Αφηρημένο

Ανθρώπινο Nanog1 είναι ένα 305-αμινοξέων (αα) ομοπεδίου περιέχουν μεταγραφή παράγοντας κρίσιμης σημασίας για την πλειοδυναμία εμβρυϊκών βλαστικών (ES) και τα κύτταρα εμβρυϊκό καρκίνωμα (EC). Σωματικών καρκινικά κύτταρα εκφράζουν κατά κύριο λόγο μια retrogene ομόλογο του Nanog1 ονομάζεται NanogP8, η οποία είναι -99% παρόμοιο με Nanog στο επίπεδο ΑΑ. Παρά το γεγονός ότι η προβλεπόμενη μ.β. του Nanog1 /NanogP8 είναι -35 kD, και οι δύο έχουν αναφερθεί να μεταναστεύσουν, για κηλίδωση Western (WB), σε φαινόμενα μοριακά βάρη 29-80 kD. Αν όλα αυτά που αναφέρθηκαν πρωτεϊνικές ζώνες αντιπροσωπεύουν αυθεντικά πρωτεΐνες Nanog είναι ασαφής. Επιπλέον, αναλυτικές βιοχημικές μελέτες για Nanog1 /NanogpP8 έχουν λείπει. Με το συνδυασμό WB χρησιμοποιώντας 8 αντι-Nanog1 αντισώματα, ανοσοκαταβύθιση, φασματομετρία μάζας, και μελέτες με τη χρήση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, εδώ παρέχουμε

άμεση

απόδειξη ότι η πρωτεΐνη Nanog1 σε NTERA-2 κύτταρα ΕΚ υπάρχει ως πολλαπλά είδη MW από ~ 22 κϋ έως 100 kD με μια κύρια ζώνη 42 κϋ ανιχνεύσιμη στο WB. Στη συνέχεια καταδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες ανασυνδυασμένου NanogP8 (rNanogP8) κατασκευασμένο σε βακτηρίδια χρησιμοποιώντας cDNAs από πολλαπλούς καρκινικά κύτταρα επίσης μεταναστεύουν, επί μετουσιωτικών SDS-PAGE, στους ~ 28 kD έως 180 kD. Είναι ενδιαφέρον, διαφορετικά αντισώματα αντι-Nanog1 εμφανίζουν διαφορετική αντιδραστικότητα προς rNanogP8 πρωτεΐνες, οι οποίες μπορεί αυθόρμητα να σχηματίσουν είδη πρωτεϊνών υψηλής μ.β.. Τέλος, δείχνουμε ότι οι περισσότερες μακροχρόνιες καλλιεργημένων καρκινικών κυτταρικών σειρών φαίνεται να εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα ή διαφορετικές ενδογενούς πρωτεΐνης NanogP8 που δεν μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα με ανοσοκατακρήμνιση. Συνολικά, η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει μοναδικές βιοχημικές ιδιότητες των Nanog1 στα κύτταρα ΕΚ και NanogP8 σε σωματικά κύτταρα καρκίνου

Παράθεση:. Liu Β, Badeaux MD, Choy G, Chandra D, Shen Ι, Jeter CR, et al. (2014) Nanog1 σε NTERA-2 και Η ανασυνδυασμένη NanogP8 από τα κύτταρα του καρκίνου σωματικά Θέσπιση Πολλαπλές διαμορφώσεις πρωτεϊνών και Μετεγκατάσταση σε πολλαπλά είδη μ.β.. PLoS ONE 9 (3): e90615. doi: 10.1371 /journal.pone.0090615

Επιμέλεια: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 29 Γενάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, με επιχορηγήσεις από ΝΙΗ (R01-CA155693), Υπουργείο άμυνας (W81XWH-13-1-0352), CPRIT (RP120380), το MDACC Κέντρο για τον Καρκίνο Επιγενετική και RNA Κέντρο-Laura & amp? επιχορήγηση John Arnold Ίδρυμα (D. Ο Tang), καθώς και από δύο Επιχορηγήσεις Κέντρο (CCSG-5 P30 CA166672 και ES007784). Γ Jeter, Μ πρόσωπο, και C. Liu υποστηρίχθηκαν, εν μέρει, από CPRIT RP120394, CPRIT RP110782 και DOD μετα-διδακτορική υποτροφία (PC121553), αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Ντχιάνι Chandra είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Nanog1 (κοινώς αποκαλείται Nanog) κωδικοποιείται από το

Nanog

γονίδιο που βρίσκεται στο Χρ . 12p13.31 (Εικ. S1 Α). Το γονίδιο έχει 4 εξώνια και κωδικοποιεί έναν παράγοντα μεταγραφής ομοπεδίου που είναι ζωτικής σημασίας για την αυτο-ανανέωση των εμβρυϊκών βλαστικών (ES) κυττάρων [1], [2]. Nanog1 υπερέκφραση σε κύτταρα ποντικού ES (MESCS) υπερνικά την απαίτηση της λευχαιμίας ανασταλτικό παράγοντα για τη διατήρηση της πλειοδυναμία [1], [3], ενώ διακοπή της

Nanog

αποτελέσματα MESC διαφοροποίηση σε extraembryonic ενδόδερμα [4]. Κάτω ρύθμιση των Nanog1 στην ανθρώπινη ΟΚΕ (βλαστοκύτταρα) οδηγεί επίσης στην απώλεια pluripotency και διαφοροποίησης σε extraembryonic κυττάρων καταγωγές [5]. Επιπλέον, σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες επαναπρογραμματισμό, Nanog1 υπερνικά τα εμπόδια επαναπρογραμματισμό και προωθεί σωματικών κυττάρων επαναπρογραμματισμό [6], [7]. Έτσι, Nanog1 είναι ένα βασικό εγγενές στοιχείο του μεταγραφικού δικτύου για τη διατήρηση της αυτο-ανανέωση της ΟΚΕ.

