Αφηρημένο

Ογκογένεση συνοδεύεται από αλλαγές στο πρότυπο μεθυλίωσης του DNA. Ο στόχος μας ήταν να δοκιμαστεί μια νέα προσέγγιση για την ταυτοποίηση των προϊόντων μετεγγραφής σε επίπεδο ολόκληρο μεταγραφής που ρυθμίζονται από μεθυλίωσης DNA. Η προσέγγισή μας βασίζεται στη σύγκριση των δεδομένων που λαμβάνονται από το μεταγραφικό προφίλ των πρωτογενών ανθρώπινων δειγμάτων και σε μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας vitro. Τα επιθηλιακά κύτταρα συλλέχθηκαν με LCM από την κανονική, αδένωμα, και οιδηματώδης του κόλου δείγματα. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, εντοπίσαμε μειωτικά γονίδια στους όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Παράλληλα 3000 ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια προσδιορίστηκαν σε ΗΤ-29 αδενοκαρκινώματος μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων του παχέος εντέρου μετά από θεραπεία απομεθυλίωση DNA. Από τους 2533 μεταγραφές που δείχνουν μειωμένη έκφραση στα νεοπλασματικής δείγματα, 154 είχαν αυξημένη έκφραση ως αποτέλεσμα της θεραπείας απομεθυλίωσης DNA. Περίπου 2/3 από αυτά τα γονίδια είχαν μειωμένη έκφραση ήδη στα δείγματα αδένωμα. Έκφραση των πέντε γονίδια (

GCG

,

NMES-1

,

LRMP

,

FAM161B

και

PTGDR

), ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR.

PTGDR

έδειξε διφορούμενα αποτελέσματα, γι ‘αυτό μελετήθηκε περαιτέρω να εξακριβωθεί η έκταση της μεθυλίωσης του DNA και την επίδρασή της στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η προσέγγισή μας είναι κατάλληλο για το γονιδίωμα-ευρεία έλεγχο των γονιδίων που ρυθμίζονται ή απενεργοποιούνται με μεθυλίωση του DNA. Δραστηριότητα των γονιδίων αυτών, ενδεχομένως, παρεμβαίνει με την εξέλιξη του όγκου, ως εκ τούτου, τα γονίδια εντοπίστηκαν μπορούν να αποτελέσουν βασικούς παράγοντες στη διαμόρφωση και την εξέλιξη της νόσου

Παράθεση:. Spisak S, Καλμάρ Α, Galamb O, Wichmann Β, Sipos F , Péterfia Β, et al. (2012) Genome-Wide Έλεγχος των γονιδίων που ρυθμίζονται από μεθυλίωσης του DNA στο Colon την ανάπτυξη του καρκίνου. PLoS ONE 7 (10): e46215. doi: 10.1371 /journal.pone.0046215

Επιμέλεια: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Απρίλη 2012? Αποδεκτές: 28 Αυγούστου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 1η Οκτωβρίου, 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Γραφείο Έρευνας και Τεχνολογίας, η Ουγγαρία (TECH_08-A1 /2-2008- 0114 επιχορήγησης), από το Εθνικό Γραφείο Καινοτομίας ουγγρικά, και από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Δανίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης ογκογονιδίων και αδρανοποίηση των καταστολείς όγκων, είναι υπεύθυνοι για τον σχηματισμό και την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) [1], [2]. Εκτός από τις συσσωρεύονται αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, η δυσλειτουργία του συστήματος ρύθμισης επιγενετικές μπορεί επίσης να οδηγήσει σε παρεκκλίνουσα σχηματισμό του επιθηλίου του παχέος εντέρου κατά μήκος της προοδευτικής διαδικασίας της καρκινογένεσης [3], [4]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές ποια μοριακά γεγονότα επηρεάζουν επιμέρους δραστηριότητες των γονιδίων και αν πρόκειται για άμεση ή έμμεση επίδραση [5], [6], [7].

Ένα από τα επιγενετικών διεργασιών που επηρεάζουν τη γονιδιακή έκφραση είναι μεθυλίωσης του DNA, ένα μετα-αναδιπλασιαζόμενη τροποποίηση του DNA που εμφανίζεται κυρίως στις περιοχές του γονιδιώματος πλούσια σε CG δινουκλεοτίδια, τα λεγόμενα CpG νησίδων [8]. Τροποποίηση των βάσεων με την προσθήκη μιας ομάδας μεθυλίου φυσικά μπορεί να αναστέλλουν πρόσδεση των παραγόντων μεταγραφής, και επιτρέπει επίσης την πρόσληψη του μεθυλο-CpG-δεσμευτικές πρωτεΐνες πεδίο (π.χ. .: MDB1-3, MeCP2) προς περιοχές υποκινητή, το οποίο μπορεί να καταστείλει την έναρξη της μεταγραφής [ ,,,0],9]. Η ανώμαλη αλλαγές του προτύπου μεθυλίωσης ιστοειδική συχνά εκδηλώνεται με δύο τρόπους: (i) την παγκόσμια υπομεθυλίωση, η οποία εμφανίζεται σε ολόκληρο το γονιδίωμα με τη γήρανση, και (ii) τις τοπικές υπερμεθυλίωση των 5 ‘ρυθμιστικών περιοχών στην ογκογένεση, η οποία συνήθως οδηγεί σε μειωμένη ή σταμάτησαν μεταγραφική δραστηριότητα των προσβεβλημένων γονιδίων [10], [11], [12]. μεσολάβηση υπερμεθυλίωση αλλαγές στη γονιδιακή ρύθμιση διαδραματίζουν βασικό ρόλο κατά την ανάπτυξη διαφόρων τύπων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, και δείχνουν επίσης μια ογκο-ειδικό πρότυπο [13].

