Αφηρημένο

Οργανοτυπικές, τρισδιάστατων μοντέλων (3D) κυτταρικής καλλιέργειας επιθηλιακών τύπους όγκων, όπως ο καρκίνος του προστάτη ανακεφαλαιώσω τις βασικές πτυχές της αρχιτεκτονικής και ιστολογία των στερεών καρκίνων. Η μορφομετρική ανάλυση των πολυκύτταρων 3D organoids είναι ιδιαίτερα σημαντικό όταν τα πρόσθετα συστατικά όπως η εξωκυτταρική μήτρα και μικροπεριβάλλον του όγκου που περιλαμβάνονται στο μοντέλο. Η πολυπλοκότητα αυτών των μοντέλων έχει μέχρι στιγμής περιορισμένη επιτυχή εφαρμογή τους. Υπάρχει μεγάλη ανάγκη για αυτόματη, ακριβή και ισχυρά εργαλεία τμηματοποίησης της εικόνας για να διευκολύνει την ανάλυση αυτών των βιολογικά σχετικών 3D μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας. Σας παρουσιάζουμε μια μέθοδο τμηματοποίησης βασίζεται σε Markov τυχαίων πεδίων (MRFs) και απεικονίζουν τη μέθοδό μας με τη χρήση 3D δεδομένων στοίβα εικόνα από οργανοτυπικό 3D μοντέλο των κυττάρων καρκίνου του προστάτη συν-καλλιεργημένα με καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες (CAFS). Η έξοδος τμηματοποίηση 3D δείχνει ότι αυτοί οι τύποι κυττάρων είναι σε φυσική επαφή με το άλλο μέσα στο μοντέλο, το οποίο έχει σημαντικές συνέπειες για τη βιολογία του όγκου. απόδοση Τμηματοποίηση ποσοτικοποιείται με τη χρήση ετικετών αλήθεια έδαφος και δείχνουμε πώς κάθε βήμα της μεθόδου μας αυξάνει την ακρίβεια τμηματοποίησης. Παρέχουμε η αλήθεια έδαφος ετικέτες μαζί με τα δεδομένα εικόνας και τον κωδικό. Χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα δεδομένα εικόνας που δείχνουν ότι η μέθοδος κατάτμησης μας είναι επίσης πιο γενικά εφαρμόσιμη σε άλλους τύπους κυτταρικών μικροσκόπιο και να μην περιορίζεται μόνο σε μικροσκόπιο φθορισμού

Παράθεση:. Robinson S, Guyon L, Nevalainen J, Toriseva Μ, Åkerfelt M, Νέες Μ (2015) Κατάτμηση των δεδομένων εικόνας από το Συγκρότημα οργανοτυπικές 3D Μοντέλα του καρκινικού ιστού με Markov Random Fields. PLoS ONE 10 (12): e0143798. doi: 10.1371 /journal.pone.0143798

Επιμέλεια: Olivier de Wever, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο

Ελήφθη: 3 Ιουλ 2015? Αποδεκτές: 10 του Νοεμ 2015? Δημοσιεύθηκε: 2η Δεκεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Robinson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. VTT Oy είναι μια μη-κερδοσκοπική, πλήρως κρατικής ιδιοκτησίας ερευνητικό ίδρυμα που διαδέχεται επίσημα την προηγούμενη οργάνωση, που ιδρύθηκε το 1942, παλαιότερα γνωστή ως Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus ή VTT (Το Εθνικό Κέντρο Τεχνικής Έρευνας της Φινλανδίας). VTT Oy ιδρύθηκε το 01.01.2015 και διατηρεί τη δομή ενός ερευνητικού ιδρύματος μεγάλης κλίμακας. Η έρευνα που περιγράφεται εδώ είναι αποκλειστικά ακαδημαϊκού χαρακτήρα, που δεν συνδέονται με οποιονδήποτε τρόπο σε εμπορικά προϊόντα, υπηρεσίες ή εν εξελίξει έρευνα της σύμβασης με τρίτους διεξάγεται σε VTT Oy. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από την Ακαδημία της Φινλανδίας, χορηγεί αριθμούς 284619 (Μ Α) και 267.326 (MN). SR είναι ο δικαιούχος της σύμβασης διατριβής CEA-Βιομηχανία και μια σύμβαση διατριβή VTT. VTT παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς SR, ΜΑ, και ΜΝ, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. MT έχει εργαστεί ως εξωτερικός ερευνητής συνδεδεμένες με το VTT μέσω της ερευνητικής ομάδας (με επικεφαλής τον ΜΝ). Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα συγγραφέα εισφορές

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα που σχετίζονται με την υπαγωγή τους με VTT. Αυτή η συνεργασία δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Κινητά διαδικασίες συμβαίνουν φυσικά σε τρεις διαστάσεις (3D) και τα κύτταρα είναι συνήθως ενσωματωμένα σε εξωκυττάρια μήτρα , η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος. Κατά συνέπεια, φυσιολογικώς σχετικό μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας όλο σχεδιαστεί σε μορφές 3D ενσωματωμένα σε εξωκυτταρική μήτρα για να συλλάβει συγκρότημα ιστού όπως η βιολογία περισσότερο πιστά [1]. Μια συμπαγής όγκος αντιπροσωπεύει ένα διαταραγμένο και πολύπλοκη ιστού με το δικό της χαρακτηριστικό ομοιόσταση των ιστών του και γύρω μικροπεριβάλλον του όγκου. Όγκου των κυττάρων πλαστικότητα και σημαντικές ιδιότητες, όπως η διαφοροποίηση σε σχέση με την εισβολή των καρκινικών κυττάρων επηρεάζονται έντονα από το μικροπεριβάλλον του όγκου. Ανακεφαλαιώνοντας τα χαρακτηριστικά των συμπαγών όγκων

in vitro

απαιτεί δοκιμασίες με βάση κύτταρα που μιμούνται ταυτόχρονα την εξωκυττάρια μήτρα και μικροπεριβάλλον του όγκου, ομοιότυπες και ετερότυπη κυττάρου-κυττάρου επαφές, και επιτρέπουν τον σχηματισμό των σχετικών αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας. Οργανοτυπικό 3D τεχνικές καλλιέργειας κυττάρων αντιπροσωπεύουν σήμερα τις πιο βιολογικά σχετικές

in vitro

μοντέλα για τη διερεύνηση της διαφοροποίησης επιθηλιακών καρκίνου, πόλωση και την εισβολή [1-3]. Ωστόσο, η έλλειψη κατάλληλων μεθόδων ανάλυσης μικροσκόπιο εικόνα έχει μέχρι στιγμής περιορισμένη την επιτυχή εφαρμογή και την ερμηνεία αυτών των μοντέλων.