πρωτεΐνης Ανθρώπινα Nanog1 έχει 305 αμινοξέα (αα) και 5 λειτουργική υποτομείς, δηλαδή, Ν-τελική περιοχή (ND ), ομοπεδίου (HD), C1-τερματικό τομέα (CD1), περιοχή πλούσια σε τρυπτοφάνη (WR) και C2-τερματικό τομέα (CD2) [8] – [11] (Εικόνα 1Α).. Το ND εμπλέκεται στην παρεμβολή μεταγραφή και C-τερματική περιοχή περιέχει το ενεργοποιητή μεταγραφής. Ο τομέας HD απαιτείται για Nanog πυρηνικό εντοπισμό και μετενεργοποίηση και το WR περιοχή διαμεσολαβεί τη διμερισμό Nanog πρωτεΐνη, η οποία είναι απαραίτητη για την δραστικότητα πλειοδυναμία [12], [13]. Ενδιαφέροντος, τα ανθρώπινα

Nanog

έχει 11 ψευδογονίδια [14], μεταξύ των οποίων και

NanogP8

, που βρίσκεται στη Χρ. 15q14, έχει ένα πλήρες ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης [14], [15] (Σχ. S1B) που κατέχει ένα στοιχείο Alu στο ομόλογο 3′-UTR με εκείνη του

Nanog1

γονίδιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι

NanogP8

είναι retrogene παρά ένα ψευδογονίδιο. NanogP8 έχει τουλάχιστον 6 συντηρημένο νουκλεοτίδιο (nt) διαφορές σε σύγκριση με Nanog1, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε κάποιες αλλαγές αα [15].

(Α) Σχηματική απεικόνιση της ανθρώπινης πρωτεΐνης Nanog και 8 αντι-Nanog Abs που χρησιμοποιούνται σε αυτό το μελέτη. Εμφανίζονται σε παρενθέσεις είναι επιτόπων των επιμέρους Abs. ΝΔ, περιοχή Ν-άκρου? HD, ομοπεδίου? CD1 και CD2, περιοχή C-τελικό άκρο 1 και 2? WR, περιοχή πλούσια σε τρυπτοφάνη. Ο αστερίσκος στη ΝΔ δείχνει το υπόλειμμα Leu61 αναγνωρίζεται από την eBioscience mAb (βέλος) χαρτογραφηθεί από τις παρούσες μελέτες μας. (Β-Η) WB ανάλυση NTERA-2 ΒΑ (Ν, δύο διαφορετικές παρτίδες) ή κυτοσόλιο (C) χρησιμοποιώντας 8 αντι-Nanog Abs. Μεμονωμένα Ab υποδεικνύεται στο κάτω μέρος και μ.β. στα αριστερά. Μαύρο βέλος, η προβλεπόμενη πρωτεΐνη 35 kD Nanog? κόκκινο βέλος, ο κύριος 42 kD μπάντα? . Πράσινα βέλη, πρόσθετες ζώνες (ειδικά μετά από μεγαλύτερες εκθέσεις)

Η

Είναι ενδιαφέρον, πολλά σωματικά καρκινικά κύτταρα έχουν αναφερθεί να εκφράσουν Nanog mRNA ή /και πρωτεΐνη [15] – [46]. Αρκετές επιφυλάξεις σχετίζονται με πολλές από αυτές τις μελέτες.

Πρώτο

, στο επίπεδο του mRNA, αυστηρή μελέτες που χρησιμοποιούν απόκλιση RT-PCR σε συνδυασμό με αλληλούχιση ή διαφορική ευαισθησία στο ένζυμο περιορισμού AlwN1 [15], [17], [31], [32], [34] , [46], έχουν δείξει ότι η σωματική τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν κατά προτίμηση την μεταγραφή του

NanogP8

γονιδίου (Σχήμα S1B? βλ. παρακάτω) αντί

Nanog1

. Πράγματι, έχουμε παρατηρήσει ότι το

nanog1

τόπος έχει σιγήσει σε ορισμένα σωματικά κύτταρα καρκίνου [15]. αλληλουχίας μας αναλύσεις αποκαλύπτουν ότι εμβρυϊκό καρκίνωμα κυττάρων (ΕΚ) NTERA-2 εκφράζουν

Nanog1

αλλά όχι

NanogP8

mRNA, ενώ όλα τα σωματικά κύτταρα καρκίνου (6 διαφορετικούς τύπους συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από πρωτογενή προστάτη) δείχνουν 5 από τα 6 διαφορές nt ειδικά για

NanogP8

[15]. Μεταξύ των 5 συντηρημένες αλλαγές nt στο

NanogP8

, ένα (nt759) θα πρέπει να οδηγήσει σε αα αλλαγή (Q253H) αν και ορισμένοι καρκινικά κύτταρα δείχνουν άλλα μη συντηρημένες αλλαγές nt (δηλαδή, πολυμορφισμοί) που θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε αλλαγές αα (π.χ., L61P για HPCa6) [15]. Κάνοντας τη διάκριση μεταξύ Nanog1 και NanogP8 είναι σημαντικό, διότι οι δύο μεταγραφές που προέρχονται από χωριστές γονιδιωματική τόπους και έχουν διαφορές στα επίπεδα αλληλουχία nt.

Δεύτερον

, πολλές προηγούμενες μελέτες έχουν απλώς διασυνδέσεων χωρίς σχολαστικά την λειτουργική σημασία της έκφρασης NanogP8 σε καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη (PCA) ως μοντέλο, έχουμε δείξει [15] ότι: 1) NanogP8 πρωτεΐνη εκφράζεται ως κλίση σε κύτταρα προστάτη με ευκόλως ανιχνεύσιμη πυρηνική NanogP8 μόνο σε ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων προστάτη? 2) Τα NanogP8 κύτταρα πρωτεΐνης που εκφράζουν αυξήθηκαν στην πρωτοβάθμια προστάτη σε σύγκριση με ταιριάζουν καλοήθεις ιστούς? 3)

NanogP8

πρωτεΐνης mRNA και NanogP8 είναι εμπλουτισμένα σε CD44

+ και CD44

+ CD133

+ πρωτογενή κύτταρα του προστάτη? 4) shRNA μεσολάβηση knockdown του

NanogP8

αναστέλλει την αναγέννηση του όγκου του προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου κύτταρα? και 5) Τα ογκο-ανασταλτικά αποτελέσματα του

NanogP8

knockdown σχετίζονται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την κλωνική επέκταση των κυττάρων όγκου και διαταραχής της διαφοροποίησης. πρόσφατες μελέτες μας δείχνουν ότι η επαγόμενη έκφραση NanogP8 χύμα κύτταρα του προστάτη είναι αρκετή για να προσδώσει (CSC) ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και την προώθηση των ανδρογόνων-ανεξάρτητη ανάπτυξη του προστάτη [34] και ότι NanogP8 είναι εμπλουτισμένο σε αδιαφοροποίητη (PSA

– /lo) προστάτη κύτταρα και νοκ ντάουν της επιβραδύνει απόφυση του ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη [41]. Οι μελέτες μας [15], [34], [41] επισημαίνουν στους δυνητικούς προ-ογκογόνο λειτουργίες NanogP8.

