Αφηρημένο

Στόχος

Αυτή η μελέτη είναι να διερευνήσει το ρόλο των Mas που σχετίζονται με το γονίδιο (mRG) C στην παθογένεια και τη θεραπεία του πόνου από καρκίνο των οστών (BCP).

Μέθοδοι

μοντέλο BCP ποντίκι ιδρύθηκε από οστεοσαρκώματος κυττάρων εμβολιασμό. συμπεριφορές πόνου που σχετίζονται με αξιολογήθηκαν με την αυθόρμητη δοκιμή συμπεριφοράς ανύψωσης και μηχανικής δοκιμής αλλοδυνία. Τα επίπεδα έκφρασης του MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western blot και ανοσοϊστοχημεία.

Αποτελέσματα

Pain-δοκιμές σχετικά με τη συμπεριφορά έδειξαν σημαντικά αυξημένη αυθόρμητη συσπάσεων (NSF) και μειώθηκε πόδι απόσυρση μηχανικό κατώφλι (PWMT) σε μοντέλα ποντικών της BCP. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και πριν από μοντελοποίηση, όλα τα επίπεδα έκφρασης του MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP δραματικά αυξημένα, οι οποίες ήταν ιδιαίτερα αυξημένη την ημέρα 7 μετά την επέμβαση και στη συνέχεια, σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η θεραπεία του MrgC αγωνιστή BAM8-22 σημαντικά επάνω ρυθμισμένη Gi και ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης NR2B, στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP, σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Από την άλλη πλευρά, αντι-MrgC σημαντικά κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση Gi, ενώ δραματικά τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση NR2B, στα ποντίκια BCP. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση. Είναι σημαντικό, BAM8-22 εξασθενεί σημαντικά τα ερεθίσματα πόνου συμπεριφορές στα ποντίκια BCP.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας έδειξε τα MrgC μεσολάβηση αλλαγές Gi και έκφραση ΝΡ2Β στα ποντίκια BCP, που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην υπερευαισθησία πόνου. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να παρέχει μια νέα στρατηγική για την αντιμετώπιση της BCP στην κλινική

Παράθεση:. Sun Υ, Jiang Μ, Χου Β, Lu C, Lei Υ, Ma Ζ, et al. (2016) Mas-Σχετικές Gene (MRG) C Ενεργοποίηση Εξασθενεί καρκίνο των οστών Πόνος μέσω Αναλογικός Gi και NR2B. PLoS ONE 11 (5): e0154851. doi: 10.1371 /journal.pone.0154851

Επιμέλεια: Shao-Ιούνιος Tang, Πανεπιστήμιο του Τέξας Ιατρικού Κλάδου, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 27, Δεκεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 20, Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2016

Copyright: © 2016 Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Φυσικό Ίδρυμα της Κίνας (81400914, 81500954, 81371207, 81300950 και 81500955), το Εθνικό Φυσικό Ίδρυμα επαρχία Jiangsu, Κίνα (RC2011006 και XK201140), και το Έργο Ιατρική Τεχνολογία Ανάπτυξη της Nanjing (YKK13068). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πόνου από καρκίνο των οστών (BCP) είναι ένα από τα πιο δυσεπίλυτα παράγοντες σε ασθενείς που πάσχουν από όγκους πρωτογενούς οστών ή οστικές μεταστάσεις, η οποία επηρεάζει έντονα την ποιότητα ζωής [1] των ασθενών. Μέχρι στιγμής, ο μηχανισμός για την BCP δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως, και οι τρέχουσες θεραπείες είναι πάντα αναπόφευκτα συνοδεύεται με σημαντικές αρνητικές συνέπειες [2, 3]. Ως εκ τούτου, είναι πραγματικά σημαντικό και επείγον να αναπτυχθούν νέες αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές για την BCP στην κλινική.

Πολυάριθμες μελέτες δείχνουν ότι, σε τρωκτικά, γονίδιο mas σχετίζονται (MRG) C, μια αισθητική νευρώνα-ειδική GPCR, μετοχές ουσιαστική ομοιογένεια με ανθρώπινο ομόλογο της, MrgX1, με περίπου 45-65% ταυτοσημία αλληλουχίας αμινοξέων [4]. MrgC βρίσκεται ειδικά στους νευρώνες μικρής διαμέτρου ραχιαίας ρίζας γαγγλίου (DRG), τα οποία είναι πιθανώς αλγαισθητικό. Έχει αποδειχθεί ότι, εντός της θήκης ένεση MrgC αγωνιστή, δηλαδή BAM8-22 και γ2-MSH, θα μπορούσε να παράγει αντιεπώδυνη επιδράσεις και θα μετριάσει τη θερμότητα υπεραλγησία σε οξεία μοντέλα πόνου [5-7]. Επιπλέον, αδημοσίευτα δεδομένα από το εργαστήριο μας απέδειξε επίσης ότι, εντός της θήκης χορήγηση του αγωνιστή MrgC BAM8-22 θα εξασθενήσει BCP σε ένα μοντέλο ποντικού, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