Εκτός από τα καρκινικά κύτταρα, διαφορετικά στρωματικά κύτταρα αποτελούν το πιο κρίσιμο συστατικό του μικροπεριβάλλον του όγκου. ινοβλάστες Cancer σχετιζόμενη (CAFS) είναι το πιο άφθονο είδος στρωματικών κυττάρων στα περισσότερα καρκινώματα και διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου [4-6]. Ως εκ τούτου, CAFS αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό στόχο για τις θεραπείες του καρκίνου. Η αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και CAFS εξακολουθεί να είναι ελάχιστα κατανοητή και πιο αξιόπιστη και ισχυρή μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας που καλύτερα ανακεφαλαιώσουμε το συγκρότημα ιστολογία

in vivo

όγκους που απαιτούνται για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων του όγκου-στρώματος.

Θεωρούμε πολυκαναλικό δεδομένα 3D στοίβας εικόνας από ένα πολύπλοκο οργανοτυπικές 3D μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας των κυττάρων του όγκου του καρκίνου του προστάτη συν-καλλιεργήθηκαν με CAFS. 3D μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας και απεικόνισης πρωτόκολλο μας σχετίζεται με την πολυκύτταρους επίπεδο στο οποίο οι συνολικές ιδιότητες του organoids όγκου και δομών CAF είναι περισσότερο κρίσιμη από τη σύλληψη μεμονωμένων κυττάρων ή πυρήνων κυττάρων. Αποκτήθηκαν με σχετικά μεγάλη απόσταση μεταξύ των εικόνων στη στοίβα, η ανάλυση των δεδομένων εικόνας μέσα σε μια εικόνα ήταν μέχρι 20 φορές το ψήφισμα μεταξύ των εικόνων στη στοίβα.

Οι υγιείς ιστούς του προστάτη που σχηματίζεται από acini, τα οποία είναι κούφια συστάδες των κυττάρων που σχηματίζουν τις μικρότερες λειτουργικές μονάδες εκκριτική αδένα. Σε πρώιμο στάδιο καρκίνου του προστάτη αυτά τα λόβια αρχίζουν να γεμίζουν με προ-κακοήθη ή κακοήθη κύτταρα να γίνουν στερεά σφαιροειδή. Το σχήμα και το μέγεθος των πολυκύτταρων organoids περιέχει πολύτιμες πληροφορίες μορφομετρικών [7] και το ενδιαφέρον μας έγκειται στο πολυκύτταρων όγκου και δομών CAF ως ξεχωριστές ενημερωτικό αντικείμενα. Ακριβής κατάτμηση τόσο της πολυκύτταρων όγκου και δομών CAF είναι το πρώτο βήμα για τη διερεύνηση της μορφής στην οποία και κλίμακα αυτών των τύπων κυττάρων μπορεί να σχηματίζουν άμεσες επαφές κυττάρου-κυττάρου. Ως εκ τούτου, στόχος μας είναι να παράγει μια αυτόματη κατάτμηση και για τους δύο τύπους των αντικειμένων χωρίς να αναλαμβάνει προηγούμενη ενημέρωση σχήμα ή την εξέταση μεμονωμένων κυττάρων.

Αυτοματοποιημένα όρασης υπολογιστών επιτρέπει συνήθως για πολύ μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα και αντικειμενικότητα από το εγχειρίδιο της ανθρώπινης ανάλυση [8]. Κατάτμηση και ο προσδιορισμός των τμημάτων της εικόνας που παρουσιάζουν ενδιαφέρον είναι το πρώτο βήμα σε πολλές εφαρμογές υπολογιστικής όρασης. Απλές μέθοδοι κατωφλίου αποτελούν τη βάση πολλών τυπικών μεθόδων τμηματοποίησης [9]. Δημοφιλή δωρεάν πλατφόρμες ανάλυσης εικόνας, όπως τηλέφωνα Profiler [10] και ImageJ /Φίτζι [11] παρέχουν πρακτικές εφαρμογές τέτοιων μεθόδων τμηματοποίησης που έχουν σχεδιαστεί ειδικά για την κυτταρική δεδομένων μικροσκοπία και επιτρέπουν την ανάλυση πέρα ​​από τον κατακερματισμό της σε εξειδικευμένα αγωγών για συγκεκριμένα σύνολα δεδομένων. Ωστόσο, η ανάλυση αυτή είναι συνήθως επικεντρώνεται σε στοιχεία μικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης σε μονό κύτταρο ή ακόμα και υπο-κυτταρικά επίπεδα και είναι επίσης επικεντρώθηκε κυρίως σε δύο διαστάσεων πολιτισμούς (2D) μονοστοιβάδα κυττάρων, αν είναι δυνατόν 3D θέασης όγκο και την απόδοση στο ImageJ. Τα εμπορικά προϊόντα λογισμικού που εστιάζονται σε 3D ανάλυση κυτταρική μικροσκοπία εικόνας, όπως Imaris (Bitplane) και Volocity (PerkinElmer) σχεδιασμένο για πολύ λεπτομερή ανάλυση των εικόνων υψηλής ανάλυσης στο επίπεδο του ενός κυττάρου, όπου μπορεί να υπάρχει τόσο λίγο όσο 0,5

μ

m μεταξύ των εικόνων στο 3D στοίβα. Οι ειδικές ανάγκες των δεδομένων εικόνας από πολύπλοκο μοντέλο 3D καλλιέργειας κυττάρων μας, είναι δεδομένα εικόνας πολυκάναλη 3D όπου υπάρχουν μεγάλες αποστάσεις μεταξύ των εικόνων στο 3D στοίβα, απαιτούν εις βάθος χειραγώγηση της μεθόδου κατάτμησης που δεν είναι διαθέσιμη μέσα σε αυτές τις πλατφόρμες.