Τρίτον

, οι προβλεπόμενες πρωτεΐνες Nanog1 και NanogP8 είναι -99% ταυτόσημες [15 ]. Κατά συνέπεια, ο όρος «Nanog» χρησιμοποιείται συχνά για να γενικά αναφέρεται είτε πρωτεΐνη (που είναι επίσης η περίπτωση σε αυτό το έγγραφο). Παρ ‘όλα αυτά, η ειδικότητα της πλειοψηφίας των εμπορικά διαθέσιμων αντισωμάτων αντι-Nanog (τα οποία ήταν όλα εγείρονται έναντι Nanog1? Πίνακας 1) για Nanog1 και, ειδικότερα, για NanogP8 παραμένει μη χαρακτηρισμένο. Ως εκ τούτου, δεν είναι σαφές αν οι υποθετικές ζώνες πρωτεΐνης Nanog εμφανίζονται στην κηλίδωση Western (WB), στην οποία συχνά μόνο μια περικομμένη λωρίδα φαίνεται, ή η χρώση πρωτεΐνης Nanog φαίνεται στην ανοσοϊστοχημεία (IHC) αντιπροσωπεύουν πραγματικά την πρωτεΐνη Nanog.

Τέλος

, κατά περίεργο τρόπο, αν και το στηρίζεται μοριακή μάζα Nanog πρωτεϊνών (τόσο για Nanog1 και NanogP8) είναι ~ 35 kD, πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφερθεί υποθετικές πρωτεΐνες Nanog μεταναστεύουν, σε SDS-PAGE, σε προφανή μοριακή μάζα των 29 έως 80 kD σε ES, ΕΚ, και τα σωματικά κύτταρα καρκίνου (Πίνακας 1) [2], [5], [17], [24] – [26], [46] – [59]. Ακόμη πιο αινιγματικά, το ίδιο αντίσωμα φαίνεται συχνά να ανιχνεύσουν ζώνες πρωτεϊνών διαφορετικών «Nanog» (Πίνακας 1). Αν όλα αυτά που αναφέρθηκαν υποθετικό είδος πρωτεΐνης Nanog είναι αλήθεια πρωτεΐνες Nanog έχει ακόμη να είναι

άμεσα

καθοριστεί.

Η

Η παρούσα μελέτη είχε αναλάβει να αντιμετωπίσει τις δύο τελευταίες ερωτήσεις. Πρέπει πρώτα να παρέχει άμεση απόδειξη ότι η πρωτεΐνη Nanog1 στο NTERA-2 κυττάρων ΕΚ μεταναστεύει στη διεύθυνση & lt? 30 έως -100 kD. Στη συνέχεια, δείχνουν ότι οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες NanogP8 μπορούν επίσης να μεταναστεύσουν σε ~ 28 kD σε ~ 180 kD. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι πρωτεΐνες Nanog1 /NanogP8 πιθανό να εγκρίνει πολλαπλές διαμορφώσεις. Πρέπει επιτέλους να αποδείξει ότι οι περισσότεροι μακροχρόνια καλλιεργημένα σωματικά κύτταρα καρκίνου φαίνεται να εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα ή βιοχημικά αποκλίνουσες ενδογενή NanogP8 έτσι ώστε να μην μπορεί εύκολα να ανοσοκαταβυθίζεται κάτω από τα 8 εμπορικά αντισώματα αντι-NanogP8.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και Αντιδραστήρια

Διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PC3, Du145, LNCaP), ο καρκίνος του μαστού (MCF-7), του κόλου καρκινώματος (Colo320), και μελάνωμα (WM -562) κύτταρα, ελήφθησαν από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε συνιστώμενες μέσα που περιέχουν 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS (ορός εμβρύου μόσχου). κύτταρα τερατοκαρκινώματος (NTERA-2, ο κλώνος D? CRL-1973) αγοράστηκαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε mTeSR ™ 1 μέσο (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). kit Nuclear εκχύλισης ήταν από Thermo Scientific (Rockford, IL). Οκτώ αντι-Nanog πρωτογενή αντισώματα (Ab) ελήφθησαν από εμπορικές εταιρείες (Πίνακας 1? Εικ. 1Α). Δευτερογενή και τον έλεγχο Abs αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. αντιδραστήρια ECL αγοράστηκαν από την PerkinElmer, Inc (MA, USA). Η τρέχουσα έρευνα δεν περιλαμβάνει πειράματα σε ζώα ή ανθρώπους (δηλαδή, ζουν άτομα ή αναγνωρίσιμες προσωπικές πληροφορίες). Όλες οι άλλες μελέτες που παρουσιάζονται εδώ ήταν ο ερευνητής-ξεκίνησε και δεν απαιτούν έγκριση από άλλους ρυθμιστικούς φορείς.

siRNA- και shRNA μεσολάβηση Nanog νοκ ντάουν πειράματα

Για τα siRNA νοκ ντάουν πειράματα (Σχ. 2 ), χρησιμοποιήσαμε siGENOME SMARTpool siRNA κατά της ανθρώπινης Nanog1 και siCONTROL μη στόχευση siRNAs ελήφθησαν από Dharmacon (Lafayette, CO). Κύτταρα επιστρώθηκαν 24 ώρες νωρίτερα πιάτα 6 φρεατίων επιμολύνθηκαν με siRNAs χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για WB πειράματα.