Είναι γνωστό, ότι η μεθυλίωση του DNA επηρεάζει τις δραστηριότητες γονίδιο χωρίς να αλλάζει η αλληλουχία DNA από μόνη της, και μπορεί να επανέλθει με απομεθυλίωση παράγοντες οι οποίοι δρουν με αναστολή της μεθυλίωσης του DNA, όπως 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα). Αυτό δίνει μια θεωρητική δυνατότητα να επιβραδυνθεί ή να συλλάβουν την ανάπτυξη του όγκου σε περίπτωση πρόωρης ανίχνευσης. Ωστόσο, για την καλύτερη κατανόηση των διαδικασιών μεθυλίωσης του DNA, καθώς και για την δυνατότητα χρησιμοποίησης ορθοκολικού καρκίνου-ειδικών βιοδεικτών μεθυλίωση για τη διαλογή των ασθενών, ή ακόμη και για να επιτευχθεί γονίδιο στόχευσης απομεθυλίωση στο μέλλον, τα προσβεβλημένα γονίδια πρέπει να εντοπιστούν. Αν και έχουν αρκετά γονίδια μεθυλίωση ρυθμιζόμενων έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται με τον καρκίνο (συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού καρκίνου) ανάπτυξη, μια λεπτομερής διαδικασία εξακολουθεί να παραμένει ασαφές [14], [15], [16], [17], [18], [19] .

Αν και πολλές στρατηγικές είναι διαθέσιμες για την αξιολόγηση του DNA μεθυλίωση στο επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος συμπεριλαμβανομένης αλληλούχιση [20], [21] και τα συστήματα array [22], [23], οι προσεγγίσεις αυτές μπορεί να είναι επαρκής μόνο στην περίπτωση του ιστούς ή κυτταρικές καλλιέργειες, από τις οποίες μπορούν να ληφθούν σχετικά μεγάλη ποσότητα του υλικού έναρξης (γονιδιωματικό DNA), όπως διαφορετικοί τύποι κυττάρων έχουν διακριτά πρότυπα μεθυλίωσης [24], [25], [26]. σύλληψη Laser μικροδιατομής (LCM) μπορεί να χρησιμεύσει ως κατάλληλη μέθοδος κύτταρο διαχωρισμού [27]. Ωστόσο, η περιορισμένη ποσότητα των συλλεκτικά δείγματος οδηγεί σε μια προκλητική μειονέκτημα στην περίπτωση των μελετών μεθυλίωσης, επειδή οι τεχνικές ενίσχυσης σήμερα διαθέσιμα in vitro δεν μπορεί να διατηρήσει το μοτίβο μεθυλίωσης. Σε αντίθεση, η έκφραση του γονιδίου μπορεί να αναλυθεί συστηματικά στις λέιζερ μικροτομή κύτταρα, τα οποία μπορούν να συνδυαστούν με την ανάλυση μικροσυστοιχιών για τη συλλογή πληροφοριών, ακόμη και από ένα μόνο κύτταρο στο επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος.

Σε αυτή την εργασία παρουσιάζουμε μια έκφραση του γονιδίου που βασίζονται προσέγγιση η οποία είναι κατάλληλη για την αποτελεσματική, υψηλής απόδοσης, γονιδιώματος σε επίπεδο διαλογής για μεθυλίωση ρυθμιζόμενα γονίδια, των οποίων η μειωμένη έκφραση μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου. Οι δυνατότητες αυτής της μεθόδου αποδείχθηκε προηγουμένως με τον εντοπισμό 17 μεταγραφές που ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος, και έδειξαν αυξημένη δραστικότητα σε ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου μετά από 5-Αζα αγωγή [28]. Η επέκταση της προηγούμενης μελέτης, εδώ έχουμε αναφέρει 154 γονίδια, τα οποία είναι πιθανό αναστέλλεται από μεθυλίωση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η αξιοπιστία της μεθόδου υποστηρίζεται από ένα ευρύ φάσμα πειραματικών και

in silico

μεθόδους που παρουσιάζονται στο παρόν έγγραφο. Έκφραση διαφόρων μεταγραφημάτων ελέγχθηκε με RT-PCR. Έχουμε αποκαλύψει τη σχέση μεταξύ της έκφρασης του γονιδίου και την κατάσταση μεθυλίωσης στην περίπτωση της

PTGDR

γονιδίου με ανάλυση RT-PCR, ανοσοϊστοχημεία, διθειώδες αλληλουχίας, και ανάλυση HRM. Στο PCA αναλύσεις φυσιολογικό, αδένωμα, και τα δείγματα CRC μπορεί να πραγματοποιηθεί επιτυχώς διαχωρίζεται με βάση τα πρότυπα έκφρασης αυτών των 154 μεταγραφές, τόσο στο δικό μας σύνολο του δείγματος και σε ανεξάρτητα σύνολα δείγμα που λαμβάνεται από τη βάση δεδομένων GEO.

Αποτελέσματα

Microarrays δειγμάτων ιστού LCM και ΗΤ-29 κυττάρων

υπερμεθυλίωση αρκετών γονιδιωματικών περιοχών είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι σχετίζονται με ογκογόνο μετασχηματισμό. Λόγω μεθυλίωση του νησιού (ες) σε CpG περιοχή προαγωγού ενός γονιδίου μπορεί να μειώσει τη μεταγραφή του γονιδίου, ψάξαμε για τα γονίδια με μειούμενο έκφραση σε δείγματα ανθρώπινου όγκου κόλου συγκριτικά με φυσιολογικό κολονικό επιθηλιακών ιστών. αλλαγές έκφραση σε δείγματα όγκων μπορεί να προκύψει από διαφορετικά μοριακά γεγονότα, συμπεριλαμβανομένων των άμεσων και έμμεσων επιπτώσεων των μεταλλάξεων [29], [30], [31]. Ωστόσο, οι αλλαγές στο πρότυπο έκφρασης που παρατηρείται σε ένα απομεθυλιωμένο μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας μπορούν να προβλέψουν ποια γονίδια ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA (Σχήμα 1). Η γονιδιακή έκφραση σε δείγματα ιστού μελετήθηκε με HGU133 Plus2.0 μικροσυστοιχίες, και τα ληφθέντα δεδομένα αναλύθηκαν με τη (Ανάλυση Σημασία των μικροσυστοιχιών) SAM αλγόριθμο. Περίπου 2.000 μεταγραφές, που ανήκουν σε περίπου 2.500 σύνολα ανιχνευτή, ταυτοποιήθηκαν τα οποία είχαν μειωμένη έκφραση στα δείγματα όγκου (Πίνακας S1).

