Αφηρημένο

E-cadherin συχνά χάνεται κατά τη διάρκεια επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης και την εξέλιξη των επιθηλιακών ογκογένεσης. Βρήκαμε ένα δείκτη του επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης, CD44, ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση σε λειτουργική απώλεια Ε-καδερίνης σε οισοφαγικό κυτταρικές γραμμές και τον καρκίνο. Η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση του CD44 πρότυπο ισομορφής. Χρησιμοποιώντας ένα οργανοτυπικό μοντέλο ανακατασκευάσει, δείχνουμε αυξημένη έκφραση CD44 σε περιοχές της κυτταρικής εισβολής συνδέεται με την ΜΜΡ-9 στην αιχμή. Επιπλέον, η ακτιβίνη Α αυξάνει εισβολή κύτταρο μέσω CD44 ρύθμιση προς τα πάνω μετά την απώλεια Ε-καδερίνης. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας παρέχουν λειτουργικά στοιχεία CD44 ρύθμιση προς τα άνω σε οισοφάγου εισβολή του καρκίνου

Παράθεση:. Le Bras GF, Allison GL, Richards NF, Ansari SS, Ουάσιγκτον ΜΚ, andl CD (2011) CD44 Η αναβάθμιση στην Ε- καντερίνης-Αρνητική οισοφάγου Αποτελέσματα σε κυτταρική διείσδυση. PLoS ONE 6 (11): e27063. doi: 10.1371 /journal.pone.0027063

Συντάκτης: Adam Ι Marcus, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιούλη 2011? Αποδεκτές: 10 Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 1, Νοέμ 2011

Copyright: © 2011 Le Bras et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. CDA είναι ο αποδέκτης μιας Μελετητή Βραβείο Έρευνας της αμερικανικής Γαστρεντερολογικής Association (AGA) /Ίδρυμα Πεπτικό Σύστημα Υγείας και Διατροφής (FDHN) και χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (DK075379). Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε την ανοσοϊστολογία Core και το Μεταγραφική πυρήνα στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt για την κοπή και χρώσεις IHC, και άλλες εγκαταστάσεις πυρήνα που υποστηρίζονται μέσω του Πεπτικού Disease Research Center (P30-DK058404) και τη χορήγηση Vanderbilt Ingram Cancer Center Support (P30-CA068485). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CD44, ή ινδική ομάδα αίματος, είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη και ένας υποδοχέας για το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), ένα κύριο συστατικό της εξωκυττάριας μήτρας [1]. CD44 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ακεραιότητα των ιστών και εμπλέκεται σε πολλές λειτουργίες που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου όπως κύτταρο μετανάστευση [2], η αντίσταση στην απόπτωση [3] και την παρουσίαση των αυξητικών παραγόντων και πρωτεάσες [4], [5]. Επιπλέον, CD44 έχει ταυτοποιηθεί ως ειδικός δείκτης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [6], [7] και των καρκινικών κυττάρων που υποβάλλονται σε επιθηλιακή-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) -όπως διαδικασία [8]. Οι διαφορετικές ισομορφές μεταφράζονται λόγω εναλλακτικό μάτισμα εξωνίων 6-15 [9]. Το τυποποιημένο έντυπο του CD44 (CD44s) πιστεύεται ότι εκφράζεται παντού, ενώ μερικές μορφές παραλλαγή, CD44v, έχουν συσχετιστεί με μετάσταση [10].

Ένα σημαντικό βήμα της EMT είναι η απώλεια της E-cadherin. E-cadherin είναι ένα βασικό συστατικό των ενώσεων προσφύσεως και μεσολαβεί κυτταρική πρόσφυση αλληλεπιδρώντας με τις κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες β-κατενίνης [11] και p120 [12]. Οι ενώσεις προσφύσεως συνδέονται με το ακτίνης του κυτταροσκελετού μέσω κυτταροπλασματική συνδέτες όπως α-κατενίνης [13]. Ε-καδερίνης μπορεί να κατασταλεί μέσω μεταγραφικά Snail1, Snail2, Twist, Zeb1 και Zeb2, η οποία μπορεί να ρυθμίζεται με τον ΤΟΡβ [14]. Η διέγερση των κυττάρων καρκίνου του μαστού με ΤΟΡβ αποτελέσματα συν-εντοπισμό της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας ΜΤ1-ΜΜΡ και CD44 στην κυτταρική μεμβράνη και προκαλεί διάσπαση CD44 οδηγεί σε υψηλά επίπεδα διαλυτής CD44 [15]. Αντιστρόφως, η αλληλεπίδραση μεταξύ υαλουρονάνη και CD44 ρυθμίζει την κυκλοφορία του υποδοχέα ΤΟΡβ, η οποία μπορεί να ρυθμίσει TGFβ σηματοδότηση [16].

Κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ, επιθηλιακά κύτταρα εκφράζουν δείκτες όπως CD44, τα οποία είναι γνωστό ότι εκφράζονται σε καρκινικά βλαστοκύτταρα [ ,,,0],8]. Η ακτιβίνη Α έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας βασικός ρυθμιστής του βλαστική ικανότητα [17]. Η ακτιβίνη Α, ένα μέλος της υπεροικογένειας ΤΟΡβ, έχει επίσης περιγραφεί ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη, την αιμοποίηση και ογκογένεση [18] – [24]. Συνεπώς, θέλαμε να προσδιοριστεί αν η ακτιβίνη Α επάγει ΕΜΤ σε οισοφάγου κύτταρα και έτσι συνδέει την επαγωγή κυτταρικής εισβολής σε ακτιβίνη Α και η έκφραση CD44.

Έχουμε προηγουμένως δείξει τη συντονισμένη απώλεια της Ε-καδερίνης και ΤGFβ-υποδοχέα II (ΤΟΡβΚΙΙ) σε οισοφαγικό καρκίνωμα [25]. Άλλες αναφορές έχουν δείξει τη σημασία του CD44 σε οισοφαγικού πλακώδους καρκινώματος επιδεικνύοντας μια υψηλότερη έκφραση της CD44v6 [26], [27], αλλά ο αντίκτυπός της στην εισβολή του όγκου παραμένει αμφιλεγόμενη. Ως εκ τούτου, έχουμε ως στόχο να μελετήσει την έκφραση CD44 σε οισοφάγου πλακώδες επιθήλιο

in vivo

και

in vitro

. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι CD44 ρύθμιση προς τα πάνω συνδέεται με την απώλεια Ε-καδερίνης σε πρωτογενείς οισοφάγου καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου. Λειτουργικά, καταδείξαμε ότι η Ακτιβίνη Α σηματοδότησης απουσία Ε-καδερίνης μπορεί να ρυθμίζει προς τα πάνω CD44. Επιπλέον, CD44 άγκυρες ΜΜΡ-9 στην επεμβατική μπροστά μεταφράζεται σε αυξημένη κυτταρική εισβολή. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν σημαντικές συνέπειες για έναν νέο ρόλο της Ακτιβίνης Α στην επαγωγή της EMT με ρύθμιση προς τα άνω του CD44.

Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Πρωτοβάθμια οισοφάγου επιθηλιακά κύτταρα (κερατινοκύτταρα) από φυσιολογικό ανθρώπινο οισοφάγο καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, τα υπερκείμενα που περιέχουν pFB-neo ρετροϊό που κωδικοποιεί είτε πλήρους μήκους Ε-καδερίνης ή κυρίαρχο-αρνητικό μετάλλαγμα της Ε-καδερίνης στερούνται την κυτταροπλασματική ουρά (που ορίζεται ως ΕΚ) χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση των hTERT-αθανατοποιημένων, αλλά μη μετασχηματισμένα, οισοφαγική επιθηλιακά κύτταρα [28]. Αδειάστε pFBneo χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Επιπλέον, μια κυρίαρχη-αρνητική μεταλλαγμένη του ΤΟΡβΚΙΙ (ένα δώρο του Dr. Η Moses, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Nashville, ΤΝ), υποκλωνοποιήθηκε σε ρΒΑΒΕ puro, χρησιμοποιήθηκε για να παράγει κύτταρα ECdnT και κενές ρΒΑΒΕ puro ως έλεγχος. Πλήρους μήκους Ε-καδερίνης σε pFBneo χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αποκατάσταση της έκφρασης Ε-καδερίνης σε ΤΕ-8 και τα κύτταρα FLO-1. Εμβρύου οισοφάγου ινοβλάστες αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Οι οισοφάγου πλακωδών κυτταρικές σειρές καρκινώματος, κύτταρα ΤΕ, ήταν ένα είδος δώρο από Drs. Rustgi και Nakagawa (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). Αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου κυτταρικές σειρές OE33, FLO-1 και SK-GT-4 [29] – [31] και οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές κεφαλής και λαιμού JHU-012 και JHU-013 αναπτύχθηκαν από την πρωτογενή κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων στο τμήμα της κεφαλής και του τραχήλου Έρευνα στο Πανεπιστήμιο Johns Hopkins.