οι

Markov τυχαίων πεδίων (MRFs) που χρησιμοποιείται για την όραση σε πολλούς διαφορετικούς τομείς και για ένα ευρύ φάσμα προβλημάτων [12]. Τέτοια μοντέλα είναι δημοφιλής επειδή η δομή του Markov «γείτονα» επιτρέπει τις χωρικές σχέσεις των εικονοστοιχείων που πρέπει να ληφθούν υπόψη, ενώ εξακολουθούν να είναι υπολογιστικά εφικτή. Για τα δεδομένα κυτταρική μικροσκοπία εικόνα, έχουν μεθοδολογίες MRF βασίζεται έχουν εφαρμοστεί για την παρακολούθηση μεμονωμένων κυττάρων [13, 14], ταξινόμηση [15], ανίχνευση κίνησης [16], την αποκατάσταση της εικόνας και αποσυνέλιξη [17, 18], και τον προσδιορισμό της μίτωσης [19, 20]. MRFs έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την κατάτμηση της εικόνας σε ένα ευρύ αριθμό τομέων, με πολλά «φυσική εικόνα» (μη-μικροσκοπία) εφαρμογές [21]. Για

in vivo

κυτταρική εικόνες μικροσκοπίας, έχουν MRFs έχουν χρησιμοποιηθεί για τον κατακερματισμό της σε συγκεκριμένες εφαρμογές ιστολογία [22, 23] και για την κατάτμηση ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, όπως τα αιμοφόρα αγγεία [24]. Έχουν χρησιμοποιηθεί για

in vitro

κυτταρική μικροσκοπία εικόνες με το τμήμα ατομικών πυρήνων των κυττάρων [25] συμπεριλαμβανομένων χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο σχήμα των πυρήνων πριν από [26, 27]. Μια μέθοδος MRF βάση έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τμηματοποίηση και ταξινόμηση των υπο-κυτταρικών δομών εντός των μεμονωμένων κυττάρων [28].

Έχουμε εφαρμόσει τη μέθοδο 3D τμηματοποίησης μας βασίζεται σε MRFs και να δείξει ότι εκτελεί με ακρίβεια τα δεδομένα εικόνας από πολύπλοκες οργανοτυπικά 3D μοντέλα καρκίνου του προστάτη. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου κατάτμησης μας αποδεικνύεται από τη χρήση διαφορετικών αλλά στενά συνδεδεμένα δεδομένα πειραματική εικόνα και ποσοτικά σε σύγκριση με άλλες μεθόδους κατάτμησης χρήση ετικετών έδαφος αλήθεια. Δείχνουμε ότι MRF μέθοδος μας βασίζεται αποτυπώνει με ακρίβεια βιολογικά σχετικές, αλλά συχνά λεπτότερο και πιο αμυδρά χαρακτηριστικά όπως σύνθετη CAF δομές και τη διάκριση των όγκων σε σχέση με τα κύτταρα του στρώματος σε ένα σκηνικό 3D. Δείχνουμε επίσης ότι η μέθοδος κατάτμησης μας είναι πιο γενικά εφαρμόσιμη σε άλλους τύπους δεδομένων εικόνας κυτταρική μικροσκοπία και δεν περιορίζεται μόνο σε μικροσκόπιο φθορισμού.

Υλικά και μέθοδοι

δεδομένα εικόνας Cellular μικροσκόπιο

Χρησιμοποιούμε 3D στοίβα συνεστιακή δεδομένων μικροσκόπιο εικόνα από τρεις διαφορετικές αλλά στενά συνδεδεμένα οργανοτυπικά 3D μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων, τα οποία αναφέρονται ως «ΑΝ δεδομένα εικόνας», η «ΖΩΝΤΑΝΑ δεδομένα εικόνας» και η «δεδομένα ΡΑΚ εικόνα». Πλήρεις λεπτομέρειες των πειραματικών και απεικόνισης πρωτόκολλα έχουν προηγουμένως δημοσιευθεί [29] και περιγράφονται κατωτέρω εν συντομία. Όλα τα 3D στοίβες των εικόνων τόσο από την ΕΠΕΥ και να ζήσουν τα δεδομένα εικόνας με το χέρι κατά διαστήματα από τους βιολόγους που εκτέλεσε τα πειράματα. Το εγχειρίδιο τμηματοποίησης έγινε στο Adobe Photoshop (Adobe Systems) και οδήγησε σε κάθε pixel δίνεται μια ετικέτα έδαφος αλήθεια είτε «σε καρκινικά κύτταρα εστίασης», «σε CAFS εστίαση» ή «εκτός εστίασης /υπόβαθρο». Αυτές οι ετικέτες έδαφος αλήθεια που χρησιμοποιούνται για την επικύρωση της μεθόδου κατάτμησης μας.

παρασκευάσματα που διατίθενται στο εμπόριο εξωκυττάριας ουσίας (αυξητικός παράγοντας-μειωμένη Matrigel με συγκέντρωση απόθεμα των 8 mg /ml και το κολλαγόνο τύπου Ι, με ένα απόθεμα 3 mg /ml) αγοράστηκαν από την Invitrogen BD και χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα 3D συν-καλλιέργεια. Μια αραίωση 25% ή το 50% του Matrigel χρησιμοποιήθηκε και ένα 1: 1 μίγμα αμφοτέρων των παρασκευασμάτων χρησιμοποιείται συνήθως (2-4 mg /ml Matrigel, 1.5 mg /ml κολλαγόνου). Αμφότερα τα κύτταρα του όγκου και στρωματικά σπάρθηκαν ως εναιωρήματα απλού κυττάρου, με την αρχική πυκνότητες 700-1500 κύτταρα /φρεάτιο. Οι 3D συν-καλλιέργειες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια αρχή «σάντουιτς», όπου όλα τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων στοιχείων στρωματικά σπάρθηκαν στο ίδιο επίπεδο στρώμα για τη διευκόλυνση της απεικόνισης. Κάτω από αυτές τις εγκαταστάσεις, αρχική πυκνότητα σποράς ήταν περίπου 1800 κύτταρα /cm

2.