NR2B είναι μία από τις υπομονάδες του υποδοχέα NMDA , η οποία έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση του πόνου σε διάφορους τραυματισμούς [8, 9]. Η φωσφορυλίωση της τυροσίνης του NR2B στον νωτιαίο μυελό συνδέεται με την κεντρική ευαισθητοποίηση, αυξάνοντας ραχιαίο κέρας την υπερδιέγερση και τη διευκόλυνση της αισθητηριακών πληροφοριών, η οποία μπορεί να είναι υπεύθυνη για BCP [10, 11]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ανταγωνιστές υποδοχέα NMDA (όπως η κεταμίνη) και NR2B-εκλεκτικοί ανταγωνιστές (όπως ιφενπροδίλη και Ro25-6981) θα μπορούσε να ασκήσει ισχυρές αναλγητικές επιδράσεις σε ζωικά μοντέλα BCP [12, 13]. Ωστόσο, αυτοί οι ανταγωνιστές έχουν επίσης αποδειχθεί ότι σχετίζεται με μη ανεκτές παρενέργειες, συμπεριλαμβανομένης της εξασθένησης της μνήμης και ψυχοτομιμητικά αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να εξερευνήσουν νέους τρόπους για να ρυθμίζουν τους υποδοχείς NMDA, χωρίς να επηρεάζεται η βασική δραστηριότητα του υποδοχέα, για να επιτευχθεί καλύτερη αναλγητική δράση.

Σε αυτή τη μελέτη, το μοντέλο ποντικού της BCP ιδρύθηκε από τον εμβολιασμό των κυττάρων οστεοσαρκώματος, και ο ρόλος του MrgC στην παθογένεση και τη θεραπεία της BCP διερευνήθηκε. συμπεριφορές που σχετίζονται με τον πόνο αξιολογήθηκαν σε αυτά τα μοντέλα ποντικού, και ανιχνεύθηκαν επίσης τα επίπεδα έκφρασης του Gi και NR2B στο νωτιαίο μυελό, πριν και μετά την χειραγώγηση της MrgC.

Υλικά και Μέθοδοι

ζώα και καλλιέργεια κυττάρων

ενηλίκων αρσενικών C3H /HeJ ποντίκια, ηλικίας 4-6 εβδομάδων, βάρους 18-22 g, αγοράστηκαν από την Vital ποταμό Πειραματικό Κέντρο των ζώων, Πεκίνο, Κίνα. Αυτά τα ζώα εξοικειώθηκαν μεμονωμένα υπό ένα σκοτεινό κύκλο /12/12-h φως, σε μια σταθερή θερμοκρασία δωματίου των 24 ° C, με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες ζώων είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και τη χρήση των Συνδεδεμένων Drum-Πύργος Νοσοκομείο Ιατρικό Κολέγιο του Πανεπιστημίου Nanjing. Φυσικές συνθήκες των ποντικών παρακολουθούνται πριν από κάθε τεστ συμπεριφοράς, και κανένα από αυτά τα ποντίκια πέθαναν απροσδόκητα πριν από την πειραματική παράμετρο

Fibrosarcoma NCTC 2472 κύτταρα (2.087.787?. American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA ) καλλιεργήθηκαν με το μέσο NCTC 135 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) με 10% ορό αλόγου (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) σε ένα 5% CO

2, 37 ° C επωαστήρα .

ομαδοποίηση των ζώων και μοντελοποίηση

μοντέλο BCP ιδρύθηκε σύμφωνα με μια προηγούμενη διαδικασία από Schwei

et al

. [14]. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 50 mg /kg πεντοβαρβιτάλη του νατρίου (1% σε φυσιολογικό ορό), και μια επιφανειακή τομή έγινε στο δέρμα που υπέρκειται του δεξιά articulatio Genu. Gonarthrotomy διεξήχθη για να εκτεθούν οι κόνδυλοι του μηριαίου οστού, η οποία στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε φως κατάθλιψη που προκαλείται από οδοντιατρική φρέζα. Cortex τρυπήθηκαν με βελόνα 30-gauge. Για τους ποντικούς στο μοντέλο ομάδα (n = 60), 20 μί α-ΜΕΜ που περιέχει 2 × 10