Για την αναστολή της E-cadherin, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2x 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 6- καλά. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αλλάχθηκε σε DMEM ελεύθερο ορού και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μια τελική συγκέντρωση 10 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας επιμόλυνση με φωσφορικό ασβέστιο (400 μί RNAse ελεύθερο νερό αναμίχθηκε με 50 μι 2,5 Μ CaCl

2, 50 μι 2 μΜ siRNA με 500 μι HBSP2x (280 mM NaCl, 1,5 mM Να

2 ΡΟ

42H

2O, 12 mM γλυκόζη, 10 mM KCL, 50 mM HEPES pH7.05 σε 500 mL RNAse- ελεύθερο νερό)). siRNA ελήφθησαν από Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), Hs-CDH1_12 (SI1) και Hs_CDH1_13 (SI2) χρησιμοποιήθηκαν εναντίον E-cadherin και Allstars αρνητική, μη φίμωση ανιχνευτές siRNA χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο (ctrl). Για διέγερση, 20 ng /ml Ακτιβίνης Α (R &? D, Minneapolis, MN) προστέθηκε στην καλλιέργεια

μικροσυστοιχίες ιστών

οισοφάγου ιστών πλακώδους καρκινώματος αγοραστεί μέσω χειρουργικής στο Okayama. Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Kitano Νοσοκομείο και το Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια, μέσω της Συνεργατικής Ανθρώπινο Δίκτυο Tissue (CHTN). Όλα ήταν παθολογικά διαγνωστεί ως οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) [32]. Επιπλέον, μια εμπορική σειρά ιστού για ESCC, AccuMax Array (ISU ABXIS, Co., διανέμεται από την Accurate Chemical & amp? Scientific Corp., Westbury, ΝΥ) που περιέχει 80 οισοφάγου καρκίνο εκ πλακωδών φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) ιστούς από τους 40 ασθενείς και 4 φυσιολογικούς ελέγχους χρησιμοποιήθηκε για immunhistochemical χρώση. Μαζί, τα δεδομένα θα μπορούσαν να συλλέγονται για 166 εκ πλακωδών δείγματα όγκων, 2 περιπτώσεις με την εξέλιξη από το φυσιολογικό, καρκίνωμα

in situ

να ESCC, και επιπλέον φυσιολογικούς μάρτυρες ιστού.

Εκατόν-και- τριάντα τρεις οισοφαγικού αδενοκαρκινώματος (ΑΗΚ) δείγματα FFPE αναλύθηκαν μετά ανοσοϊστοχημική χρώση. Αυτά τα δείγματα ελήφθησαν από τα αρχεία των υπηρεσιών της παθολογίας στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt (Nashville, TN, USA), του Πανεπιστημίου Otto-von-Guericke (Μαγδεμβούργο, Γερμανία) και από την CHTN [33]. Ιστοπαθολογική διάγνωση του Barrett οισοφάγος, δυσπλασία και αδενοκαρκίνωμα οισοφάγου ελέγχθηκε βάσει του H & amp? E-βάφονται τμήματα σύμφωνα με την ταξινόμηση της Βιέννης του γαστρεντερικού επιθηλιακών νεοπλασιών [34]. χρώση ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας αντι-τηγάνι αντίσωμα CD44, κλώνος F10-44-2, και αντι-Ε-καδερίνης αντίσωμα, κλώνος 36. Έκφραση βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0 έως 3 με το 0 να απουσιάζει, και 3 είναι η υψηλότερη ένταση σήματος , και μεμβρανώδης ή κυτταροπλασματική εντόπιση της χρώσης καταγράφηκε. Δείγματα με βαθμολογίες 1 ή υψηλότερο και με μεμβρανώδη εντοπισμός θεωρήθηκαν θετικά. Για τη στατιστική ανάλυση θετικά μηνύματα, ανεξάρτητα από την ένταση θεωρήθηκαν θετικά και βαθμολογίες κάτω από το 1 ως αρνητική και στατιστικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 2 × 2 πίνακες έκτακτης ανάγκης και την ακριβή δοκιμασία του Fisher.

Οργανοτυπικές πολιτισμό

οργανοτυπικές καλλιέργειες αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του οισοφάγου (κερατινοκύτταρα) σπάρθηκαν πάνω σε ένα στρώμα 3:01 κολλαγόνου Ι /matrigel με 7.5 × 10

4 ανθρώπινου εμβρυϊκού οισοφάγου ινοβλάστες ενσωματωθεί. Κολλαγόνου Ι αγοράστηκε από Οργανογένεσης (Canton, ΜΑ) και Matrigel Matrix από BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ). Την ημέρα 11, οι καλλιέργειες αυξήθηκαν σε αέρα-υγρού για να προκληθεί διαφοροποίηση του επιθηλίου. Οι καλλιέργειες συλλέχθηκαν την ημέρα 15 και είτε σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη (Fisher, Pittsburg, ΡΑ) για εμβάπτιση σε παραφίνη ή απευθείας ενσωματώνονται σε Tissue-Tek O.C.T. ένωση (VWR, Batavia, IL) για κατεψυγμένες τομές.

