Αφηρημένο

Λόγω της ικανότητάς της να ρυθμίζει τη σύνθεση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ), το πλέγμα χοριοειδούς (CP) είναι ιδανική για να υποκινήσει μια ταχεία ανταπόκριση σε κρανιοεγκεφαλική κάκωση (ΚΕΚ) με την προσκόμιση της ανάπτυξης ρυθμιστικών πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, καρκίνο του οισοφάγου σχετίζεται με το γονίδιο-4 (Ecrg4) είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο που κωδικοποιεί μια ορμόνη που ομοιάζει πεπτίδιο που ονομάζεται augurin ότι είναι παρούσα σε μεγάλες συγκεντρώσεις σε CP επιθήλια (CPE). Επειδή augurin θεωρείται ότι ρυθμίζει τη γήρανση, την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση neuroprogenitor στο ΚΝΣ, αξιολογήσαμε την κινητική της έκφρασης Ecrg4 και augurin ανοσοαντιδραστικότητα σε CPE μετά από τραυματισμό του ΚΝΣ. Ενήλικες αρουραίοι τραυματίστηκαν με ένα διεισδυτικό του φλοιού αλλοίωσης και μεταβολές στην augurin ανοσοαντιδραστικότητα εξετάστηκαν με ανοσοϊστοχημεία. γονιδιακή έκφραση Ecrg4 χαρακτηρίστηκε από

in situ υβριδισμού

. επιφάνεια του κυττάρου augurin ταυτίστηκε ιστολογικά με ομοεστιακή μικροσκοπία και βιοχημικά από υπο-κυτταρική κλασματοποίηση. Τόσο γονιδιακή έκφραση Ecrg4 και augurin επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν 24-72 ώρες μετά τον τραυματισμό, αλλά αποκατασταθεί μη τραυματισμένα επίπεδα από την ημέρα 7 μετά τον τραυματισμό. χρώση πρωτεΐνης στο supraoptic πυρήνα του υποθαλάμου, που χρησιμοποιείται ως μία περιοχή του εγκεφάλου ελέγχου, δεν δείχνουν μείωση του auguin ανοσοαντιδραστικότητας. γονιδιακής έκφρασης Ecrg4 εντοπίζεται στα κύτταρα CPE, και augurin πρωτεΐνης στο CPE κοιλιακή πρόσωπο. Εξωκυτταρική κυτταρικής επιφάνειας πρόσδεση της 14ης augurin kDa επιβεβαιώθηκε με κυτταρική επιφάνεια κλασμάτωση πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων CPE in vitro, ενώ ένα θραύσμα 6-8 kDa του augurin ανιχνεύθηκε σε ρυθμισμένα μέσα, υποδεικνύοντας απελευθέρωση από την κυτταρική επιφάνεια με πρωτεολυτική επεξεργασία. Σε ΚΠΣ αρουραίο, ωστόσο, 14 augurin kDa ανιχνεύθηκε. Υποθέτουμε η αρχική απελευθέρωση και πρωτεολυτική επεξεργασία του augurin συμμετέχει στη φάση ενεργοποίησης της ζημίας ενώ υπέστη Ecrg4 κάτω ρύθμιση είναι dysinhibitory κατά τη διάρκεια της πολλαπλασιαστικής φάσης. Κατά συνέπεια, augurin θα παίξουν συστατική ανασταλτική λειτουργία στην κανονική του ΚΝΣ, ενώ κάτω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Ecrg4 σε τραυματισμό, όπως στον καρκίνο, dysinhibits πολλαπλασιασμό

Παράθεση:. Podvin S, Γκονζάλες AM, Miller MC, Dang Χ, Botfield Η, Donahue JE, et al. (2011) καρκίνο του οισοφάγου Σχετικές Gene-4 είναι ένα χοριοειδούς πλέγματος-Προέρχεται Τραυματισμός Response Gene: Αποδεικτικά στοιχεία για μια διφασική ανταπόκριση στην Πρώιμη και Ύστερη εγκεφαλική βλάβη. PLoS ONE 6 (9): e24609. doi: 10.1371 /journal.pone.0024609

Επιμέλεια: Colin Combs, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Ντακότα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 14 του Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Podvin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Δρ. Podvin υποστηρίζεται από μια Mentored Νέων Ερευνητών Βραβείο από την Hydrocephalus Association (www.hydroassoc.org). Ο Δρ Baird, ο Δρ Eliceiri και ο Δρ Coimbra υποστηρίζονται από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (www.nih.gov) P20 Διερευνητικές Κέντρο επιχορήγησης για τους επίδοξους Healing έρευνα από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών (www.nigms .nih.gov? P20 GM078421) και υποστηρίζεται επίσης από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) EY018479 (Δρ Baird), (ΝΙΗ) HL073396 (Δρ Eliceiri) και από συμπληρωματική χρηματοδότηση μέσω της αμερικανικής Ανάκτηση και Επανεπένδυση Πράξη (ARRA ). Καμία εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για αυτές τις μελέτες για το Δρ Μίλερ, ο Δρ Dang, ο Δρ Ντόναχιου, Dr. Rossi και Δρ ΣΤΟΠΑ. Conrad Johanson υποστηρίζεται από ΝΙΗ AG027910. Όλες οι μελέτες που διεξήχθησαν στο Πανεπιστήμιο του Μπέρμιγχαμ από τον Δρ Γκονζάλες, ο Δρ Botfield, Δρ Boissaud-Cooke και ο Δρ Leadbeater χρηματοδοτήθηκαν από μια επιχορήγηση από την Σχολή της Κλινικής και Πειραματικής Ιατρικής, Κολέγιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένο Βασίλειο (www.medicine.bham.ac.uk). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τραυματική βλάβη του εγκεφάλου (ΤΒΙ) συχνά συνδέεται με κακή κλινική έκβαση επειδή ένας πάνω πληθωρικός φλεγμονώδη απόκριση μπορεί να προκαλέσει ακούσια βλάβη τόσο τραυματίες και μη τραυματισμένα κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) των ιστών [1]. Επιπλέον, υπάρχουν βιοφυσικές αλλαγές στο ΚΝΣ που περιορίζουν λειτουργικές ανακτήσεις. Για παράδειγμα, ο σχηματισμός ενός νευρογλοιακών ουλή μετά από τραυματισμό προστατεύει τους νευρώνες από διεγερτική τοξική παράγοντες [1], [2], αλλά μπλοκ συναπτική εκ νέου ανάπτυξη και neuroprogenitor κυτταρική διήθηση από την υποκοιλιακή ζώνη (SVZ) [3]. Επιπλέον, το οίδημα μπορεί να διαταράξει αίματος-εγκεφάλου (ΒΒΒ) και υγρό αίμα-εγκεφαλονωτιαίο (BCSFB) εμποδίων, τη συμπίεση του εγκεφαλικού παρεγχύματος [4] και το συμβιβασμό του ενδοθηλίου, χοριοειδούς επιθηλιακά πλέγμα (CPE), κοιλιακή ependymal (Ve) και τα κύτταρα υπαραχνοειδή (Α.Ε.), η οποία συνήθως φιλτράρουν τις τοξίνες από το διάμεσο υγρό, διατηρούν την ιοντική ισορροπία του ΚΠΣ, και εκκρίνουν ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες για τη διατήρηση της ομοιόστασης του ΚΝΣ [5].

