Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια επιθετική κακοήθεια που συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο με κακή πρόγνωση. Εδώ, αναφέρουμε τα χημειοθεραπευτικά αποτελέσματα των βιοδραστικών προανθοκυανιδίνες από σπόρους σταφυλιού (GSPs) όπως αξιολογήθηκε με τη χρήση

In Vitro

και

In Vivo

μοντέλα. Θεραπεία των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων (MIAPaCa-2, PANC-1 και AsPC-1) με τις GSP

In Vitro

μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και αυξημένη G2 /M φάση σύλληψη του κυτταρικού κύκλου οδηγεί στην επαγωγή της απόπτωσης σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Η απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος GSPs επαγόμενη συνδέθηκε με μια μείωση στα επίπεδα του Bcl-2 και Bcl-XL και μια αύξηση στα επίπεδα του Βαχ και της ενεργοποιημένης κασπάσης-3. Θεραπεία της MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα με τις GSP μειώθηκε επίσης τα επίπεδα της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάσης (ΡΙ3Κ) και φωσφορυλίωση της Akt σε ser

473. siRNA knockdown του ΡΙ3Κ από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μείωσε επίσης την φωσφορυλίωση της Akt. Περαιτέρω, διαιτητική χορήγηση GSPs (0,5%, β /β) ως συμπληρωμένο δίαιτα ελέγχου AIN76A ανέστειλε σημαντικά την αύξηση του MIAPaCa-2 παγκρεατικού ξενομοσχεύματα όγκου αναπτύχθηκαν υποδόρια σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς, η οποία σχετίζεται με: (

i

) αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, (

ii

) επαγωγή της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων, (

iii

) αυξημένη έκφραση του Bax, μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και ενεργοποίηση της κασπάσης-3 -θετικό κύτταρα, και (

iv

) μειωμένη έκφραση της ΡΙ3Κ και π-Akt σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GSPs μπορεί να έχει ένα δυνητικό χημειοθεραπευτικό επίδραση στην παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Prasad R, Vaid Μ, Katiyar SK (2012) Σταφύλι προανθοκυανιδίνη του καρκίνου του παγκρέατος Αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων

In Vitro

και

In Vivo

μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και βάζοντας στο στόχαστρο την PI3K /AKT οδό. PLoS ONE 7 (8): e43064. doi: 10.1371 /journal.pone.0043064

Επιμέλεια: Abbes Belkhiri, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 17, 2012? Αποδεκτές: 16, Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Αυγούστου, 2012

Copyright: © Prasad et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από την Merit Veterans Administration Award κριτική (SKK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος θεωρείται ότι είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες. Είναι μια επιθετική κακοήθεια που συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο με κακή πρόγνωση? το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι & lt? 5% [1], [2]. Μόνο το 20% των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είναι επιλέξιμοι για χειρουργική εκτομή, η οποία παραμένει η μόνη πιθανή θεραπευτική αγωγή [3]. Παρά το γεγονός ότι ένας συνδυασμός χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση, οι περισσότεροι ασθενείς πεθαίνουν από την εξέλιξη της νόσου, που συχνά σχετίζεται με επίκτητο ή ενδογενή ανθεκτικότητα σε χημειοθεραπεία [4], [5]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών που μπορούν να στοχεύσουν τα μόρια που συνδέονται με την ανάπτυξη παγκρεατικού όγκου και παρακάμπτουν ή αντίσταση σε απόπτωση μπορεί να οδηγήσει σε βελτίωση των αποτελεσμάτων σε ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του παγκρέατος ξεπεραστούν.