εισβολή των κυττάρων Δοκιμασίες

δοκιμασίες εισβολή διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] χρησιμοποιώντας μέγεθος πόρου θαλάμων εισβολή 8 μm Biocoat Matrigel Fluoroblok (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ). Επιθηλιακά κύτταρα (5 × 10

4 ανά θάλαμο) σπάρθηκαν στα ένθετα transwell και τα εισβάλλοντα κύτταρα χρωματίστηκαν με Calcein ΑΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA) μετά από ολονύκτια επώαση. Ακτιβίνη Α προστέθηκε με συγκέντρωση 20 ng /ml ως χημειοελκτικό. Εισβολή προσδιορίστηκε ποσοτικά με τη χρήση του πολλαπλού Plate Reader Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT). Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Ο άνθρωπος και η Whitney τεστ διεξήχθη για στατιστική ανάλυση.

Αντισώματα

CD44 Ερμής-III (ένα είδος δώρο από τον Δρ Έλεν Αγνό, Ινστιτούτο Wistar, Philadelphia, PA) χρησιμοποιήθηκε για ανοσοφθορισμό επί κατεψυγμένων τμήματα? αντι-CD44 κλώνο 2C5 (R &? συστήματα D, Minneapolis, MN) για το Western Blot? CD44 F10-44-2 και α-τουμπουλίνης (Abcam, Cambridge, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία για FFPE και Western Blot, αντίστοιχα? E-cadherin αγοράστηκε από την BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ), β-ακτίνη και αSMA κλώνος 1Α4 αμφότερα αγοράστηκαν από την Sigma (Saint Louis, ΜΟ), αντι-ΜΜΡ-9 από την Calbiochem (EMD Chemicals, Rockland, ΜΑ)? S100A4 είναι από Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA) και βιμεντίνης κλώνος V9 από Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

ανοσοϊστοχημείας και ανοσοφθορισμού

Η ανοσοϊστοχημεία έγινε με την Vecta Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια τους. Πρωτογενής αντίσωμα επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C και δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το σήμα αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ υποστρώματος DAB για υπεροξειδάσης. Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, ένα βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας Texas-Red-στρεπταβιδίνη ή δευτερεύον αντίσωμα FITC σήμα. Χρωματισμένες τομές τοποθετήθηκαν με DAPI περιέχει μέσο στερέωσης.

Ζυμογράφημα και in situ ζυμογραφία

Ρυθμισμένα μέσα από οργανοτυπική καλλιέργεια αναπτύσσεται υπό συνθήκες χωρίς ορό για 48 ώρες διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα ακρυλαμιδίου 10% που περιέχει ζελατίνη σε 4 ° C. Τα πήγματα βάφτηκαν με Coomassie blue R250 για 2 ώρες και η περίσσεια του χρωματισμού απομακρύνεται με αποχρωματισμός ρυθμιστικό (10% οξικό οξύ 20% μεθανόλη). Εικόνες πάρθηκαν χρησιμοποιώντας Gel Doc ™ XR (Bio Rad, Hercules, CA).

Για in situ ζυμογραφία, συζυγές φλουορεσκεΐνης DQ-Ζελατίνη (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) επαναιωρήθηκε σε 1 ml απιονισμένο νερό σε συγκέντρωση 1 mg /ml. 100 μg /ml DQ-ζελατίνης χρησιμοποιήθηκε για να επικαλύψει 5 micron πάχους κατεψυγμένες τομές οργανοτυπικές καλλιέργειες για 18 ώρες στους 37 ° C. Η φλουορεσκεΐνη σήμα στα τμήματα απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss, Thornwood, ΝΥ).

κηλίδωση Western

στυπώματα Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [35]. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

Αποτελέσματα

Πρωτοβάθμια ανθρώπινη οισοφάγου όγκους δείχνουν αντίστροφη έκφραση της E-cadherin και CD44