το CPE ιδίως υποφέρει μοναδικές μεταβολικές και τις διαρθρωτικές τάσεις κατά τη διάρκεια της οξείας στάδια του ΚΝΣ τραυματισμό, οι οποίες περιορίζουν τις λειτουργίες που διαφορετικά θα αποκατάσταση της ομοιόστασης κατά τη διάρκεια της επισκευής. Για παράδειγμα, αγγειογενές οίδημα μετά από τραυματισμό αυξάνει τον όγκο του εξωκυτταρικό διαμέρισμα υγρού και προκαλεί κοιλιομεγαλία. Η προκύπτουσα μηχανική καταπόνηση [6] και την εισβολή των ουδετερόφιλων [7] να αυξήσει διαρροή των BCSFB σφιχτά κόμβων και αποκόλληση του κορυφαίου βλεφαρίδες από τη CPE και Ve κύτταρα. Επιπλέον, διαταράσσεται στενοσυνδέσεων βλάψουν πρωτεΐνη υπερδιήθηση και να οδηγήσει σε αυξημένη χύδην και οσμωτική ροή του νερού μέσα CSF [8], [9], [10].

Μεταξύ των πεπτιδίων που παράγονται στην, και ρυθμίζεται από το CPE [11], [12], augurin είναι ένα πρόσφατα περιγράφεται ορμόνη-όπως πρωτεΐνη που παράγεται μετά πρωτεολυτική επεξεργασία του

σχετίζεται με το γονίδιο-4

(Ecrg4) ολοπρωτεΐνης [13] και πιστεύεται ότι παίζει ένα καρκίνο του οισοφάγου ρόλο στην ομοιόσταση του ΚΝΣ [14], [15]. Προηγούμενες εκθέσεις [15] έχουν δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Ecrg4 στο ΚΝΣ είναι υψηλότερα στην CPE και επένδυμα τόσο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (www.genepaint.org [16]) και στον ενήλικο ΚΝΣ (www.brain-map.org [17] ) και πρότειναν ένα πιθανό ρόλο augurin το προϊόν της στην ομοιόσταση του ΚΝΣ. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από τις παρατηρήσεις μας ότι knockdown της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της Ecrg4 zebrafish ανάπτυξη επαγόμενο κυτταρικό υπερ-πολλαπλασιασμό στον αναπτυσσόμενο ΚΝΣ και δημιούργησε ένα κοιλιομεγαλία φαινότυπο. Σε αντίθεση, Ecrg4 υπερέκφραση σε ενήλικα εγκέφαλο αρουραίου μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων στην SVZ πισίνα ενήλικων κυττάρων neuroprogenitor κατόπιν φλοιώδη μοντέλο μαχαιριά τραυματισμού του ΚΝΣ [14].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι υπάρχει μια ταχεία απώλεια τόσο augurin και την έκφραση του γονιδίου Ecrg4 στο CPE μετά από τραυματισμό του ΚΝΣ. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι augurin παίζει συστατική ανασταλτική λειτουργία στην κανονική του ΚΝΣ και ότι η ταχεία απελευθέρωση της από και την επακόλουθη εξαφάνιση από το CPE μετά τον τραυματισμό μπορεί να βοηθήσει σκανδάλη και να διατηρήσουν την ανταπόκριση του ΚΝΣ σε τραυματισμό, επιτρέποντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Αποτελέσματα

augurin είναι μία πρωτεΐνη κυτταρικής μεμβράνης

ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των augurin σε περικοιλιακή περιοχές του εγκεφάλου (Σχήμα 1Α, κόκκινο) έδειξε ότι, σε πολλές περιπτώσεις, η μεγαλύτερη ένταση augurin ανοσοσήμανση ήταν πολωμένο (βέλος) με σημαντική χρώση εντοπισμού στην κοιλιακή πλευρά των κυττάρων CPE (κόκκινη χρώση σε σύγκριση με DAPI πυρηνική χρώση με μπλε χρώμα). Επιπλέον, το μοτίβο της ανοσοαντιδραστικότητας στο κυτταρόπλασμα του CPE ήταν κοκκώδη, η οποία μπορεί να είναι ενδεικτική της παρουσίας augurin σε εκκριτικά κυστίδια (ένθετο). Σε αντίθεση augurin ανοσοαντιδραστικότητα δεν ανιχνεύθηκε σε CP ενδοθήλιο ή στα εκτός αυλού επιφάνεια του CPE. Αυτό πρότεινε ότι, άπαξ έξω από το κύτταρο, augurin μπορεί να είναι ένα πλάσμα μεμβράνη-πρωτεΐνης που συνδέεται σε επαφή με και με τη δυνατότητα έκκριση στο ΕΝΥ. Για να προσδιορίσετε αν augurin απελευθερώνεται στο ΚΠΣ in vivo, εμείς επεξεργασία ΚΠΣ αρουραίους για ανοσοαποτύπωση και ανιχνεύεται μια μπάντα kDa 14 (Εικόνα 1Β) που αντιστοιχεί στο προβλεπόμενο μοριακό βάρος augurin, την επεξεργασία 118 αμινοξέων ορμόνη-όπως πεπτίδιο που κωδικοποιείται από ECRG4 ( 31-148) [18]. Μια δεύτερη υψηλότερη ζώνη MW αγνώστου ταυτότητας ανιχνεύθηκε επίσης η οποία μπορεί να αντανακλά υπεροχή του πεπτιδίου για τη συσσωμάτωση (αδημοσίευτη παρατήρηση)