5 NCTC 2472 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του χώρου ενδομυελική του δεξιού μηριαίου οστού χρησιμοποιώντας μια μικροσύριγγα 25 μL. Οι ποντικοί στην ομάδα sham (n = 20) εγχύθηκαν μόνο με α-ΜΕΜ. Η οπή έγχυσης σφραγίστηκε με οδοντιατρικό αμάλγαμα, και άφθονη άρδευση υλοποιήθηκε με φυσιολογικό ορό πριν από το τραύμα έκλεισε οριστικά. Όλα τα αναγκαία μέτρα αναλήφθηκαν για την ελαχιστοποίηση των πιθανών πόνο και αγωνία. Για παράδειγμα, τα ποντίκια ήταν υπό γενική αναισθησία, όταν διεξήχθησαν οι διαδικασίες. Tourniquet χρησιμοποιήθηκε για τη μείωση της αιμορραγίας όσο το δυνατόν περισσότερο. Η μόλυνση αποτράπηκε λειτουργώντας υπό στείρες συνθήκες και με αποστειρωμένο εξοπλισμό.

Ο πόνος που σχετίζονται με δοκιμές συμπεριφοράς

Μετά την μοντελοποίηση, η αυθόρμητη δοκιμή συμπεριφοράς ανύψωσης και μηχανικής δοκιμής αλλοδυνία διεξήχθησαν για τη μέτρηση του αριθμού των αυθόρμητων συσπάσεων (NSF) και την απόσυρση πόδι μηχανικό κατώφλι (PWMT), αντίστοιχα. Όλες οι δοκιμές διεξήχθησαν κατά τη διάρκεια της φάσης φωτός, και τα ποντίκια αφέθηκαν να εγκλιματιστούν για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από κάθε δοκιμή. NSF και PWMT εξετάστηκαν πριν από τη μοντελοποίηση των ζώων (ημέρα 0), κατά τις ημέρες 3, 5, 7, 10, και 14 μετά τη μοντελοποίηση και στις ημέρες 1, 3, και 7 μετά τη χορήγηση του φαρμάκου.

Για την αυθόρμητη δοκιμή ανύψωσης συμπεριφορά, ένας ποντικός διατηρήθηκε σε ένα άτομο διαμέρισμα πλεξιγκλάς (10 cm × 10 cm × 15 cm) για 30 λεπτά, και το δεξί πίσω NSF σκέλους καταγράφηκε για 2 λεπτά. . Ανελκυστήρα του δεξιού οπίσθιου άκρου που δεν σχετίζονται με τα πόδια ή περιποίηση θεωρήθηκε ως ένα υποχωρείτε

Από την άλλη πλευρά, η δοκιμή μηχανική αλλοδυνία διεξήχθη με τα νημάτια Von Frey (0,16 – 2,0 g κάμψη δύναμη? Stoelting, Ξύλο Dale, IL, USA), όπως περιγράφεται από τους Chaplan

κ.ά.

. [15]. Ένας ποντικός τοποθετήθηκε σε ένα μεμονωμένο διαμέρισμα διαφανή πλεξιγκλάς (10 cm × 10 cm × 15 cm) σε ένα πάτωμα μεταλλικού πλέγματος με 0,5 cm × 0,5 cm τετράγωνα. Νημάτια προσανατολισμένα κάθετα ενάντια στην πελματιαία επιφάνεια με αρκετή δύναμη που προκαλεί ελαφρά κάμψη πάνω στο πόδι ζώου, η οποία πραγματοποιήθηκε για 6-8 s κάθε φορά, με μια 10-λεπτών διάστημα. Θετική απόκριση ορίστηκε ως η ζωηρό απόσυρση ή πέλματος flinching, και ο PWMT προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το διαδοχικά αύξηση και μείωση αντοχής ερέθισμα (δηλαδή, το επάνω-και-κάτω μέθοδο). Κάθε πόδι δοκιμάστηκε πέντε φορές για κάθε ερέθισμα δύναμη, μέχρι τη δύναμη αποκοπής των 2,0 g. Η χαμηλότερη δύναμη νήματος με τουλάχιστον τρεις θετικές απαντήσεις θεωρήθηκε ως PWMT.