Στη ρύθμιση συν-καλλιέργεια ΑΝ 3D, LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη [30] ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με CAFS PF179T απομονωθεί από ένα ασθενή με καρκίνο του προστάτη [31], σε μια αρχική αναλογία κύτταρο σπορά 1: 2 σε εξωκυτταρική μήτρα. Μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε. Ένα αντίσωμα ειδικό για παν-κερατίνη χρησιμοποιήθηκε για την ειδική χρώση του organoids όγκου, ενώ CAFS χρώστηκαν με ένα αντίσωμα κατά της ανθρώπινης βιμεντίνης. κύτταρα CAF τελικά συγχωνεύθηκαν σε μεγάλες πολυκύτταρων δομών, οι οποίες χαρακτηριστικά γύρω από την περιφέρεια του organoids όγκου.

Στη ρύθμιση 3D συγκαλλιέργεια LIVE, χρησιμοποιήθηκαν παραλλαγές των ίδιων κυττάρων όπως και για τα δεδομένα της εικόνας αν οριστεί. Σε αυτό το πείραμα, τα κύτταρα όγκου LNCaP που εκφράζουν DsRed πρωτεΐνη συν-καλλιεργήθηκαν με CAFS PF179T εκφράζουν GFP. ως ανωτέρω Χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες πειραματικές συνθήκες, εξωκυττάρια μήτρα εκχυλίσματα και άλλες ρυθμίσεις. Ο σχηματισμός, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη μορφογένεση του organoids όγκου, καθώς και ο σχηματισμός των πολυκύτταρων δομών από απλά CAFS παρακολουθήθηκε επί μια περίοδο 14 ημερών, μετά την οποία διεξήχθη απεικόνισης. Η ρύθμιση συγκαλλιέργεια ΡΑΚ 3D ήταν το ίδιο με το ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΩΝ ρύθμιση με την προσθήκη της κινάσης εστιακής προσκόλλησης αναστολείς (ΡΑΚ) Υ11 και PF-573228 αγοράζονται από Tocris Bioscience. Οι τρεις προϋποθέσεις ήταν: DMSO ελέγχου (0,01%), 5

μ

συγκέντρωση Μ Υ11 και 5

μ

Μ συγκέντρωση PF-573228

Multichannel 3D ομοεστιακό ψηφιακή. εικόνες ελήφθησαν όταν τα κύτταρα του όγκου και CAFS απεικονίστηκαν ξεχωριστά. Και οι δύο τύποι κυττάρων που παρουσιάζονται παρακάτω στο διαφορετικό (ψεύτικο) κανάλια χρώματος: κόκκινο για τα καρκινικά κύτταρα και πράσινο για CAFS. Τα δεδομένα αν και ζωντανή εικόνα αποκτήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Zeiss Axiovert-200M, εξοπλισμένο με περιστρεφόμενο δίσκο συνεστιακή μονάδα Yokogawa CSU22 χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Plan-Neofluar 20 × στόχος (αριθμητικό άνοιγμα 0,17). Τα δεδομένα εικόνας ΑΝ αποτελούνται από 8 στοίβες των εικόνων, ενώ τα ζωντανά στοιχεία της εικόνας αποτελείται από 12 στοίβες των εικόνων. Κάθε εικόνα έχει διάσταση 512 × 672 pixels και τον αριθμό των εικόνων σε ένα ενιαίο κυμαίνεται στοίβα από 9 έως 22. Για όλες τις εικόνες από τα δύο σύνολα δεδομένων, ένα εικονοστοιχείο ≈ 0,5

μ

m μέσα σε μια εικόνα και την απόσταση μεταξύ παρακείμενα εικόνες σε μια στοίβα είναι 10

μ

m. Τα δεδομένα εικόνας ΡΑΚ αποκτήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Plan-Neofluar 5 × στόχος (αριθμητικό άνοιγμα 0,16) και αποτελούνται από 24 στοίβες των εικόνων (8 για κάθε κατάσταση). Ένα pixel ≈ 2.5

μ

m μέσα σε μια εικόνα και η απόσταση μεταξύ γειτονικών εικόνων σε μια στοίβα είναι 40

μ

m. Κάθε εικόνα έχει διάσταση 512 × 672 pixels και τον αριθμό των εικόνων σε ένα ενιαίο στοίβα είναι 18.

Μια ανεξάρτητη, χαμηλότερη πολυπλοκότητα εικόνα 2D σύνολο δεδομένων (BBBC003v1) που παρέχονται στη συλλογή Benchmark Ευρεία bioimage [32] είναι επίσης που χρησιμοποιούνται για την επικύρωση του κατακερματισμού. Τα δεδομένα αποτελούνται από 15 εικόνες της ενιαίας πολυκύτταρων εμβρύων ποντικού, καθένα από τα οποία είναι 640 × 480 pixel σε κλίμακα του γκρι εικόνα που έχετε τραβήξει με το διαφορικό μικροσκοπία αντίθεσης παρέμβαση και με λόγο αλήθειας τμηματοποίηση του συνόλου της δομής του εμβρύου. Εμείς επιπλέον να εξετάσει την απόδοση του κατακερματισμού με την αντίθεση «μελάνωμα» 2D φάση και δεδομένων εικόνας »Tscratch» (BBBC019), επίσης από τη Συλλογή Benchmark Ευρεία bioimage. Τα δεδομένα Μελάνωμα εικόνα αποτελείται από 20 εικόνες έκαστο με διαστάσεις 1024 × 1280 pixels, ενώ τα δεδομένα Tscratch εικόνα αποτελείται από 24 εικόνες έκαστο με διαστάσεις 1028 × 1384 pixels. Και τα δύο σύνολα δεδομένων είναι από το «επούλωση των πληγών» πειράματα με κατατμήσεις έδαφος αλήθεια παρέχονται επίσης.