Πίνακας Α:. Ανοσοϊστοχημική απόδειξη για πρόσδεση στην κυτταρική επιφάνεια: Το ανοσοδραστικό augurin αναγνωρίζεται από αυτό το αντίσωμα σε εκχυλίσματα CP ταυτοποιήθηκε ως το προϊόν της Ecrg4 με ανοσοαποτύπωση και καταδεικνύοντας την παρουσία ενός 14 kDa πρωτεΐνη ECRG4 (31-148) μεταποιημένα με διάσπαση της αλληλουχίας-οδηγού οξύ 30 αμινοξέα όπως προσδιορίζεται προηγουμένως [13]. Μεταξύ περικοιλιακής κύτταρα του εγκεφάλου, πολωμένο εστίες punctated χρώσης augurin παρατηρήθηκαν στο εξωκυτταρικό κοιλιακή επιφάνεια του χοριοειδούς πλέγματος στρώμα επιθηλιακών κυττάρων (κόκκινο, βέλος) σε σχέση με την πυρηνική αντιχρωστική (μπλε, DAPI). Ένα κοκκώδες πρότυπο χρώσης παρατηρείται στο κυτταρόπλασμα εάν το στρώμα CPE κύτταρο, το οποίο είναι ενδεικτικό των ρυθμιζόμενων φυσαλιδώδους έκκριση στην επιφάνεια του κυττάρου. Πίνακας Β: Ανίχνευση ανοσοαντιδραστικών augurin σε CSF αρουραίου: Ανοσοκηλίδωση του CSF αρουραίου έδειξε μια 14 kDa ζώνη (βέλος) που αντιστοιχεί στο προβλεπόμενο μοριακό βάρος augurin (ECRG4 (31-148)). Πίνακας C: Βιοχημική απόδειξη για κυτταρικής επιφάνειας πρόσδεση του augurin: Έκφραση Ecrg4 στα καλλιεργημένα κύτταρα CPE ανιχνεύθηκε ούτε με στύπωμα Western (αριστερό πάνελ) ούτε με RT-PCR των μη μεταδιηγερμένα κύτταρα (δεν δείχνεται). Έτσι, για να μελετήσουν Ecrg4 in vitro ήταν απαραίτητη η χρήση ενός φορέα αδενοϊού που περιέχει το ανθρώπινο Ecrg4 ORF. Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται από τα κύτταρα CPE 48 ώρες μετά καμία μεταγωγή ή μεταγωγή με AD

GFP ή AD

ECRG4. Το μοριακό βάρος του Ecrg4 προερχόμενο πεπτιδικά θραύσματα που εκφράζονται σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western στο αριστερό πλαίσιο. Κυττάρου-επιφανειακές πρωτεΐνες κλασματώθηκαν με καταβύθιση του Neutravidin-σύνδεση βιοτινυλιωμένου πρωτεϊνών στην κυτταρική επιφάνεια (κεντρικό φύλλο) που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western. Η μορφή πεπτίδιο που εκκρίνεται από τα κύτταρα ανιχνεύτηκε με άμεση στύπωση Western του ρυθμισμένου μέσου (δεξί πάνελ).

Η

Για την περαιτέρω αντιμετώπιση του υποκυτταρική κατανομή των augurin σε CPE, βιοτινυλιωμένο στην κυτταρική επιφάνεια των πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων CPE στον πολιτισμό και κλασματώνονται τα βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών μέσω preciptiation με χάντρες ουδετεραβιδίνη. Στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν κυτταρική επιφάνεια κλάσμα με ένα αντίσωμα αντι-augurin [19]. Καλλιεργημένα κύτταρα CPE, όπως και πολλούς άλλους τύπους κυττάρων σε καλλιέργεια που εξετάσαμε, δεν εκφράζουν ενδογενή Ecrg4 αλλά θα μπορούσε να το πράξει μετά την παράδοση του γονιδίου με ιογενείς ή πλασμιδικούς φορείς [14]. Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων CPE με AD

ECRG4, μια ζώνη 14 kDa ανιχνεύθηκε σε λύματα ολόκληρων κυττάρων (Σχήμα 1C, αριστερό πάνελ, λωρίδα 3). Ομοίως, μια πρωτεΐνη 14 kDa ανιχνεύτηκε με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας που δείχνει ότι augurin εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια (Σχήμα 1 C, μεσαίο πάνελ, λωρίδα 3). Η ανάλυση στυπώματος Western του ρυθμισμένου μέσου των κυττάρων CPE ωστόσο, με τον οποίο μπορούμε προηγουμένως έδειξαν περιέχονται augurin (ή ανοσοαντιδραστικά θραύσμα του augurin, το οποίο προσδιορίστηκε ποσοτικά με ELISA [14]), έδειξε μια ανοσοαντιδραστικό πεπτίδιο το οποίο ήταν περίπου 6-8 kDa (Εικόνα 1Γ, δεξιό πλαίσιο, λωρίδα 3). Αυτό υποδηλώνει ότι, σε μας in vitro μοντέλο, δελτία διάσπαση πεπτίδιο (-α) augurin τεμάχιο (-α) από την επιφάνεια του CPE κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα καθορίσει ότι η in vitro augurin συγκρατείται στην επιφάνεια του κυττάρου και ότι η επεξεργασία πρωτεολυτική κυτταρική επιφάνεια απελευθερώνει ένα μικρότερο πεπτίδιο σε μέσο σε σύγκριση με ό, τι ανιχνεύθηκε σε CSF αρουραίου. Αυτό εγείρει την πιθανότητα ότι δύο διαφορετικά επεξεργασμένες μορφές augurin μπορεί να ρίξει από τα κύτταρα CPE και θα μπορούσε να είναι ενδεικτική των δύο πεπτιδίου productes το καθένα με μια δραστηριότητα διάκριτους. Δεν ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε σε ολόκληρη κυτταρολύματα, κλάσματα κυτταρικής επιφάνειας ή ρυθμισμένα μέσα από είτε μη μεταδιηγερμένα ή AD

GFP μεταγωγή κύτταρα (Σχήμα 1 C, λωρίδες 1 και 2).