Η

Γονίδια τα οποία αδρανοποιούνται με υπερμεθυλίωση μπορεί να επανενεργοποιηθεί με την απομάκρυνση του μεθυλίου ομάδες από τα νησιά του CpG περιοχών προαγωγού τους, η οποία μπορεί να ληφθεί με ανάπτυξη των κυττάρων με την παρουσία του ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση αναστολέας της 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. επίπεδα έκφρασης γονιδίων σε 5-αζα-κατεργασμένα και μη-κατεργασμένα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ΗΤ-29 κόλον συγκρίθηκαν. Επειδή η θεραπεία 5-Αζα προκαλεί δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [32], [33], [34], οι προσδιορισμοί ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης της θεραπείας. Με βάση τα αποτελέσματα 10 μΜ 5-αζα εφαρμόστηκε στη θεραπεία απομεθυλίωση του ΗΤ-29 κύτταρα. Επειδή η θεραπεία 5-Αζα δεν μπορεί να επανενεργοποιήσει γονίδια εντελώς, θεωρήσαμε τις κορυφαίες 3000 σύνολα ανιχνευτή που έχει την υψηλότερη ημερολόγιο

αξίες 2ΕΜ σε επίπεδο σημαντικότητας p & lt? 0.025 έως δυνητικά να ρυθμίζεται προς τα πάνω. Μεταξύ των περίπου 2000 μεταγραφές που έδειχναν μειωμένη μεταγραφή στους όγκους του παχέος εντέρου, 154 γονίδια βρέθηκαν που έδειξαν αυξημένη έκφραση των 5-Αζα-αγωγή κύτταρα ΗΤ-29 χρησιμοποιώντας τα παραπάνω κριτήρια. Με βάση την ανάλυση μικροσυστοιχίας αυτά είναι υποψήφια γονίδια τα οποία είναι πιθανό σιγήσει σε όγκους παχέος εντέρου με DNA υπερμεθυλίωση είτε άμεσα είτε έμμεσα (Πίνακας S2). Είναι ενδιαφέρον ότι, 108 από τις 154 μεταγραφές είχαν μειωθεί σημαντικά τα επίπεδα ήδη στα δείγματα αδένωμα (Σχήμα S1) (Πίνακας S3). πρόβλεψη υποστηρικτής περιοχή έγινε χρησιμοποιώντας τα εργαλεία Οικόπεδο EMBOSS CpG. Με βάση τα αποτελέσματα της πρόβλεψης και αναλύσεις των ανεξάρτητων δεδομένων δημόσιας μικροσυστοιχιών, επιλέχθηκαν 6 μεταγραφές για περαιτέρω ανάλυση. Αυτές οι μεταγραφές ανήκουν στο

GCG

(γλυκαγόνη),

NMES-1

(φυσιολογικού βλεννογόνου του οισοφάγου ειδικά 1, που ονομάζεται επίσης

C15orf48

),

LRMP

(πρωτεΐνη της μεμβράνης λεμφικών-περιορισμένη),

FAM161B

(οικογένεια με ομοιότητα ακολουθίας 161, μέλος Β), και

PTGDR

(υποδοχέας D2 προσταγλανδίνης) γονίδια, τα οποία επίσης έδειξαν διαφορική έκφραση σε μας προηγούμενη πιλοτική μελέτη [35], αλλά δεν έχουν συνδεθεί με CRC και πριν, και να

CDKN2B

, ένα γνωστό ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Το σχήμα 2 αντιπροσωπεύει τα πρότυπα έκφρασης αυτού του σετ των 6 γονιδίων σε σύνολα δεδομένων LCM μας. Η θερμικός χάρτης δείχνει σχετικά υψηλή έκφραση του γονιδίου που σε φυσιολογικούς ιστούς που μειώνεται κατά τη διάρκεια καρκινογένεσης.

Η έκφραση του γονιδίου καταστολής του όγκου

CDKN2B

δείχνεται για σύγκριση. Ανιχνευτών κωδικούς αναγνώρισης και τα ονόματα των γονιδίων υποδεικνύονται στα δεξιά. Οι έξι στήλες δείχνουν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από μικροσυστοιχιών έξι μεμονωμένα δείγματα για κάθε τύπο των ιστών. Μαύρα τετράγωνα δείχνουν ότι η γονιδιακή έκφραση ήταν αμετάβλητη σε αυτό το πείραμα. Ο βαθμός της έντασης του κόκκινου ή πράσινου δείχνει το επίπεδο της υψηλής έκφρασης του γονιδίου ή χαμηλή, αντίστοιχα.

Η

RT-PCR Επικύρωση Αναλύσεις

Στο μικροσυστοιχιών αναλύει τη μεταγραφή όλων των γονιδίων αυτών ανεστάλη στα δείγματα όγκου αλλά έδειξαν διαφορετικούς βαθμούς ετερογένειας στα δείγματα αδένωμα (Σχήμα 2). Επιπλέον, αυτά τα γονίδια επανενεργοποιήθηκαν σε διάφορους βαθμούς, ως αποτέλεσμα της θεραπείας 5-Αζα σε κύτταρα ΗΤ-29. Στο GCG ανάλυσης μικροσυστοιχιών, NMES-1, και LRMP μεταγραφές έδειξε ισχυρή απαντήσεις (& gt? 2,5-πλάσια αύξηση), ενώ FAM161B και PTGDR mRNAs έδειξαν ασθενέστερη απαντήσεις (& lt? 1,5 φορές αύξηση). Η έκφραση του

CDKN2B

, ως ένα πολύ γνωστό μεθυλίωση ρυθμίζονται ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ελέγχθηκε με RT-PCR πριν από την [36]. Επιπλέον, η έκφραση των πέντε επιλεγμένων γονιδίων,

GCG

,

NMES-1

,

LRMP

,

FAM161B

, και

PTGDR

, δοκιμάστηκε επίσης σε ανεξάρτητες λέιζερ μικροδιατομή του κόλου και επίσης σε απομεθυλιωθεί ΗΤ-29 κύτταρα με πραγματικού χρόνου PCR. Οι αλληλουχίες εκκινητών εφαρμόζονται PCR δίνονται στον Πίνακα S4.