Μη τοξικά φυτοχημικά προσφέρουν υποσχόμενα επιλογές για την ανάπτυξη αποτελεσματικών χημειοθεραπευτικών στρατηγικών για διάφορους τύπους καρκίνου. Μερικά περίπτωση ελεγχόμενες επιδημιολογικές μελέτες υποστηρίζουν την ιδέα ότι η κατανάλωση των βιοδραστικών διαιτητικών φυτοχημικών μειώνει τον κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος [6], [7]. προανθοκυανιδίνες σπόρων σταφυλιού (GSPs) είναι βιοενεργά φυτοχημικά που έχουν δείξει αντι-καρκινογόνο δράση σε ορισμένα μοντέλα όγκων των ζώων [8], https://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/8/1379 – B10 # B10and φαίνεται να επιδεικνύουν ελάχιστη τοξικότητα σε πειραματόζωα [9], [10]. Οι GSPs εξάγεται εύκολα από σταφύλι-σπόρους, και είναι ένα μίγμα διμερή, τριμερή, τετραμερή, και ολιγομερή του μονομερούς κατεχινών και /ή (-) – επικατεχίνη [9], [10]. GSPs έχουν δειχθεί ότι έχουν αντιφλεγμονώδη, αντι-οξειδωτικό και αντι-μεταστατικές ιδιότητες τόσο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα [8] – [12]. Αναστέλλουν υπεριώδους ακτινοβολίας- και χημικό καρκινογόνο επαγόμενης καρκινογένεσης του δέρματος σε μοντέλα ποντικών [9], [13]. Πρόσφατα, έχουμε δείξει ότι η διαιτητική χορήγηση GSPs με δίαιτα ελέγχου AIN76A οδήγησε σε μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης του μη μικροκυτταρικού ξενομοσχευμάτων όγκου καρκίνου του πνεύμονα [14]. GSPs αναστέλλουν την επιθετική πιθανότητα του μελανώματος και κεφαλής και λαιμού κύτταρα πλακώδους καρκινώματος όπως αξιολογείται χρησιμοποιώντας

in vitro

μοντέλα [11], [12]. Ωστόσο, ο αντι-καρκινογόνο δυναμικό του GSPs κατά του καρκίνου του παγκρέατος είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη.

Ο φωσφατιδυλινοσιτόλη 3′-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι είναι ένα θεμελιώδες μονοπατιού σηματοδότησης που μεσολαβεί αρκετές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ανάπτυξη , η επιβίωση των κυττάρων και την κινητικότητα [15]. Αυξημένη ενεργοποίηση και απελευθέρωση των συστατικών στη ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι έχουν εμπλακεί σε πολλές κακοήθειες και σε προσδίδει αντίσταση στη χημειοθεραπεία [16]. Akt είναι μία καλά χαρακτηρισμένη κινάσης σερίνης /θρεονίνης. Η αυξημένη δραστικότητα Akt έχει εμπλακεί σε διάφορους τύπους καρκίνων, όπου προωθεί την επιβίωση των κυττάρων μέσω της επίδρασής σε πολυάριθμες κατάντη στόχων, συμπεριλαμβανομένων την αδρανοποίηση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, η ενεργοποίηση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [17]. Η ενεργοποίηση του Akt είναι ένα συχνό συμβάν σε καρκίνο του παγκρέατος και σχετίζεται με κακή προγνωστικές μεταβλητές και τα αποτελέσματα [18] – [20]. Μια μελέτη έδειξε ότι το 59% των παγκρεατικών αδενοκαρκινώματα έδειξε υπερενεργοποίηση του Akt [18]. Ορισμένες μελέτες υποδεικνύουν ότι η αναστολή της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι ευαισθητοποιεί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με την αποπτωτική επίδραση της χημειοθεραπείας τόσο

in vitro

και

in vivo

[21] – [23].

στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το χημειοθεραπευτικό αποτέλεσμα των GSPs επί καρκίνου του παγκρέατος με τη χρήση των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών MIAPaCa-2, PANC-1 και AsPC-1 ως

in vitro

μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας. Για να επαληθεύσετε τις

in vitro

δεδομένων, πραγματοποιήσαμε

in vivo

μελέτες ξενομοσχεύματος όγκου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με τις GSP αποτέλεσμα αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επαγωγή της απόπτωσης και αναστολής της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Τα πρωτογενή αντισώματα ελήφθησαν ως εξής: αντισώματα ειδικά για Bax, Bcl-2, Bcl-XL, διασπασμένη κασπάση 3, ΡΙ3Κ, Akt, ρ-Akt και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ)? Η κυκλίνη Β1, Cdc25B, Cdc25C, Ki-67, και τα δευτερογενή αντισώματα, τα οποία horseradishperoxidase-συζευγμένα, αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Το κιτ PI3K siRNA είχε αγοραστεί από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Η αννεξίνη V-συζευγμένο AlexaFluor488 απόπτωση Detection Kit αγοράστηκε από την Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης ήταν από τη Bio-Rad (Hercules, CA). ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλο-2-υλ] -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο) και όλα τα άλλα χημικά ήταν αναλυτικής καθαρότητας και αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Οι GSPs ελήφθησαν από την Kikkoman Corporation (Ιαπωνία). Η χημική σύνθεση και η σταθερότητα του GSPs έχουν περιγραφεί προηγουμένως [9], [10].

Κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, AsPC-1, PANC-1 και MIAPaCa -2, ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD), και καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται ως μονοστιβάδες σε DMEM συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT), 100 μg /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη από την Invitrogen (Carlsbad, CA) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5%

2 ατμόσφαιρα CO. Οι GSPs διαλύθηκαν σε μια μικρή ποσότητα διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO, 100 μL) πριν από την προσθήκη στα μέσα ενημέρωσης. Η μέγιστη συγκέντρωση του DMSO στα μέσα ενημέρωσης δεν υπερέβη το 0,1% (ν /ν). Κύτταρα κατεργασμένα με DMSO εξυπηρετούνται μόνο ως έλεγχο του οχήματος.

Κυτταρική βιωσιμότητα και τον κυτταρικό θάνατο προσδιορισμούς

Η επίδραση της GSPs στην βιωσιμότητα των κυττάρων καρκινώματος του παγκρέατος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [24 ]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς τις GSP για 24 και 48 ώρες. Στο τέλος του καθορισμένου χρονικού διαστήματος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μι 5 mg /mL ΜΤΤ και τα προκύπτοντα κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 150 μL DMSO. Η απορρόφηση χρώματος καταγράφηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας Βίο-Rad 3350. Η επίδραση της GSPs στη βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίζεται με βάση το ποσοστό ελέγχου, το οποίο αυθαίρετα μία τιμή 100% βιωσιμότητα. GSPs-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού βαφής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς τις GSP για 24 και 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,25% μπλε της τρυπάνης βαφή και τα κύτταρα που είχαν αναλάβει τη χρωστική μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Το κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από τις GSP εκφράζεται ως η μέση ± SD ποσοστό των νεκρών κυττάρων σε κάθε ομάδα αγωγής από τρία επαναλαμβανόμενα πειράματα.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

MIAPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1 ήταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση GSPs (0, 20, 40 και 60 μg /mL) σε πλήρες μέσο για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [24]. Εν συντομία, το 1 × 10

5 κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε 50 μι ψυχρό PBS στο οποίο 450 μL ψυχρή μεθανόλη προστέθηκε και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση, το σφαιρίδιο επωάστηκε με RNase Α (20 μg /mL) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /mL) επί πάγου στο σκοτάδι. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) εξοπλισμένο με Cell Quest 3.3 λογισμικού στον Μηχανισμό Πυρήνα του UAB Comprehensive Κέντρο Καρκίνου.

αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

GSPs επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα προσδιορίσθηκε ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το αννεξίνης V-συζευγμένο Alexa fluor 488 Apoptosis Detection Kit ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία των κυττάρων με τις GSP για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με Αννεξίνη V Alexa fluor488 (Alexa488) και ιωδιούχου προπιδίου για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Τα βαμμένα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογή χρησιμοποιώντας το όργανο FACSCalibur (BD Biosciences) και Cell Quest 3.3 λογισμικό.

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα με ή χωρίς τις GSP τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [24]. Για ανάλυση στυπώματος Western, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν επί 10% πηκτών Τρις-γλυκίνης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης, η μεμβράνη επωάστηκε με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με το κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας και οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστηρίων (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Η μεμβράνη στη συνέχεια απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών στη γέλη.

Ζώα και μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

Θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια 4-5 εβδομάδων ηλικίας αγοράστηκαν από το National Cancer Institute (Bethesda, MD) και στεγάζεται σε διευκόλυνσης των πόρων των ζώων στο Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήσης. Το πρωτόκολλο των ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Πανεπιστημίου της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, και ο αριθμός πρωτοκόλλου ζώο είναι: 101109267. Τα ποντίκια που παρέχονται με αποστειρωμένο διατροφή AIN76A και νερό

κατά βούληση

. Για να προσδιοριστεί η

in vivo

χημειοθεραπευτική αποτελεσματικότητα των διαιτητικών GSPs έναντι της ανθρώπινης αυξητικής ξενομοσχεύματος παγκρεατικού όγκου, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα MIAPaCa-2 (5 × 10

6 σε 100 μι PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό κάθε ποντίκι. Μία ημέρα μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες με οκτώ ποντικών ανά ομάδα. Μία ομάδα ποντικών έλαβε την δίαιτα ελέγχου AIN76A, ενώ η δεύτερη ομάδα ποντικών έλαβε 0.5% GSPs συμπληρωμένο δίαιτα ελέγχου AIN76A σε παστίλιες σε όλη την περίοδο του πειράματος. Το πείραμα τερματίστηκε στο 11