διανομή Augurin σε χοριοειδές πλέγμα αλλαγές μετά τραυματισμό του ΚΝΣ

Χρησιμοποιήσαμε ένα φλοιού μοντέλο βλάβης του τραυματισμού του ΚΝΣ [20], για να αξιολογήσει κατά πόσον η ζημία που πραγματοποιούνται γονιδιακής έκφρασης Ecrg4 και augurin ανοσολογική αντίδραση στα πλάγια ΚΚ κοιλίας. Έλεγχος και τραυματισμένο αρουραίοι θανατώθηκαν σε 1, 3, και 7 ημέρες μετά την εκτέλεση μιας 3 mm βάθος βλάβης στο δεξιό εγκεφαλικό φλοιό, πλευρικά προς τις κοιλίες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, παρατηρήσαμε με συνεστιακή μικροσκοπία ότι υπήρχε σημαντική χρώση διάχυτη στην κανονική, άθικτο πλευρική κοιλία CP που εμφανίστηκε σε πολλά κύτταρα CPE να πολωθεί προς το κορυφαίο, κοιλιακή επιφάνεια που βλέπει από τα επιθηλιακά κύτταρα και με Διακοπτόμενης περιοχές ετικέτα ανοσοφθορισμού (Σχήμα 2Α). Όταν αξιολογείται 24 ώρες μετά την κάκωση (Σχήμα 2Β) το σήμα ανοσοχρώση ήταν σχεδόν απούσα αν και υπήρχε κάποια ανοσοαντιδραστικότητα βρέθηκε σε απομονωμένες εστίες. Ακόμη και εκεί όμως, η συνολική ένταση της χρώσης εμφανίστηκε μειωμένη. Με 3 ημέρες μετά τον τραυματισμό (Σχήμα 2C), η ανοσοχρώση ακόμη μειώθηκε σε σύγκριση με τον έλεγχο μη τραυματισμένα ζώα, αλλά φάνηκε πιο ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλο το CP σε σύγκριση με χρώση 1 ημέρα μετά την βλάβη. Με 7 ημέρες, η ένταση της χρώσης ήταν τώρα να διακριθεί από εγκεφάλους ελέγχου και υπήρχε ένα συνδυασμένο μοτίβο πολωμένου κορυφής και εστιακή διάστικτη χρώση με ένα πιο διάχυτο πρότυπο augurin ανοσοαντιδραστικότητας. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι augurin κινητοποιήθηκε αμέσως μετά τον τραυματισμό του ΚΝΣ και πιθανώς απελευθερώνονται στο CSF.

Ένα φλοιώδες τραύμα από μαχαίρι μειωμένα augurin επίπεδα πρωτεΐνης στο ετερόπλευρο CP όπως προσδιορίζεται από ανοσοϊστοχημική χρώση και συνεστιακής μικροσκοπίας. Η οφθαλμική μαχαίρι διαπέρασε το φλοιό ραχιαία αρουραίο να transect μεσολοβίου 3 mm βάθος και την πλευρική προς τα δεξιά πλευρική κοιλία. Ανοσοαντιδραστικά επίπεδα πρωτεΐνης augurin στο ετερόπλευρο CP μειώθηκαν στις 24 ώρες (Πίνακας Β) και 3 ημέρες (Πίνακας C) μετά την βλάβη σε σύγκριση με άθικτα ζώα μάρτυρες (Πίνακας Α). Με 7 ημέρες μετά τη βλάβη augurin πρωτεΐνη είχε επιστρέψει στο ίδιο περίπου επίπεδο με άθικτη ελέγχους. Εικόνες εκπρόσωπος της n = 3 αρουραίους.

Η

Ecrg4 είναι μια απάντηση τραυματισμό γονίδιο

Η μακροπρόθεσμη απώλεια των ανοσοδραστικών augurin στα κύτταρα CPE παρακάτω φλοιού βλάβη θα μπορούσε να αποδοθεί είτε (1) συνεχής και ταχεία έκκριση-και-απελευθέρωσης augurin καταστρέφουν ενδοκυτταρικές αποθήκες ή (2) έχασε augurin μέσω μειωμένη έκφραση του γονιδίου. Συνεπώς, χρησιμοποιήσαμε in situ υβριδοποίηση για να αξιολογήσει την έκφραση του γονιδίου στο χοριοειδές πλέγμα μετά τον τραυματισμό (Σχήμα 3). Ένα αντιπληροφοριακό ανιχνευτή αρουραίου Ecrg4 mRNA έδειξε ένα ισχυρό μήνυμα σε μη τραυματισμένους εγκεφάλους αρουραίων ελέγχου που έμοιαζε με το μοτίβο παρατηρείται για ανοσοϊστοχημική χρώση (Σχήμα 3Α). Το σήμα εμφανίστηκε περιορίζεται σε κύτταρα CPE και ως με την πρωτεΐνη, το σήμα χάθηκε 24 ώρες μετά την κάκωση (Σχήμα 3Β) και παρέμεινε έτσι μέχρι 3 ημέρες (Σχήμα 3C) μετά την οποία, η εκ νέου εμφανίστηκε με 7 ημέρες (Σχήμα 3D) σε επίπεδα παρόμοια με εκείνα στα ζώα ελέγχου. Το σήμα ανιχνεύθηκε σε ζώα ελέγχου και 7 ημέρες μετά τη βλάβη κρίθηκε επίσης ειδικές επειδή δεν υβριδοποίηση ανιχνεύθηκε σε τομές CP από ψευδο-ή 7 ημέρες μετά τη βλάβη ζώα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνθετικό ιχνηλάτη ελέγχου (Σχήμα 3Ε και F). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η Ecrg4 είναι ένα γονίδιο πρώιμη απόκριση τραυματισμού και ότι η απώλεια του augurin είναι διφασική: πρώτα λόγω χύμα απελευθέρωση από την κυτταρική επιφάνεια και ενδοκυτταρικά κυστίδια αποθήκευσης και το δεύτερο, λόγω της απώλειας της έκφρασης γονιδίων Ecrg4 όλη την πολλαπλασιαστική φάση του τραυματισμού.