Για να καθορίσει τον ρόλο του CD44 σε οισοφάγου κυτταρική εισβολή και EMT, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση Ε-καδερίνης και CD44 επί μικροσυστοιχίες ιστό 166 πλακώδες καρκίνωμα (SCC) και 131 αδενοκαρκινώματα. Για δύο οισοφάγου SCC ασθενείς, δείγματα που αντιπροσωπεύουν την εξέλιξη από την κανονική σε καρκίνωμα

in situ

(CIS) και ακολούθως ESCC (Εικ. 1Α έως 1C), παρατηρήσαμε μια σταδιακή αύξηση της έκφρασης CD44. Συνολικά, η Ε-καντερίνη ήταν σε μεγάλο βαθμό περιορίζεται σε περιοχές με χαμηλή ή απούσα έκφραση CD44 στο φυσιολογικό επιθήλιο (Εικ. 1 D, Ε) και 20 από 166 όγκων. Για οισοφάγου SCC, παρατηρήσαμε προς τα πάνω ρύθμιση του CD44 σε απουσία Ε-καδερίνης σε 54% των όγκων (90 από 166 όγκους). Μαζί, 110 από 166 (66%, p & lt? 0,02) των κλινικών δειγμάτων μας εμφανίζεται αυτό το αντίστροφη σχέση της E-cadherin και CD44. Οισοφάγου δείγματα αδενοκαρκινώματος έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση της Ε-καδερίνης και έκφραση CD44 σε 63 από 131 δείγματα (48%), με 41 δείγματα που έχουν ουσιαστική E-cadherin, αλλά χωρίς έκφραση CD44. Είκοσι-δύο δείγματα είχαν αυξημένη έκφραση CD44 και είναι αρνητικά για το E-cadherin. Στο σύνολό τους, δείχνουμε μια στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,05) αντίστροφη συσχέτιση για την έκφραση της Ε-καδερίνης και CD44. Οι εικόνες των αντιπροσωπευτικών ανοσοϊστοχημικές χρώσεις των ιστών του όγκου επιδεικνύοντας τη σύνδεση της Ε-καδερίνης και CD44 φαίνεται στο Σχ. 1 F-Ι.

IHC με δείχνει αντι-CD44 αντίσωμα αυξημένη έκφραση CD44 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης από την κανονική (Α) προς καρκίνωμα

in situ,

CIS (Β), και του όγκου (Γ). Αντίσωμα έναντι Ε-καδερίνη και CD44 δείχνουν έκφραση της Ε-καδερίνης (D) και με την απουσία του CD44 (Ε) στην κανονική επιθήλιο. Σε ιστούς ΑΗΚ με διατήρησε την έκφραση Ε-καδερίνης (F, διακεκομμένη μαύρη γραμμή) το σήμα για το CD44 είναι χαμηλό (G). (H) Απώλεια Ε-καδερίνης είναι συνδεδεμένη με ένα έντονο σήμα για CD44 (Ι). Ράβδος κλίμακας είναι 50 micron.

Η

E-cadherin-αρνητικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του οισοφάγου δείχνουν αυξημένη έκφραση CD44

Για να διερευνηθεί η αντίστροφη συσχέτιση της Ε-καδερίνης με CD44 σε καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές γραμμές , αναλύσαμε οισοφάγου πλακωδών κυτταρικές σειρές καρκινώματος, κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκινικές κυτταρικές σειρές (-12 ΤΕ-1, -7, -8, -11 και) (JHU-012, JHU-013), καθώς και αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές (FLO-1, OE33 και SK-GT-4) με Western Blot για το E-cadherin και η έκφραση CD44, καθώς και ΤΟΡβΚΙΙ και βιμεντίνης. Ενώ το τυποποιημένο έντυπο του CD44 (CD44s) εκφράζεται σε μεσεγχυματικά κύτταρα, ορισμένες μορφές παραλλαγή, CD44v, που εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα [36]. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα διατηρούν την έκφραση Ε-καδερίνης είχαν χαμηλότερα επίπεδα του προτύπου (85 kDa λόγω της έλλειψης του εξονίου 6-15) και τη μορφή παραλλαγής (150 kDa) του CD44. Η απώλεια της Ε-καδερίνης συσχετίζεται με την αυξημένη έκφραση του CD44s και αύξηση στην έκφραση της βιμεντίνης δείκτη EMT (Εικ. 2Α). Για να καθοριστεί εάν αποκατάσταση της Ε-καδερίνης μπορεί να επηρεάσει την έκφραση του CD44s και CD44v, εμείς επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές ΤΕ-8 και FLO-1, και οι δύο εκφράζουν χαμηλά επίπεδα της Ε-καδερίνης, με πλήρους μήκους Ε-καδερίνης. Κατά την αποκατάσταση της έκφρασης Ε-καδερίνης, το συνολικό επίπεδο της έκφρασης CD44 μειώθηκε, αλλά η παραλλαγή (επιθηλιακό) μορφή (125 kDa) αυξήθηκε (Εικ. 2Β).