ης εβδομάδας μετά από ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Η ανάπτυξη του όγκου και το σωματικό βάρος ανά ποντικό ανά εβδομάδα καταγράφηκε. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Vernier δαγκάνες και οι όγκοι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο μοντέλο hemiellipsoid: όγκος όγκου = ½ (4π /3) (l /2) (W /2) h, όπου L = μήκος, W = πλάτος και h = ύψος . Με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές που IACUC, το μέγεθος του όγκου δεν θα πρέπει να αυξηθεί περισσότερο από 1,5 εκατοστά

2 ή το μέγεθος μιας δεκάρας. Σε αυτό το στάδιο, το πείραμα τερματίστηκε, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, όγκου από κάθε ποντικό αποκόπηκε και το υγρό βάρος του κάθε όγκου σε κάθε ομάδα καταγράφηκε. Ένα τμήμα του όγκου χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή προϊόντων λύσης όγκου για ανάλυση western blot και το άλλο τμήμα του ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη και χρησιμοποιήθηκε για ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του Ki-67-θετικά, ρ-Akt -θετικό και της ενεργοποιημένης κασπάσης-3-θετικών κυττάρων

εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές όγκων (πάχους 5 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Μετά ενυδάτωση, ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη τοποθετώντας τα πλακίδια σε 10 mmol /L ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου (ρΗ 6,0) στους 95 ° C για 20 λεπτά που ακολουθείται από 20 λεπτών ψύξης. Οι τομές μετά πλύθηκαν σε θέσεις πρόσδεσης PBS και η μη ειδική μπλοκαρίστηκαν με 1% αλβουμίνη βόειου ορού με 2% ορό κατσίκας σε PBS πριν από την επώαση είτε με αντι-Ki-67, αντι-ρ-Ακί ή αντι-διασπασμένη κασπάση 3 αντίσωμα. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα που ακολουθείται από συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου στρεπταβιδίνη. Οι τομές επωάστηκαν περαιτέρω με υπόστρωμα 2,4-διαμινοβενζιδίνη και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Το Ki-67-θετικά και διασπασμένη κασπάση 3-θετικών κυττάρων σε ένα τμήμα μετρήθηκαν σε τουλάχιστον 4-5 διαφορετικά πεδία και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus (μοντέλο BX40F4, Tokyo, Japan) εφοδιασμένο με ένα Q-χρώμα 5 της Olympus κάμερα.

δοκιμασία TUNEL για αποπτωτικά κύτταρα

Η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη χρησιμοποιώντας αδιέξοδο

Kit TM Χρωματομετρική TUNEL System (Promega Corporation, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά την ανάκτηση αντιγόνου, τα τμήματα του όγκου (5 μm πάχους) έχουν καθορισθεί από επώαση με 4% παραφορμαλδεΰδη στους 4 ° C. Τα διαπερατά τομές επωάστηκαν με τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης ανασυνδυασμένο (ΕΤΑΕ) ένζυμο καταλυόμενη μίγμα της αντίδρασης και νουκλεοτιδίων για 60 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Μετά από βύθιση σε ρυθμιστικό /πλύση στάση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα τμήματα πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση μη ενσωματωμένου φθοροσκεΐνη-12-dUTP και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. TUNEL-θετικά κύτταρα εξετάστηκαν και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Τα κύτταρα TUNEL θετικά εκφράζεται ως ποσοστό του συνόλου των κυττάρων στο μικροσκοπικό πεδίο.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ των τιμών των ομάδων ελέγχου και θεραπείας προσδιορίστηκε με είτε φοιτητής

t

δοκιμών ή απλά μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από

post hoc

τεστ Tukey για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 4.00 για Windows, GraphPad Software, Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια, ΗΠΑ, www. graphpad.com. Σε κάθε περίπτωση,

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

GSPs αναστέλλουν τη βιωσιμότητα και να προκαλέσουν το θάνατο των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

Η ανασταλτική του πολλαπλασιασμού. επιδράσεις της GSPs επί παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, MIAPaCa-2, PANC-1 και AsPC-1, προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις GSPs (0, 10, 20, 40 και 60 μg /mL) για 24 και 48 ώρες. Μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων MIAPaCa-2 παρατηρήθηκε ότι κυμαινόταν από 2 έως 35% (