προετοιμασία των ναρκωτικών και της διοίκησης

Τα φάρμακα παρασκευάζονται και χορηγούνται σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα [5]. BAM8-22 (SML0729? Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) και αντι-MrgC αντίσωμα (orb101320? Biorbyt, San Francisco, CA, USA) ήταν και τα δύο διαλυμένα σε αλατούχο ορό. Σε 14 ημέρες μετά την μοντελοποίηση, τα μοντέλα ποντικών χωρίστηκαν τυχαία στις ακόλουθες τρεις ομάδες: (1) η ομάδα ελέγχου μοντέλο BCP (n = 20), στο οποίο τα ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με φορέα (φυσιολογικός ορός) και μόνο? (2) η ομάδα BAM8-22 (n = 20), στην οποία οι ποντικοί BCP υποβλήθηκαν σε αγωγή με BAM8-22? και (3), το αντι-MrgC ομάδα (n = 20), στην οποία οι ποντικοί BCP υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-MrgC. Για τις ομάδες BCP + Β και BCP + Α, 5 μι BAM8-22 (8.0 nmol) ή αντι-MrgC (1/20 ν /ν) χορηγήθηκε ενδοραχιαία, μία φορά την ημέρα, για 7 συνεχόμενες ημέρες [16].

Western blot ανάλυση

οι ποντικοί θανατώθηκαν με αποκεφαλισμό μετά βαθιά αναισθησία με 100 mg /kg νάτριο πεντοβαρβιτάλης. Οσφυϊκού νωτιαίου μυελού L

3-L ήταν

5 τμήματα απομακρύνεται και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν με ρυθμιστικό λύσης, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση (4 ° C) στα 13.000 rpm για 10 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με το κιτ BCA (Thermo Fisher Scientific Life Science Research, Σαγκάη, Κίνα). δείγμα πρωτεΐνη διαχωρίστηκε σε SDS-PAGE, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Μετά από αποκλεισμό με γάλα 5% άπαχο σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, η μεμβράνη επωάστηκε με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού κουνελιού αντι-MrgC (αραίωση 1: 500? Orb101320? Biorbyt), αντι-NR2B μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ποντικού (1: 1000 αραίωση? ab93610? Abcam, Cambridge, MA, USA), και αντι-ποντικού κουνελιού αντι-Gi πολυκλωνικό αντίσωμα (1: 500 αραίωση? ab140333? Abcam), αντίστοιχα. Μετά την πλύση, η μεμβράνη επωάστηκε με IgG αίγας αντι-κουνελιού (αραίωση 1: 5000? Ab6721? Abcam) ή γίδινο αντι-ποντικού IgG (1: 5000 αραίωση? Ab6789? Abcam). οπτικοποίηση ζώνη πρωτεΐνης επιτεύχθηκε με τη μέθοδο ECL (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), και η πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό IPLab (Scanalytics, Fairfax, VA, USA). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς.

Ανοσοϊστοχημεία

Για ανοσοϊστοχημεία, το οσφυϊκού νωτιαίου μυελού L

3-L

5 τμήματα διαποτίστηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε 0,1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 7.4) την ημέρα 3 μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Οι ιστοί κόπηκαν σε 25 μm τομές σε μικροτόμο. Μετά από πλύση με PBS, οι τομές δεσμεύτηκαν με 10% (ν /ν) φυσιολογικό ορό εμβρύου μόσχου σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με πολύκλωνο αντίσωμα αντι-ποντικού κουνελιού αντι-MrgC (αραίωση 1: 250? Orb101320? Biorbyt) ή αντι-NR2B ποντικού αντι-ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα (1: 500 αραίωση? Ab93610? Abcam) στους 4 ° C για 48 h. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με Alexa Fluor 594 αντι-κουνελιού IgG (αραίωση 1: 500? Ab150084? Abcam) και Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (1: 500 αραίωση? Ab150117? Abcam) στους 4 ° C όλη τη νύκτα . Μετά τη σφράγιση, οι τομές απεικονίστηκαν στα 200 × μεγέθυνση με την Leica TCS SP2 πολυφωτονικών συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία), και οι εικόνες αναλύθηκαν με το Image-Pro Plus λογισμικό (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) .

Στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Η μονόδρομη ANOVA εκτελέστηκε για σύγκριση της ομάδας, με δοκιμή LSD post hoc όταν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Ο πόνος που σχετίζονται με συμπεριφορές σε ποντίκια BCP

Για να εκτιμηθεί ο πόνος που σχετίζονται με συμπεριφορές στο πίσω δεξί άκρο των ποντικών BCP, η αριθμός των αυθόρμητων συσπάσεων (NSF) και την απόσυρση του ποδιού μηχανικό κατώφλι (PWMT) μετρήθηκαν πριν από τη μοντελοποίηση (ημέρα 0), και τις ημέρες 3, 5, 7, 10, και 14 μετά τη μονιμοποίηση μοντέλο. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην NSF και PWMT μεταξύ των sham και το μοντέλο των ομάδων πριν από τη μοντελοποίηση (Σχήμα 1). Για NSF, στην ομάδα sham, η NSF ήταν σημαντικά αυξημένα την ημέρα 3 μετά από λειτουργία (

P

& lt? 0,05), η οποία στη συνέχεια επέστρεψε στο επίπεδο συγκρίσιμο με πριν μοντελοποίηση την ημέρα 5 μετά την επέμβαση και μετά (σχ 1Α). Από την άλλη πλευρά, στο μοντέλο της ομάδας, σε σύγκριση με πριν από την μοντελοποίηση, η NSF επίσης σημαντικά αυξημένα κατά την ημέρα 3 μετά την μοντελοποίηση (

P

& lt? 0,05), και μετά μειώθηκε ελαφρά κατά την ημέρα 5 μετά την μοντελοποίηση. Ωστόσο, η NSF στο μοντέλο της ομάδας συνέχισαν να αυξάνονται στις ημέρες 7, 10, και 14 μετά την μοντελοποίηση, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι πριν από την μοντελοποίηση (όλα

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Α). Για PWMT, στην ομάδα εικονική, PWMT είχε μειωθεί σημαντικά κατά την ημέρα 3 μετά την επέμβαση (

P

& lt? 0.05), η οποία στη συνέχεια επέστρεψε στο ανάλογο επίπεδο με πριν μοντελοποίηση δύο ημέρες αργότερα και στη συνέχεια (Εικόνα 1Β). Στο μοντέλο ομάδα, σε σύγκριση με πριν από την μοντελοποίηση, η PWMT είχε μειωθεί σημαντικά κατά την ημέρα 3 μετά την μοντελοποίηση (

P

& lt? 0,05), και στη συνέχεια ελαφρώς αυξημένα 2 ημέρες αργότερα. Ωστόσο, η PWMT στο μοντέλο ομάδα διατηρείται μείωση στις ημέρες 7, 10, και 14 μετά μοντελοποίησης, η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι πριν από τη μοντελοποίηση (όλα

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν την επιτυχή δημιουργία του μοντέλου ποντικού της BCP, τα οποία είναι κατάλληλα για την επόμενη έρευνα.

NSF (Α) και PWMT (Β) εκτιμήθηκε στις ομάδες μοντέλο επίφαση και BCP (n = 8) πριν από την μοντελοποίηση των ζώων (ημέρα 0), και τις ημέρες 3, 5, 7, 10, και 14 μετά τη μονιμοποίηση μοντέλο. Σε σύγκριση με πριν από την μοντελοποίηση, *

P

& lt? 0,05? σε σύγκριση με την ομάδα sham στο αντίστοιχο χρονικό σημείο,

#

P

& lt? 0.05.

Η

Up-ρυθμιζόμενη έκφραση MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP

Για να διερευνήσει τα επίπεδα έκφρασης των MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP, διεξήχθη ανάλυση κηλίδος Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, σε σύγκριση με την ομάδα sham και πριν από μοντελοποίηση, όλα τα επίπεδα έκφρασης του MrgC, Gi, και NR2B στους ποντικούς BCP ήταν αυξημένα δραματικά μετά μοντελοποίησης, οι οποίες ήταν ιδιαίτερα αυξάνοντας την ημέρα 7 μετά την επέμβαση και μετά, σε μια εποχή εξαρτώμενης τρόπο (όλα

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι, τα επίπεδα έκφρασης του MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό είναι πάνω ρυθμισμένα στους ποντικούς BCP, που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην παθογένεση και την ανάπτυξη του BCP.

Τα επίπεδα έκφρασης (Α) του MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών και οι ποντικοί ψευδο BCP ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western πριν μοντελοποίηση των ζώων (ημέρα 0? D0), και τις ημέρες 3, 5, 7, 10, και 14 (D3- D14) μετά την εγκατάσταση του μοντέλου. (Β-D) Στατιστικές αναλύσεις του MrgC (Β), Gi (C), και NR2B (D) στο νωτιαίο μυελό του επίφαση και BCP ποντίκια (η = 6). Σε σύγκριση με πριν από την μοντελοποίηση, *

P

& lt? 0,05? σε σύγκριση με την ομάδα sham,

#

P

& lt? 0.05.

