακας 1) εφαρμόστηκε για τη διερεύνηση της αναγνώρισης των γαγγλιοζιτών και γαγγλιοσιδίου-μιμητικά πεπτίδια από τα επιλεγμένα αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα (Πίνακας 2).

Δυναμική ιστοσελίδα χαρτογράφηση

τα τρία υπολείμματα του βρόχου HCDR3 λείπει από τη δομή του chP3 (ΠΣΠ 3IU4) [30]. Η λείπει τμήμα χειρονακτικά κατασκευαστεί, και χαμηλής ενέργειας διαμορφομερών αυτού του τμήματος, καθώς και το υπόλειμμα δίπλα σε κάθε πλευρά του λείπουν τμήματος (ήτοι συνολικά πέντε υπολείμματα), δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο τελειοποίηση βρόχο Prime [47]. Η διαδικασία χαρτογράφησης θέση (βλέπε παραπάνω) διεξήχθη επί δέκα χαμηλότερη ενεργειακή διαμορφομερή. Η πιο πιθανή διαμορφομερές από το σύνολο επιλέχθηκε με βάση την ομοιότητά του με το μουσικό σύνολο μέσος όρος της δέσμευσης υδρογόνου και van der Waals χάρτες τοποθεσία. Το σύνολο μέσος χάρτες υπολογίστηκαν με το μέσο όρο των εισφορών αλληλεπίδραση του κάθε χαρτογραφηθεί υπολείμματος σε όλη τη σειρά των δέκα διαμορφομερών. Η ομοιότητα του site κάθε διαμορφωτή Χάρτες για το σύνολο μέσο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη έκφραση: όπου

μια

είναι το κατώφλι για την επιλογή των σημαντικών επαφών δεσμού υδρογόνου (ως κλάσμα),

b

είναι η τιμή αποκοπής για την επιλογή σημαντικών van der Waals επαφές (ως κλάσμα),

r

2

HB

είναι ο συντελεστής συσχέτισης υπολογίζεται μεταξύ ενός συγκεκριμένου διαμορφωτή και το σύνολο μέσο για τις επαφές δεσμών υδρογόνου, και

r

2

VDW

είναι ο συντελεστής συσχέτισης υπολογίζεται μεταξύ ενός συγκεκριμένου διαμορφωτή και το σύνολο μέσο όρο για van der Waals επαφές. Το διαμορφομερές που παρουσιάζει την υψηλότερη ομοιότητα με τις μέσες σύνολο χάρτες επιλέχθηκε ως το πιο πιθανό διαμορφωτή.

Peptide μιμητισμό των γαγγλιοσιδίων

γαγγλιοσίδης-μιμητικά πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε επικαλυπτόμενα θραύσματα εξαπεπτίδιο και ελλιμενίζεται στο αντίσωμα στόχους χρησιμοποιώντας GOLD. Η τεχνική χαρτογράφησης ιστοσελίδα (βλέπε παραπάνω) εφαρμόστηκε σε προκύπτουν σύνολα της πόζες. Τα δεδομένα αλληλεπίδρασης για το σύνολο των εξαπεπτιδίων συγκεντρώθηκε για να δώσει ένα σύνολο χάρτες του τόπου για τα πλήρη πεπτίδια, όπως περιγράφεται παραπάνω [36].

Σύγκριση γαγγλιοσίδη και μιμούνται αναγνώριση

Για να συγκρίνετε το αναγνώριση των γαγγλιοζιτών και πεπτίδιο που βασίζεται μιμείται τους, διαγράμματα διασποράς συγκρίνοντας τις εισφορές αλληλεπίδραση των υπολειμμάτων αντισώματος σε αναγνώριση του γαγγλιοσιδίου και μιμούνται αναγνώριση παρήχθησαν. Η απόσταση ανάμεσα σε κάθε σημείο και τη γραμμή που αντιπροσωπεύει την ισοδυναμία των γαγγλιοσίδη και μιμούνται αναγνώριση (

δ

) υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Θετική

δ

τιμές δείχνουν μια αύξηση του αριθμού των αλληλεπιδράσεων από την εν λόγω καταλοίπων με τον μιμούνται, ενώ οι αρνητικές

δ

τιμές δείχνουν πιο αλληλεπιδράσεις με το γαγγλιοζίτη. Υπολείμματα με

δ

μεγαλύτερη από μία απόλυτη τιμή των 3,00 θεωρήθηκαν να διαφέρουν σημαντικά από τη γραμμή της ισοδυναμίας.

Αποτελέσματα

Μοριακή βάση για την αξιολόγηση

Πολλά μοριακή προγράμματα σύνδεσης αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να προβλέψουν το κρυσταλλογραφικό τρόπος συνδέσεως μιας σειράς αντιχλαμυδιακό αντισωμάτων σε σύμπλεγμα με αντιγόνα πολυ-Kdo (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα της αξιολόγησης μοριακή βάση για να αποδείξει ότι τα περισσότερα προγράμματα είναι γενικά ανεπιτυχής στην ακρίβεια κατάταξη την κρυσταλλογραφική λειτουργία δέσμευσης (Πίνακας 3). Ωστόσο, όλα τα προγράμματα ήταν σε θέση να προσδιορίσει τη σωστή λειτουργία δέσμευσης (δηλαδή, λιγότερο από 2,0 Α rmsd μεταξύ πόζα και τον τρόπο δεσμευτικό κρυσταλλογραφική) για τουλάχιστον μία περίπτωση, ανεξάρτητα από την κατάταξη. Η εξαίρεση σε αυτό είναι GOLD, το οποίο ήταν σε θέση να προσδιορίσουν με ακρίβεια τόσο και τάξη, όπως η κορυφή θέτουν, τη σωστή λειτουργία δέσμευσης σε τέσσερις περιπτώσεις, αυτά είναι όλα τα S73-2 συγκροτήματα (κωδικοί ΠΣΠ 3HZK, 3HZV και 3HZY), και το συγκρότημα του S25-39 με Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll) (ΠΣΠ 3OKK). Δύο από αυτές τις επιτυχημένες περιπτώσεις παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. Γενικά, η αύξηση του μεγέθους και της ευελιξίας της ορίζουσας υδατανθράκων εξετάζονται οδήγησε σε μειωμένη προβλέψεις για την ποιότητα. Επιπλέον, η σύνδεση τοπογραφία site μπορεί επίσης να επηρεάσει την ποιότητα των προβλέψεων, όπως παρατηρήθηκε στο παρελθόν [45], ωστόσο, πολύ λίγοι κατάλληλη συγκροτήματα μοντέλο είναι διαθέσιμο για να το επιβεβαιώσει.

Α. Σύγκριση των top κατατάσσονται πόζα που λαμβάνεται από το μοριακό docking (κίτρινο) με την κρυσταλλογραφική λειτουργία σύνδεσης (μπλε) του Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S25-39 συγκρότημα (ΠΠ 3OKK). B. Σύγκριση κορυφαία πόζα (κίτρινο) που λαμβάνεται από τη μοριακή βάση για την κρυσταλλογραφική λειτουργία σύνδεσης (μπλε) του Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S73-2 συγκρότημα (ΠΠ 3HZV ). Γ Σχηματική αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων στην Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S25-39 προβλέπεται από το μοριακό docking. Δ Σχηματική αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων στην Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll): S73-2 συγκρότημα. Μοριακή βάση σύνδεσης διεξάγονται χρησιμοποιώντας GOLD 4.1.1. Τα Σχήματα 2Α και 2Β παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας PyMOL [64]. Τα Σχήματα 2C και 2D παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας LIGPLOT [65]. Υπόμνημα με τα σχήματα 2C και 2D: δεσμούς υδρογόνου – πράσινο παύλες? υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις – κόκκινο τόξα? άνθρακα – μαύρο? οξυγόνου – κόκκινο? αζώτου – μπλε? συνδέτη ομόλογα – μοβ? πρωτεΐνη ομόλογα -. πορτοκαλί

Η

Βελτιστοποίηση της χαρτογράφησης ιστοσελίδα για την αναγνώριση αντισώματος των όξινων σακχάρων

Δεδομένου ότι ο χρυσός παράγεται τις πιο ακριβείς στάσεις, ανεξάρτητα από την ικανότητα να ταξινομήσει αυτές τις πόζες, χρησιμοποιήθηκε για να παρέχει την πόζα σύνολο εισόδου για τη χαρτογράφηση ιστοσελίδα. Ένα άθροισμα αποκοπής 80% και για τις δύο δεσμούς υδρογόνου και van der Waals αλληλεπιδράσεις έχει αποδειχθεί ότι είναι βέλτιστη όταν αντισώματα αντι-υδατάνθρακα χαρτογράφηση τόπου, όπου μικρότερες, λιγότερο ευέλικτα και λιγότερο λειτουργικά θεωρήθηκαν ποικιλόμορφη υδατάνθρακες [32]. Αυτό αποκοπής έχει επίσης εφαρμοστεί με επιτυχία σε αντισώματα πεπτιδίου αναγνωρίζουν και υδατανθράκων λεκτίνη αλληλεπιδράσεις [34], [36]. Για να προσδιοριστεί αν αυτή η αποκοπής ήταν κατάλληλη για τη μελέτη της αναγνώρισης του αντισώματος των όξινων σακχάρων με ιδιαίτερα ευέλικτο δεσμούς (δηλαδή, (1 → 6) ή (2 → 8) διασυνδέσεις), ένα εύρος τιμών αποκοπής διερευνήθηκε (Πίνακας S1). Η αποκοπή του 90% βρέθηκε να είναι πιο συνεπής, αποδίδοντας ένα χαμηλότερο τυπική απόκλιση στα δεδομένα του προϊόντος (δηλαδή, η αναπαραγωγή × ορθότητα) που ελήφθη για το σύνολο των περιπτώσεων (S.D. = 0,05). Το 80% αποκοπής έδωσε ένα πανομοιότυπο μέσο για την αποκοπή του 90% σε όλη την σειρά που μελετήθηκαν περιπτώσεις, αλλά ήταν ελαφρώς μικρότερη από το σύμφωνο αποκοπής 90% (S.D. = 0,08). Ωστόσο, η χρήση της αποκοπής του 90% οδήγησε σε σχετικά κακή ορθότητα χάρτη (~0.5-0.6) σε σύγκριση με προηγούμενες υποθέσεις [32], [34], [36]. Αυτό το χαμηλό επίπεδο του χάρτη ορθότητα μπορεί να αποδοθεί στη συμπερίληψη πολλών εσφαλμένων van der Waals επαφές.

Για να βελτιστοποιηθεί η επιλογή των αλληλεπιδρώντων υπολειμμάτων, δεσμούς υδρογόνου και van der Waals επαφές θεωρήθηκαν με ξεχωριστό αποκοπές, αντί του ίδιου αποκοπής για κάθε τύπο αλληλεπίδρασης, όπως χρησιμοποιείται προηγουμένως [32], [34], [36]. Όταν δεσμό υδρογόνου θεωρήθηκε μόνο, η αποκοπή του 90% βρέθηκε να είναι η βέλτιστη για το εύρος των πειραματικών συστημάτων (Πίνακας S2) και έδωσαν ανώτερα αποτελέσματα στην εξέταση τόσο δεσμούς υδρογόνου και van der Waals με τον ίδιο αποκοπής. Εξέταση ορισμένων van der Waals επαφές είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό αλληλεπιδράσεων με μη πολικές πλευρικές αλυσίδες. Διαπιστώθηκε ότι ένας αποκοπής 40% για van der Waals επαφές, σε συνδυασμό με αποκοπή 90% για τις αλληλεπιδράσεις δεσμού υδρογόνου, με την προϋπόθεση η βέλτιστη πρόβλεψη κρυσταλλογραφικές επαφές (Πίνακας S3).

Χρησιμοποιώντας αυτό το βελτιστοποιημένο αποκοπής του, αποδείχθηκε ότι χαρτογράφηση θέση και η κορυφή ενέχουν λαμβάνεται από μοριακή βάση σύνδεσης εκτελείται συγκριτικά κατά την πρόβλεψη αλληλεπίδρασης καταλοίπων (Σχήμα 3, Πίνακας 4). Επιπλέον, η βελτιστοποιημένη αποκοπής προσφέρει ποιοτικό χώρο χάρτη συγκρίσιμα στην αναπαραγωγή και την ορθότητα να μελετήσει προηγουμένως με αντίσωμα και λεκτίνη-υδατάνθρακα συστήματα [32], [34].

Kdoα (2 → 4) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll) σύνδεση σε S73-2 (ΠΣΠ 3HZY) που περιγράφεται από τον χάρτη δεσμών υδρογόνου (Α) και van der Waals χάρτης αλληλεπίδρασης (Β). Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAll) σύνδεση σε S25-39 (ΠΣΠ 3OKO) που περιγράφεται από τον χάρτη δεσμών υδρογόνου (C) και van der Waals χάρτης αλληλεπίδρασης (D). Το βάθος χρώματος δείχνει το επίπεδο της συμμετοχής ενός συγκεκριμένου υπολείμματος σε αναγνώριση συνδέτη? πιο έντονα φωτίζεται κατάλοιπα συμμετέχουν περισσότερο στην αναγνώριση συνδέτη από ασθενώς φωτίζεται υπολείμματα. Η λειτουργία δέσμευσης κρυσταλλική δομή παρουσιάζεται σε κάθε δομή σε στικ χρωματίζεται από άτομο τύπο (C, κίτρινο? O, κόκκινο). Εικόνες καταστρέφονται με PyMOL [64].

Η

Δυναμική χαρτογράφηση ιστοσελίδα της chP3

Η δομή των chP3 (ΠΣΠ 31U4) λείπει τρία κατάλοιπα από το βρόχο HCDR3 [30] . Είναι γνωστό ότι τα υπολείμματα από αυτόν τον βρόγχο είναι σημαντικά για την αναγνώριση αντιγόνου από chP3. Προκειμένου να προσδιοριστεί η πλέον κατάλληλη διαμόρφωση αυτού του βρόχου, «δυναμική» χαρτογράφηση θέση του chP3, οπότε χαρτογράφηση θέση πολλαπλών διαμορφομερών chP3 – μεταβάλλοντας μόνο στην διαμόρφωση του λείπει τμήμα του βρόχου HCDR3 – διεξήχθη. Δεδομένου ότι λιγότερο από δέκα πόζες λήφθηκαν όταν ελλιμενισμού Neu5Gc-GM3 στην τέταρτη χαμηλότερη ενεργειακή διαμορφομερές της chP3 HCDR3, χαρτογράφηση τοποθεσία δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί σε αυτή τη δομή. Το ενδέκατο-χαμηλότερη ενεργειακή διαμορφομερές χρησιμοποιήθηκε αντ ‘αυτού, να κάνει μια σειρά από δέκα δομών.

Από μελέτες τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης, είναι γνωστό ότι Arg111.2H (Arg100AH ​​σε αρίθμηση Kabat) είναι κρίσιμη για την αναγνώριση γαγγλιοσιδίου [ ,,,0],30]. Συνεπώς, θα πρέπει να αναμένεται ότι το υπόλειμμα αυτό είναι σε μεγάλο βαθμό εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση αντιγόνου. Όταν η διαδικασία χαρτογράφησης θέση διεξήχθη στη χαμηλότερη ενεργειακή chP3 HCDR3 διαμορφομερές, Arg111.2H αντιπροσώπευαν μόνο 5,31% του συνόλου των παρατηρηθεί δεσμών υδρογόνου, ενώ άλλα υπολείμματα ευθύνονται για ένα σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό δεσμών υδρογόνου (Πίνακας S4). Έτσι, η κορυφαία διαμορφωτής βαθμολόγησης δεν είναι πιθανώς το πιο αντιπροσωπευτικό του βιολογικώς σχετικού κράτους. Παρόμοια χάρτες του τόπου σε αυτό παρατηρήθηκαν για το πέμπτης και ένατης χαμηλότερες δομές ενέργειας chP3. Η δεύτερη χαμηλότερη ενεργειακή chP3 HCDR3 διαμορφωτής χαρακτήρισε σχεδόν καθόλου αλληλεπιδράσεις με Arg111.2H (0,90% των δεσμών υδρογόνου και 1,34% του van der Waals αλληλεπιδράσεις), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο βρόχος είναι επίσης πιθανό να είναι σε βιολογικά άσχετο διάπλασης. Μετά την επιθεώρηση της δομής αυτής, η πλευρική αλυσίδα του Arg111.2H στοίβες με την πλευρική αλυσίδα του Trp57H, και επομένως δεν μπορεί εύκολα να αλληλεπιδρούν με το συνδετήρα (Σχήμα 4). Στο τρίτο χαμηλότερη ενεργειακή δομή, τα πιο δεσμούς υδρογόνου παρατηρήθηκαν με Arg111.2H – μόλις πάνω από το 20% όλων των δεσμών υδρογόνου. Ως εκ τούτου, η δομή αυτή είναι πιθανό να είναι αντιπροσωπευτικό του βιολογικώς σχετικού κράτους. Άλλες βασικές επαφές σε αυτή τη δομή περιλαμβάνονται Ala112.1H, His107L και Tyr108L. Η έκτη χαμηλότερη ενεργειακή δομή χαρακτήρισε Arg111.2H και Ala112.1H ως βασικό επαφές, αλλά δεν κατέχει εξέχουσα θέση τα δύο κατάλοιπα από την ελαφριά αλυσίδα, αναγνωρίζονται ως σημαντικές για αλληλεπιδράσεων στην τρίτη χαμηλότερη ενεργειακή δομή. Αντ ‘αυτού, Ser38H αναγνωρίστηκε ως κλειδί επικοινωνίας. Η όγδοη χαμηλότερη ενεργειακή δομή ήταν παρόμοια με αυτή, με ελαφρώς μεγαλύτερη έμφαση στις αλληλεπιδράσεις με His107L και Tyr108L. Στην έβδομη χαμηλότερη ενεργειακή δομή, Arg111.2H κυριάρχησε τις αλληλεπιδράσεις δεσμών υδρογόνου, που αντιπροσωπεύουν σχεδόν το ένα τρίτο του συνόλου των δεσμών υδρογόνου που παρατηρήθηκε με την εν λόγω δομή. Ωστόσο, Ala112.1H, Gln112H, His107L και Tyr108L κάθε αντιπροσώπευαν περίπου 10% του συνόλου των δεσμών υδρογόνου. Η tenth- και ενδέκατη-χαμηλότερες δομές της ενέργειας που παρέχεται παρόμοια χάρτες του τόπου σε ένα άλλο, με δεσμούς υδρογόνου αρκετά ομοιόμορφα κατανεμημένη μεταξύ Arg112.2H, Ala112.1H, Gln112H, Ala113H, His107L και Tyr108L.

Α. Η δεύτερη χαμηλότερη ενεργειακή διαμορφωτής, τονίζοντας το στοίβαγμα μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων των Arg111.2H και Trp57H. B. Η δέκατη-χαμηλότερη ενέργεια διαμορφομερές, προβλέπεται ότι θα είναι πιο πιθανό να εμπλέκονται στη σύνδεση συνδετήρα. Γ συγκόλληση υδρογόνου site map για δέκατη-χαμηλότερη ενεργειακή διαμορφωτή. Δ Η van der Waals χάρτη για δέκατη-χαμηλότερη ενεργειακή διαμορφωτή. Τα υπολείμματα που συμβάλλουν στην προτεινόμενη γαγγλιοζίτη μοτίβο σύνδεσης τόνισε στους χάρτες ιστοσελίδα δεσμούς υδρογόνου.

Η

Σε όλες τις περιπτώσεις, van der Waals επαφές κυριαρχούνταν από Trp57H και Trp116L (Πίνακας S5). Τα υπολείμματα HCDR3 – Arg111.2H, Ala112.1H και Gln112H – ήταν επίσης σημαντικό για van der Waals επαφές. Η σημασία τους είναι συνήθως ανάλογα με τη σημασία τους για το δεσμό υδρογόνου (δηλαδή, υπολείμματα τα οποία είναι έντονα σημαντικά για τη συγκόλληση του υδρογόνου είναι συνήθως έντονα σημαντικά για επαφές van der Waals).