P

& lt? 0,05) μετά από 24 ώρες, και 20 έως 60% (

P

& lt? 0,01) μετά από 48 ώρες αγωγής με τις GSP, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες, παρατηρήθηκαν παρόμοιες επιδράσεις των GSPs στη θεραπεία των PANC-1 και τα κύτταρα AsPC-1 (Σχήμα 1 Β και 1 C, αριστερά πάνελ) εκτός του ότι η GSPs επαγόμενη μείωση της βιωσιμότητας των AsPC-1 κύτταρα ήταν μικρότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε για τις άλλες κυτταρικές σειρές. Προσδιορίσαμε επίσης την κυτταροτοξική δράση των GSPs επί παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών από την άποψη του κυτταρικού θανάτου με τη χρήση της τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α (δεξιά πάνελ), σε σύγκριση με τα μη-GSPs επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, η θεραπεία των κυττάρων MIAPaCa-2 με τις GSP οδήγησε σε μια σημαντική και δοσοεξαρτώμενη αύξηση σε κυτταρικό θάνατο. Θεραπεία για 24 ώρες οδήγησε σε 5-28% (

P

& lt? 0,05) αύξηση του κυτταρικού θανάτου, ενώ η θεραπεία για 48 ώρες οδήγησε σε 9-38% (

P

& lt? 0,05 -0.001) κυτταρικό θάνατο. Χρησιμοποιώντας ταυτόσημες συνθήκες, παρόμοιες κυτταροτοξικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στη θεραπεία των PANC-1 και τα κύτταρα AsPC-1 με τις GSP (Εικόνα 1Β και 1C, δεξιά πάνελ).

(Α) κύτταρα MIAPaCa-2, (Β) PANC -1 κύτταρα, και (C) κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις GSPs για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Αριστερό πάνελ: Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα εκφράζονται σε όρους επί τοις εκατό των κυττάρων ελέγχου (μη GSPs θεραπεία) ως η μέση τιμή ± SD από 8 επαναλήψεις. Δεξιά πλαίσια: Η κυτταροτοξική δράση του GSPs επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία κυανού τρυπανίου χρωστικής αποκλεισμού όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Τα δεδομένα κυτταρικού θανάτου που παρουσιάζονται ως η μέση τιμή επί τοις εκατό των νεκρών κυττάρων από τρία πειράματα ± SD

vs.

ομάδα ελέγχου (μη-GSPs-θεραπεία). Σημαντική διαφορά

vs

ομάδα ελέγχου,

*

P

& lt?. 0.001?

**

P

& lt?. 0.05

Η

GSPs προκαλέσουν G2-M διακοπή του κυτταρικού κύκλου φάσης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Η διακοπή της κανονικής σε κύτταρα πρόοδο του κύκλου και διαίρεση είναι σημαντικά γεγονότα στην εξέλιξη του καρκίνου. Για τον προσδιορισμό των πιθανών μηχανισμών των αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της GSPs, ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας MIAPaCa-2 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών σε επεξεργασία με 20, 40 ή 60 μg /mL του GSPs. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, μετά την επεξεργασία του MIAPaCa-2 κύτταρα με τις GSP για 48 ώρες υπήρχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό κυττάρων στην φάση G2-M καθόλου χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις: 20 μg /mL (15,5%,

P

& lt? 0,05), 40 μg /mL (23,9%,

P

& lt? 0,01) και 60 μg /mL (29,4%,

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με την μη-GSPs αγωγή μάρτυρες (5,9%). Κατά την 24 h χρονικό σημείο, η επίδραση της GSPs επί G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία για 48 ώρες. Παρόμοιες επιδράσεις του GSPs επί G2 /M φάση σύλληψης αποτελέσματα χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή PANC-1 (Σχήμα 2Β). Στην συνέχεια προσδιορίσαμε την επίδραση της GSPs επί ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου που εμπλέκονται στη φάση G2 /M του προόδου του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα της κηλιδώσεως Western αποκάλυψε ότι η κατεργασία του MIAPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1 με κυμαινόμενες συγκεντρώσεις GSPs για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην έκφραση Β1 κυκλίνης όπως επίσης και μείωση των επιπέδων έκφρασης του Cdc25B και Cdc25C πρωτεΐνες οι οποίες ρυθμίζουν την G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 2C).

MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με φορέα (0,1% DMSO) ή τις GSP (20, 40 και 60 μg /mL) σε πλήρες μέσο. Μετά από 48 ώρες αγωγής, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υπέστησαν πέψη με RNase. Cellular DNA χρωματίστηκε με ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να αναλυθεί η κατανομή του κυτταρικού κύκλου, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι αντιπροσωπευτικές ιστογράμματα του κυτταρικού κύκλου από δύο ανεξάρτητα πειράματα σε MIAPaCa-2 (Α) και PANC-1 (Β) κυττάρων μετά από κατεργασία με διάφορες δόσεις GSPs απεικονίζεται. (C) Επίδραση GSPs επί G2 /M ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου σε φάση MIAPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ή τις GSP (20, 40, 60 μg /mL σε DMSO) για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται, κυτταρολύματα παρασκευάζονται και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από στύπωμα Western αναλύσεις για διάφορες πρωτεΐνες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από τρία επιμέρους πειράματα φαίνονται.

Η

GSPs επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

Για να εξεταστεί κατά πόσον η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και την επαγωγή της G2 /M σύλληψη φάση στην ανθρώπινη παγκρέατος καρκινικών κυττάρων με κατεργασία GSPs είχε σχέση με την επαγωγή της απόπτωσης, οι MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις GSPs και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την Alexa488 αποπτωτικά Detection Kit. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε από την άποψη της έγκαιρης ή προχωρημένου σταδίου αποπτωτικά κύτταρα, τα οποία παρουσιάζονται αντίστοιχα στην κάτω δεξιά (LR) και άνω δεξιά (UR) τεταρτημόρια του FACS ιστογράμματα (Σχήμα 3Α). Κατεργασία των MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα με τις GSP για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική επαγωγή απόπτωσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Τα ποσοστά του συνόλου των αποπτωτικών κυττάρων (σε UR + LR τεταρτημόρια) σε κύτταρα MIAPaCa-2 μετά θεραπείες GSPs ήταν ως εξής: 5.2% (έλεγχος αγωγή με όχημα), 16,6% (20 μg /mL,

P

& lt ? 0,05), 25,9% (40 μg /mL,

P

& lt? 0,01) και 35,8% (60 μg /mL,

P

& lt? 0.001), όπως συνοψίζεται στον πίνακα Β παρατηρήθηκε. Παρόμοια GSPs-επαγωγή απόπτωσης όταν τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP για 48 ώρες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3Β.

(Α) MIAPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις GSPs (0, 20, 40 και 60 μg /mL) σε πλήρες μέσο για 48 ώρες, μετά συλλέχθηκαν για την ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων με ανάλυση FACS χρησιμοποιώντας την αννεξίνη V-Alexa Fluor488 απόπτωσης Vybrant Assay Kit (Alexa488) μετά το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το κάτω δεξιά (LR) τεταρτημόριο των ιστογραμμάτων FACS δείχνει το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (Alexa488-χρώση κύτταρα) και το τεταρτημόριο πάνω δεξιά (UR) δείχνει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αργά (Alexa488 + ιωδιούχο προπίδιο-χρώση κύτταρα). (Β) Τα συνολικά ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων σε κάθε ομάδα θεραπείας μετά από 48 ώρες που συνοψίζονται με δεδομένα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD δύο πειραμάτων. Σημαντική διαφορά

vs

ομάδα ελέγχου (μη-GSPs-θεραπεία), *

P

& lt?. 0.001? **

P

& lt? 0,05. (Γ) Κατεργασία του MIAPaCa-2 και κυττάρων με μεταβαλλόμενες συγκεντρώσεις GSPs για 48 αποτελέσματα ώρες σε μία μείωση εξαρτώμενη από τη δόση στα επίπεδα έκφρασης των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2 και Bcl-XL), αυξάνοντας παράλληλα το 1 PANC- έκφραση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax. GSPs αυξήσει επίσης το επίπεδο ενεργοποίησης της κασπάσης-3 σε κύτταρα.

Η

Επίδραση της GSPs επί των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Τα μέλη της οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης λειτουργώντας ως υποκινητές ή αναστολείς του κυτταρικού θανάτου [26] – [28]. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η θεραπεία των κυττάρων MIAPaCa-2 με τις GSP (20, 40, 60 μg /mL) για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-2 και Bcl-XL (Σχήμα 3C) ενώ η έκφραση του Βαχ ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις GSPs (Σχήμα 3C). Παρόμοια επίδραση των GSPs επί των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 βρέθηκε επίσης όταν τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP για 48 ώρες. Όπως διασπασμένη κασπάση 3 θεωρείται ότι είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης, προσδιορίσαμε επίσης το αποτέλεσμα του GSPs στην διασπασμένης κασπάσης-3 σε αυτά τα δείγματα και επιβεβαίωσε ότι τα GSPs αύξησε την ενεργοποίηση ή διάσπαση της κασπάσης-3 σε δύο MIAPaCa-2 και PANC -1 κύτταρα (Σχήμα 3C).