(Α) Nanog siRNA πειράματα σε κύτταρα NTERA-2. κύτταρα NTERA-2 επιμολύνθηκαν με μια δεξαμενή Nanog ειδικών siRNAs για 48 ώρες, συλλέχθηκαν, και χρησιμοποιούνται για την απομόνωση του ΝΕ για WB με την Kamiya Ab. Τα αριστερά και δεξιά πάνελ αντιπροσωπεύουν την ταινιών μικρού μήκους και έκθεση (SE και LE, αντίστοιχα) (σημειώστε ότι το αριστερό κάτω πάνελ είναι η συντομότερη εκτεθειμένη ταινία για να απεικονίσουν την σημαντική knockdown του kD ζώνη 42). Lamin A /C ήταν ο έλεγχος φόρτωσης. UT, μη επιμολυσμένα? NC siRNA, αρνητικός έλεγχος (siCONTROL μη στόχευση) siRNAs? Nanog siRNA, SMARTpool siRNA εναντίον Nanog. Κόκκινο, μαύρο και μπλε αιχμές βελών δείχνουν τα μεγάλα 42 kD, ήσσονος σημασίας 35 kD, και 48 ζώνες πρωτεΐνης kD, αντίστοιχα, τα οποία μειώθηκαν κατά Nanog νοκ ντάουν. Τα πράσινα βέλη αναφέρονται σε πρόσθετες συγκροτήματα που παρουσίασαν επίσης μείωση. (Β) Το WB έγινε με το CS αντι-Nanog pAb κουνέλι.

Η

Για τους νοκ ντάουν πειράματα shRNA Nanog, φακοϊούς συμπεριλαμβανομένων pLL3.7, Nanog-shRNA και TRC-shRNA παρήχθησαν 293FT συσκευασία κυττάρων (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) χρησιμοποιώντας τα τροποποιημένα πρωτόκολλα που περιγράφηκε προηγουμένως [15], [60]. Εν συντομία, γενετικίνη-επιλεγμένα, νωρίς-πέρασμα 293FT κύτταρα (6 × 10

6/15 cm τρυβλίο) διαμολύνθηκαν με το RRE (6 μg), REV (4 μα) και VSVG (4 μg) των πλασμιδίων συσκευασίας, κατά μήκος με έναν φορέα λεντοϊού (6 μg) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 για τη διεξαγωγή της διαμόλυνσης. Σε 36-48 ώρες, μέσων που περιέχουν ιό συλλέχθηκαν και προστέθηκαν φρέσκα μέσα. Μετά επιπλέον 12-24 ώρες καλλιέργειας, υπερκείμενα ιού συλλέγονται και πάλι, συνενώθηκαν, και υπερφυγοκεντρήθηκαν να παράγει συμπυκνωμένο ιικών αποθεμάτων. Μεμονωμένα τίτλοι προσδιορίστηκαν για την GFP-tagged ιού χρησιμοποιώντας κύτταρα ΗΤ1080. Το μη-GFP ​​ετικέτα ιό TRC-shRNA παρασκευάστηκε παράλληλα και ανέθεσε τον έλεγχο (pLL3.7) τίτλος. Τα κύτταρα στόχοι καλλιεργήθηκαν 24 ώρες νωρίτερα και έχουν μολυνθεί σε περίπου 50% της πυκνότητας των κυττάρων και η συγκομιδή για

in vitro

ή

in vivo πειράματα

48-72 ώρες μετά τη μόλυνση.

Βακτηριακές έκφραση και ο καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Nanog (rNanog)

NanogP8

ή

Nanog1

cDNA σε καλλιεργημένα NTERA-2, MCF-7, και LNCaP κύτταρα ή στα δημοτικά ανθρώπινο προστάτη δείγματα (HPCa1, HPCa5 και HPCa6) ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές LDF1 /LDR1 (LDF1 5′-TCTTCCTCTATACTAACATGAGT-3 ‘? LDR1 5′-AGGATTCAGCCAGTGTCCA-3’) και κλωνοποιήθηκε εντός pCR2.1 [15]. Τα θραύσματα EcoRI /NotI ή BamHI /SalI που περιέχει την αλληλουχία κωδικοποίησης Nanog μετά υποκλωνοποιήθηκαν στις ίδιες θέσεις είτε σε pET-28a (+) ή ΡΕΤ-28β (+) φορέα έκφρασης βακτηριακής να δημιουργήσει His-tagged πρωτεΐνες σύντηξης. Μετά την επαλήθευση ένθετο με ανάλυση πέψης με περιοριστικά ένζυμα και αλληλούχιση του DNA, τα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν για να μετασχηματίσουν BL21 (DE)

3 αρμόδια βακτήρια να εκφράσουν τις πρωτεΐνες σύντηξης. πρωτεΐνη Nanog προκλήθηκε με 0.5 mM IPTG για 3-6 ώρες στους 37 ° C και βακτηριακό ίζημα διατηρήθηκε στους -80 ° C. Για καθαρισμό, βακτηριακά σφαιρίδια που περιέχουν-tagged His πρωτεΐνη Nanog λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Ν &

2P0

4, ρΗ 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM ιμιδαζόλης, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, και 1 mg /ml λυσοζύμη ), κατεργασία με υπερήχους για 10 δευτερόλεπτα (ένας παλμός). His-tagged Nanog στο υπερκείμενο καθαρίστηκε με σφαιρίδια νικελίου ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen).

WB χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες (rNanog), προϊόν λύσης ολικού κυττάρου (WCL), ή πυρηνικό εκχύλισμα (ΝΕ)

rNanog πρωτεΐνες λήφθηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. WCL και ΝΕ (από καλλιεργημένα κύτταρα) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. 50-80 μg πρωτεΐνες (rNanog και NTERA-2 ΝΕ) αναλύθηκαν με 12.5% ​​SDS-PAGE και τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη μεταφοράς Immobilon-Ρ (Millipore, Bedford, ΜΑ). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό ξηρό γάλα σε TBST (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl και 0.1% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TBST, κατόπιν επωάστηκαν για 1 ώρα με 1:2000 δευτερογενές αντίσωμα, και αναπτύχθηκε με αντιδραστήριο ανίχνευσης ECL Plus WB (PerkinElmer).

Ανοσοκαθίζηση (ΙΡ)

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνες (500 μ§) ή ΝΕ (800 μg ή, ανάλογα με πειραματικούς σκοπούς) επωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες αντι-Nanog αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, το διάλυμα επωάστηκε με πρωτεΐνη A /G-αγαρόζης (Sigma, ΜΟ, USA) για άλλη 1 ώρα στους 4 ° C. Μετά την επώαση, τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό RIPA. Πρωτεΐνες δεσμεύεται με πρωτεΐνη Α-αγαρόζη εκλούστηκαν με ρυθμιστικό SDS-PAGE φόρτωσης και έβρασε για 8 λεπτά και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE.