(Α) Western Blot ανάλυση του οισοφάγου πλακώδους κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (ΤΕ-1 -7, -8, -11, και -12), κυτταρικές σειρές οισοφαγικού αδενοκαρκινώματος (FLO-1, OE33, SK-GT-4) κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού (JHU-012 και, JHU-013) δείχνουν ότι η έκφραση της Ε-καδερίνης και ΤΟΡβΚΙΙ σχετίζεται με χαμηλά επίπεδα CD44, ενώ η απώλεια του Ε-καδερίνης και ΤΟΡβΚΙΙ συσχετίζεται με προς τα πάνω ρύθμιση του CD44 και του βιμεντίνη δείκτη EMT. (Β) Αποκατάσταση της E-cadherin, ECAD, έκφραση με ρετροϊική επιμόλυνση ΤΕ-8 και FLO-1 κύτταρα σε σύγκριση με το φορέα ελέγχου (νεο) καταδεικνύει μια γενική μείωση της έκφρασης CD44 μαζί με ένα διακόπτη για να αυξηθεί CD44v πάνω CD44s (CD44v: CD44variant, CD44s:. CD44 πρότυπο)

η

έκφραση CD44 ρυθμίζεται αυξητικά στο οισοφάγου επιθηλιακά κύτταρα που υποβάλλονται σε EMT

Έχουμε ήδη δημιουργήσει ένα μοντέλο για να αναλύσει τις επιπτώσεις της απώλειας E-cadherin για οισοφάγου κερατινοκύτταρα με ρετροϊική έκφραση των κυρίαρχων-αρνητικών Ε-καδερίνης (ΕΚ) ή κυρίαρχο-αρνητικό Ε-καδερίνης σε συνδυασμό με κυρίαρχο-αρνητικό ΤΟΡβΚΙΙ (ECdnT) [25]. Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης και CD44 και των δεικτών EMT για τη διαλεύκανση του ρόλου των CD44 σε οισοφάγου ΕΜΤ και την κυτταρική εισβολή. ΕΚ και ECdnT κύτταρα έχουν ρυθμίζεται προς τα πάνω έκφραση CD44, και το θετικό σήμα CD44 εντοπίζεται κυρίως σε περιοχές του επιθηλιακού κυττάρου εισβολή μέσα στον υποκείμενο μήτρα (Εικ. 3). Αμφότερα τα κύτταρα EC και ECdnT έχουν αυξημένα επίπεδα S100A4, βιμεντίνη και αSMA υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα που υφίστανται EMT σε οργανοτυπικές καλλιέργειες (Σχ. 3D-F).

Ανοσοϊστοχημεία παραφίνης τομών με αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης ( Α), αντι-ΤΟΡβΚΙΙ (Β) και αντι-CD44 (C) δείχνει CD44-θετικά κύτταρα σε κύτταρα ΕΚ και ECdnT εισβάλλουν μέσα στον υποκείμενο μήτρα κολλαγόνου /matrigel (βέλη) που είναι αρνητικά για Ε-καδερίνη και ΤΟΡβΚΙΙ. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για το δείκτες ΕΜΤ S100A4 (D), βιμεντίνη (Ε) και αSMA (F) δείχνει αυξημένη θετικό σήμα σε εισβάλλοντα κύτταρα. μπαρ κλίμακα είναι 50 micron.

Η

CD44 συν-εντοπίζεται με MMP-9 που βρίσκονται στην αιχμή των χωροκατακτητικών περιοχών και ρυθμίζεται αυξητικά από ακτιβίνη Α

Για να αναλύσουμε το μηχανισμό με τον οποίο μεσολαβεί CD44 κελί εισβολή εστιάσαμε στην ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας, εξέχοντα πρωτεάσες πέψη την εξωκυτταρική μήτρα. Για την οπτικοποίηση δραστικότητα ΜΜΡ σε περιοχές της εισβολής χρησιμοποιήσαμε in situ ζυμογραφία. Φλουορεσκεΐνη-θετικών περιοχών ανίχνευσης ΜΜΡ δραστικότητα περιορίζονταν στην αιχμή στα κύτταρα ΕΚ και ECdnT και κυτταρικές εισβολή μέσα στον υποκείμενο μήτρα (Σχ. 4Α). Προσαρμοσμένα μέσα από οργανοτυπικές καλλιέργειες έδειξε μια σταδιακή αύξηση της ΜΜΡ-9 έκκριση και ΜΜΡ-2 και δραστικότητα ΜΜΡ-9 στα επεμβατικές κύτταρα (Σχ. 4Β). ΜΜΡ-9 έχει περιγραφεί σαν ένα συνεταίρο δέσμευσης του CD44 [37], [38]. Χρησιμοποιώντας διπλή χρώση ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι CD44 και ΜΜΡ-9 που απεικονίζουν συν-εντοπισμό τους στην επιφάνεια του κυττάρου στην αιχμή του διηθητικού περιοχές (Εικ. 4C). Για να καταδειχθεί αυξημένη επιθετική πιθανότητα σε απόκριση Ακτιβίνης Α, ένα μέλος της οικογένειας ΤΟΡβ, έκκριση της οποίας αυξάνεται στις επεμβατικές οργανοτυπικές καλλιέργειες (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), μπορούμε διεγερμένα κύτταρα ECdnT και το καρκίνο του οισοφάγου κυτταρική γραμμή ΤΕ-11 και δείχνουν αυξημένη κυτταρική εισβολή

in vitro

(Εικ. 4D).