5-Αζα αγωγή κύτταρα ΗΤ-29.

Για να μελετηθεί η επίδραση της απομεθυλίωσης, ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 10 μΜ 5- Aza και το επίπεδο έκφρασης της επιλεγμένης ομάδας γονιδίων εξετάστηκε σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου αιθυλεστέρα-αγωγή (διαλύτης για 5-Αζα) (Σχήμα 3). Μετά την απομεθυλίωση,

GCG

,

NMES-1

, και

LRMP

γονίδια έδειξαν αύξηση της έκφρασης, ενώ η μεταγραφή του

FAM161B

γονίδιο δεν άλλαξε σημαντικά . Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με μια θεραπεία 20 μΜ 5-Αζα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της συγκριτικής Cp (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Γονίδια θεωρήθηκαν ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω με τιμές χαμηλότερες από 0,5 (50% μείωση, οριζόντια διακεκομμένη γραμμή), και ρυθμίζεται προς τα πάνω με τιμές ανώτερες 2 (δύο-φορές αύξηση). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο housekeeping ελέγχου. Ανοιχτό γκρι και σκούρο γκρι στήλες δείχνουν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε αδενώματος και σε δείγματα όγκου σε σχέση με φυσιολογικά δείγματα, αντίστοιχα. Εκκολαφθεί στήλες δείχνουν τη σύγκριση των 5-Aza αντιμετωπίζονται και τα κύτταρα ελέγχου. Οι τυπικές αποκλίσεις των μετρούμενων επιπέδων μεταγραφής υπολογίστηκαν και ενδείκνυνται για κάθε μεταγράφημα. εντάσεις γονίδιο καθαριότητας τέθηκαν στον μέσο όρο για κάθε ομάδα.

Η

δειγμάτων LCM ιστού.

Τα αποτελέσματα RT-PCR συγκρίθηκαν σε φυσιολογικό κόλον βλεννογόνο αδενώματος και φυσιολογικό κόλον σχέσεις βλεννογόνο όγκου σε μεμονωμένα δείγματα ιστών. Αυτά τα πέντε φυσιολογικά επιθηλιακά, πέντε αδενώματος και τέσσερα όγκου δείγματα ήταν ανεξάρτητες από αυτές που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση μικροσυστοιχίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν καλή συμφωνία με την ανάλυση μικροσυστοιχίας,

GCG

,

NMES-1

, και

FAM161B

γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα κάτω τόσο στην αδενώματος και τα δείγματα όγκων, ενώ

LRMP

έδειξε μειωμένη έκφραση μόνο στα δείγματα των όγκων (Σχήμα 3).

PTGDR

έκφρασης έδειξε διφορούμενα αποτελέσματα στα πειράματα RT-PCR. Δεν δείχνουν μια ισχυρή απάντηση για τη θεραπεία 10 μΜ 5-Αζα, αλλά είχε περίπου 1,7 φορές αυξημένη έκφραση όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ 5-Αζα. Επίσης, τα επίπεδα PTGDR RNA έδειξαν ετερογένεια στα δείγματα των ιστών (Σχήμα 4Α), ως εκ τούτου πραγματοποιήσαμε περαιτέρω αναλύσεις για να αποκαλύψει το υπόβαθρο αυτών των παρατηρήσεων. Οι τιμές έκφρασης για τον ανιχνευτή 215894_at PTGDR που δοκιμάστηκαν σε ανεξάρτητα σύνολα GEO (Σχήμα 4 Β, C). Σε αυτούς τους ανεξάρτητους σύνολα δειγμάτων, μειωμένα επίπεδα PTGDR mRNA βρέθηκαν ήδη στα δείγματα αδένωμα, το οποίο μειώθηκε περαιτέρω σε δείγματα CRC.

σε πραγματικό χρόνο PCR και ανάλυση δεδομένων διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Γονίδια θεωρείται ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω με τιμές χαμηλότερες από 0,5 (50% μείωση, οριζόντια διακεκομμένη γραμμή) (Α) κατανομή αξίας Έκφραση της probeset 215894_at (για

PTGDR

γονίδιο) στην GSE8671 (Β) και GSE18105 ( Γ) σύνολα δεδομένων GEO. τιμές P: Κανονικό εναντίον Adenoma P = 0.000712? CRC έναντι Κανονική Ρ = 0.0003797? LCM CRC έναντι Κανονική Ρ = 0.0000004? LCM CRC εναντίον CRC P = 0,834.