πειράματα Κάθαρση αναδίπλωσης

Για να απομονωθεί και να καθαριστεί μια μεγάλη ποσότητα rNanog, βακτηριακές σφαιρίδια σε υπερήχους 6 φορές με 10 δευτερόλεπτα για παλμούς. Το διάλυμα επεξεργασίας με υπερήχους φυγοκεντρείται σε 10.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με ψυχρό PBS τρεις φορές. Το καταβυθισθέν υλικό ήταν το σώμα εγκλεισμού του rNanog πρωτεΐνης. Για να διαλυθεί η έγκλειστο, ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 7 Μ ουρία χρησιμοποιήθηκε και στη συνέχεια το διάλυμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι ρυθμιστικών διαλυμάτων 1.5 Μ, 0.6 Μ, 0.3 Μ και 0.1 Μ ουρία (σε 1.5 Μ NaCl, 10 mM Tris HCI, ρΗ 7.0). Το διάλυμα αιμοκάθαρσης υποβλήθηκε σε SDS-PAGE για να διαπιστώσει την ύπαρξη της διαλυτής πρωτεΐνης Nanog.

ταυτοποίηση πρωτεϊνών Nanog (ID) με φασματομετρία μάζας (MS) αναλύει

Τρεις σειρές των πρωτεϊνών MS-based πειράματα ID διεξήχθησαν είτε rNanog πρωτεΐνες ή ΝΕ παρασκευάζονται από κύτταρα NTERA-2. Στο

πρώτη

πείραμα ID, ανοσοκατακρημνίσαμε ένα μεγάλο ποσό της ΝΕ κυττάρων NTERA-2 (~ 2 mg συνολικά) με την R &? D κατσίκα pAb. Μετά το πλύσιμο (3χ) με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ, οι πρωτεΐνες που δεσμεύτηκαν με την πρωτεΐνη G-αγαρόζης εκλούστηκαν με ρυθμιστικό SDS-PAGE φόρτωσης και έβρασε για 8 λεπτά και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE. Η πηκτή στη συνέχεια βάφτηκε με διάλυμα SYPRO Ruby. Φέτες πηκτής /περιοχές που περιέχουν ζώνες ενδιαφέροντος αποκόπηκαν, πρωτεΐνες εκλούστηκαν και υποβλήθηκαν σε πέψη τρυψίνης. Οι πέψης θρυπτικού αναλύθηκαν με LC-MS /MS χρησιμοποιώντας την Dionex Ultimate 3000 RSLCnano LC συζευγμένο με το Thermo Orbitrap Elite. Πριν από διαχωρισμό HPLC, τα πεπτίδια αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας Millipore U-C18 ZipTip με σιφώνιο άκρες ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Α 2 cm μήκος × 100 μm εσ C18 5 μm παγίδα (Proxeon EASY στήλη) ακολούθησε μια εσ 75 μm μακρύ χ 15cm αναλυτική στήλη συσκευασμένη με C18 3 υλικό μm (Dionex Acclaim ΡΕΡΜΑΡ 100). Ρυθμιστικό Α αποτελούνταν από 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό και ρυθμιστικό διάλυμα Β 0.1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν για 35 λεπτά χρησιμοποιώντας βαθμιαίο HPLC του 5% Β έως 45% Β επί 30 λεπτά με ρυθμό ροής 300 nl /min. Το ψήφισμα FT-MS έχει οριστεί σε 120.000 και πάνω 20 MS /MS αποκτήθηκαν σε λειτουργία παγίδα CID ιόντων. Πρώτες δεδομένα υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας SEQUEST ενσωματωμένο στο Proteome Discoverer v1.3 χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους: την πλήρη θρυψίνη χωνέψει με μέγιστη 2 αναπάντητες διασπάσεις, σταθερό τροποποίηση carbamidomethylation κυστεΐνης, μεταβλητή της οξείδωσης τροποποίηση της μεθειονίνης και deaminidation των ασπαραγίνη και γλουταμίνη, αναζητώντας την ανθρώπινη proteome αναφοράς από UniProt από τον Μάρτιο του 2012 (80990 εγγραφές). Η μάζα ακρίβεια για τις πρόδρομες ουσίες είχε οριστεί σε 10 ppm μονοϊσοτοπική μάζα, για τα ιόντα κομμάτι ήταν 0,8 Da μάζα μονοϊσοτοπική. Μια βάση δεδομένων δόλωμα παρήχθη από την ανθρώπινη βάση δεδομένων UniProt και χρησιμοποιούνται από Peptide Validator και ικρίωμα για τον υπολογισμό των ψευδώς θετικές τιμές. X! Αναζητήσεις βάση δεδομένων Tandem (Το GPM, thegpm.org, έκδοση κυκλώνα (2010.12.01.1)) διεξήχθησαν ενσωματωμένα σε ικριωμάτων 3 Q + (Proteome λογισμικού) χρησιμοποιώντας τις ίδιες παραμέτρους αναζήτησης ως SEQUEST. Ικρίωμα χρησιμοποιείται για την επικύρωση των πεπτιδίων και πρωτεϊνών ταυτίσεις με φιλτράρισμα εμπιστοσύνης 95% εμπιστοσύνης για δύο πεπτίδια, και ένα 99,9% αποκοπής εμπιστοσύνης πρωτεΐνη. Ψευδώς θετικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών τιμές υπολογίστηκαν ως 0,02% και 0,1% αντίστοιχα από ικριωμάτων.

Στο

δεύτερο

σειρά πειραμάτων με τη χρήση της ΝΕ κυττάρων NTERA-2, πραγματοποιήσαμε την παράλληλα IP χρησιμοποιώντας ο Kamiya pAb που ακολουθείται από την R &? D pAb και τα ανοσοϊζήματα διαχωρίστηκαν σε μια γραμμική ιόντων παγίδα φασματομετρία μάζας (LTQ, Oorbitrap Βέλος) όπως περιγράφεται [61]. Απλά, οι αποκόπηκαν θραύσματα αποχρωματίζονται με διάλυμα αποχρωματισμού (40% μεθανόλη, 50 mM NaHCO

3 σε νερό) και υποβλήθηκε σε in-gel χώνευση χρησιμοποιώντας 100 ng θρυψίνη σε 50 mM ΝΗ