(Α) για

in situ

zymography, οι τομείς δραστηριότητας ΜΜΡ τονίζεται από ένα θετικό φλουορεσκεΐνη σήμα σε κατεψυγμένα τμήματα των ECAD, ΕΚ και ECdnT οργανοτυπικές καλλιέργειες. (Β) Ζυμογράφημα χρησιμοποιώντας οργανοτυπική καλλιέργεια ρυθμισμένο μέσο συλλέγεται από τα κύτταρα ECAD, ΕΚ και ECdnT απεικονίζει αυξημένη έκκριση ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. (C) Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού των ECAD, ΕΚ και ECdnT δείχνει ΜΜΡ-9 (κόκκινο) colocalization με CD44 (πράσινο) σε επεμβατική κύτταρα. μπαρ κλίμακα είναι 50 micron. (Δ) Η διέγερση με ακτιβίνη Α επάγει αυξημένη εισβολή των ECdnT και ΤΕ-11 κύτταρα σε δοκιμασίες εισβολής. Σύγκριση μεταξύ των ομάδων έγινε με παραμετρικό τεστ άνθρωπος και Whitney μη, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0.001. (Ε) Western Blot των προϊόντων λύσης κυττάρου από ΤΕ-11 επιμολυσμένα με Allstars αρνητικές μη φίμωση κύτταρα siRNA (Ctrl) και ΤΕ-11 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA έναντι Ε-καδερίνης (SI1, SI2) αποδεικνύει προς τα πάνω ρύθμιση του CD44 μετά από διέγερση με Ακτιβίνη A.

η

ακτιβίνη α έχει επίσης περιγραφεί για τη ρύθμιση βλαστική ικανότητα [17] και υποθέσαμε ότι CD44 ως ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων θα μπορούσε να είναι υπό τη ρύθμιση του Ακτιβίνης α να προσδιορίσει ένα δυναμικό μονοπάτι σηματοδότησης υπεύθυνο για η προς τα πάνω ρύθμιση του CD44, αναλύσαμε την καρκίνο του οισοφάγου κυτταρική γραμμή, ΤΕ-11, μετά από knockdown Ε-καδερίνης, χρησιμοποιώντας siRNA. Εμείς διεγερμένα ΤΕ-11 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA εναντίον κυττάρων Ε-καδερίνης με Ακτιβίνη Α και ανέλυσαν την έκφραση του CD44. Ακτιβίνη Α θεραπεία αυξημένη έκφραση CD44 παραλλαγής σε ΤΕ-11 σε απουσία Ε-καδερίνης (Εικ. 4Ε).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν την ρύθμιση της έκφρασης CD44 μέσω Ε-καδερίνης μέσω Ακτιβίνη Α και να παρέχει λειτουργικά στοιχεία για μια αιτιώδη ρόλο στην επαγωγή της κυτταρικής εισβολής.

Συζήτηση

Θα δείξουμε την σταδιακή απώλεια της E-cadherin συσχετίζεται με προοδευτική αύξηση του CD44

in vitro

και

in vivo

. Σε περίπτωση απουσίας του Ε-καδερίνης, ακτιβίνη Α μπορεί να επάγει την έκφραση CD44. Ακτιβίνη Α αποδείχθηκε ότι είναι ένας ρυθμιστής κλειδί για βλαστική ικανότητα [17] και όπως και άλλα μέλη της υπεροικογένειας ΤΟΡβ, έχει επίσης αναφερθεί ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη και την ογκογένεση [20], [22] – [24]. Η υπερέκφραση του ακτιβίνη Α έχει περιγραφεί σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Ακτιβίνη Α προάγει κύτταρο όγκου επιθετικότητα από την αυξημένη έκφραση της ΜΜΡ-7 και Ν-cadherin [22] – [24]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η Ακτιβίνη Α μπορεί να ρυθμίζει αυξητικά CD44, η οποία με τη σειρά της αγκυρώνει ΜΜΡ-9 στο άκρο προσβολής και επάγει κυτταρική εισβολή. Η ένωση της E-cadherin, CD44 και MMPs με EMT προτείνει έναν σημαντικό ρόλο για Ακτιβίνης Α στο EMT.