GSPs αναστέλλουν ΡΙ3Κ /Akt έκφραση σε καρκινικά κύτταρα

Καθώς η ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σηματοδότησης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη του καρκίνου, εμείς εξέτασαν τις επιδράσεις της GSPs αυτή την διαδρομή κυτταρικής επιβίωσης. MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP για 48 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα των ΡΙ3Κ και φωσφορυλίωση της Akt σε Ser

473 προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος Western. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η θεραπεία αυτών των κυτταρικών σειρών με τις GSP για 48 ώρες μείωσε τα επίπεδα τόσο του κανονιστικού (ρ85) και καταλυτική (P110) υπομονάδες ΡΙ3Κ και μείωσε επίσης την φωσφορυλίωση της Akt σε Ser

473 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενη τρόπο (Εικόνα 4Α). Όπως είναι καλά γνωστό ότι η δραστικότητα Akt συνήθως ρυθμίζεται από ενεργοποιημένα ΡΙ3Κ, επαληθεύσαμε ότι περαιτέρω Akt ρυθμίζεται από ΡΙ3Κ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε νοκ-κάτω ΡΙ3Κ σε MIAPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1 χρησιμοποιώντας κιτ ΡΙ3Κ siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι siRNA knockdown του ΡΙ3Κ είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση των επιπέδων του ρ-Akt σε αμφότερες MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα. Ωστόσο, η επίδραση στη συνολική Akt έκφραση δεν παρατηρήθηκε σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές σε siRNA knockdown του ΡΙ3Κ. Knockdown πρωτεϊνών ΡΙ3Κ επαληθεύτηκε επίσης χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western.

(Α) Κατεργασία MIAPaCa-2 και PANC-1 κύτταρα με τις GSP μειώνει το επίπεδο έκφρασης της PI3Kp85 (κανονιστική) και PI3Kp110 (καταλυτική) και φωσφορυλίωση του Akt με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Μετά την κατεργασία για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και προϊόντα λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος western για να προσδιοριστεί η έκφραση των διαφορετικών πρωτεϊνών. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων πρωτεΐνης. (Β) siRNA knockdown του ΡΙ3Κ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε μείωση του ρ-Akt επίπεδα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου siRNA.

Η

Διαιτητικά GSPs αναστέλλουν την ανάπτυξη των παγκρεατικών ξενομοσχευμάτων όγκου σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς

Δεδομένου ότι αυτά

in vitro

μελέτες έδειξαν ότι θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με τις GSP μειώνει τη βιωσιμότητα και επάγει την απόπτωση των κυττάρων αυτών, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν διαιτητική χορήγηση GSPs αναστέλλει

in vivo

ανάπτυξης όγκου χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Δεδομένου ότι η θεραπευτική επίδραση του GSPs σε κυτταρικές σειρές PANC-1 MIAPaCa-2 και ήταν ταυτόσημα, επιλέξαμε την κυτταρική σειρά MIAPaCa-2 για αυτά τα

in vivo

μελέτες. Σε προηγούμενες μελέτες έχουμε επίσης βρει ότι η διαιτητική GSPs στη δόση των 0,5% προκάλεσε σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις ανάπτυξη σε όγκους [9], [29], επιλέξαμε αυτή τη δόση του GSPs για περαιτέρω

in vivo

μελέτη. Τα ποντίκια έλαβαν την δίαιτα ελέγχου AIN76A μόνος του ή την ίδια δίαιτα συμπληρωμένη με τις GSP (0,5%, β /β). Τα μέσα βάρη σώματος των GSPs επεξεργασμένου και μη GSPs αγωγή ποντικών ήταν συγκρίσιμες σε όλη την πειραματική περίοδο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ομοίως, τα ποντίκια που έλαβαν τις GSP στη διατροφή τους, δεν παρουσιάζουν καμία φυσική ένδειξη τοξικότητας ή μη φυσιολογική συμπεριφορά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η χορήγηση του GSPs στη διατροφή κατά τη συγκέντρωση που χρησιμοποιείται σε αυτές τις μελέτες δεν σχετίζεται με εμφανή ακαθάριστο τοξικότητα.