Η

Bisulfite ειδικά PCR και Διαχείρισης Ανθρώπινου Δυναμικού (High Resolution τήξης) Ανάλυση

Για να βεβαιωθείτε ότι η ρυθμιστική περιοχή του

PTGDR

πράγματι υπερμεθυλιωμένο, εκτελέσαμε ανάλυση τήξης PCR και υψηλής ανάλυσης διθειώδες ειδικές για γενωμικού DNA [37]. Η πρότυπη σειρά διάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η ευαισθησία των δοκιμασιών HRM μας. Σύμφωνα με τις καμπύλες τήξης κανονικοποιημένες, δοκιμασία μας ήταν σε θέση να ανιχνεύει 2% μεθυλιωμένου DNA σε 98% μη μεθυλιωμένη φόντο. Η επί τοις εκατό μεθυλίωσης των δειγμάτων ιστού εκτιμήθηκε σύμφωνα με κανονικοποιημένες καμπύλες τήξης τους σε σύγκριση με την πρότυπη σειρά αραίωσης. Όλα τα δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου ομαλοποιημένη καμπύλη τήξης μειώθηκαν μεταξύ των περιοχών που οριοθετούνται με 0% -2% τυποποιημένα δείγματα. Στην περίπτωση των δειγμάτων όγκου, 1 δείγμα ήταν στο 0% -2% Εύρος μεθυλίωση, 2 μεταξύ 2-25% και δύο δείγματα αναλογία μεθυλίωση υψηλότερο από 25% (Σχήμα 5) έδειξε. Ανάλυση του επιλεγμένου

PTGDR

περιοχή από την κυτταρική σειρά ΗΤ29 έδειξε σχεδόν 100% μεθυλίωση. Για την επικύρωση, διθειώδες αλληλούχισης διεξήχθη για να προσδιοριστεί η κατάσταση μεθυλίωσης της περιοχής αυτής. (Εικόνα S2.)

Οι διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν την πρότυπη σειρά διάλυσης από τεχνητά μεθυλιωμένο DNA (0%, 25%, 50%, 75% και 100%). Το στερεό μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από ένα κανονικό δείγμα. Στερεά γκρι γραμμές αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα που λαμβάνονται από 5 ανεξάρτητα δείγματα οιδηματώδης ιστού. Η ανάλυση μπορεί να διακρίνει HRM μεθυλίωση των φυσιολογικούς και ογκογόνους ιστούς βασίζεται στο διαφορετικό G: περιεχόμενα C στην αλληλουχία υποκινητή διθειώδες-μετατραπεί. Οι περιοχές προαγωγέα που περιέχουν περισσότερο μεθυλιωμένα κυτοσίνες, τα οποία δεν μπορούν να μετατραπούν σε ουρακίλη από την κατεργασία όξινου θειώδους, έχει υψηλότερες θερμοκρασίες τήξης. Η θερμοκρασία τήξης είναι ανάλογη προς το λόγο της μη μετατραπεί κυτοσίνες.

Η

Ιστός Microarray Analysis, PTGDR Ανοσοϊστοχημεία

Η D2 υποδοχέα προσταγλανδίνης μελετήθηκε περαιτέρω με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας TMA διαφάνειες για να προσδιοριστεί η επίδραση της μεθυλίωσης του DNA στο επίπεδο πρωτεΐνης. Φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου του παχέος εντέρου έδειξε ισχυρή επιθηλιακά κυτταροπλασματική ανοσοχρώση, η οποία μειώθηκε διαδοχικά στο στάδιο αδένωμα κοντά στην επιφάνεια του αυλού. Η ένταση ανοσοκηλιδώσεως μειώθηκε περαιτέρω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και μόνο μέτρια έκφραση θα μπορούσε να παρατηρηθεί στα δείγματα όγκου (Σχήμα 6 αριστερό πλαίσιο). Αν και σε μερικές αδενώματος και ογκογόνους δειγμάτων η έκφραση της πρωτεΐνης βρέθηκε να είναι παρόμοιο με αυτό που ανιχνεύθηκε στο φυσιολογικό επιθήλιο (σχήμα S3). Μια προκατειλημμένη μείωση έκφρασης πρωτεΐνης PTGDR παρατηρήθηκε στην εξέλιξη αλληλουχία αδένωμα-καρκινώματος (Σχήμα 6 δεξιό πλαίσιο).

Στα κανονικά δείγματα (κορυφή), κατά κύριο λόγο ισχυρή, διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση ανιχνεύθηκε, το οποίο μετρίως μειώθηκε στην δείγματα αδένωμα (μέση), και μόνο ασθενή κυτταροπλασματική χρώση παρατηρήθηκε στα δείγματα παχέος καρκίνος (κάτω). Το δεξί πλαίσιο εμφανίζει τα οικόπεδα ένωση που αντιπροσωπεύουν μεροληπτικό τρόπο μειώνεται η έκφραση της πρωτεΐνης PTGDR κατά μήκος της αλληλουχίας καρκίνωμα αδένωμα. Για τη μέτρηση της σύνδεσης δύο μεταβλητών (έκφραση και το στάδιο της νόσου), χρησιμοποιήθηκε η Chi-square τεστ. Το ύψος (και βάθος χρώματος) των κουτιών είναι ανάλογη με τη διαφορά μεταξύ της παρατηρούμενης και της αναμενόμενης συχνότητας των βαθμολογιών. Η προς τα κάτω κόκκινου χρώματος πλαίσια δείχνουν ότι η παρατηρούμενη συχνότητα είναι χαμηλότερη από την αναμενόμενη. Οι προς τα πάνω, μπλε αντικείμενα αντιπροσωπεύουν το αντίθετο. PTGDR βαθμολογίες ανοσοχρώση:

–

2 = καμία χρώση? 0 = ασθενής χρώση? 1 = μέτρια χρώση? 2 = έντονη διάχυτη επιθηλιακά κυτταροπλασματική ανοσοχρώση.