Η

Επιπτώσεις της MrgC αγωνιστή και αντι-MrgC για Gi και έκφραση ΝΡ2Β στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP

Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της MrgC αγωνιστή και αντι-MrgC στην έκφραση επίπεδα MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP, αυτά τα μοντέλα ζώων χορηγήθηκαν πρώτα με BAM8-22 ή αντι-MrgC, και στη συνέχεια τα επίπεδα έκφρασης του MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western και ανοσοϊστοχημεία. Τα αποτελέσματά μας από την ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (μοντέλα ποντικών που έλαβαν όχημα), η MrgC αγωνιστής BAM8-22 σημαντικά up-ρυθμίζονται τα επίπεδα έκφρασης των MrgC και Gi, ενώ σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται το επίπεδο έκφρασης NR2B, στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP, σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0,05) (σχήμα 3Α-3D). Από την άλλη πλευρά, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (όχημα), το αντι-MrgC σημαντικά ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης του MrgC και Gi, ενώ δραματικά τα επάνω ρυθμισμένη το επίπεδο έκφρασης NR2B, στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP, σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0,05) (σχήμα 3Α-3D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της MrgC και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (όχημα), τα επίπεδα έκφρασης του NR2B στο νωτιαίο μυελό ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά BAM8-22 και σημαντικά αυξημένα από αντι-MrgC, στα ποντίκια BCP (τόσο

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 3Ε-3G). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, η χειραγώγηση των MrgC θα μπορούσε να επηρεάσει σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης των Gi και NR2B στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης της MrgC, Gi, και NR2B σε ο νωτιαίος μυελός ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western, σε ψευδο ποντικούς, τον έλεγχο μοντέλο (Veh) ποντικούς, και οι ποντικοί μοντέλο χορηγήθηκε με BAM8-22 ή αντι-MrgC, κατά τις ημέρες 1, 3, και 7 μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. (Β-D) Στατιστικές αναλύσεις του MrgC (Β), Gi (C), και τα επίπεδα έκφρασης NR2B (D) μετά τη χορήγηση του φαρμάκου, όπως υποδεικνύεται από ανάλυση κηλίδας Western (n = 6). (Ε) Έκφραση MrgC (κόκκινο) και NR2B (πράσινο) στο νωτιαίο μυελό ανιχνεύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία στα ποντίκια sham, τον έλεγχο μοντέλο (όχημα) ποντικούς, και οι ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με το μοντέλο BAM8-22 ή αντι-MrgC (χ 200) . (F-G) Στατιστικές αναλύσεις του MrgC (F) και επίπεδα έκφρασης NR2B (G) μετά από τη χορήγηση του φαρμάκου, όπως υποδεικνύεται από ανοσοϊστοχημεία (n = 6). Σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος,

& amp?

P

& lt? 0,05? σε σύγκριση με το προηγούμενο χρονικό σημείο,

$

P

& lt? 0.05.

Η

MrgC αγωνιστή εξασθενεί αλγαισθητικά συμπεριφορές σε ποντίκια BCP

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η ενεργοποίηση MrgC θα μπορούσε να ασκούν αναλγητική δράση στα ποντίκια BCP, αυτά τα ζωικά μοντέλα χορηγήθηκαν με BAM8-22 για 7 συνεχόμενες ημέρες (αρχίζοντας από την ημέρα 14 μετά την επέμβαση), και στη συνέχεια τα nociceptive συμπεριφορές αξιολογήθηκαν τις ημέρες 1, 3, και 7 μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Anti-MrgC χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (μοντέλα ποντικών που έλαβαν θεραπεία με όχημα), BAM8-22 μείωσε σημαντικά NSF και αυξημένη PWMT στο ομόπλευρο πίσω πόδι του BCP ποντικών (

P

& lt? 0,05), σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4). Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία του αντι-MrgC αυξήθηκε περαιτέρω δραματικά NSF και μειωμένη PWMT σε αυτά BCP ποντικούς (

P

& lt? 0,05), σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επεξεργασία των MrgC αγωνιστή θα μπορούσε να εξασθενήσει σημαντικά τις συμπεριφορές ερεθίσματα πόνου σε αυτά τα ποντίκια BCP.

ποντίκια BCP χορηγήθηκαν με BAM8-22 ή αντι-MrgC για 7 συνεχόμενες ημέρες (αρχίζοντας από την ημέρα 14 μετά την επέμβαση ), και στη συνέχεια τα nociceptive συμπεριφορές αξιολογήθηκαν στις ημέρες 0, 1, 3, και 7 (Ημέρα 0-Ημέρα 7) μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Οι στατιστικές αναλύσεις του NSF (Α) και PWMT (Β) σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία BCP με BAM8-22 ή αντι-MrgC. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου μοντέλο BCP στο αντίστοιχο χρονικό σημείο,

& amp?