Εβδομαδιαία μέτρηση του όγκου του όγκου έδειξε ότι η μέση ανάπτυξη του όγκου σε όρους συνολικού όγκου του όγκου /ποντίκι ήταν υψηλότερη στα ποντίκια που δεν έλαβαν τις GSP από τις ομάδες τις GSP-θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, σε ποντικούς που έλαβαν τις GSP στη δόση των 0,5% στη διατροφή τους, ο όγκος του όγκου κατά τον τερματισμό του πειράματος ήταν 64% (

P

& lt? 0.005) λιγότερο. Το πείραμα τερματίστηκε στις 11

ου εβδομάδα μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Κατά το χρόνο αυτό οι ποντικοί θανατώθηκαν, οι όγκοι συλλέχθηκαν και το υγρό βάρος του όγκου /ποντικό σε κάθε ομάδα θεραπείας καταγράφηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α (δεξιό πλαίσιο), το υγρό βάρος των όγκων ήταν 68% χαμηλότερη (

P

& lt? 0.005) σε ποντίκια χορηγήθηκε 0,5% GSPs στη διατροφή σε σύγκριση με τους όγκους από μη GSPs κατεργασμένα ποντίκια.

(Α) Διαιτητικά χορήγηση GSPs (0,5%, β /β) αναστέλλει την ανάπτυξη MIAPaCa-2 κύτταρα αναπτύσσονται ως ξενομοσχεύματα σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Μέσος όγκος του όγκου ± SD /ποντίκι (mm3) σε κάθε ομάδα θεραπείας μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. ιστοί ξενομοσχεύματος όγκου συλλέχθηκαν στο τέλος του πειράματος στις 11 εβδομάδες και το υγρό βάρος του όγκου /ποντικό σε κάθε ομάδα αναφέρεται σε γραμμάρια ως ο μέσος όρος ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ του ελέγχου και τις GSP-αγωγή ομάδες αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την Bonferroni

t

δοκιμή, η = 8. Η στατιστική σημαντικότητα

vs

όγκους από μη GSPs- ποντίκια με αγωγή ελέγχου, *

P

& lt? 0.005. (Β) Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του TUNEL-θετικών κυττάρων σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου από ποντικούς χορηγήθηκε GSPs στη διατροφή και τα ποντίκια δεν GSPs λαμβάνουν δείχνεται, και τα προκύπτοντα δεδομένα σχετικά με TUNEL-θετικών κυττάρων συνοψίζονται. (Γ) Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της ενεργοποιημένης κασπάσης-3-θετικών κυττάρων σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου από τις GSP-κατεργασμένα και μη-κατεργασμένα GSPs ποντικούς. Τα Ανοσοϊστοχημική δεδομένα όσον αφορά το ποσοστό των θετικών κυττάρων παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD από 5-6 δείγματα όγκων από κάθε ομάδα. TUNEL θετικά ή κασπάσης-3-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε τέσσερα έως πέντε διαφορετικούς τομείς, και τα δεδομένα συνοψίζονται σε όρους επί τοις εκατό θετικών κυττάρων από δείγματα ξενομοσχεύματος 5-6 όγκων. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφίες εμφανίζονται. (D) Διαιτητικά GSPs αναστέλλουν την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών ενώ αυξάνεται η έκφραση των προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bax, και τα επίπεδα των ενεργοποιημένων κασπασών-3 σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου. Προϊόντα λύσης όγκου παρασκευάστηκαν από τα ξενομοσχεύματα όγκου που συλλέγονται κατά τον τερματισμό του πειράματος που περιγράφεται στο Σχήμα 5Α και υποβλήθηκε σε ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες εμφανίζονται από ανεξάρτητα πειράματα από τουλάχιστον πέντε όγκους από πέντε διαφορετικά ποντίκια ανά ομάδα με τις ίδιες παρατηρήσεις.

Η

Διαιτητικά GSPs ενισχύσει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των παγκρεατικών κυττάρων όγκου σε ξενομοσχεύματα

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου με διαιτητική GSPs προκαλείται από τον θάνατο των κυττάρων του όγκου σε ξενομόσχευμα ιστούς, αξιολογήσαμε την επίδραση της GSPs στο αποπτωτικό δείκτη των καρκινικών κυττάρων σε δείγματα ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL.