Abstract

προηγουμένως έδειξαν ότι ο παράγοντας κατακερματισμού του DNA, το οποίο περιλαμβάνει ένα κασπάσης-3-ενεργοποιημένη DNase (CAD) και αναστολέα της (ICAD), μπορεί να επηρεάσει το ρυθμό του κυτταρικού θανάτου μέσω της παραγωγής PARP-1- ενεργοποιώντας τα διαλείμματα του DNA. Εδώ ελέγξαμε την υπόθεση ότι η ICAD ελλειμματικών κόλον επιθηλιακά κύτταρα που εμφανίζουν αντίσταση σε ερεθίσματα θάνατο μπορεί να συσσωρεύεται επιπλέον γενετικές τροποποιήσεις, που οδηγεί σε ένα ογκογόνο φαινότυπο. Δείχνουμε ότι η ανεπάρκεια ICAD μπορεί να σχετίζεται με κακοήθεια του παχέος εντέρου στον άνθρωπο. Πράγματι, από την εξέταση της έκφρασης ICAD χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία σε μια σειρά από καρκίνο του παχέος εντέρου τόσο και φυσιολογικούς ιστούς έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης ICAD ήταν σοβαρά σε κίνδυνο στις καρκινικούς ιστούς. Μετά βλάβη του DNA που προκαλείται από μια χαμηλή δόση ακτινοβολίας, τα κύτταρα ICAD αποκτήσουν ογκογόνο φαινότυπο. κύτταρα του παχέος εντέρου που προέρχονται από επιθηλιακά ICAD ποντικούς έδειξε μία σημαντική αντίσταση σε θάνατο που προκαλείται από την διμεθυλυδραζίνη καρκινογόνο κόλον σε vitro και σε ποντικούς. Τέτοια αντίσταση συσχετίστηκε με μείωση της PARP-1 ενεργοποίησης. Σε ένα ζωικό μοντέλο διμεθυλυδραζίνη επαγόμενης ογκογένεση του παχέος εντέρου, ICAD

– /- ποντίκια ανέπτυξαν σημαντικά υψηλότερους αριθμούς όγκων με σημαντικά μεγαλύτερα μεγέθη από τα αντίστοιχά άγριου τύπου. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο φαινότυπος του ICAD

– /- ποντίκια δεν ήταν σχετίζεται με σημαντική αύξηση του προκαρκινικών φυσιολογικών κρυπτών εστιών που υποδηλώνει μια πιθανή σύνδεση με την εξέλιξη του όγκου και όχι για την έναρξη. Το πιο σημαντικό, η ανεπάρκεια ICAD συσχετίστηκε με σοβαρή γενωμική αστάθεια, όπως εκτιμάται από συστοιχία συγκριτική γενωμική υβριδισμού. Όπως γενωμική αστάθεια αποτελούνταν πιο περίοπτη θέση του ενισχύσεις, αλλά με αρκετά μεγάλο διαγραφές σε σύγκριση με τους ομολόγους άγριου τύπου που επηρεάζει αρκετά γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων

RAF-1

,

ΠΣΔ

,

LMO3

και

Fzd6

ανεξάρτητα από

p53

. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας παρουσιάσει ένα βιώσιμο υπόθεση για την εμπλοκή της ανεπάρκειας ICAD στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και δείχνουν ότι η απόπτωση και γενετική αστάθεια μπορεί να περιλαμβάνει τα μέσα με τα οποία η ανεπάρκεια μπορεί να συνεισφέρει στην διαδικασία της αύξησης ευαισθησίας σε καρκινογόνο προκαλούμενη ογκογένεση.

Παράθεση: Errami Υ, Brim Η, Oumouna-Benachour Κ, Oumouna Μ, Naura AS, Kim H, et al. (2013) Ανεπάρκεια ICAD στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και Προδιάθεση για Colon Ογκογένεση: Σύνδεση με απόπτωση Αντίστασης και της γονιδιωματικής αστάθειας. PLoS ONE 8 (2): e57871. doi: 10.1371 /journal.pone.0057871

Επιμέλεια: Vincenzo Coppola, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Αυγ 2012? Αποδεκτές: 29 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Errami et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από την επιχορήγηση ΕΓΓ-116608 από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (https://www.cancer.org/) και HL072889 επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (https://www.nhlbi.nih.gov/) για να AHB. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να δηλώσω ότι η HB και ΗΑ είναι PLoS ONE Editorial μελών του Διοικητικού Συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Colon καρκινογένεση είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που απαιτεί πολλά χρόνια για να αναπτυχθεί και να συνδέεται με διάφορες πρόσφατα χαρακτηριζόμενη γενετικές αλλοιώσεις [1], [2], [3]. Η εμφάνιση αδρανοποίησης μεταλλάξεων σε δύο αλληλόμορφα του

αδενωματώδη πολυποδίαση coli

γονίδιο (

APC

) [2], ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, θεωρείται ότι είναι ένα από τα αρχικά γεγονότα σε ορθοκολικό καρκινογένεση . Μετάλλαξη και η συνακόλουθη απορύθμιση του

K-RAS

πρωτο-ογκογονίδιο είναι επίσης πιστεύεται ότι αποτελεί μια πρόωρη παράγοντας που συμβάλλει στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου [4]. Ο κύκλος εργασιών των επιθηλιακών κυττάρων είναι σχετικά ταχεία και γενετικές αλλαγές που καθιστούν αυτά τα κύτταρα ανθεκτικά σε απόπτωση ή περισσότερες πολλαπλασιαστικές είναι κρίσιμες για την έναρξη γεγονότων στην ογκογένεση του παχέος εντέρου [4]. Η επακόλουθη συσσώρευση των μεταλλαγμένων επιθηλιακών κυττάρων συμβάλλει στο σχηματισμό των δομών είναι γνωστή ως μη-φυσιολογικών κρυπτών εστίες (ACF) [5].

Ο κατακερματισμός του DNA πιστεύεται ότι είναι ένα σημαντικό βήμα στην διάθεση του γονιδιώματος των αποπτωτικών κυττάρων. Η ταυτόχρονη διάσπαση των πυρηνικών λαμίνη, το DNA πρώτα αποικοδομείται σε μεγάλα θραύσματα από 50 έως 300 kb, τα οποία στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία σε ενδοπυρηνοσωματική επαναλήψεις [6], [7]. παράγοντα κατακερματισμού του DNA (DFF) έχει προταθεί για να συμβάλει στη διαδικασία αυτή [8]. DFF αποτελείται από δύο υπομονάδες, μία 40-kDa κασπάσης-ενεργοποιημένη DNase (CAD) ή DFF40 και 45-kDa αναστολέας ICAD της (DFF45) [8], [9], [10]. Η δραστικότητα ενδονουκλεάσης αυτού του ενζύμου, η οποία είναι εγγενής σε CAD, επάγεται σε διάσπαση ICAD με κασπάσης-3. ICAD λειτουργεί τόσο ως αναστολέας της δραστηριότητας CAD και ως συνοδός για αυτό το υπομονάδα [10], [11], [12]. Πράγματι, ICAD απαιτείται για έκφραση CAD και την αφθονία της ενδονουκλεάσης σε ICAD

– /- κύτταρα είναι κατά πολύ μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα άγριου τύπου [8], [9], [10], [13]. Εμείς και άλλοι [13], [14], [15], [16], [17] ανέφεραν ότι μία ποικιλία τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, ινοβλάστες, και φλοιώδεις νευρώνες που προέρχονται από ICAD

– /- ποντίκια, εμφανίζουν αντίσταση στην απόπτωση που επάγεται από διάφορα ερεθίσματα. Δείξαμε επίσης τη σημασία της DFF στον κατακερματισμό του DNA σε 50-kb κομμάτια κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [13], [14], [15], [16], [17]. Η παραγωγή αυτών των ρηγμάτων της έλικας DNA έχει ως αποτέλεσμα την ταχεία και παροδική ενεργοποίηση του ΡΑΚΡ-1. PARP-1-μεσολάβηση αποτελέσματα πολυ (ΑΟΡ-ριβοσυλ) ίωση σε αξιοσημείωτη μείωση των ενδοκυτταρικών συγκεντρώσεων του NAD και ΑΤΡ, δημιουργώντας μια κυτταρική ενέργεια έλλειψη που θεωρείται ότι συμβάλλει στην επιτάχυνση της διαδικασίας θανάτου [13], [16], [18], [19]. Δείξαμε ότι η αποτυχία του ICAD

– /- ινοβλάστες να παράγουν 50-kb θραύσματα DNA σε απόκριση σε TNF-α προστάτευσε τα κύτταρα από την υπερβολική ενεργοποίηση της PARP-1 και ως εκ τούτου εμποδίζεται η εξάντληση των ενδοκυτταρικών NAD [13], [16] . Η καθυστέρηση στην PARP-1 ενεργοποίησης που παρατηρείται σε αυτά τα κύτταρα συσχετίζεται με καθυστερήσεις τόσο στην κασπάσης-3 ενεργοποίησης και σε προ-αποπτωτικά μιτοχονδριακή εκδηλώσεις, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c [13], [16]. Με βάση αυτές τις διάφορες παρατηρήσεις, προτείναμε ότι η παραγωγή του 50-kb θραύσματα DNA με DFF δεν είναι απλώς μια παθητική βαθμίδα στην αποικοδόμηση του DNA, αλλά μάλλον ότι συμβάλλει, μαζί με PARP-1, τα μιτοχόνδρια, και της κασπάσης-3, σε μία ενίσχυση φάση της απόπτωσης [13], [16].

έκφραση ICAD και μεταλλάξεις στο

ICAD

γονίδιο πρόσφατα σχετίζεται με έναν αριθμό ανθρώπινων κακοηθειών, καθώς και με ένα ζωικό μοντέλο καρκίνου του δέρματος [20], [21]. Επιπλέον, Konishi et al. ανέφεραν ότι η έκφραση ICAD mRNA ήταν χαμηλότερη σε οισοφαγικό όγκους πλακώδες καρκίνωμα με υψηλότερο βαθμό παθολογική μαζί με λεμφαδένα μετάσταση [20]. Αντιστρόφως, η έκφραση της πρωτεΐνης ICAD αναφέρθηκε ότι είναι συχνά ρυθμίζεται αυξητικά στην ωοθηκών ορώδες καρκίνωμα και μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης της επιθετικής συμπεριφοράς με προγνωστική αξία [22]. Δεδομένης της σημασίας της απόπτωσης στη συντήρηση του παχέος ιστού και απορρύθμισης της στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, που προορίζεται στην παρούσα μελέτη για να εξετάσει κατά πόσο η πιθανή συσχέτιση μεταξύ της συμμετοχής των ICAD στην απόπτωση και την σταθερότητα του γονιδιώματος μπορεί να είναι κρίσιμη για την πρόληψη ογκογένεση του παχέος εντέρου. Επιπλέον, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν η αποτυχία των επιθηλιακών κυττάρων του κόλου να εκφράσουν ICAD κατέστησε τους επιρρεπείς σε συσσωρεύονται γενετικών ανωμαλιών εκτός από μια πιθανή ικανότητα να αντισταθούν επαγωγή της απόπτωσης, η αύξηση της ευαισθησίας των ζώων αυτών να καρκινογόνος (διμεθυλυδραζίνη? DMH) επαγόμενης ογκογένεση του παχέος εντέρου. Για αυτές τις μελέτες, χρησιμοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη προσέγγιση συνδυάζοντας μια σειρά από ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και των φυσιολογικών ιστών, μια πρόσφατα ανεπτυγμένη μέθοδος για απομόνωση πρωτογενών επιθηλιακών κυττάρων του παχέος εντέρου, καθώς και μια καλά εδραιωμένη ΩΜΗ που προκαλείται μοντέλο ποντικού της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η τρέχουσα μελέτη διεξήχθη σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Συντήρηση (IACUC πρωτόκολλο: BC0015) και πειραματικό πρωτόκολλο (πρωτόκολλο IACUC: 2227) εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης LSUHSC ζώων. Η συστοιχία ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου μέσα πυκνότητας (που αγοράστηκε από την US Biomax Inc. Rockville, MD, USA) και τα 23 δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και των φυσιολογικών ιστών (LSUHSC πυρήνας παθολογία) εμπίπτουν IRB τύπου απαλλαγή 4.

ζώα και θεραπεία

WT και ICAD

– /- ποντίκια, τόσο διατηρείται σε φόντο /SV C57BL /6 × 129, αναπαρήχθησαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο ελεύθερη εγκατάσταση σε LSUHSC, Νέα Ορλεάνη, LA, και επιτρέπεται η απεριόριστη πρόσβαση σε αποστειρωμένο φαγητό και νερό

κατά βούληση

και διατηρήθηκαν σε 12-ωρη φως-12-ωρη σκούρο χρονοδιάγραμμα. Σε 5 εβδομάδες ηλικίας, οι ποντικοί (12 ζώα ανά ομάδα) έλαβαν μια

ip

ένεση των 20 mg /kg DMH (Sigma, St. Louis, ΜΟ) σε αλατόνερο που περιέχει 1 mM EDTA μία φορά την εβδομάδα για οκτώ εβδομάδες . Τα ζώα στη συνέχεια θανατώθηκαν με CO

2 ασφυξία 12 ή 24 εβδομάδες αργότερα. Για την οξεία ανοίγματα, τα ποντίκια έλαβαν μία μόνο

ί.ρ.

Ένεση 20 mg /kg του φαρμάκου και θυσιάστηκαν είτε 24 ή 48 ώρες αργότερα. Αφαιρέθηκε κόλον και σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη. Μερικά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση πρωτογενή ΧΚΕ όπως περιγράφεται παρακάτω.

Απομόνωση των επιθηλιακών κυττάρων πρωτογενούς κόλον, ανοσοφθορισμό, θεραπείες, μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και κλωνογονική δοκιμασία

Άνω και κάτω τελεία ανοίχθηκαν διαμήκως και πλύθηκαν εκτεταμένα με ασβέστιο και μαγνήσιο ελεύθερο HBSS συμπληρωμένο με αντιβιοτικά. τμήματα ιστού επωάστηκαν για 90 λεπτά στους 37 ° C σε πλήρες μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 20% FBS, 2% ζωμός Luria, γλουταμίνη, 10 mg δισπάση, και 0.2% κολλαγενάση Ι (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood NJ) με σταθερή ήπια ανάδευση. Το προϊόν πέψης πλύθηκε με HBSS με φυγοκέντρηση και μετά επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο χωρίς ένζυμα. Απομονωμένα κρύπτες του παχέος εντέρου στη συνέχεια επιστρώθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες, μετά από το οποίο επιπλέει κρύπτες μεταφέρθηκαν σε φρέσκο ​​πιάτο σε πλήρες μέσο. Η αποτελεσματικότητα της απομόνωσης των κυττάρων εκτιμήθηκε με το βαθμό καθαρότητας των κρυπτών και του μικρού αριθμού των νεκρών κυττάρων. Η επιθηλιακή φύση των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανοσοφθορισμό με αντισώματα προς παν-κυτοκερατίνης (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Για τον προσδιορισμό του κυτταρικού θανάτου, CECs παρασκευάστηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό 2,5 ng /ml ΤΝΡ-α, 5 μg /ml κυκλοεξαμίδιο, και 3 mM βουτυρικό οξύ (TNF + CHX + ΒΑ) ή με 1 mM ΩΜΗ για 24 ώρες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε, σε δείγματα εις τετραπλούν, χρησιμοποιώντας χρώση καλσεΐνη-ΑΜ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Για την κλωνογόνο ανίχνευση, WT και ICAD

– /- ινοβλάστες ποντικού (περιγράφεται [13]) εκτέθηκαν σε IR (2 Gy), μετά την οποία τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους 35 mm σε 0.5% χαμηλού σημείου τήξης αγαρόζης σε ένα κρεβάτι από 1% ευγενή άγαρ σε πλήρες μέσο DMEM. Οι αποικίες βαθμολογήθηκαν με ένα αυτοματοποιημένο μετρητή και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως φορές-αύξηση σε σύγκριση με την τιμή για ψευδο-ακτινοβολημένα κύτταρα WT.

Ιστοπαθολογία και ανοσοϊστοχημεία (IHC).

Διαδοχικές τομές από παραφίνη -embedded κολονικής ιστοί παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους. Κάθε πέμπτη ενότητα υποβλήθηκε σε H & amp? Ε χρώση για τη συνήθη ιστολογική αξιολόγηση. Πυκνωτική /αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκαν με πυρηνική συμπύκνωση, κυτταρική κατάτμηση, συρρίκνωση, και /ή αποκόλλησης από το βλεννογόνο, ενισχυόμενη με δοκιμασία TUNEL (Millipore, Billerica, ΜΑ). Η δοκιμασία TUNEL δεν χρησιμοποιήθηκε ως κύριο μέσο για τον προσδιορισμό pycnosis /απόπτωση, δεδομένου ότι ICAD

– /- κύτταρα απέτυχαν, σε γενικές γραμμές, για να εμφανίσετε προφανή θετικά μηνύματα μετά την επισήμανση. Η συστοιχία ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου μέσα πυκνότητα (103 περιπτώσεις /208 πυρήνες) αγοράστηκε από την US Biomax Inc. (Rockville, MD, USA). Είκοσι τρία δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών αποκτήθηκαν από τον πυρήνα παθολογία LSUHSC. Τομές ιστού υποβλήθηκαν σε IHC με πρωτεύοντα αντισώματα σε ICAD (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), πολυ (ADP-ριβόζη) (BD Pharmingen, San Diego, CA), PCNA (Novusbio, Littleton, CO), MCP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), COX-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Αξιολόγηση της ανοσοδραστικότητας και οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν τυφλά από πιστοποιημένο παθολόγο (L. Del Valle). Για την ανάλυση συστοιχίας ιστού, ICAD ανοσολογική είχε χαρακτηριστεί ως υψηλή (≥4 +), μέτρια /υψηλή (3+), μέτρια /χαμηλή (2+), χαμηλή (1+), ή αρνητικό (-). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό θετικότητας του συνόλου των δειγμάτων (καρκίνος ή κανονική)

Προσδιορισμός και καταμέτρηση των ACF και των όγκων

ACF εντοπίστηκαν στην H & amp?.. E-χρώση διαδοχικών τομών με βάση της παρουσίας των άτυπων πυρήνες, το μέγεθος, αυξημένη pericryptal περιοχή, και συμπυκνωμένη στρώση των επιθηλιακών κυττάρων με τη βοήθεια από τη βοήθεια της παθολογοανατόμο (

Κ. Fallon

). ACF με 2 ή περισσότερους αδένες συμπεριλήφθηκαν στην αξιολόγηση. Διάμετρος των όγκων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα στερεοσκοπικό μικροσκόπιο.

Ο χαρακτηρισμός των χρωμοσωμικών ανωμαλιών από aCGH.

Το προφίλ του χρωμοσωμικές εκτροπές σε κολικό ιστό (που απομονώνονται από ιστούς παραφίνης) από ΩΜΗ επεξεργασμένο WT ή ICAD

– /- ποντικών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ολιγο βάσει μικροδιάταξης CGH με τσιπ που περιέχει 105000 γονιδιωματικό ανιχνευτές ποντικού (Agilent, Santa Clara, CA? www.agilent.com). Οι έλεγχοι αναφοράς ήταν DNA που απομονώθηκε από ιστό του παχέος εντέρου του ίδιας ηλικίας αφελείς WT ή ICAD

– /- ποντίκια. Τα DNA μάρτυρα και δοκιμής υποβλήθηκαν σε πέψη με το

Alu

Ι και

Rsa

Ι (Promega, Madison, WI), και καθαρίστηκε με τη QIAprep Spin Miniprep κιτ (Qiagen, Germantown, MD). Δοκιμή DNA (1 μg) και αναφοράς DNA (1 μg) επισημάνθηκαν με τυχαία έναρξη με Cy5-dUTP και Cy3-dUTP, αντιστοίχως, με τη χρήση της Agilent Genomic DNA Labeling Kit Plus. Τα ξεχωριστά επισημασμένα δείγματα δοκιμής και αναφοράς συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Microcon ΥΜ-30 φίλτρα (Millipore, Billerica, ΜΑ) και, στη συνέχεια, συνδυάζονται. Μετά από μετουσίωση καθετήρα και προ-ανόπτησης με το ποντίκι Cot-1 DNA, η υβριδοποίηση πραγματοποιήθηκε στους 65 ° C με περιστροφή για 40 ώρες σε 20 rpm. Τέσσερα στάδια έγιναν με Agilent Ολίγο CGH πλύσεις: ρυθμιστικό Πλύσης 1 σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά, ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 στους 37 ° C για 1 λεπτό, ένα ξέβγαλμα ακετονιτρίλιο σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό και ένα πλύσιμο 30 sec σε θερμοκρασία δωματίου σε της Agilent σταθεροποίηση και ξήρανση λύση. Όλες οι διαφάνειες σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή μικροσυστοιχιών Agilent DNA. Δεδομένων, συμπεριλαμβανομένων Αντιγραφή Παραλλαγές Αριθμός ελήφθησαν από Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό Εξόρυξη 9 και αναλύονται με το λογισμικό Agilent Γονιδιωματική Workbench 5.0, με τη χρήση των στατιστικών αλγορίθμων z σκορ και ADM-2 σύμφωνα με το όριο ευαισθησίας αντίστοιχα σε 2,5 και 6,0 και ένα κινούμενο μέσο όρο παράθυρο των 0,2 Mb.

ανάλυση δεδομένων

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD των τιμών από τουλάχιστον έξι ποντικοί ανά ομάδα ή από 4 έως 6 αντίγραφα της ίδιας θεραπείας των καλλιεργημένων κυττάρων. λογισμικό PRISM (GraphPad, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των διαφορών μεταξύ των πειραματικών ομάδων με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett. Η ανάλυση των δεδομένων aCGH περιγράφηκε παραπάνω.

Αποτελέσματα

Σύνδεσης μεταξύ ανεπάρκειας ICAD και κακοήθεια του παχέος εντέρου στον άνθρωπο

Έχουμε ξεκινήσει τις μελέτες μας με τη διεξαγωγή άμεση εξέταση της έκφρασης ICAD χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία σε μια σειρά από καρκίνο του παχέος εντέρου, τόσο και φυσιολογικούς ιστούς. Η έκφραση του ICAD φάνηκε να είναι πιο εμφανή σε επιθηλιακά κύτταρα του φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέως εντέρου με μία πρωτοταγή πυρηνικό υποκυτταρική εντόπιση (Εικ. 1Α). επίπεδα έκφρασης ICAD, ωστόσο, ήταν σε κίνδυνο στις καρκινικούς ιστούς (Σχ. 1Α). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η χρόνια φλεγμονή και των αναμενόμενων αποκρίσεων στρες που σχετίζεται με τέτοια φλεγμονή δεν φάνηκε να επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης ή υποκυτταρική εντόπιση του ICAD στο κόλον (Εικ. 1Β). Το σχήμα 1C παρέχει μια ποσοτική αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης ICAD στη συστοιχία ιστού: περισσότερο από το 40% των καρκινικών ιστών θεωρήθηκαν ότι εξαντλούνται αξιοσημείωτα του ICAD. Είναι κατανοητό ότι η αντοχή των δεδομένων επιτυγχάνεται με τη χρήση συστοιχιών ιστού μπορεί να περιορίζεται με δεδομένο το γεγονός ότι δεν μπορεί να περιλαμβάνει φυσιολογικό γειτονικό του παχέος ιστούς ως εσωτερικοί έλεγχοι. Για την παράκαμψη αυτού του περιορισμού εξετάσαμε την έκφραση του ICAD σε 23 ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου σε συνδυασμό με το φυσιολογικό ιστό που συλλέγονται από τους ίδιους ασθενείς. Η ανάλυση των ιστών έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης ICAD παραβίασης στους καρκινικούς ιστούς, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 D (κάτω πλαίσιο) σε σύγκριση με εκείνη που εντοπίστηκαν στο φυσιολογικό κολονικό ιστό του ίδιου ασθενούς? 17 από 23 δείγματα παρουσίασαν μείωση στο επίπεδο του ICAD σύγκριση με τα επίπεδα ανιχνεύθηκαν σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. Τα υπόλοιπα δείγματα έδειξαν μέτρια έως μικρή αλλαγή στην ICAD ανοσολογική αντίδραση. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν μια πιθανή σχέση μεταξύ της ανεπάρκειας ICAD και κακοήθεια του παχέος εντέρου. Ωστόσο, μια πιο λεπτομερής έρευνα απαιτείται για να κατανοήσουν και να καθοριστεί η σχέση μεταξύ της ανεπάρκειας ICAD και κακοήθεια του παχέος εντέρου, ιδιαίτερα εκείνων που σχετίζονται με την εξέταση της συμμετοχής της πρωτεΐνης στην κυτταρική μοίρα και γενετική μεταβολή που οδηγεί σε καρκινογένεση.

(Α ) συστοιχίες ιστό που περιέχει τμήματα από φυσιολογικό κόλον (n = 60) ή καρκίνο (n = 131), οι ιστοί υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική χρώση με αντισώματα κατά της ανθρώπινης ICAD. επίπεδα (Β) Έκφραση ICAD σε χρόνια φλεγμονή του παχέος εντέρου. (Γ) Η έκταση της ICAD ανοσοδραστικότητα εκτιμήθηκε και έχουν χαρακτηρισθεί ως υψηλού (≥4 +), μέτρια /υψηλή (3+), μέτρια /χαμηλή (2+), χαμηλή (1+), ή αρνητική (-)? Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό θετικότητα των συνολικών δειγμάτων (καρκίνος ή φυσιολογικό). (D) φυσιολογικών και καρκινικών ιστών μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, ενσωματωμένα (κανονικής και νοσούντες ιστούς από κάθε ασθενείς ενσωματωμένα μαζί), τεμαχίστηκαν, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε IHC με αντισώματα για την ανθρώπινη ICAD. Μαύρα κουτιά (Α, Β, και Δ) υποδεικνύουν τις μεγεθύνεται περιοχές.

Η

Προώθηση ογκογόνο φαινότυπο με ανεπάρκεια ICAD κατά την έκθεση σε βλάβες του DNA που προκαλούνται από χαμηλή δόση ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR)

προηγουμένως έδειξαν ότι η ανεπάρκεια ICAD μειώνει την ευαισθησία να (TNF-α) θάνατος κυττάρων επαγόμενη [13], [25]. Για να καθοριστεί εάν η απόπτωση ανθεκτικό φαινότυπο ICAD

– /- ινοβλάστες προωθούνται μετασχηματισμός τους μετά την επαγωγή της βλάβης του DNA, εξετάσαμε την ικανότητα αυτών των κυττάρων να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Άγριου-τύπου (WT) και ICAD

– /- κύτταρα πρώτα εκτίθεται σε χαμηλή δόση (2 Gy) IR, μετά την οποία ανεστάλησαν σε άγαρ με πλήρες μέσο και αποικίες μετρήθηκαν μετά από επώαση για 3 εβδομάδες. Το Σχήμα 2Α δείχνει ότι η ανεπάρκεια ICAD οδήγησε σε σημαντική (-6.5 φορές) αύξηση στην ικανότητα των κυττάρων να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ μετά από έκθεση σε IR? αξίζει να σημειωθεί ότι οι αποικίες που αναπτύχθηκαν από τα κύτταρα άγριου τύπου ήταν μικρές σε αριθμό και μέγεθος. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ένα κρίσιμο ρόλο για ICAD στην ομοιόσταση των κυττάρων και ότι η ανεπάρκεια ICAD μπορεί να συμβάλει σε μία ογκογόνο φαινότυπο κατόπιν βλάβης του DNA

(Α) ICAD

-. /- Και WT ινοβλάστες ποντικού είτε εκτέθηκαν σε IR (2 Gy) ή ψευδο-ακτινοβολημένα, μετά την οποία θα καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ με πλήρες μέσο για 3 εβδομάδες. Οι αποικίες στη συνέχεια μετρήθηκαν με ένα αυτοματοποιημένο μετρητή. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό της τιμής WT κύτταρα ψευδο-ακτινοβολημένα και είναι μέσοι ± SD του τριπλούν από αντιπροσωπευτικό πείραμα. *, Η διαφορά από την ψευδο-ακτινοβολημένα κύτταρα WT, σ & lt? 0,05? #, Διαφορά από WT κύτταρα που εκτίθενται σε IR (2 Gy), σ & lt? 0,05. (Β) CECs παρασκευάστηκαν από ποντικούς WT και αφέθηκε να διαδώσει για 4 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοφθορισμό με αντισώματα προς παν-κυτοκερατίνης (κόκκινο) ή χρώση με ϋΑΡΙ (μπλε)? πινάκιο κορυφής είναι ένα παράδειγμα CECs ορατές με φωτεινό μικροσκόπιο πεδίου. Κίτρινα βέλη δείχνουν παχέος κρύπτες. (Γ) CECs, που απομονώνονται από WT ή ICAD

– /- ποντίκια, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 ng /ml TNF σε συνδυασμό με 5 μg /ml κυκλοεξαμίδιο και 3 mM βουτυρικό οξύ (ορίζεται ως TNF + CHX + ΒΑ) ή 1 mM ΩΜΗ. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία του TNF + CHX + ΒΑ ή DMH, μετά την οποία, μετά την οποία η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση της καλσεΐνης-ΑΜ φθορισμού. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό της βιωσιμότητας των μη επεξεργασμένων κυττάρων και είναι μέσα ± Τ.Α. τιμών από τέσσερα φρεάτια από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. * Διαφορά από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, ρ & lt? 0,05. #, Διαφορά από την αντίστοιχη θεραπεία κύτταρα, σ & lt? 0,05. (Δ) Οι ποντικοί έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή ένεση 20 mg /kg DMH ή αλατούχο (μάρτυρας). Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 48 ώρες, και άπω παχύ έντερο τους απομακρύνθηκαν και μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη. Τομές ιστού στη συνέχεια παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε Η &? Ε χρώση ή χρώση TUNEL. Πυκνωτική αποπτωτικών κυττάρων /προσδιορίστηκαν με πυρηνική συμπύκνωση, κυτταρική κατάτμηση, συρρίκνωση, και /ή αποκόλληση από βλεννογόνο, ενισχυόμενη με δοκιμασία TUNEL. Κατά μέσο όρο, μετρήθηκαν 40 κρύπτες ανά τμήμα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο αριθμός των πυκνωτική /αποπτωτικών κυττάρων ανά mm

2. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD των τιμών από τουλάχιστον έξι ποντίκια ανά ομάδα. *, Διαφορά από τα αντίστοιχα μη επεξεργασμένα ποντίκια?

σ

& lt? 0,01? #, Η διαφορά από την WT ποντίκια που εκτέθηκαν σε ΩΜΗ,

σ

& lt? 0,01. (Ε) Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (D) με την εξαίρεση ότι θυσιάστηκαν μετά από 24 ώρες. Το απώτερο παχύ έντερο απομακρύνθηκαν και μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη. Τομές ιστού στη συνέχεια παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε IHC με αντισώματα προς πολυ (ADP-ριβόζη). Κόκκινα κουτιά δείχνουν τις μεγεθύνεται περιοχές? κίτρινα βέλη δείχνουν πολυ (ADP-ριβόζη) -immunoreactive πυρήνες. (F) Ένα ποσοτικοποίηση των πολυ (ADP-ριβόζη) -immunoreactive πυρήνες των ΜΑΕΚ στο βλεννογόνο του κόλου των διαφορετικών πειραματικών ομάδων.

Η

σύνδεσης μεταξύ γονίδιο διαγραφή ICAD και μια μείωση στην ευαισθησία επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου σε ερεθίσματα θάνατο

Λόγω της δυνητικής ογκογόνο επίδραση της ανεπάρκειας ICAD κατά βλάβες στο DNA, εξετάσαμε τη δυνατότητα αυτή στο παχύ έντερο ρύθμιση

in vitro

και

in vivo

. Για να αρχίσει τις δοκιμές υπόθεση μας, εξετάσαμε την επίδραση της

ICAD

γονίδιο knockout με την απόκριση του επιθηλιακά κύτταρα πρωτογενούς κόλου (ΧΚΕ) προς επαγωγείς κυτταρικού θανάτου, για παράδειγμα, TNF-α, κυκλοεξιμίδιο, και βουτυρικό οξύ ( TNF + CHX + ΒΑ) ή με την καρκινογόνο παχέος εντέρου ΩΜΗ. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η + CHX + συνδυασμός BA TNF είναι αποτελεσματική στην προώθηση θανάτωσης κυττάρων σε ΧΚΕ [26]. Επιπλέον, αρκετές εκθέσεις από εμάς και άλλους έδειξε ότι κυκλοεξαμίδιο ή βουτυρικό ευαισθητοποιεί έναν αριθμό ανθρώπινων επιθηλιακών κυτταρικών σειρών κόλου σε TNF-α που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο [26], [27], [28], [29], [30]. Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια μέθοδο για την απομόνωση πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου [26]. Το Σχήμα 2Β δείχνει τα τυπικά χαρακτηριστικά των επιθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από ένα απομονωμένο κρύπτης του κόλου? η επιθηλιακή φύση των απομονωμένων κυττάρων επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό με αντισώματα εναντίον κυτοκερατίνης. Θεραπεία των ΜΑΕΚ με TNF + CHX + BA που προκαλείται από το θάνατο που ήταν μέτρια, αλλά μειώθηκε σημαντικά από ανεπάρκεια ICAD (Σχ. 2C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ανεπάρκεια ICAD παρείχε καλύτερη αντίσταση στην καταστροφή κυττάρων σε απάντηση ΩΜΗ. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον ανεπάρκεια ICAD παρέχει επίσης αντοχή σε ΩΜΗ

in vivo

κατά την οξεία έκθεση. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με μια μονή δόση (20 mg /kg) ΩΜΗ για 24 ή 48 ώρες. Το σχήμα 2D δείχνει ότι η ανεπάρκεια ICAD μείωσε σημαντικά τον αριθμό των πυκνωτική /αποπτωτικών κυττάρων σε κολονικό βλεννογόνο αξιολογήθηκε 48 ώρες μετά την έκθεση DMH. Δεδομένου προηγουμένως αναφερθεί σχέση μας μεταξύ έκφρασης ICAD και ενεργοποίηση PARP [13], [16], εξετάσαμε αν η αντίσταση του ICAD

– /- ΧΚΕ να ϋΜΗ-επαγόμενης θάνατος σχετίστηκε με μείωση της ενεργοποίησης PARP. Σχήμα 2Ε δείχνει ότι η θεραπεία DMH προκάλεσε μια ισχυρή ενεργοποίηση της PARP, όπως αποδεικνύεται από ανοσοαντιδραστικότητα πολυ (ADP-ριβόζη) σε πυρήνες ΜΑΕΚ στο βλεννογόνο του κόλου των ποντικών που έλαβαν. Αυτή η ενεργοποίηση PARP ήταν ανύπαρκτη στα επιθηλιακά κύτταρα του κόλου του βλεννογόνου του ϋΜΗ επεξεργασμένου ICAD

– /- ποντίκια. Μια ποσοτικοποίηση αυτών των αποτελεσμάτων απεικονίζεται στην Εικόνα 2F. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι DMH-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σχετίζεται με την ενεργοποίηση PARP και ότι η έκφραση ICAD απαιτείται για την αποτελεσματική επαγωγή τέτοιων κυτταρικού θανάτου. Το πιο σημαντικό, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η αντίσταση σε θάνατο ανατίθενται από ανεπάρκεια ICAD μπορεί να συμμετέχει στην συνολική διαδικασία της ογκογένεσης στο παχύ έντερο.

Ενίσχυση της ευαισθησίας σε ϋΜΗ-επαγόμενης ογκογένεση του παχέος εντέρου από ανεπάρκεια ICAD δυνητικά μετα-ACF σχηματισμό

Για να ελέγξετε περαιτέρω προαναφερθείσες μας υπόθεση, εξετάσαμε την επίδραση της γονιδιακής διαγραφής ICAD σε ένα μοντέλο της ογκογένεσης του παχέος εντέρου. WT και ICAD

– /- ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά μία φορά την εβδομάδα για 8 εβδομάδες με 20 mg /kg DMH ή όχημα (1 mM EDTA σε φυσιολογικό ορό). Οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν 12 ή 24 εβδομάδες μετά την τελευταία ένεση. Το Σχήμα 1Α δείχνει ότι το 25% των DMH επεξεργασμένου WT ποντικοί ανέπτυξαν όγκους εμφανίζοντας μια μέτρια έως ισχυρή αντίσταση κατά ϋΜΗ-επαγόμενης ογκογένεσης, ένα γνώρισμα που είναι συνεπής με την αναφερόμενη αντίσταση του C57BL /6 και 129 /Sv στελεχών να ογκογένεση του παχέος εντέρου που προκαλείται από ΩΜΗ ή υποπροϊόν αζοξυμεθάνιο της [31]. Ωστόσο, 58,3% του ϋΜΗ-εκτεθειμένο ICAD

– /- ποντίκια ανέπτυξαν όγκους, επιβεβαιώνοντας το ογκογόνο δυναμικό παρατηρείται

in vitro

. Ενώ ο μέσος όγκος ανά ποντικό σε WT ποντικούς ήταν -0,5, ο μέσος όρος των όγκων σε ICAD

– /- ποντίκια ήταν -3.5 περίπου 7 φορές υψηλότερη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανεπάρκεια ICAD αύξησε όχι μόνο την ευαισθησία των ποντικών στο ΩΜΗ αλλά επίσης αύξησε τον αριθμό των όγκων. Οι όγκοι ανιχνεύονται σε DMH επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντίκια ποικίλουν σε μέγεθος, αλλά έφθασε μεγέθη τόσο μεγάλο όσο 1 cm, που φαίνεται στο Σχήμα 3Α-Β. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση αποκάλυψε τυπικό όγκων του παχέος εντέρου με αξιοσημείωτη υπερπλασία και δυσπλασία και την ανάπτυξη των μεγάλων ACF (Σχ. 3C). Αυτοί οι όγκοι έδειξαν υψηλή PCNA θετικότητα ενδεικτική υψηλά ποσοστά πολλαπλασιασμού (Σχ. 3D). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτοί οι όγκοι εμφάνισαν μεγάλες νεκρωτικές περιοχές και εμφανίζονται σημαντικές φλεγμονή, όπως αποδεικνύεται από τον μεγάλο αριθμό των φλεγμονωδών κυττάρων εντός του πλησίον των όγκων (Σχ. 3Ε), η οποία συσχετίζεται με την υψηλή MCP-1 ανοσοδραστικότητα, μια σημαντική χημειοκίνης σε φλεγμονώδεις στρατολόγηση κυττάρων, όπως καθώς και την έκφραση της COX-2 (Σχήμα 3F).