Βρήκαμε ότι η απώλεια Ε-καντερίνης συνοδεύεται από μια αλλαγή της έκφρασης ισόμορφου CD44. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι εναλλακτικό μάτισμα του CD44 θα μπορούσε να ελεγχθεί μέσω σηματοδότησης Ras για την προώθηση της έκφρασης των μορφών παραλλαγής [39], Warzecha et al. Πρόσφατα εντοπίστηκαν επιθηλιακά παράγοντες ματίσματος (ESRP1 και ESRP2) την προώθηση της έκφρασης των CD44v για τη διατήρηση της επιθηλιακής φαινότυπο [40]. Οι εν λόγω παράγοντες χάνονται κατά τη διάρκεια της EMT [41] – [43]. Θεωρητικά, η έκφραση του CD44 πρότυπο εξαρτάται από την απώλεια του ESRP1 και 2 σε οισοφαγικό καρκίνωμα. ESRP1 και 2 έκφρασης έχει περαιτέρω αναγνωρισθεί ότι εμπλέκεται σε ΕΜΤ-συναφών προγραμμάτων splicing στον καρκίνο του μαστού [44]. Είναι ενδιαφέρον, αποσιώπηση ESPR1 /2 σε επιθηλιακά κύτταρα που επάγεται η έκφραση της καντερίνης μεσεγχυματικών, Ν-cadherin, χωρίς αλλαγές στην έκφραση Ε-καδερίνης. Αντιστρόφως, η έκφραση του ESPR1 μπορεί να αντιστρέψει Twist επαγόμενη EMT σε μαστικά επιθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, ο παράγοντας μεταγραφής Twist2 συμβάλλει στην επέκταση των κυτταρικών πληθυσμών stem-σαν μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση δεικτών βλαστικών κυττάρων όπως CD44 [45].

Στο σύνολό τους, υπάρχουν πολλαπλοί μηχανισμοί με την οποία CD44 ισομορφές, όλοι μοιράζονται την ίδια κυτταροπλασματική περιοχή, μπορεί να προκαλέσει ΕΜΤ, πολλά από τα οποία περιλαμβάνουν την αλληλεπίδραση της εξωκυττάριας περιοχής με το μικροπεριβάλλον. CD44 μπορεί να δράσει ως συν-υποδοχέας για c-Met και είναι η αληθής υποδοχέας για το υαλουρονικό οξύ, το οποίο μπορεί να προωθήσει ΕΜΤ [9]. E-cadherin ρυθμίζει αρνητικά την αλληλεπίδραση του CD44 με υαλουρονικό οξύ με αποτέλεσμα την καταστολή της εισβολής όγκου και κύτταρο διακλάδωσης μορφογένεση [46]. Δείχνουμε εδώ ότι η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης συσχετίζεται με τη μορφή CD44s και επαγωγή μιας επεμβατικής φαινοτύπου.

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι η εισβολή του οισοφάγου κερατινοκυττάρων που στερείται λειτουργικής Ε-καδερίνης και ΤΟΡβΚΙΙ επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση της καθεψίνης Β [35]. Καθεψίνη Β μπορεί να ενεργοποιηθεί σε ένα όξινο περιβάλλον που ξεκίνησε από την αλληλεπίδραση του CD44 με Na + -H + εναλλάκτη [37]. Ενώ αυξημένη δραστικότητα αποτελέσματα καθεψίνης Β στην ενεργοποίηση του ΤΟΡβ [35], ΜΜΡ-9 μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει τον ΤΟΡβ [47] που συνδέει τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ με προηγούμενη μελέτη μας. Παρακρινής TGFβ σηματοδότηση ενεργοποιεί ινοβλάστες, και επίσης προκαλεί τριχοειδή σχηματισμό [48]. Αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν τη σημασία της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής αλληλοπαρεμβολές σε ογκογένεση.

Εν κατακλείδι, δείχνουμε ότι CD44 ρύθμιση προς τα πάνω συνδέεται με την απώλεια της Ε-καδερίνης σε οισοφαγικό καρκίνωμα και ότι CD44 προάγει ΜΜΡ-9 με τη μεσολάβηση εισβολή όγκου .

Ευχαριστίες

θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε τα μέλη του εργαστηρίου Beauchamp, Δρ. Deane και Beauchamp, και ο Δρ Anil K. Rustgi και το Τμήμα Vanderbilt Βιοστατιστικής για τις χρήσιμες συζητήσεις.