Η

Έλεγχος της μεθυλίωσης γονιδίων που ρυθμίζονται σε ανεξάρτητα σύνολα δειγμάτων /έκφραση με PCA

Για να ελέγξετε τη διακριτική εξουσία των 154 επιλεγμένων γονιδίων, τα οποία είναι πιθανό ρυθμίζεται από μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, τους έχουμε δοκιμαστεί σε δύο ανεξάρτητα σύνολα δειγμάτων από την Gene Expression Omnibus (GEO) αρχείο δημόσια μικροσυστοιχιών. Ένα από τα σύνολα δειγμάτων, GSE8671 [38], περιέχει φυσιολογικό και αδένωμα, και το άλλο, GSE18105 [39], φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων. Το τελευταίο σετ δείγμα είναι ιδιαίτερα κατάλληλο για την επικύρωση, δεδομένου ότι περιέχει τόσο ομογενοποιείται και LCM δείγματα όγκων. Δραστηριότητες όλων των 154 γονίδια στη λίστα μας συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μια τυποποιημένη μέθοδο μείωσης διάσταση, ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) [40], η οποία μετατρέπει την πολυμεταβλητή καταγραφής δεδομένων 2-έκφραση

σε 2 διαστάσεις. PCA επιλέγει τις κατευθύνσεις με τη μεγαλύτερη διακύμανση στη συνέχεια περιστρέφεται και προβάλλει τα δεδομένα σε αυτό το χώρο. Υπολογίσαμε τη μήτρα μετασχηματισμού χρησιμοποιώντας 6 κανονικό μας και 6 δείγματα LCM CRC (τα δείγματα αδένωμα δεν χρησιμοποιήθηκαν κατά τον υπολογισμό του πίνακα μετασχηματισμού) και χρησιμοποιήθηκε το οδήγησε μήτρα μετασχηματισμού να προβάλει όλα τα δείγματα στο χώρο που καλύπτεται από τις πρώτες 2 κύριες συνιστώσες . Τα δύο πρώτα στοιχεία περιέχουν 81% του σωρευτικού συνολικής διακύμανσης? ως εκ τούτου, μπορεί κανείς να περιμένει να αντιπροσωπεύουν πιστά την κατανομή πολλών μεταβλητών. Εικόνα 7Α δείχνει ότι οι συνήθεις και LCM δείγματα CRC είναι σαφώς διαχωρισμένα, και όταν τα δείγματα αδένωμα προβάλλεται στο χώρο PCA, βρίσκονται μεταξύ των φυσιολογικών και CRC δείγματα, υποστηρίζουν την υπόθεση ότι αδένωμα είναι μια μεταβατική κατάσταση μεταξύ της κανονικής και CRC φάσεις [2], [41]. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μόνο τα έξι γονίδια που παρατίθενται στο Σχήμα 2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η διακριτική εξουσία των επιλεγμένων 154 γονίδια ήταν επικυρωθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευθεί σύνολα δεδομένων. Η προβολή PCA που υπολογίστηκε με βάση αποκλειστικά LCM CRC μας και φυσιολογικά δείγματα θα μπορούσαν επίσης να διαχωρίσει πλήρως τις κανονικές και αδένωμα υποσύνολα της μελέτης GSE8671 (βλέπε Εικόνα 7C). Για το άλλο σύνολο δεδομένων GEO, GSE18105, ο διαχωρισμός είναι σχεδόν τέλεια για δείγματα τόσο το ομογενοποιημένο CRC και LCM CRC, μόνο ένα σημείο, σημειώνεται με ένα βέλος στο Σχήμα 7Β είναι ταξινομηθεί εσφαλμένα. Για να βρείτε την αιτία της ανάλυσης απόσταση εσφαλμένης ταξινόμησης Ευκλείδεια διεξήχθη στην οποία αυτό το συγκεκριμένο δείγμα αποδειχθεί ότι είναι μια ακραία (Συμπληρωματική Εικόνα S4).

Τα κύρια συστατικά υπολογίστηκαν από το αρχείο καταγραφής τιμές

2-έκφραση οι 154 επιλεγμένες ομάδες ανιχνευτών για τις κανονικές-CRC δείγματα σε σύνολο LCM μας, και στη συνέχεια όλα τα 3 σετ προβλήθηκαν στο κύριο συστατικό χώρο συντεταγμένων. Σημειώστε ότι αυτή η μέθοδος μπορεί να θεωρηθεί ως μη επιβλεπόμενη ταξινόμηση, δεδομένου ότι δεν χρησιμοποιούν ρητά τις κατηγορίες στη διαδικασία ανάλυσης των δεδομένων. Σχήμα 7.A δείχνει ότι η μετατροπή PC διαχωρίζει πολύ καλά τις κανονικές και LCM CRC δειγμάτων και τοποθετεί τα δείγματα αδενώματος μεταξύ των κανονικών και CRC δείγματα. Για την επικύρωση λίστα των πιθανών γονιδίων σήμανσης, έχουμε μετατραπεί τα δεδομένα των άλλων δύο ανεξάρτητες μελέτες για τις ίδιες συντεταγμένες PC. Οι δύο μελέτες από την έκφραση γονιδίων Omnibus αρχείο μικροσυστοιχιών ήταν GSE18105 με την κανονική, CRC και LCM CRC δείγματα και GSE8671 με φυσιολογική και αδένωμα δείγματα. Για τα δύο σύνολα ο διαχωρισμός των κατηγοριών είναι καλό εκτός από ένα σημείο ακραία σε Β σημειώνονται με ένα βέλος (βλέπε συζήτηση στο κείμενο).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε ένα νέα διαλογή υψηλής απόδοσης για την επιλογή μιας ομάδας γονιδίων, των οποίων η αλλαγμένη γονιδιακή έκφραση λόγω της παρεκκλίνουσας πρότυπο μεθυλίωσης του DNA μπορεί να σχετίζεται με τον καρκίνο. Δραστηριότητα τέτοιων γονιδίων μπορεί να αναστέλλει την πρόοδο του καρκίνου, ως εκ τούτου η ταυτοποίησή τους θα μπορούσε να βελτιώσει τον προσδιορισμό της πρόγνωσης.

Σε προηγούμενη εργασία, έχουμε αναπτύξει ένα πειραματικό σύστημα για την αναγνώριση της μεθυλίωσης γονιδίων που ρυθμίζονται με βάση την εξέταση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης σε κλινικά δείγματα LCM και σε 5-αζα αγωγή κύτταρα ΗΤ-29. 110 μεταγραφές έδειξαν μειωμένη έκφραση στην ανάπτυξη του όγκου και ταυτοποιήθηκαν 71 ρυθμίζεται αυξητικά μεταγραφές και το αποτέλεσμα της 5-αζα θεραπεία. 17 μεταγραφές ανήκαν σε δύο ομάδες, και αυτές οι μεταγραφές ήταν υποτίθεται ότι ρυθμίζεται από τη μεθυλίωση του DNA [28].

Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε μια πολύ ευρύτερη στρατηγική ανάλυση, με αποτέλεσμα την ταυτοποίηση του 2533 μειωτικά μεταγραφές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου , και 3000 αυξορρυθμίζεται μεταγραφές, ως αποτέλεσμα της 5-αζα θεραπεία των κυττάρων ΗΤ-29 (Σχήμα 1). Η μεθυλίωση σχετίζονται 154 μεταγραφές ήταν παρούσες και στις δύο ομάδες, δηλαδή είχαν μειωμένη έκφραση σε όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικά κύτταρα του βλεννογόνου του παχέος εντέρου και έδειξαν αυξημένη δραστικότητα μετά τη θεραπεία απομεθυλίωση ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου. Επομένως, αυτοί οι μεταγραφές είναι πιθανό αναστέλλεται από μεθυλίωση, άμεσα ή έμμεσα, κατά την διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η ισχύς αυτού του καταλόγου υποστηρίζεται από (i) την παρουσία πολλών γονιδίων που βρέθηκαν προηγουμένως να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παχέος εντέρου (π.χ.

CHGA

,

FCGBP

,

GSN

,

απόρρητο

,

ΜΥΗ11

,

PLCG2

,

SST

,

NBL1

) [42], [43], (ii) η παρουσία πολλών γνωστών ογκοκατασταλτικών γονιδίων (π.χ.

CDKN2B

,

MTUS1

,

RASSF6

,

PDCD4

,

KLF5

,

Cds1

), και (iii) από τα αποτελέσματα των αναλύσεων κύριο συστατικό εκτελείται σε προηγουμένως δημοσιευθέντα σύνολα δεδομένων. Υπάρχουν διάφορες γενετικές και επιγενετικές παράγοντες που μπορούν να συνεισφέρουν στην μειωμένη έκφραση των γονιδίων σε κύτταρα όγκου. Ήμασταν ενδιαφέρεται γονίδια τα οποία μπορούν να σιγήσει μεθυλίωσης του DNA. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι πολλά γονίδια είναι αδρανοποιημένο σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, ωστόσο, υπάρχουν μεγάλες διαφορές μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών [16], [17], υποδηλώνοντας ότι δεν είναι όλοι οι αδρανοποιημένα γονίδια που σχετίζονται με ογκογένεση. Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, η δραστηριότητα αρκετών γονιδίων που προσδιορίζονται από την προσέγγιση μας μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη του όγκου. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από την παρουσία της εξαρτώμενης από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 2Β (

CDKN2B

) και 2C (

CDKN2C

) ογκοκατασταλτικών γονιδίων εντός της οριοθετημένης σετ γονίδιο. Η

CDKN2B

γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9ρ21, ένας τόπος στον οποίο διαγραφές συμβαίνουν συχνά σε πολλούς πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του οισοφάγου [44] και του παχέος εντέρου [45].

CDKN2B

, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω σε δείγματα όγκων αδενώματος και ορθοκολικού μας επίσης σιγήσει από μεθυλίωση του DNA σε μια ποικιλία αιματολογικών κακοηθειών [46].

CDKN2C

είχε προηγουμένως αναφερθεί για να αδρανοποιηθεί με υπερμεθυλίωση προαγωγέα σε κύτταρα Reed-Sternberg σε Hodgkin λεμφώματα, και η απώλεια της CDKN2C έδειξε αρνητική συσχέτιση με τη συνολική επιβίωση των ασθενών [47]. αποκριτή υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος 1 (

RARRES1

) είναι επίσης ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Η έκφρασή του συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω του DNA υπερμεθυλίωση σε διάφορους τύπους κακοηθών ιστών. Προς τα κάτω ρύθμιση του

RARRES1

προτάθηκε να σχετίζεται με το στάδιο D εξέλιξης του ορθοκολικού καρκίνου [48]. Υποέκφραση αρκετών άλλων γονιδίων, που προσδιορίζονται από την προσέγγιση μας, περιγράφηκε προηγουμένως ότι συνδέεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Για παράδειγμα, η μεθυλ-CpG δέσμευσης πρωτεΐνης τομέα, MBD4, η οποία εμπλέκεται στην αναντιστοιχία επισκευή σε θέσεις CpG, επηρεάζεται από μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε πάνω από το 40% των μικροδορυφόρων ασταθής σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου [49]. Ο ανθρώπινος υποδοχέας polimeric ανοσοσφαιρίνης (PIGR) βρέθηκε να υποεκφράζεται σε όγκους του παχέος εντέρου και επίσης σε κυτταρικές σειρές όγκων κόλου [50]. Παρόμοια με τα αποτελέσματά μας, το γονίδιο Ephrin-Α5 (

EFNA5

) αναφέρθηκε επίσης πριν ως μειωτικά γονίδιο στον καρκίνο του παχέος εντέρου [51]. Η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα POU κλάσης τομέα 2 3 (POU2F3) μειώθηκε στο αδενώματος και την νεοπλασματική παχέος επιθήλια. CpG νησίδες στο

POU2F3

ρυθμιστική περιοχή είναι συχνά έκτροπα μεθυλιωμένα στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [52].