μέθοδος τμηματοποίησης

Στο πλαίσιο Markov τυχαίο πεδίο (MRF), δίνεται κάθε pixel μιας ψηφιακής εικόνας ενός ετικέτα από κάποια προκαθορισμένα σετ (κλασικά «προσκήνιο» και «φόντο» για τμηματοποίηση). Βρίσκουμε την επισήμανση που βελτιστοποιεί μια αντίστοιχη λειτουργία ενέργειας έτσι ώστε η ετικέτα του κάθε pixel αντιστοιχεί στην παρατηρούμενη τιμή pixel και έτσι ώστε να υπάρχει μια «ομαλή» επισήμανσης σε ολόκληρη την εικόνα. Για κάθε εικονοστοιχείο

i

σε μια ψηφιακή εικόνα, ας

X

i

και

Z

i

είναι οι τυχαίες μεταβλητές για την ετικέτα pixel (απαρατήρητο) και έντασης των εικονοστοιχείων (παρατηρήθηκε), αντίστοιχα. Αφήστε την συλλογή των τυχαίων μεταβλητών για όλα τα εικονοστοιχεία έχει η γραφική παράσταση υπό όρους ανεξαρτησία δίνεται στο Σχήμα 1. Στη συνέχεια, η συλλογή των τυχαίων μεταβλητών είναι υπό όρους MRF με αντίστοιχη ενεργειακή λειτουργία (1) για εικονοστοιχεία

i

και γειτονικά ζεύγη pixels (

i

,

ι

) με τις ετικέτες

l

και

k

, και όπου

I

είναι η λειτουργία δείκτη, ( 2)

Η

Θα βρείτε τις ελάχιστες ενεργειακές ετικέτες (τμηματοποίηση)

Οι μοναδιαίος δυναμικά

u

i

?

l

ορίζονται ως (3) όπου

z

i

είναι η παρατηρούμενη τιμή pixel και π

l

είναι η πυκνότητα πιθανότητας λειτουργία που αντιστοιχεί στην ετικέτα

l

. Τα ζεύγη δυναμικά

w

ij

?

LK

ορίζονται να είναι (4) όπου

z

i

και

z

ι

είναι οι παρατηρούμενες τιμές pixel,

λ

0,

λ

1 και

β

είναι παράμετροι που θα ορίσετε, και dist (

i

,

ι

) είναι η απόσταση μεταξύ των πίξελ

i

και

ι

. Σημειώστε ότι η απόσταση μπορεί να είναι διαφορετική για τις γειτονικές pixels μέσα σε μια εικόνα σε σύγκριση με γειτονικά εικονοστοιχεία μεταξύ των εικόνων ανάλογα με την ανάλυση των δεδομένων εικόνας σε κάθε διάσταση.

Οι κορυφές και ακμές ενός γραφήματος υπό όρους ανεξαρτησία κωδικοποιούν την υπό όρους ανεξαρτησία ιδιότητες της αντίστοιχης σειράς τυχαίων μεταβλητών. Στην υπό όρους MRF γράφημα (Σχήμα 1), κάθε ακμή αντιστοιχεί είτε σε ένα μοναδιαίο (

X

i

,

Z

i

) ή ανά ζεύγος (

X

i

,

X

⋅) δυναμικό στην αντίστοιχη ενεργειακή λειτουργία εξίσωση (1). Σχήμα 1 δείχνει ένα 6-γείτονα όρους MRF (6 ζεύγη δυνατότητες για κάθε pixel), που χρησιμοποιούμε για τη μέθοδο 3D τμηματοποίηση μας. Κάθε pixel έχει 4 γείτονες μέσα σε μια εικόνα και 2 γείτονες μεταξύ των εικόνων στο 3D στοίβα, με λιγότερο γείτονες για pixels στα σύνορα της στοίβας.

Οι μοναδιαίο και ζεύγη δυνατότητες καθιερώσει την αλληλογραφία και «ομαλότητα» της συνολική επισήμανση pixel αντίστοιχα. Οι παράμετροι

λ

0,

λ

1 και

β

καθορίσει το ποσό της επιρροής που τα ζεύγη δυνατότητες έχουν πάνω τους μοναδιαίος δυναμικά στην ελαχιστοποίηση της συνάρτησης ενέργειας (1). Το εμπόριο-off είναι ότι χρειαζόμαστε μια επισήμανση με «λεία» συνεχόμενες τμηματικές περιοχές (γειτονικά pixels έχουν την ίδια ετικέτα), αλλά επίσης θέλουν να διατηρήσουν ασυνέχειες παρόντες στην εικόνα (S1 Σχήμα). Η μορφή των μοναδιαίος και ζεύγη δυνατότητες είναι πρότυπο για το MRF πρόβλημα του κατακερματισμού [33]. Οι δυνατότητες πληρούν την προϋπόθεση υπο-σπονδυλωτής που εγγυάται την ύπαρξη ενός ελάχιστου ενεργειακή λύση στην δυαδική περίπτωση ετικέτα και επιτρέπει την προσέγγιση της ελάχιστης ενεργειακή λύση στην περίπτωση πολλαπλών ετικέτα [34].

Για για να ρυθμίσετε τα μοναδιαίος δυναμικά την εξίσωση (3) είμαστε απαιτούν π συνάρτηση πυκνότητας

l

πάνω από τις τιμές των εικονοστοιχείων που αντιστοιχούν σε κάθε ετικέτα

l

. Η τυπική μέθοδος είναι να χρησιμοποιήσει μια διαδικασία «διαδραστική κατάτμησης» και να έχουν το χρήστη με το χέρι «σπόροι» περιοχές της εικόνας για κάθε ετικέτα [33]. Στη συνέχεια, τα εμπειρικά κατανομές των σπαρμένων περιοχών που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των μοναδιαίος δυνατότητες. Αντί χειροκίνητα σπορά της εικόνας, που ταιριάζουν σε ένα μονομεταβλητό Gaussian μοντέλο μείγμα με τρία συστατικά με την πυκνότητα των παρατηρούμενων τιμών pixel στα κόκκινα και πράσινα κανάλια ξεχωριστά. Οι πυκνότητες που χρησιμοποιούνται για τις ετικέτες κατάτμησης συνέχεια διδιάστατες μείγματα των μονομεταβλητών συστατικά που λαμβάνονται σε κάθε κανάλι χρώματος (σχήμα 2)

Οι τρεις ετικέτες είναι:. «Στο επίκεντρο» τα καρκινικά κύτταρα με ένα μίγμα «εκτός εστίασης «CAFS και« φόντο »στην άλλη διάσταση (κόκκινο),« στο επίκεντρο »CAFS με ένα μείγμα« εκτός εστίασης »τα καρκινικά κύτταρα και« φόντο »στην άλλη διάσταση (πράσινο) και ένα μείγμα« εκτός εστίασης » και «φόντο» και στις δύο διαστάσεις (διακεκομμένη).