φλοιού μαχαιριά μειωμένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης στην CP, όπως καθορίζεται από το

in situ υβριδισμού

. Η οφθαλμική μαχαίρι διαπέρασε το φλοιό ραχιαία αρουραίο να transect μεσολοβίου 3 mm βάθος και την πλευρική προς τα δεξιά πλευρική κοιλία και την έκφραση του γονιδίου Ecrg4 αξιολογήθηκε με δέσμευση ενός Ecrg4 mRNA αντιπληροφοριακό ανιχνευτή στο ετερόπλευρο CP σε ανέπαφα εγκεφάλους αρουραίων (Πίνακας Α), 24 ώρες (Πίνακας Β) 72 ώρες (Πίνακας C) και 7 ημέρες (Πίνακας Δ) μετά τον τραυματισμό. Ένα συνθετικό, αρνητικός ανιχνευτής mRNA έλεγχος δημιουργήθηκε από το pSPT18-Neo ραχοκοκαλιά έλεγχος πλασμίδιο και χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του σήματος υποβάθρου σε ελέγχου (Πίνακας Ε) και 7 ημερών (Πίνακας F) τμήματα. Εικόνες εκπρόσωπος της n = 3 αρουραίους.

Η

διανομής Augurin στο supraoptic πυρήνα (SON) δεν μειώνεται μετά CNS τραυματισμό

Για να εξεταστεί εάν τα επίπεδα augurin αλλάξει σε ένα πρότυπο παρόμοιο με το CPE παρακάτω φλοιού βλάβη, ψάξαμε για ανοσολογική αντίδραση σε μια άλλη περιοχή του εγκεφάλου με υψηλά επίπεδα augurin και της έκφρασης Ecrg4, ο γιος του υποθαλάμου [21]. Εμείς δεν βρήκε καμία μείωση στην έκφραση σε 1 και 3 d.p.i. σε τραυματισμένο αρουραίους (Σχήμα 4Β και C) σε σύγκριση με τον έλεγχο Σχήμα 4Α). Αυτή η περιφερειακή σύγκριση δείχνει τα μειωμένα επίπεδα των augurin σε 1 και 3 d.p.i. δεν είναι μια συνολική απάντηση σε όλο τον εγκέφαλο, και περαιτέρω συγκρίσεις των ανατομικές περιοχές θα καθορίσει εάν αυτό το συγκεκριμένο πρότυπο είναι μοναδικό για το CPE σε απόκριση στον τραυματισμό του CNS.

Για να αποδειχθεί η εξειδίκευση της ανταπόκρισης των τραυματισμών στο CPE, σε αντίθεση με άλλες περιοχές του εγκεφάλου που έχουν υψηλά επίπεδα της γονιδιακής Ecrg4 και augurin πρωτεϊνική έκφραση [21], εξετάσαμε ο γιος του υποθαλάμου σε τραυματίες αρουραίους σε 1 (Πίνακας Β), 3 (Πίνακας C) και 7 (Πίνακας Δ) dpi και σε σύγκριση χρώση σε άθικτο εγκέφαλο (Πίνακας Α). Ενώ μπορεί να υπήρχε μια μικρή incrase στις 3 και 7 d.p.i., η απότομη πτώση της έκφρασης που σημειώθηκαν στο CPE μετά από τραυματισμό δεν παρατηρήθηκε σε γιο. Εικόνες εκπρόσωπος της n = 3 αρουραίους.

Η

Συζήτηση

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ αποδεικνύουν ότι CP-προέρχεται Ecrg4 είναι ένα γονίδιο απάντηση τραυματισμό. Πρώτον, τραυματισμό του ΚΝΣ καθιζάνει μια ταχεία απώλεια της έκφρασης του γονιδίου Ecrg4 εντός 24 ωρών από τον τραυματισμό και παρέμειναν με παρατεταμένη για 7 ημέρες, στον οποίο χρόνο έχει αρχίσει η ζημία για την επίλυση [22]. Η άμεση απάντηση, ωστόσο, ήταν προφανώς μία αρχική μαζική απελευθέρωση του augurin από την επιφάνεια του κυττάρου CPE που ακολουθείται από περισσότερο παρατεταμένη έκκριση και την απελευθέρωση των ενδοκυτταρικών αποθεμάτων augurin. Η λειτουργία αυτού του χύδην απελευθέρωσης σε πρώιμη φάση της ζημίας δεν είναι γνωστός, αλλά ακολούθησε μια εξάντληση ανοσοαντιδραστικότητας κατά τα μέσα του φάση του τραυματισμού που είχε επιδεινωθεί από την ρύθμιση προς τα κάτω της γονιδιακής έκφρασης Ecrg4 η οποία διατηρείται καθ ‘όλη τη φάση πολλαπλασιασμού του τραυματισμό του ΚΝΣ μέσω ψήφισμά κατά την ημέρα 7.

το γονίδιο Ecrg4 είναι ένα γονίδιο καταστολής όγκων υποψήφιος που έχει αποκτήσει ιδιαίτερη προσοχή λόγω της αντίστροφη συσχέτιση της έκφρασης των γονιδίων με την ανάπτυξη και την εξέλιξη των επιθηλιακών καρκίνων [23], [ ,,,0],24]. Down ρύθμιση διαμεσολαβείται από επιγενετικές αποσιώπηση της μέσω μεθυλίωσης του DNA του προαγωγού Ecrg4 [25], [26], [27]. Πρόσφατα, η έκφραση γονιδίου Ecrg4 έχει επίσης αντιστρόφως ανάλογη με την εξέλιξη του καρκίνου και διεισδυτικότητα [27], αντι-φλεγμονώδη γονιδιακή ρύθμιση μέσω NF-kB [25], τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στην SVZ [15] και σχετίζεται άμεσα με αυξημένη γηρασμό στο ΚΝΣ [ ,,,0],15] και το ενδοκρινικό ρύθμιση της περιφερικής ισορροπίας υδρο-μεταλλικά [21], [28]. ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του (ORF) κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 148 αμινοξέων η οποία είναι εξαιρετικά διατηρημένη μεταξύ των ειδών και έχει δευτερεύουσα δομή μοτίβα που χαρακτηρίζουν νευροπεπτίδια [13]. Ωστόσο, η εξόρυξη δεδομένων αποκαλύπτει ότι Ecrg4 δεν είναι μέρος μιας μεγαλύτερης οικογένειας γονιδίων που σχετίζονται. Αυτό θα μπορούσε να υποδεικνύει αυστηρό έλεγχο εξελικτική μεταξύ Ecrg4 ορθόλογα και μια μοναδική βιολογική λειτουργία.

Η μείωση πρωτεΐνη augurin (Σχήμα 2) και την έκφραση του γονιδίου Ecrg4 (Σχήμα 3) λαμβάνει χώρα κατά περιόδους όταν τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται στην κανονική απόκριση βλάβης του ΚΝΣ [29]. Η χρονική πορεία της μειώθηκε augurin συσχετίζεται με την οξεία και υποξεία χρόνους απόκρισης σε τραυματισμό του ΚΝΣ [1], όπως και οι δύο γονιδίων και έκφραση πρωτεΐνης μειώθηκε κατά 1 έως 3 ημέρες μετά τον τραυματισμό, αλλά επιστρέφουν στο μη τραυματισμένα επίπεδα μέχρι την ημέρα 7. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενη επίδειξη μας [14] ότι η έκφραση του γονιδίου Ecrg4 είναι υψηλή στην κανονική CP και ότι Ecrg4 υπερέκφραση θέτει σε κίνδυνο την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση neuroprogenitor. Τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι augurin μπορεί να είναι σαν ένα «φρουρός» παράγοντα ηρεμίας των οποίων το καταστατικό παρουσία είναι ανασταλτική, αλλά η έλλειψη του οποίου γίνεται ένα σήμα dysinhibitory που επιτρέπει την πολλαπλασιαστική απόκριση σε τραυματισμό.

Το γεγονός ότι η έκφραση του γονιδίου Ecrg4 είναι επιγενετικώς ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA αυξάνει το ενδιαφέρον πιθανότητα ότι οι συστατικές επίπεδα augurin στο CP θα μπορούσε να ελεγχθεί επιγενετικώς επίσης. Αν ναι, μεθυλίωση του DNA των Ecrg4 θα ελέγχει τα ποσά της βασικής augurin που είναι μόνιμα παρόντες και διαθέσιμοι για απελευθέρωση κατά τη διάρκεια της οξείας φάσης της ζημίας. Η σημασία αυτής της υπόθεσης δεν είναι σαφής, αλλά θα μπορούσε να σημαίνει ότι το DNA μεθυλίωση θα μπορούσε επίσης να μετρηθεί η απόδοση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της φάσης ανάλυση της ζημίας. Παρόμοια επιγενετικές τροποποιήσεις στο DNA μεθυλίωση είναι τώρα καλά περιγραφεί μετά την ισχαιμία του ΚΝΣ και της ζημίας [30]. Αν αντιστροφή της εν λόγω ανάκτησης αλλαγές επιρροές των επιπέδων έκφρασης augurin, στη συνέχεια, ενόψει των αποτελεσμάτων της γονιδιακής Ecrg4 χτυπήσει κάτω και πάνω από την έκφραση [30], neuroprogenitor ανταπόκρισης σε τραυματισμό θα μπορούσε να επηρεαστεί σημαντικά.

Είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτο ότι , ενώ augurin είναι παρόμοιο με άλλα πεπτιδικών ορμονών από το ότι είναι συστατικώς παράγεται από τον CPE για έκκριση στο CSF [22], είναι επίσης διαφορετική από πεπτιδικών ορμονών στο εν λόγω κυτταρικής επιφάνειας πρόσδεση (Σχήμα 1C) θυμίζει παρακρινείς παράγοντες όπως επιδερμικό και ινοβλαστών αυξητικούς παράγοντες, εγκοπή, οδοντωτό και εφρινών [31], [32], [33], [34]. Εμείς [14] και άλλοι [15], έχουν περιγραφεί προηγουμένως απελευθέρωση augurin σε ρυθμισμένο μέσο μετά από μεταγωγή με Ecrg4 διαγονιδίου, και τώρα έχουμε δείξει την ανίχνευση μιας μορφής 14 kDa στο CSF αρουραίων, την πρώτη απόδειξη της εκκρίνονται augurin in vivo. Τα ευρήματά μας σε δύο διαφορετικές μορφές augurin που παράγεται από το CPE, 6 kDa (in vitro) και 14 kDa (in vivo), να αυξήσει την πιθανότητα διαφορετικών μηχανισμών απελευθέρωσης. Το γεγονός ότι ανιχνεύθηκαν δύο διαφορετικές ανοσοαντιδραστικά μορφές μπορεί να είναι συνέπεια της βιολογίας του κυττάρου μεταβάλλονται με την διαδικασία κυτταρικής καλλιέργειας, και είναι πιθανό ότι σε απόκριση στον τραυματισμό των 6 kDa αποβάλλεται σε CSF, ενώ η μορφή 14 kDa στην Εικόνα 1Β είναι συστατικώς κυκλοφόρησε. Η ισομορφή ανιχνεύεται θα μπορούσε να εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων και υπό όρους: έχουμε ανιχνεύθηκαν δύο ισόμορφα στο ρυθμισμένο μέσο των μεταγόμενων κυττάρων καλλιεργημένων προστάτη επιθηλιακών (XD, χειρόγραφο σε ανασκόπηση) και το έντυπο 6 kDa σε ένα ex vivo μοντέλο της φλεγμονής (AK, χειρόγραφο σε προετοιμασία). Εικόνα 1C υποστηρίζει την υπόθεση ότι ένα δεμένοι μορφή 14 kDa αποβάλλεται από πρωτεόλυση σε μέσα μαζικής ενημέρωσης. Η μορφή με την CSF ωστόσο (Σχήμα 1Β) θα μπορούσε να απελευθερωθεί με (1) απομάκρυνση της άγκυρας μεμβράνης, (2) συστατική απελευθέρωση από το ER /Golgi οδού ή (3) από ένα άλλο τύπο κυττάρου προέλευσης.

Η απώλεια augurin ανοσοαντιδραστικότητας σε CPE ιστού μετά από τραυματισμό δείχνει ότι υπάρχουν τρεις δεξαμενές augurin: (1) πεπτίδιο που απελευθερώνεται σε βιολογικά υγρά όπως CSF, (2) πρωτείνη συγκρατείται στην κυτταρική επιφάνεια και (3) πεπτίδια αποθηκεύονται σε ενδοκυτταρικά κυστίδια. Η άμεση απάντηση σε τραυματισμό είναι πιθανώς επεξεργασία στην επιφάνεια του κυττάρου και ακολουθείται ταχέως από augurin απελευθέρωση από ενδοκυτταρικά κυστίδια αποθήκευσης. τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μετά από τραυματισμό (Σχήμα 3) τα επίπεδα πρωτεΐνης κάτοπτρο (Σχήμα 2) γεγονός που υποδηλώνει ότι η augurin απελευθερώνεται λίγο μετά τον τραυματισμό δεν αναπληρώνονται. Η παρατήρηση ότι ένα μικρότερο, επεξεργασμένη μορφή του augurin βρίσκεται σε ρυθμισμένα μέσα (Σχήμα 1Β, πίνακας 3) υποδηλώνει ότι πρωτεόλυση και η επεξεργασία γίνεται τη στιγμή της κυτταρικής επιφάνειας απόπτωση. Η βιολογική λειτουργία, εάν υπάρχει, από αυτά τα θραύσματα δεν είναι γνωστές, αλλά μπορεί να είναι διαφορετική από εκείνη της ανέπαφης augurin προσδεδεμένα στην επιφάνεια των κυττάρων (Σχήμα 5).

Κανονικό χοριοειδές πλέγμα επιθήλια εκφράζουν Ecrg4 και περιέχουν σημαντικές 14 kDa augurin πρωτεΐνη που είναι σε ένα ανασταλτικό διαμόρφωση. Η μη μεταποιημένα πεπτίδιο περιέχεται σε 3 διαμερίσματα (1) ενδοκυτταρικά κυστίδια (δηλ στικτή ενδοκυτταρική χρώση στο Σχήμα 1) (2) κοντά στην επιφάνεια της κοιλιακής κυττάρου (δηλ πολωμένο κορυφής χρώση κυττάρων στο Σχήμα 1 και (3), προσδεδεμένα στην κυτταρική επιφάνεια ( δηλαδή Εικόνα 1Β). Μετά την κάκωση, η ξαφνική απελευθέρωση και την επεξεργασία στην κυτταρική επιφάνεια ακολουθείται από την απελευθέρωση από ενδοκυτταρικά αποθέματα ως «σήμα πανικού» για να υποδείξει συστημική τραυματισμού. η αρχική προ-φλεγμονώδη απόκριση έπειτα τερματίζει τη γονιδιακή έκφραση Ecrg4 για τουλάχιστον 1 έως 3 ημέρες μετά τον τραυματισμό. Ως εκ τούτου, κατά την αρχική φάση του τραυματισμού, κανονική, συντακτικά ανασταλτικές λειτουργίες του απουσιάζουν και έτσι επισκευή κύτταρα πολλαπλασιάζονται. Όπως επιστρέφει γονιδιακή έκφραση, ηρεμία αποκαθίσταται και ομοιόσταση αποκαθίσταται.

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ είναι συμβατά με ένα μοντέλο διπλής λειτουργίας της δραστηριότητας augurin (Σχήμα 5). Augurin συνήθως ενεργεί ως φρουρός ανασταλτικό παράγοντας που είναι ιδιοσυστατικά παρόν επί της επιθηλιακής επιφανείας του κυττάρου αλλά σε πρώιμους χρόνους μετά από τραυματισμό, augurin θραύσματα που δημιουργούνται από την επιφάνεια του κυττάρου μπορεί να είναι μία ανεκτική σήμα για την ενεργοποίηση της ζημίας. Η τοπική μείωση σε augurin συγκέντρωση θα dysinhibit πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων neuroprogenitor στην SVZ. Πράγματι, augurin υπερέκφραση σε CP και επένδυμα μειώνει την πρόσληψη BrdU και νηστίνη ανοσολογική εδώ, υποδεικνύοντας ότι CPE που προέρχονται augurin ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και τη διάρκεια ζωής της neuroprogenitors [3], [35], [36]. dysinhibition της θα μπορούσε να βοηθήσει εκτρέψουν προγονικών μετανάστευσης στην περιοχή της κάκωσης από την έκφυσης μεταναστευτικό ρεύμα [3], [35], [36]. Αν ναι, η επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Ecrg4 στο CP θα μπορούσε να βοηθήσει Guage τη λεπτή ισορροπία μεταξύ της κινητοποίησης neuroprogenitor κυττάρων στην SVZ για την επισκευή και την καταστολή της αναστολής καλλιεργούνται. . Περαιτέρω ανάλυση της κινητικής της διανομής augurin και της έκφρασης Ecrg4 κατά τις οξείες και χρόνιες φάσεις της ανάκαμψης από φλοιώδη βλάβες θα αντιμετωπίσει αυτό το ενδεχόμενο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

Όλες οι μελέτες που χρησιμοποιούν αρουραίους διεξήχθησαν με προηγούμενη έγκριση της, και σύμφωνα με, είτε η Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο Brown (Providence, RI, οι αριθμοί έγκρισης 0062-07 και 0073 – 10) ή το Υπουργείο Εσωτερικών στο Πανεπιστήμιο του Birmingham (Edgbaston, Ηνωμένο Βασίλειο , αριθμός έγκρισης 3012720-19b2). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις επιβίωση διεξήχθησαν υπό άσηπτες συνθήκες. Ιστός συλλέχθηκε από ενήλικα αρσενικά Sprague Dawley που διατηρούνται σε πρότυπο φωτός /σκότους με

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό. Για τη συγκομιδή του ιστού του εγκεφάλου, οι αρουραίοι θανατώθηκαν με

2 εισπνοή CO και αμέσως διαποτίστηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν και περαιτέρω σταθερό για όλη τη νύχτα σε PBS που περιέχει 20% σακχαρόζη και 4% PFA σε 4 ° C. Οι, οι εγκέφαλοι επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 30% σακχαρόζη επί μία νύκτα και καταψύχονται σε OCT ένωση σε ξηρό πάγο και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία.