Για να αξιολογήσουμε την ακρίβεια της προσέγγισής μας, μετρήσαμε την έκφραση των πέντε γονιδίων με RT-PCR σε ανεξάρτητα δείγματα ιστών. Αυτά τα γονίδια εντοπίστηκαν επίσης στην προηγούμενη πιλοτική μελέτη μας, αλλά δεν έχουν συνδεθεί με CRC πριν. Σε περίπτωση δύο γονίδια,

GCG

και

NMES-1

, μια αξιοσημείωτη μείωση βρέθηκε στην γονιδιακή έκφραση ήδη στο στάδιο αδένωμα. Αμφότερα τα γονίδια έδειξαν μια ισχυρή επανενεργοποίησης ως αποτέλεσμα μιας θεραπείας απομεθυλίωση ΗΤ-29 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα γονίδια απενεργοποιούνται με υπερμεθυλίωση προαγωγού. Η

NMES-1

γονίδιο (επίσης ονομάζεται ως

C15orf48

) εκφράζεται κατά μήκος του υγιούς γαστρεντερικού σωλήνα και είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [53]. Η ανώμαλη μεθυλίωση των

NMES-1 περιοχή

προαγωγού ανιχνεύθηκε επίσης σε διηθητικού καρκίνου του τραχήλου (ICC), αλλά όχι σε φυσιολογικό τραχηλικό δείγματα [54]. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο γλυκαγόνης (GCG) είναι μια προπροπρωτεΐνη η οποία διασπάται σε τέσσερις διακριτές ώριμα πεπτίδια. Αυτά τα πεπτίδια εμπλέκονται στην διατήρηση της ομοιόστασης θρεπτικό, και είναι ρυθμιστές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και απόπτωσης [55].

FAM161B

είναι μια προβλεπόμενη γονίδιο, του οποίου η συμβολή στην καρκινογένεση δεν έχει αναφερθεί ακόμα. Ήταν υποεκφράζεται σε δύο στάδια στα πειράματά μας, ωστόσο, δεν έδειξε αξιοσημείωτη ενεργοποίηση ως αποτέλεσμα της θεραπείας 5-Αζα.

Ο υποδοχέας προσταγλανδίνης D2 (

PTGDR

) γονίδιο βρίσκεται στο σύμπλεγμα υποδοχέα προσταγλανδίνης. Σε προηγούμενες μελέτες η κατάσταση μεθυλίωσης του

PTGDR

βρέθηκε να συσχετίζεται αντίστροφα με την έκφρασή του σε κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος [56]. Αποτελέσματα μικροσυστοιχίας μας πρότεινε ότι το επίπεδο PTGDR mRNA μειώνεται κατά μήκος της αλληλουχίας αδένωμα-καρκινώματος κατά μέσο όρο. Ωστόσο, η ανάλυση του επιπέδου PTGDR mRNA με RT-PCR και στο επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία PTGDR σε μεμονωμένα δείγματα ιστού έδειξαν ετερογένεια. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την ανάλυση των προηγουμένως δημοσιευθεί γονιδιακής έκφρασης σύνολα δεδομένων GSE8671 και GSE18105 (Σχήμα 4). Οι δοκιμασίες HRM ανιχνεύονται διαφορετικά επίπεδα μεθυλίωσης CpG στην περιοχή του υποκινητή PTGDR σε μεμονωμένα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το

PTGDR

γονίδιο σιγήσει DNA υπερμεθυλίωση κατά την ανάπτυξη ορισμένων όγκων παχέος εντέρου. Ωστόσο, χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση αν PTGDR αποσιώπηση δείχνει μια συσχέτιση με την πρόγνωση της νόσου.

Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μαζί με τα αποτελέσματα της επικύρωσης δείχνουν ότι μεθυλίωσης του DNA απενεργοποιεί μερικώς ορισμένα γονίδια ήδη στο αρχικό στάδιο αδένωμα. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να είναι σημαντική για το μέλλον, γιατί μετά την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου, του γονιδίου-ειδικών θεραπειών ή στοχευμένες μεθόδους ενεργοποίησης του γονιδίου μπορεί να έχει σχετική σημασία. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα γονίδια τα οποία είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη στο στάδιο αδένωμα δεν δείχνουν πάντα μία βαθμιαία μείωση δραστηριότητα κατά μήκος της αλληλουχίας αδένωμα-καρκίνωμα, δηλαδή αυτά είναι εκφρασμένα σε χαμηλότερο επίπεδο στο αδενώματος σε σχέση με τα δείγματα όγκου. Επίσης, παρατηρήσαμε υψηλότερη ομοιομορφία των δειγμάτων αδενώματος από ορθοκολικό καρκίνο δείγματα στο PCA αναλύσεις των συνόλων δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 7C vs 7Β). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι ορισμένα γονίδια που είναι αναγκαία για να απενεργοποιηθούν για τον σχηματισμό αδενώματος επανενεργοποιηθεί στον όγκο. Είναι πιο εύκολο να λάβουν τέτοιες μορφές δραστηριότητας γονιδίου με αναστρέψιμη επιγενετική ρύθμιση παρά με μεταλλάξεις. Η μεθυλίωση με μεσολάβηση ρύθμιση μπορεί να επηρεάσει περίπου το 60% των ανθρώπινων υποκινητών [11], και επιτρέπει τελειοποίηση των δραστηριοτήτων του γονιδίου για να ληφθεί ένα βέλτιστο συνδυασμό της έκφρασης. Αυτή η βέλτιστη συνδυασμός μπορεί να εξαρτάται από διάφορους παράγοντες και μπορεί να αλλάξει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Ωστόσο, λόγω του περιορισμένου αριθμού των δειγμάτων σε αυτό το έργο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την επαλήθευση αυτού του συμπεράσματος.

Ελάττωση πολλών γονιδίων που προσδιορίζονται από την προσέγγισή μας σχετίζεται με ογκογένεση. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να απαντήσει αν το σύνολο των underexpresed γονίδια που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη είναι ειδικά για καρκίνο του παχέος εντέρου. Εφαρμόζοντας την προσέγγιση μας και σε άλλα μοντέλα όγκων θα επιτρέψει την έρευνα του όγκου-ειδικότητα του μεσολάβηση υπερμεθυλίωσης μοτίβα αδρανοποίηση του γονιδίου.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα

Συλλογή Δείγματος

Ο ιστός που λαμβάνεται από χειρουργικά απομακρύνθηκαν ιστοί κόλου καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν σε -80 ° C μέχρι τη χρήση.