4HCO

3, ρΗ 8,5, για 12 ώρες. Τα πεπτίδια στη συνέχεια εκχυλίζεται με ακετονιτρίλιο και ξηραίνεται σε ξηραντήρα Speed-Vac (Savant Thermo). Κάθε ξηραίνεται δείγμα διαλύθηκε σε 20 μΐ διαλύματος 5% μεθανόλη /95% νερό /0.01% μυρμηκικό οξύ και εγχύεται στο σύστημα Surveyor HPLC (Thermo Finnigan) χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο δειγματολήπτη. Μια στήλη C18 100 mm × 75 μm (5 μm, 300 Α διάμετρο πόρων, PicoFrit? New Objective) με κινητές φάσεις του Α (0.1% μυρμηκικό οξύ σε νερό) και Β (0,1% μυρμηκικό οξύ σε μεθανόλη) χρησιμοποιήθηκε, με ένα βαθμίδα 5-95% φάσης Β επί 45 λεπτά που ακολουθείται από 95% του φάση Β για 5 λεπτά σε 200 nl /min. Τα πεπτίδια απευθείας ηλεκτροψεκασμό στο (LTQ Oorbitrap Βέλος (Thermo Scientific) χρησιμοποιώντας μια πηγή νανοψεκασμού. Η LTQ λειτουργούσε στην κατάσταση των δεδομένων που εξαρτώνται από την απόκτηση φασμάτων κατακερματισμό των 20 ισχυρότερων ιόντα υπό τον άμεσο έλεγχο του λογισμικού Xcalibur (Thermo Scientific). Λαμβάνεται MS /MS φάσματα αναζήτηση εναντίον στόχων δόλωμα βάση δεδομένων του Ανθρώπου REFSEQ στο Proteome Discoverer 1.2 interface (Thermo Fisher) με αλγόριθμο μασκότ (μασκότ 2.1, Matrix Science). Μεταβλητό τροποποίηση του ακετυλίωση (λυσίνη), δι-Γλυκίνη (λυσίνη), φωσφορυλίωση ( σερίνη και θρεονίνη) και οξείδωση (μεθειονίνη), αφέθηκε. Επίσης, στατική τροποποίηση του DeStreak (κυστεΐνη), αφέθηκε. Η ανοχή μάζα πρόδρομος περιοριζόταν στο 10 ppm με θραύσμα μάζα ανοχή 0,5 Dalton και κατ ‘ανώτατο όριο δύο αναπάντητες διασπάσεις επιτρέπονται. ειδικό προορισμό πεπτίδια διηθούνται με 5% ψευδώς ρυθμό και υπόκεινται σε χειροκίνητη επαληθεύσεις ανακαλύψετε.

στο

τρίτο πείραμα ID

, rNanog1 /rNanogP8 πρωτεΐνες καθαρίστηκαν και φέτες γέλης που περιέχει διάφορες ζώνες πρωτεΐνης που χρησιμοποιούνται σε MALDI -TOF ταυτοποίηση /TOF όπως περιγράφηκε προηγουμένως [62]. Πέψης θρυπτικού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF /TOF (ΑΒ Sciex, Foster City, CA). Τα δείγματα αφαλατώθηκαν με μC18 ZipTips (Millipore, Billerica, ΜΑ) με έκλουση απευθείας πάνω στο MALDI στόχου χρησιμοποιώντας την μήτρα α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέος σε 5 mg /ml σε 67% ακετονιτρίλιο /0,1% τριφθοροοξικό οξύ. MS και MS /MS φάσματα αποκτήθηκαν αυτόματα με τη χρήση 4000 Series Explorer V 3.0 RC1. Έως και 20 κορυφές με S /N 20 επιλέχθηκαν για τον κατακερματισμό MS /MS, με εξαίρεση κορυφές μήτρα, θρυψίνη, και κεράτινη. Πρόσθετες αιχμής επεξεργασίας και αναζήτησης δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GPS Explorer v3.5. ΜΑΣΚΩΤ V2.0 ή V2.2. Φάσματα αναζήτηση στη βάση δεδομένων Swiss-Prot συμπεριλαμβανομένων των Ανθρωπίνων ακολουθίες (1 Σεπτεμβρίου 2009, 20.495 εγγραφές). Οι παράμετροι αναζήτησης που επιλέχθηκαν ήταν διάσπαση από θρυψίνη /P με έως 2 αναπάντητες διασπάσεις, σταθερές τροποποίηση carbamidomethylation κυστεΐνης και μεταβλητής τροποποιήσεις πρωτεΐνης Ν-τελική ακετυλίωση, οξείδωση της μεθειονίνης και τροποποίηση πυρογλουταμικού οξέος του πεπτιδίου Ν-τερματικά υπολείμματα γλουταμίνης. Η αναζήτηση της βάσης δεδομένων που χρησιμοποιείται 50 ppm μάζα ανοχή για μονοισοτοπικές μαζών MS και επιλέχθηκαν για το MS 0,2 Da για το MS /MS, έως και 100 κορυφές, με την ελάχιστη S /N 15, και έως 65 ιόντα κομμάτι με ελάχιστη S /N 3. Η έρευνα εξόδου συνδυάζει τα αποτελέσματα από το MS αναζήτηση και η αναζήτηση MS /MS χρησιμοποιώντας ένα πιθανοτικό αλγόριθμο Mowse. Η βαθμολογία ΜΑΣΚΩΤ ορίζεται ως -10 * logP, όπου P είναι η πιθανότητα ότι η παρατηρούμενη παιχνίδι είναι ένα τυχαίο γεγονός. Η μασκότ σκοράρει 56 που αντιστοιχεί στο p & lt?. 0,05 επιλέγεται ως αποκοπής για ένα σημαντικό χτύπημα, και αυτές οι πρωτεΐνες που υπερβαίνει την τιμή αποκοπής που αναφέρθηκαν

Αποτελέσματα

Επτά από τα οκτώ αντι-Nanog αντισώματα ανιχνεύουν, στο WB, το μεγαλύτερο 42 kD και δευτερεύουσες 35 kD μπάντες στην NTERA-2 NE