Η

Οι παράμετροι

λ

0,

λ

1 και

β οι

καθορίζονται με βάση τις κατανομές των μοναδιαίος δυνατότητες για την εξισορρόπηση του trade-off μεταξύ της αλληλογραφίας και την ομαλότητα στην έξοδο κατάτμησης. Αν και υπάρχουν μέθοδοι για την εκμάθηση αυτών των παραμέτρων χρησιμοποιώντας ένα σύνολο εκπαίδευσης του εδάφους αλήθειας επισημασμένου δεδομένα εικόνας, αυτές οι μέθοδοι είναι πολύ δαπανηρές υπολογιστικά και έτσι δεν χρησιμοποιείται συχνά στην πράξη [35]. Επιπλέον, μια επισήμανση έδαφος αλήθεια είναι σπάνια διαθέσιμα στις περισσότερες εφαρμογές. Για κάθε στοίβα από εικόνες που setandso ότι τα μοναδιαία και ζεύγη δυναμικά μοιράζονται το ίδιο εύρος. Η αξία των

β

ρυθμίζεται χειροκίνητα σε έναν υποψήφιο στοίβα των εικόνων και η ίδια αξία χρησιμοποιείται για όλες τις άλλες στοίβες από το ίδιο πείραμα.

Ως ένα βήμα προ-επεξεργασίας, χρησιμοποιούμε ένα τοπικό φίλτρο εντροπία [9] για την ποσοτικοποίηση των τοπικών υφή (built-in entropyfilt λειτουργία του MATLAB Επεξεργασία εικόνας Toolbox). Το τοπικό φίλτρο εντροπίας εφαρμόζεται τόσο για τα κόκκινα και πράσινα κανάλια ξεχωριστά. Οι πρώτες αποχρώσεις του γκρι εικόνες κάτω-δείγμα σε 8-bit, ώστε κάθε pixel αντιστοιχεί άμεσα σε μια τιμή έντασης στο σύνολο {0, 1, …, 255}. Για κάθε εικονοστοιχείο

i

, η τοπική εντροπία φιλτραρισμένη τιμή iswhere

σ

ι

είναι το ποσοστό των pixels στη γειτονιά που έχουν την ίδια ένταση σε pixel em

ι

. Η γειτονιά του κάθε pixel

i

είναι η πλατεία 9 × 9 επίκεντρο pixel

i

χωρίς αποκλεισμούς με συμμετρική padding γύρω από τα σύνορα της εικόνας.

μέθοδο 3D κατάτμησης μας είναι συνοψίζονται στα παρακάτω βήματα (Σχήμα 3):

Διαδικασία η 3D στοίβα των εικόνων χρησιμοποιώντας το τοπικό φίλτρο εντροπίας στο κόκκινο (τα καρκινικά κύτταρα) και πράσινο (CAFS) κανάλια ξεχωριστά,

Fit μονοπαραγοντική Gaussian μοντέλα μείγμα με τις φιλτραρισμένες τιμές pixel στο κόκκινο (τα καρκινικά κύτταρα) και πράσινο (CAFS) κανάλια ξεχωριστά,

Συνδυάστε τις πυκνότητες μίγματος (Σχήμα 2) και υπολογίζονται τα μοναδιαία και ζεύγη δυνατότητες,

Βρείτε την ελάχιστη ενεργειακή επισήμανση.

η

Ομοεστιακή μικροσκόπιο χρησιμοποιείται για μοντέλα 3D εικόνα συγκαλλιέργειας με αποτέλεσμα ένα 3D στοίβα των εικόνων. μέθοδο 3D κατάτμησης μας εφαρμόζεται στο 3D στοίβα των εικόνων που προκύπτουν σε 3D παραγωγή τμηματοποίησης.

Η

Εμείς εφαρμοστεί η μέθοδος κατάτμησης μας στο MATLAB και να χρησιμοποιηθεί το

α

-expansion αλγόριθμο για να βρείτε το ελάχιστη ενεργειακή επισήμανση [34, 36, 37].

μέθοδο επικύρωσης

Όχι μόνο εργαλείο είναι διαθέσιμο για να εκτελέσει την απαιτούμενη κατάτμησης για οποιοδήποτε δεδομένο σύνολο δεδομένων. Κάθε μέθοδος έχει τα δικά της πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα και είναι συχνά προσαρμοσμένη στις ειδικές εφαρμογές όπως είναι η χρήση εκ των προτέρων πληροφορίες σχήματος όταν τμηματοποίηση μονά κύτταρα ή κυτταρικών πυρήνων [25-27]. Αν και υπάρχουν πολλές εξελιγμένες μεθόδους κατάτμησης, δεν είμαστε ενήμεροι για οποιαδήποτε άλλη που θα ήταν κατάλληλο να ισχύει για τα 3D δεδομένα στοίβας εικόνας από σύνθετο μοντέλο μας κουλτούρα 3D κυττάρων. Ως εκ τούτου, για λόγους σύγκρισης, χρησιμοποιούμε μια σειρά από τυποποιημένες μεθόδους κατάτμησης που μπορεί να θεωρηθεί ως «δημιουργία» για να MRF προσέγγισή μας:

intOtsu Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο οτσού [38] για να κατώτατο όριο τα κόκκινα και πράσινα κανάλια ένταση ξεχωριστά και συνδυάζοντας τις ετικέτες έτσι ώστε «καρκινικό κύτταρο» ή «CAF» διαγραφές «φόντο», ή αν ένα pixel είναι χαρακτηρισμένα τόσο «καρκινικό κύτταρο» και «CAF» είναι τυχαία μία από αυτές τις ετικέτες.

entOtsu χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Otsu να κατωφλίου η τοπική εντροπία διηθείται κόκκινα και πράσινα κανάλια ξεχωριστά και συνδυάζοντας τις ετικέτες χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία όπως παραπάνω.