Κατά την ανάλυση των δημιουργούνται χάρτες του τόπου, διαπιστώθηκε ότι η chP3 διαμορφωτής πιο αντιπροσωπευτικό της μέσης κράτους ήταν το δέκατο-κατετάγη διαμορφωτής (Σχήμα 4, Πίνακας 5). Αυτό διαμορφωτής διαθέτει σημαντικό δεσμό υδρογόνου με Arg111.2H, είναι γνωστό ότι είναι σημαντικό για την αναγνώριση από μελέτες μεταλλαξιγένεσης κατευθυνόμενης σε θέση, αλλά προτείνει επίσης τη σημασία των γειτονικών καταλοίπων HCDR3 (Ala112.1H, Gln112H, Ala113H) και τα υπολείμματα LCDR3 His107L και Tyr108L. Οι αλληλεπιδράσεις van der Waals συμβεί σε μεγάλο βαθμό με τρυπτοφάνη κατάλοιπα στις θέσεις 57 ώρες και 116L. Αυτή η αξιοποίηση υπολειμμάτων είναι παρόμοιο με άλλα αντισώματα αντι-υδατάνθρακες [32].

Η

Προσδιορισμός των πιθανών γαγγλιοζίτη-αναγνωρίζοντας μοτίβο

Είχαμε διερευνηθεί αναγνώριση γαγγλιοζίτη από τα τέσσερα αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα (Πίνακας 2) χρησιμοποιώντας ταυτόσημες δεσμούς υδρογόνου και van der Waals αποκοπές, σύμφωνα με προηγούμενες εργασίες μας [20], [32], [34], και αυτό που προσδιορίζονται μερικά από τα υπολείμματα που ενδέχεται να εμπλέκονται στην αναγνώριση γαγγλιοσιδίου [48]. Για να επιβεβαιώσετε τα αποτελέσματα αυτής της προκαταρκτικής μελέτης, οι περιπτώσεις αυτές έχουν πλέον επανεξεταστεί χρησιμοποιώντας τις βελτιστοποιημένες τιμές αποκοπής. Τα αντίστοιχα επίτοπα υδατάνθρακα των γαγγλιοζιτών έχουν ελλιμενίζεται σε R24, ME36.1 και 14F7, καθώς και οι βελτιστοποιημένες αποκοπές εφαρμόστηκαν για να ταυτοποιηθούν υπολείμματα πιθανό αντίσωμα που εμπλέκονται στην αναγνώριση γαγγλιοσιδίου. Τα παραγόμενα χάρτες του τόπου, καθώς και εκείνη που παράγεται από τη δυναμική διαδικασία χαρτογράφησης εφαρμοστεί σε chP3, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της παρουσίας ενός πιθανού μοτίβου γαγγλιοσίδης δέσμευσης των αντι-γαγγλιοσιδικά αντισώματα. Τα βασικά κατάλοιπα που εμπλέκονται στην αναγνώριση γαγγλιοσιδίου συνοψίζονται στον Πίνακα 6.

Η

αναγνώριση γαγγλιοσίδης από τα αντισώματα γενικά κυριαρχείται από αλληλεπιδράσεις με την βαριά αλυσίδα (Σχήματα 4 και 5). Στις περιπτώσεις των mAbs R24 και 14F7, αναγνώριση ήταν εξαρτάται εξ ολοκλήρου από υπολείμματα βαριάς αλυσίδας, ενώ για mAbs ME36.1 και chP3, περίπου το ένα τρίτο όλων των αλληλεπιδράσεων συνέβη με κατάλοιπα ελαφράς αλύσου. Αυτές οι διαφορές στην χρησιμοποίηση CDR μπορεί να εξηγηθεί από την άποψη των δεσμευτικών τοπογραφιών θέση του καθενός από τα αντισώματα? οι δεσμευτικές κοιλότητες των R24 και 14F7 και οι δύο αποτελούνται εξ ολοκλήρου από υπολείμματα βαριάς αλυσίδας, με πρόσβαση στα LCDRs μπλοκαριστεί από HCDR2.

συγκόλληση υδρογόνου και van der Waals χάρτες ιστοσελίδα του R24 (Α και Β), ME36.1 (Γ και Δ) και 14F7 (Ε και F). Τα υπολείμματα που συμβάλλουν στην πιθανή γαγγλιοζίτη μοτίβο σύνδεσης επισημαίνονται στους χάρτες ιστοσελίδα δεσμούς υδρογόνου.