Ανθρώπινο

Nanog1

γονίδιο (gi 13376297), εντοπισμένο σε Χρ. 12p13.31 και εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα ES και ΕΚ, έχει ένα 915-bp ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (Εικ. S1 Α). Είναι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 305-ΑΑ που αναφέρεται συνήθως ως Nanog (Εικ. 1Α). Ανθρώπινη πρωτεΐνη Nanog1 προβλέπεται να έχει μια μοριακή μάζα των -35 kD. Περιέργως, υποθετικές πρωτεΐνες Nanog μεταναστεύει στα φαινόμενα μοριακά βάρη 29-80 kD σε WB έχουν αναφερθεί σε ES, ΕΚ, και τα σωματικά κύτταρα καρκίνου (Πίνακας 1). Δεν είναι σαφές, ωστόσο, εάν αυτές αναφέρονται τα είδη πρωτεΐνης Nanog εκπροσωπεί πραγματικά τις πρωτεΐνες Nanog. Για να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα και να προσδιορίσει άμεσα την μοριακή μάζα (ες) της ενδογενούς πρωτεΐνης Nanog, πρέπει πρώτα να πραγματοποιηθεί ολοκληρωμένη WB αναλύσεις στα κύτταρα ΕΚ NTERA-2 χρησιμοποιώντας 8 εμπορική αντι-Nanog (δηλαδή, αντι-Nanog1) αντισωμάτων (Abs) κατευθύνεται έναντι διαφορετικών περιοχών της ανθρώπινης πρωτεΐνης Nanog (Σχήμα 1Α?. πίνακα 1, τα πρώτα 8 Abs). Μεταξύ των 8 αντι-Nanog Abs, τέσσερις [Kamiya Rb pAb, SC (Santa Cruz) κατσικίσιο pAb N17, Cell Signaling (CS) Rb pAb και Rb mAb] κατευθύνονται προς την ΝΔ, δύο (SC Rb pAb H-155 και R & amp ? D κατσίκα pAb) στο Ο-τελικό άκρο, και ένα (BioLegend Rb pAb) προς την HD (ομοιοπεριοχή) ενώ ένα άλλο (eBioscience mAb) ανυψώνεται κατά της πρωτεΐνης πλήρους μήκους ανθρώπινου Nanog1 (Σχήμα 1Α)

Τα WB αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι διαφορετικά αντισώματα εμφανίζονται διακριτά αντιδραστικότητα και κάθε αντίσωμα ανιχνεύεται πολλαπλές ζώνες σε NTERA-2 NE (επικεντρωθήκαμε στον τομέα της πυρηνικής έκφρασης όπως Nanog είναι ένας παράγοντας πυρηνική μεταγραφή) με MW που κυμαίνεται από ~ 28 kD έως -100 kD (Εικ . 1Β-Η). Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι:. 1), η eBioscience mAb αποκάλυψε ότι το

καθαρότερες

και πιο

ειδικές

αντιδραστικότητα, ανιχνεύοντας μόνο μια ισχυρή ζώνη του ~42 kD (Εικόνα 1Β, κόκκινο κεφαλή βέλους) και μια αδύναμη ζώνη του -35 kD (Σχ. 1Β, μαύρο βέλος) στα ΒΑ χωρίς ανοσοαντιδραστικές ζώνες στο κυτταρόπλασμα με 3 λεπτά έκθεσης του φιλμ (Εικ. 1Β). Από την άλλη πλευρά, η eBioscience mAb παρουσίασαν τη χαμηλότερη ευαισθησία μεταξύ των 8 αντισώματα. Η ζώνη των 35 kD και μια άλλη μπάντα -65 kD στο ΒΑ έγινε εμφανής μετά από μεγάλο χρονικό διάστημα έκθεσης (15 λεπτά? Εικ. 1Β). 2) Η Kamiya pAb έδειξε

η δεύτερη καθαρότερη

αντιδραστικότητα (Εικ. 1Γ). Κατά την σύντομη έκθεση (10 sec), ανίχνευσε μια ισχυρή ζώνη 42 kD με πολύ αμυδρή ζώνη 35 kD στην ΝΕ (Εικ 1C?. Κόκκινα και μαύρα βέλη, αντίστοιχα). Στο κυτοσόλιο, αυτό ανιχνεύεται η ζώνη των 42kD και διάφορα άλλα συγκροτήματα (Εικ. 1 C). Κατά την παρατεταμένη έκθεση (2 λεπτά), ο Kamiya pAb ανιχνεύεται επίσης τρεις επάνω ζώνες στα -48 kD, -65 kD και -90 kD τόσο ΒΑ και κυτοσόλιο (Εικ. 1 C, τα πράσινα βέλη στην δεξιά πλευρά). 3) Και οι δύο CS Rb pAb και mAb ήταν

τα πιο ευαίσθητα

αντισώματα έτσι ώστε να ανιχνεύονται τα εξέχοντα 42 kD και 35 kD μπάντες με μόνο 1-5 sec έκθεση (Εικ. 1D). Αμφότερα τα αντισώματα ανιχνεύθηκαν επίσης αρκετές επιπλέον ζώνες (Εικ. 1 D, πράσινα βέλη). 4) Η Επιτροπή Εποπτείας κατσίκα pAb (N17) εντόπισε μια προφανή 42 kD μπάντα και μια αμυδρή 35 kD ζώνη, μαζί με δύο άνω ζώνες των -55 kD και ~58 kD (Εικ. 1 Ε). 5) Η Biolegend Rb pAb ήταν το «βρώμικες» Ab και ανιχνεύεται μια σειρά ισχυρών ζωνών στο κυτταρόπλασμα και μόνο αμυδρή 42 kD ζώνη στο ΒΑ (Εικ. 1F, κόκκινο βέλος). 6) Η Επιτροπή Εποπτείας Rb pAb (H-155) ανιχνεύεται το προφανές 42 kD μπάντα και την ασθενέστερη 35 kD ζώνη (Εικ. 1 G, κόκκινο και μαύρο βέλη, αντίστοιχα), μαζί με πολλά άλλα συγκροτήματα στα 100 kD, 70 kD, 58 kD και ~ 28 kD (Εικ. 1G, πράσινα βέλη). 7) Τέλος, η R & amp?.. Δ κατσίκα pAb εντόπισε μια προφανή ζώνη των 42 kD και μια μικρή λωρίδα 35 kD (Σχήμα 1, κόκκινα και μαύρα βέλη, αντίστοιχα), μαζί με αρκετές επιπλέον ζώνες (Σχήμα 1, τα πράσινα βέλη) .