μείγματα κατωφλίου των τοπικών εντροπία φιλτραρισμένες εικόνες χρησιμοποιώντας τα διμεταβλητή μίγμα πυκνότητες (Σχήμα 2).

MRF Η μέθοδος που παρουσιάζεται σε αυτή την εργασία.

Η

μέθοδο οτσού βρίσκει την παγκόσμια όριο που μεγιστοποιεί το μεταξύ τάξης διακύμανσης των προκυπτόντων ομάδες και είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για βασικές αποχρώσεις του γκρι εικόνα κατάτμησης [ ,,,0],9]. μοντέλα μείγμα είναι οι ίδιοι, επίσης, χρησιμοποιείται ευρέως για πολλές εφαρμογές τμηματοποίησης εικόνας [39]. Δεδομένου ότι οι διμεταβλητή μείγματα που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των μοναδιαίος δυναμικά στο MRF με βάση τη μέθοδο τμηματοποίησης μας, η μέθοδος των «μείγματα» είναι ισοδύναμη με τη μέθοδο MRF που παρουσιάζονται σε αυτό το χαρτί με

λ

0 =

λ

1 = 0.

Η έξοδος από τις τέσσερις μεθόδους κατάτμησης είναι σε σύγκριση με τις ετικέτες έδαφος αλήθεια χρησιμοποιώντας τη γενική μακροοικονομική F

1-score, την αρμονική μέση τιμή της ακρίβειας ταξινόμησης και Υπενθυμίζουμε [40]. Ως εκ τούτου, F

1-score = 1 για ένα τέλειο επισήμανση. Τα δεδομένα της εικόνας αν και ζωντανή, καθώς και τα ανεξάρτητα στοιχεία του εμβρύου ποντικιού εικόνας που χρησιμοποιείται για την επικύρωση.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σας παρουσιάζουμε μια σειρά από αποτελέσματα, προκειμένου να συζητήσουν τα οφέλη της MRF μας με βάση τη μέθοδο για την ιδιαίτερα πολύπλοκη βιολογική εφαρμογή μας, ειδικότερα, πολυκαναλικό 3D δεδομένα εικόνας με μεγάλες αποστάσεις μεταξύ των εικόνων στη στοίβα. Χρησιμοποιώντας το 3D εξόδου τμηματοποίηση, είναι δυνατόν να διερευνηθεί εάν τα καρκινικά κύτταρα και CAFS σχηματίζουν επαφές μεταξύ κυττάρων ή διαχωρίζονται στις μας 3D μοντέλο συν-καλλιέργειας, η οποία έχει σημαντικές επιπτώσεις για τη βιολογία του όγκου. Δείχνουμε επιπλέον την χρησιμότητα της τοπικής φίλτρου εντροπίας και ότι η προσέγγισή μας βασίζεται MRF αποκτά τα πιο ακριβή αποτελέσματα κατάτμησης. Ο κωδικός για τη μέθοδο κατάτμησης μας, τα δεδομένα εικόνας και οι ετικέτες έδαφος αλήθεια είναι όλα παρέχονται ως συμπληρωματικό υλικό (S1, S2 και S3 Files).

εξόδου Τμηματοποίηση προτείνει την φυσική επαφή των πολυκύτταρων όγκου και δομών CAF

Η έξοδος της μεθόδου 3D κατάτμησης μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διερευνηθεί αν organoids πολυκύτταρων όγκου και δομών CAF βρίσκονται σε άμεση επαφή.

Χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο για τα αποτελέσματα της εικόνας 3D κυτταρικής καλλιέργειας σε ένα 3D στοίβα από εικόνες που αντιστοιχούν σε μια σειρά παράλληλων εστιακά επίπεδα. Μια μέγιστη προβολή έντασης μπορεί να επιτευχθεί με την προβολή τις μέγιστες τιμές έντασης των εικονοστοιχείων στην (

x

,

y

) αεροπλάνο. Παρά το γεγονός ότι ένα σημαντικό ποσό των πληροφοριών μπορεί να χαθεί, η ανάλυση των προοπτικών 2D εικόνα είναι πολύ πιο ανεπτυγμένες και λιγότερο υπολογιστικά ακριβά από ό, λαμβάνοντας υπόψη το σύνολο 3D στοίβα των εικόνων. Για τους λόγους αυτούς, οι τρέχουσες πλαίσια ανάλυσης εικόνας για 3D μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων του καρκίνου του προστάτη με βάση τη μέγιστη προβολές ένταση [41, 42]. Αν και μέγιστη ένταση προεξοχές μπορεί να είναι κατάλληλες για την ανάλυση μοντέλων μονοκαλλιέργεια για ορισμένες εφαρμογές, δεν είναι κατάλληλες για πιο σύνθετες οργανοτυπικά μοντέλα όπως μοντέλα συν-καλλιέργειας. Από όλες τις διαρθρωτικές πληροφορίες που προβάλλεται σε η (

x

,

y

) αεροπλάνο, δεν θα ήταν δυνατό να προσδιοριστεί εάν organoids όγκου και CAFS είναι σε άμεση επαφή ή να διαχωρίζονται φυσικά με τη χρήση ενός 2D ανάλυση .

Σχήμα 4 (α) δείχνει τη μέγιστη προβολή έντασης τόσο τα κόκκινα και πράσινα κανάλια (ψευδές χρώμα) για ένα παράδειγμα 3D στοίβα. Παραμένει ασαφές αν η κεντρική όγκου και δομών ΚΠΑ είναι σε άμεση επαφή. Οι δομές CAF φαίνεται να βρίσκεται εντός της δομής του όγκου (μπλε βέλος), η οποία είναι βιολογικά άνευ σημασίας. Σε κλινικά δείγματα όγκων, ινοβλάστες δεν είναι συνήθως βρίσκονται μέσα organoids όγκου, αλλά χαρακτηριστικά μόνο surround επιθηλιακά (όγκου) αδρανών υλικών. Μόνο περιστασιακά, CAFS μπορεί να έρθει σε επαφή με καρκινικά κύτταρα στην επιφάνεια των δομών του όγκου.