Αντισώματα

ανοσοφθορισμού.

Ένα πολύκλωνο αντίσωμα IgY τέθηκε σε κοτόπουλα ενάντια ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ECRG4 (71 – 148) και η συγγένεια αντιγόνου καθαρίζεται με εμπορική σύμβαση με Genway Biotech, Inc., (San Diego, CA). Καθαρισμένα προ-άνοσο IgY από το ίδιο ζώο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας σε ανοσοχρώση εγκεφάλου αρουραίου ιστού και γίδινο αντι-κοτόπουλου-AlexaFluor® 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση. Western blotting: Affinity καθαρισμένο κουνελιού αντι ανθρώπινο ECRG4 πρωτογενές αντίσωμα (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και αίγας αντι-κουνελιού-υπεροξειδάση χρένου (HRP) δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (JacksonImmuno Labs, West Grove, ΡΑ) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση πρωτεΐνης σε ανάλυση Western blotting.

Ιϊκοί φορείς

Ένας φορέας αδενοϊού που περιέχει ένα διαγονίδιο για την ανθρώπινη Ecrg4 ORF (AD

ECRG4) παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ένας αδενοϊός που περιέχει το διαγονίδιο για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (AD

GFP, Vector BioLabs, Philadelphia, ΡΑ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Cell Culture

Ένα πρωτεύον CP επιθηλιακή κυτταρική σειρά ανθρώπινου αγοράστηκε από ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) και καλλιεργήθηκαν σε Μέσο επιθηλιακών κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για μόλυνση αδενοϊού, συρρέοντα κύτταρα μετρήθηκαν και μεταγωγή με πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 20.

Penetrating CNS αλλοιώσεων Μοντέλο

Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με 5% ισοφλουράνιο σε οξυγόνο (1,7 L /min) και δεδομένου 0,3 mg /kg βουπρενορφίνης υποδορίως για αναλγησία πριν από τον τραυματισμό του ΚΝΣ. Αναισθησία εκτιμήθηκε με τσίμπημα ποδιού αντανακλαστικό. Το κρανίο εκτίθεται πρώτα με μια οβελιαία τομή κατά μήκος της μέσης γραμμής της κεφαλής και μετά τη δημιουργία μιας οπής αγριάδα μέσα από την σκληρά μήνιγγα με οδοντικό τρυπάνι, μια αλλοίωση έγινε 3 mm δεξιά βρέγμα, 7,5 mm μπροστά από το επίπεδο του αυτιού-bar και 3 mm βάθος χρησιμοποιώντας ένα οφθαλμικό μαχαίρι (Unitome μαχαίρι, BD Waltham, ΜΑ). Η ζημία που προκλήθηκε διατέμνεται το μεσολόβιο και η πληγή μαχαίρι μπήκε στο ραβδωτό σώμα. Έχουμε χρησιμοποιήσει αυτό το μοντέλο τραυματισμού εκτενώς σε άλλες μελέτες [37], [38], [39], [40]. Άθικτο εγκεφάλους αρουραίων από ζώα un-λειτουργούν χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Συλλογή CSF αρουραίου

δείγματα ΕΝΥ από ενήλικους αρουραίους Spragu-Dawley συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν βαθιά σε στερεοταξικό πλαίσιο με την κεφαλή ανυψώνεται πάνω από το σώμα. Μια τομή έγινε από την κορυφή του κεφαλιού προς τη βάση του λαιμού. Ο μυς ανασυρθεί από γύρω από τη βάση του κρανίου. Χρησιμοποιώντας μια σύριγγα Hamilton, CSF αποσύρθηκε από την Magna δεξαμενής και καταψύχεται αμέσως σε ξηρό πάγο. Οι αρουραίοι στη συνέχεια σκοτώθηκαν από τερματικό αναισθησία.

Cell Surface Πρωτεΐνη κλασματοποίηση και Ανοσοστύπωμα

Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα CPE μολύνθηκαν με AD

ECRG4 ή AD

GFP ένα ΜΟΙ 20 έως υπερεκφράζουν είτε Ecrg4 ή GFP. πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας βιοτινυλιώθηκαν και τράβηξε τα κάτω χρησιμοποιώντας κυτταρική επιφάνεια Kit Πρωτεΐνη Απομόνωση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Pierce, Rockford, IL). Καταβυθισμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια με επώαση Neutravidin σε 2% ρυθμιστικό δείγματος δωδεκυλοθειικό λίθιο κάτω από αναγωγικές συνθήκες για μία ώρα στους 25 ° C. Ανοσοδραστικών πρωτεϊνών ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες μέγεθος κλασματώθηκε σε 4-12% Bis-Tris gel για SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε 0,2 μm πολυβινυλιδενο φθορίδιο μεμβράνης, η οποία μπλοκαρίστηκε με διάλυμα 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για μία ώρα στους 25 ° C. Κουνέλι αντι-ανθρώπινο augurin (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) αραιώθηκε σε 1% BSA σε συγκέντρωση 0,5 μg /ml και επωάστηκε με την μεμβράνη επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύσεις με PBS που περιέχει 0.05% Tween-20, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-κουνελιού-ΗΚΡ δευτερογενούς αντισώματος /ml κατσίκα 0,1 μg αραιωμένο σε 1% BSA για μία ώρα στους 25 ° C, ξεπλένονται και κατόπιν επωάστηκαν με Super Signal West Pico χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Pierce, Rockford, IL).