P

& lt? 0.05.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η BCP παθογένεια σχετίζεται με το up-ρυθμιζόμενη έκφραση MrgC, Gi, και NR2B στο νωτιαίο μυελό. Επιπλέον, ο αγωνιστής BAM8-22 MrgC, αλλά όχι το αντίσωμα αντι-MrgC, θα μπορούσε να ανακουφίσει σημαντικά τα ανώμαλα σχετίζονται με τον πόνο συμπεριφορών, μέσω ρύθμισης των επιπέδων Gi και έκφραση NR2B. Τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να παρέχουν μια πιθανή στρατηγική αναλγητικό για την BCP στην κλινική.

BCP είναι κλινικά χαρακτηρίζεται από φλεγμονή, νευροπαθητικό εφέ, και ογκογόνο της δυνατότητες, [17, 18]. Έχει καλά αποδεκτό ότι NMDA υποδοχέα (ειδικά η υπομονάδα NR2B) -εξαρτώμενη κεντρική ευαισθητοποίηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην υπερευαισθησία πόνου [19]. Στο μετασυναπτικό πυκνότητες, οι υποδοχείς NMDA συνδεδεμένο με ικριώματα και πρωτεΐνες σηματοδότησης, τη ρύθμιση της συναπτικής διαβίβασης [20]. Επιπλέον, ΝΜϋΑ υποδοχέα θα μπορούσε να συνδεθεί με Ca

2 + /εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση II (CaMKII) και μέλη της οικογένειας MAGUK (όπως PSD-95). Αυτή η αλληλεπίδραση ζευγάρια το NMDA υποδοχέα με τη μεσολάβηση Ca

εισροή 2+ να επηρεάσουν τις ενδοκυτταρικές τελεστές και ένζυμα σηματοδότησης, οι οποίες συμβάλλουν στην εξαρτώμενη από τον υποδοχέα NMDA κεντρική ευαισθητοποίηση [21]. προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει ότι η φωσφορυλίωση του NR2B στον νωτιαίο ραχιαίο κέρας στα μοντέλα BCP ήταν σημαντικά τα πάνω ρυθμισμένη μετά την έγχυση ινοσαρκώματος κύτταρο, η οποία συνοδεύεται από προφανή συμπεριφορές πόνου που σχετίζονται με [11]. Επιπλέον, ο προς τα πάνω ρύθμιση της φωσφορυλίωσης NR2B θα μπορούσε να μειωθεί σημαντικά με την ενδοθηκική έγχυση του MrgC BAM8-22 αγωνιστή. Τα αποτελέσματα μας στην παρούσα μελέτη έδειξε ότι BAM8-22 κατέστειλε BCP-επαγόμενη υπεραλγησίας, επάνω ρυθμισμένη Gi και ρυθμισμένα προς τα κάτω έκφραση NR2B στον νωτιαίο μυελό, υποδεικνύοντας ότι MrgC θα μπορούσε να συνδυαστεί με Gi, επαγωγή αναλγησίας.

λειτουργική σημασία της ενεργοποίησης Gi στους νευρώνες DRG έχει αναφερθεί προηγουμένως [22, 23]. Με βάση αυτά τα ευρήματα και η δική μας, υπάρχει η πιθανότητα ότι MrgC θα μπορούσε να ρυθμίσει την ευαισθησία του πόνου μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης Gi. Φυσικά, περαιτέρω μελέτες απαιτούνται ακόμη για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση. Από την άλλη πλευρά, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η BAM8-22 μπορούσε να αναστείλει την επίμονη φλεγμονώδη και χημικές πόνο, και ρυθμίζουν προς τα κάτω το επίπεδο έκφρασης του c-fos στον νωτιαίο μυελό [5, 6, 24]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι συνδετήρες MrgC θα μπορούσε να λειτουργήσει ως αντι-υπεραλγησίας παράγοντες. Gi πρωτεΐνη εμπλέκεται σε στρες και /ή φλεγμονή που προκαλείται εκκίνηση [25], καθώς και επαγόμενη από οπιοειδές υπεραλγησίας αναρρόφησης [26]. ενεργοποίηση gi θα μπορούσε να συμβάλει στην αναλγησίας του BAM8-22. BAM8-22 μπορούσε δοσοεξαρτώμενο μειώνει NMDA που επάγεται συμπεριφορές πόνου σε αρουραίους [27], υποδηλώνοντας ότι μπορεί να επάγει αναλγησία νωτιαίος με καταστολή διέγερση υποδοχέα που σχετίζονται με NMDA. Εχει αναφερθεί πρόσφατα ότι ενεργοποιημένα MrgC θα μπορούσε να καταστείλει την αυξητική ρύθμιση των προ-αισθητήριας υποδοχής διαμεσολαβητών (π.χ., nNOS και CGRP) και αναστέλλουν την c-fos έκφραση υπό φλεγμονώδεις καταστάσεις πόνου [5, 7].

η παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η ενεργοποίηση MrgC αμβλυνθούν οι BCP που σχετίζονται με συμπεριφορές, η οποία ήταν σύμφωνη με προηγούμενα ευρήματα [11, 12, 28, 29]. Η εμφύτευση των κυττάρων του όγκου στο δεξί μηριαίο οστό που προκαλείται προοδευτικές αλλαγές στην NSF και PWMT, υποδεικνύοντας την επιτυχή δημιουργία του μοντέλου BCP. Εν τω μεταξύ, αυτοί οι ποντικοί BCP συνοδεύτηκε από μια αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων έκφρασης του Gi και NR2B στο νωτιαίο μυελό, που θα μπορούσε να συμμετέχει στην ανάπτυξη και τη συντήρηση των BCP. Επιπλέον, τα ευρήματά μας αποκάλυψε επίσης ότι η ενδοραχιαία χορήγηση των MrgC αγωνιστή BAM8-22 εξασθένησε την απτική υπερευαισθησία και πόνος που σχετίζονται με συμπεριφορές στο τραυματισμένο πόδι αυτών των μοντέλων ποντικού και διαμορφωμένα τα επίπεδα έκφρασης του Gi και NR2B στο νωτιαίο μυελό. Ωστόσο, αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για την αντι-MrgC. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι MrgC, Gi, και NR2B θα μπορούσαν να συμμετάσχουν στην ρύθμιση της συμπεριφοράς πόνου που σχετίζονται με αυτά τα ποντίκια BCP. Περαιτέρω σε βάθος μελέτες που απαιτούνται ακόμη για να διερευνήσει τις λεπτομερείς μηχανισμούς.

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, η NSF αυξήθηκαν και η PWMT μειώθηκαν στο σύστοιχο πίσω άκρων αυτών BCP ποντίκια, την ημέρα 7 μετά την επέμβαση. Ωστόσο, η μειωμένη PWMT την ημέρα 3 και το ανακτημένο συμπεριφορά κατά την ημέρα 5 μετά την μοντελοποίηση μπορεί να αποδοθεί στις λειτουργικές επιδράσεις. Την ημέρα 14 μετά τη λειτουργία, τα BCP-συμπεριφορές που σχετίζονται ήταν προφανείς και έτειναν να είναι σταθερή. Κατά συνέπεια, ημέρα 14 μετά τη λειτουργία επελέγη ως χρονικό σημείο για την παρέμβαση του φαρμάκου σε αυτά τα ποντίκια BCP. Λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα και τη συνέχεια της BCP, επαναλαμβανόμενες χορήγηση φαρμάκου εφαρμόστηκε για να ασκήσει περίπου τα θεραπευτικά αποτελέσματα και να διερευνήσει την βέλτιστη διάρκεια δοσολογίας.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, τα επίπεδα έκφρασης του MrgC, Gi, και NR2B δραματικά αυξημένα στο νωτιαίο μυελό των ποντικών BCP. Επιπλέον, ο αγωνιστής MrgC BAM8-22 σημαντικά επάνω ρυθμισμένη Gi και ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης NR2B. Είναι σημαντικό, BAM8-22 θα μπορούσε να μετριάσει τα ερεθίσματα πόνου συμπεριφορές σε αυτά τα ποντίκια BCP. αποτελέσματά μας έδειξαν MrgC αλλαγές που προκαλούνται από την έκφραση Gi /NR2B στα ποντίκια BCP, που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην διαμόρφωση της υπερευαισθησίας πόνου. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να παρέχει μια νέα στρατηγική για την αντιμετώπιση της BCP στην κλινική.

Ευχαριστίες

Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Φυσικό Ίδρυμα της Κίνας (81400914, 81500954, 81371207, 81300950, 81500955 και ), το Εθνικό Φυσικό Ίδρυμα της επαρχίας Jiangsu, Κίνα (RC2011006 και XK201140), και το Πρόγραμμα Ιατρικής Τεχνολογίας Ανάπτυξης της Nanjing (YKK13068).