(α) Μέγιστη προβολή ένταση του αντιπροσωπευτικού 3D στοίβα. (Β) – (δ) Διαφορετικές απόψεις για την αντίστοιχη 3D εξόδου τμηματοποίηση χρησιμοποιώντας MRF μέθοδος μας βασίζεται. Το μπλε βέλος δείχνει όπου οι CAFS φαίνεται να είναι στο εσωτερικό του όγκου οργανοειδή στη μέγιστη προβολή έντασης, αλλά μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι έξω από το 3D εξόδου κατάτμησης. Δείτε S1 βίντεο για ένα βίντεο του 3D εξόδου κατάτμησης.

Η

Το 3D κατάτμηση των καρκινικών κυττάρων (κόκκινο) και CAFS (πράσινο) απεικονίζεται στο Σχήμα 4 (β) και 4 (δ). Η έξοδος του κατακερματισμού υπογραμμίζει πιο συγκεκριμένα διαστήματα περιφέρειες που αντιστοιχούν στο ΚΠΑ δομές που βρίσκονται σε άμεση επαφή με τις τμηματικές περιοχές που αντιστοιχούν σε πολυκύτταρους δομή του όγκου. Ειδικότερα, οι CAFS που φαίνεται να βρίσκεται μέσα στη δομή του όγκου της μέγιστης προβολής εντάσεως (σχήμα 4 (α)) μπορεί τώρα να θεωρηθεί ότι είναι έξω, αλλά σε επαφή με τις δύο πλευρές του κεντρικού όγκου οργανοειδούς (μπλε βέλος). S1 Βίντεο παρέχει πρόσθετες απόψεις σχετικά με το 3D τμηματοποίηση.

Το 3D που παρέχονται εξόδου κατάτμησης (Σχήμα 4 (β) και 4 (δ)) φαίνεται μάλλον «θολή», ειδικά σε

z

όπου η οργανοειδή όγκος έχει μια «επίπεδη κορυφή». Αυτό είναι ένα χαρακτηριστικό των δεδομένων εικόνας και οφείλεται στη σχετική αραιότητας των δεδομένων στο

z

. Δεν θα ήταν σκόπιμο να προεκτείνουν την απόδοση, έτσι ώστε οι organoids όγκου μοιάζουν περισσότερο με «στρογγυλά σφαιρίδια» σε 3D, καθώς αυτό ενδεχομένως θα συγχύσει σημαντικές δομικές πληροφορίες και δεν θα πρέπει να υποστηρίζεται από την ανάλυση των δεδομένων εικόνας.

είναι δυνατόν να προσδιοριστούν με το χέρι, αν και η οποία κατά διαστήματα περιοχές CAF βρίσκονται σε άμεση επαφή με τις τμηματικές organoids όγκου με την οπτικοποίηση την προϋπόθεση εξόδου 3D κατάτμησης μας. Για να αποδείξει την απόδειξη της έννοιας του αυτόματα την ποσοτικοποίηση του όγκου-στρώματος επαφή με την έξοδο του κατακερματισμού, θεωρούμε τα δεδομένα ΡΑΚ εικόνας (S2 σχήμα). Με MRF τμηματοποίηση μας, θεωρούμε ότι η επαφή μεταξύ των «καρκινικά κύτταρα» και κατακερματισμένες περιοχές »CAFS» θα δώσει μια εκτίμηση της επαφής με όγκο στρώμα στο μοντέλο.

Σχήμα 5 δείχνει διαγράμματα διασποράς του συνολικού όγκου , συνολικής επιφάνειας και το συνολικό επαφής για τα διαστήματα «καρκινικά κύτταρα» και τις περιφέρειες «CAFS ‘στα δεδομένα εικόνας FAK. Ο συνολικός όγκος είναι ο συνολικός αριθμός των επισημασμένων pixels, συνολικής επιφάνειας είναι ο συνολικός αριθμός των επισημασμένων pixels δίπλα σε ένα pixel με άλλη ετικέτα και η συνολική επαφή είναι ο συνολικός αριθμός των επισημασμένων «καρκινικά κύτταρα» και pixels »CAFS» που είναι γειτονικά. Ο συνολικός όγκος και η συνολική επιφάνεια των δύο organoids όγκου και δομές CAF είναι γενικά μικρότερα κατόπιν αναστολής ΡΑΚ (Σχήμα 5 (α) και 5 (β)) και αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες [29]. οθόνες ελέγχου DMSO μια βασική γραμμή επαφής όγκου-στρώματος (Σχήμα 5 (γ)) και οι αναστολείς ΡΑΚ διαταράξει προφανώς αυτήν την επαφή. Με την Υ11 αναστολέα, φαίνεται να είναι λιγότερη επαφή κατά μέσο όρο εκεί, ωστόσο η επαφή είναι επίσης πιο μεταβλητή. Υπάρχουν δύο στοίβες εικόνα που έχουν υψηλότερο συνολικό όγκο, επιφάνειας και σε επαφή με συγκεκριμένα (υποδεικνύεται από το μπλε αστερίσκους στο S2 σχήμα). Είναι σαφές ότι PF-573228 αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων οργανοειδούς (σχήμα 5 (α) και 5 (β)) και ως εκ τούτου υπάρχουν λίγες φυσικές επαφές μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων (Σχήμα 5 (c)). Μια δοκιμασία Kruskal-Wallis πραγματοποιήθηκε σε συνολικό επαφής (σχήμα 5 (c)) και η μηδενική υπόθεση ότι τα διάφορα δείγματα είναι όλα υλοποιήσεις της ίδιας κατανομής απορρίφθηκε (p-value = 2,6 × 10

-4). Αντίστοιχα ζεύγη συγκρίσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney

U

δοκιμής.