Η

Παρά τις διαφορές στην πρόσδεση τοπογραφίες site, υπάρχουν βασικές ομοιότητες μεταξύ των αντισωμάτων τα οποία γίνονται εμφανή με την δομική εξέταση των χάρτες του τόπου. Τέσσερα κατάλοιπα, τοποθετημένα σε ένα σχετικά παρόμοιες «σπείρα» γύρω από κάθε θέση σύνδεσης αντισώματος, είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνες για αλληλεπιδράσεις σύνδεσης υδρογόνου με τα γαγγλιοσίδια. Προχωρώντας προς τα δεξιά, η πιθανή γαγγλιοσίδιο μοτίβο σύνδεσης των αντισωμάτων antiganglioside περιλαμβάνει δύο πολικά υπολείμματα (τυπικά Ser, ακολουθούμενη από Tyr, Thr ή Asp), ένα αρωματικό κατάλοιπο (τυπικά Tyr) και ένα βασικό υπόλειμμα (Arg). Δεν είναι όλα τα αντισώματα είναι απολύτως σύμφωνες με αυτό το μοτίβο? για παράδειγμα, R24 διαθέτει ένα υπόλειμμα θρεονίνης, όπου θα πρέπει να αναμένεται μια αργινίνη, και chP3 διαθέτει ένα υπόλειμμα αλανίνης, όπου θα πρέπει να αναμένεται μια σερίνη

Το πεπτίδιο μιμητισμό των γαγγλιοσιδίων

Το πεπτίδιο μιμούνται των GD3. – RHAYRSMAEWGFLYS – θα μπορούσε να αναπαράγουν το σύνολο σχεδόν των van der Waals αλληλεπιδράσεις γίνονται από τον γαγγλιοζίτη με R24, αλλά μερικές σημαντικές διαφορές στο προφίλ δεσμούς υδρογόνου συνέβη (Πίνακας S6). Οι χάρτες αποκάλυψαν ότι το πεπτίδιο απέτυχε να αναπαράγουν τον αριθμό των δεσμών υδρογόνου μεταξύ τρισακχαρίτη GD3 και τις Gly38H υπολείμματα αντισώματος και Ser58H. Ωστόσο, μια σημαντική αύξηση σε δεσμούς υδρογόνου με το HCDR3 υπολείμματα, Tyr113H και Tyr114H, παρατηρήθηκε. Το μειωμένο δυναμικό του πεπτιδίου να βαθιά και με συνέπεια να διεισδύσουν την θέση δέσμευσης σε όλη την πόζα σύνολο μπορεί να εξηγήσει γιατί λιγότερες αλληλεπιδράσεις παρατηρήθηκαν με Gly38H και Ser58H. Tyr113H και Tyr114H μπορούν να αντέξουν οικονομικά περισσότερο αλληλεπιδράσεις με το πεπτίδιο, δεδομένου ότι είναι πιο εύκολα προσβάσιμα. Από τη σύγκριση της ganglioside- και χάρτες του τόπου πεπτίδιο προερχόμενο (Σχήμα 6), το πεπτίδιο φαίνεται να είναι μια μερική δομική μιμούνται του GD3 [20]. Αυτή η μερική δομική μίμηση θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη ανοσολογική μιμητισμός των GD3 από αυτό το πεπτίδιο [25].

Α. δεσμούς υδρογόνου site map περιγράφουν πεπτίδιο (RHAYRSMAEWGFLYS) αναγνώριση από R24. B. van der Waals ιστοσελίδα αλληλεπίδραση χάρτη που περιγράφει την αναγνώριση του πεπτιδίου από R24. Χάρτες του τόπου που δημιουργούνται και καταστρέφονται με PyMOL [64]. Γ Σύγκριση του site δεσμών υδρογόνου χάρτες που περιγράφουν GD3 και την αναγνώριση του πεπτιδίου. Δ Σύγκριση van der Waals ιστοσελίδα χάρτες που περιγράφουν GD3 και την αναγνώριση του πεπτιδίου. Στα Σχήματα 6C και 6D, ανοικτά σημεία που δείχνουν τα υπολείμματα που αποκλίνουν σημαντικά από τη γραμμή που αντιπροσωπεύει την ισοδυναμία των υδατανθράκων και του πεπτιδίου αλληλεπιδράσεις (δηλαδή,