Εν ολίγοις, αυτό το ολοκληρωμένο WB ανάλυση χρησιμοποιώντας 8 αντι-Nanog Abs και η NTERA-2 NE αποκάλυψε ότι: 1) εκτός από την BioLegend Ab, οι άλλες 7 αντι-Nanog Abs όλα τα

κοινώς

αναγνωρίζουν ένα σημαντικό 42 kD και μια μικρή 35 kD πρωτεϊνική ζώνη? 2) Τρεις αντισώματα που δημιουργούνται κατά της Ν-τελικό άκρο, δηλαδή, Kamiya Rb pAb, CS pAb και CS mAb, δίνουν καθαρό WB αποτελέσματα μετά από σύντομη έκθεση των ταινιών? 3) με την μεγαλύτερη έκθεση, όλα τα αντισώματα που ανιχνεύουν πρόσθετες ζώνες πρωτεΐνης που κυμαίνονται από ~ 28 kD έως & gt? 100 kD. Ωστόσο, διάφορα Abs ανιχνεύουν διαφορετικά πρότυπα των αντιδραστικών πρωτεϊνικών ζωνών? 4) Όσον αφορά την ευαισθησία, το CS mAb και CS pAb είναι η πιο ευαίσθητη ακολουθείται από την Kamiya Ab ενώ η eBioscience mAb είναι η λιγότερο ευαίσθητη? 5) Η BioLegend αντι-Nanog Ab δεν εντοπίζει τις 42 kD ως κύρια πρωτεϊνική ζώνη στο NTERA-2 NE? και 6) διαφορετικά αντισώματα μπορούν να αναγνωρίζουν επιλεκτικά διαφορετικές ζώνες πρωτεΐνης. Για παράδειγμα, η Kamiya pAb, αλλά όχι το CS pAb ή mAb αντέδρασαν με τη ζώνη 48 kD.

siRNA μεσολάβηση knock-down αποκαλύπτει την πρωτεϊνική ζώνη των 42 kD ως το κυρίαρχο πρωτεΐνη ισομορφή Nanog σε NTERA-2 κύτταρα

Δεδομένου ότι η προβλεπόμενη πρωτεΐνη Nanog είναι ~ 35 kD, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι ο ανήλικος πρωτεϊνική ζώνη 35 kD συχνά ανιχνεύεται στο WB πιο πιθανό είναι η πρωτεΐνη Nanog. Για να επιβεβαιώσετε αυτό το συμπέρασμα και να προσδιορίσει αν η κυρίαρχη 42 kD και οποιαδήποτε από τις πρόσθετες ζώνες είναι επίσης Nanog πρωτεΐνες, εκτελέσαμε siRNA πειράματα knock-down σε κύτταρα NTERA-2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η Kamiya Rb pAb ανιχνεύεται με συνέπεια την ισχυρή 42 πρωτεϊνική ζώνη kD, η οποία μειώθηκε σε απόκριση προς Nanog siRNA. Επιπλέον, ο ανήλικος 35 kD ζώνη και αρκετές άλλες ασθενέστερες ζώνες που μεταναστεύουν στις 48 kD, 65 kD, 75 kD, και 90 kD όλα μειώθηκε στην Nanog siRNA επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Α). Όταν εκτελείται WB χρησιμοποιώντας το CS Rb pAb, ο Nanog siRNAs χτύπησε επίσης κάτω από το 42 kD και 35 kD ζώνες (Εικ. 2Β). Επιπλέον, ένα άνω ζώνη 65 kD ήταν επίσης μειωμένη (Εικ. 2Β). Σημειώστε ότι η CS pAb δεν ανίχνευσε 48 kD ή άλλο ανώτερο μπάντες εκτός κϋ ζώνη 65 (Σχ. 2Β), σύμφωνα με τις προηγούμενα αποτελέσματα WB με το CS pAb και mAb (Σχ. 1D). Συλλογικά, το siRNA knock-down πειράματα δείχνουν ότι

η πρωτεΐνη Nanog στα κύτταρα NTERA-2 φαίνεται να μεταναστεύσουν, για μετουσίωση SDS-PAGE, σε πολλαπλές μοριακές μάζες, συμπεριλαμβανομένων περίπου

35

,

42

,

48

,

65

,

75

, και

90

kD με το συγκρότημα 42-kD είναι το κυρίαρχο «ισομορφή»

.

Χαρακτηρισμός των ειδών πρωτεΐνης Nanog στην NTERA-2 κύτταρα με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) που ακολουθείται από φασματομετρία μάζας (MS) αναγνώρισης (ID)

Για να τεκμηριώσει τα siRNA νοκ ντάουν αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε δύο σειρές πειραμάτων ID πρωτεΐνης MS-βάση.

Στην πρώτη

, πραγματοποιήσαμε πειράματα IP χρησιμοποιώντας 500 μg ΒΑ από NTERA-2 και σωματικά καρκινικά κύτταρα και με 5 αντι-Nanog Abs, δηλαδή, eBioscience mAb, Kamiya pAb, CS Rb mAb, SC pAb H155 και το R & amp? D κατσίκα pAb (Σχήμα 3?. Το Σχ. S2A-Β? δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλα τα 5 αντισώματα ανοσοκαταβυθίζονται το KD Nanog συγκρότημα 42 στο NTERA-2 NE. Για παράδειγμα, όταν IP έγινε με την Kamiya pAb που ακολουθείται από WB χρησιμοποιώντας είτε eBioscience mAb (Σχήμα 3Α, λωρίδα 9). Ή R & amp? D κατσίκα pAb (Εικ. S2A, διαδρομή 10), η πρωτεΐνη 42 κϋ ανοσοκαταβυθίστηκε. IP με το CS Rb mAb, που κατευθύνεται επίσης εναντίον της Ν-τελικό άκρο του Nanog, γκρέμισαν το kD ζώνη 42 (WB χρησιμοποιώντας το R & amp? D κατσικίσιο pAb? Σχ. 3Β, λωρίδα 9). Όταν IP έγινε με τη SC pAb H-155, κατευθύνεται προς το C-άκρο του Nanog, ακολουθούμενη από WB χρησιμοποιώντας είτε eBioscience mAb (Σχήμα 3C, λωρίδα 8). Ή R & amp? D κατσίκα pAb (Εικ. S2B), το 42 kD πρωτεΐνη ανοσοκαταβυθίστηκε στο NTERA-2 ΝΕ. Όπως φαίνεται στο Σχ. TSS, θέση έναρξης της μεταγραφής? WT, άγριου τύπου?