WT και ICAD

-. /- ποντίκια έλαβαν ενέσεις DMH μία φορά την εβδομάδα για 8 εβδομάδες. Οι ποντικοί θανατώθηκαν 24 εβδομάδες αργότερα. (Α) Διάμετρος των όγκων εκτιμήθηκε στις διάφορες πειραματικές ομάδες? n = 12. * Διαφορά από ΩΜΗ επεξεργασμένο WT ποντίκια, σ & lt? 0,01. (Β) Ένα μεικτό εξέταση ενός μεγάλου όγκου ανιχνεύθηκε σε DMH επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντίκια. (Γ) Η &? Ε-χρώση κολικού ιστού με ένα μεγάλο όγκο από ένα DMH επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντικό? σημειώστε τις μεγάλες νεκρωτικές πυρήνες (μαύρα βέλη) και την αγγείωση (κίτρινα βέλη). (D) έκφραση PCNA σε όγκους κόλον από DMH επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντίκια όπως αξιολογείται με IHC. (Ε) Η &? Ε-χρώση με ένα τμήμα όγκου από έναν DMH επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντικού με φλεγμονώδη κύτταρα (βέλη) στην περιοχή του όγκου. (F) MCP-1 και την έκφραση COX2 σε όγκους κόλον από DMH επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντίκια, όπως εκτιμάται από IHC? το δικαίωμα του πίνακα είναι ένα IgG ελέγχου.

Η

Οι γενετικές αλλοιώσεις που καθιστούν CECs ανθεκτικά σε απόπτωση ή περισσότερες πολλαπλασιαστικές είναι ζωτικής σημασίας για την έναρξη γεγονότα στην ογκογένεση του παχέος εντέρου [1]. Η επακόλουθη συσσώρευση αυτών των τροποποιημένων επιθηλιακών κυττάρων συμβάλλει στο σχηματισμό ACF. Αυτές οι προκαρκινικές αλλοιώσεις μπορεί ή δεν μπορεί να εξελιχθεί σε όγκους, αλλά γενικά θεωρείται ότι είναι μια προϋπόθεση για την εξέλιξη του όγκου [5]. Ως εκ τούτου, εξέτασε την επίδραση της έλλειψης ICAD για ACF σε προγενέστερο χρονικό σημείο (12 εβδομάδες μετά την τελευταία ένεση ΩΜΗ) και πριν από την ανάπτυξη των μεγάλων αδενωμάτων. Παραδόξως, αν και ο αριθμός των ACF στο παχύ έντερο ΩΜΗ έλαβαν ICAD

– /- ποντίκια κινήθηκαν υψηλότερα από εκείνα που ανιχνεύθηκαν στον ομόλογό WT, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια ICAD έπαιξε μεγαλύτερο ρόλο στην εξέλιξη του όγκου και όχι στην έναρξη

WT και ICAD

-. /- Ποντίκια έλαβαν ενέσεις ΩΜΗ μία φορά την εβδομάδα για 8 εβδομάδες. Οι ποντικοί θανατώθηκαν 12 εβδομάδες αργότερα. ACF εντοπίστηκαν και μετρήθηκαν σε Η &? Ε-χρώση σειριακές τομές. Μόνο ACF με 2 ή περισσότερους αδένες συμπεριλήφθηκαν στην αξιολόγηση? n = 12. * Διαφορά από ΩΜΗ επεξεργασμένο WT ποντίκια, σ & lt? 0,05. Το δεξί πάνελ αντιπροσωπεύει ένα παράδειγμα ενός μεγάλου ACF σε κόλον ενός DMH επεξεργασμένου ICAD

– /-. Ποντίκι

Η

Προώθηση της γονιδιωματικής αστάθειας από ανεπάρκεια ICAD κατά την έκθεση ϋΜΗ σε ποντίκια και η επίδραση σε του παχέος εντέρου γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο

ανεπάρκεια CAD πρόσφατα σχετίζεται με γενετική αστάθεια στην καρκινογένεση του δέρματος και ακτινοβολημένα κυτταρικές σειρές [20], [21]. Αναστολή της κατάτμησης DNA από κασπάση-3-ανθεκτική μετάλλαξη του ICAD οδήγησε σε αύξηση χρωμοσωμικές εκτροπές σε ρ53-ανεξάρτητο τρόπο [32]. Είμαστε δίπλα θέλησε να εξετάσει κατά πόσον η αύξηση της ευαισθησίας όγκου σε ΩΜΗ επεξεργασμένο ICAD

– /- ποντίκια συσχετίστηκε με μεταβολή της γονιδιωματικής ακεραιότητας στο παχύ έντερο ΩΜΗ έλαβαν ICAD

– /- ποντίκια. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε σειρά συγκριτικών γενωμικού υβριδισμού (aCGH) αναλύσεις του όγκου που περιέχουν ιστούς κόλου ICAD

– /- ποντίκια και σε σύγκριση με τους ομολόγους WT. Το Σχήμα 5 δείχνει ότι η θεραπεία με DMH προκάλεσε ήπια γενωμική αστάθεια σε WT ποντικούς, η οποία αποτελούνταν κυρίως από διαγραφές πιο ευδιάκριτα στα χρωμοσώματα 2, 9, 11, 13, και 15. Σε έντονη αντίθεση, οι τροποποιήσεις στην κολονική ιστούς του DMH επεξεργασμένου ICAD

– /- ποντίκια ήταν εκτεταμένες και αποτελούνταν κυρίως από ενισχύσεις. Εικόνα 5Β εμφανίζει ποσοτικές εκτιμήσεις των αλλαγών αποτελεί αντιπροσωπευτικό δείγμα της συμβολής της ICAD σε γενωμική αστάθεια. Είναι αξιοσημείωτο ότι, ενώ η ανεπάρκεια ICAD συνδέθηκε με 170 και 120 ενίσχυση διαγραφή εστίες, ICAD επάρκειας συνδέθηκε με αποκλεισμό των περισσότερων ενισχύσεις (20 εστίες) με ένα μέτριο αποτέλεσμα επί διαγραφές (68 εστίες). Όταν αυστηρότητα αυξήθηκε και εφαρμόστηκε μία αποκοπή ενός 3-φορές αλλαγή, οι αριθμοί των τροποποιημένες θέσεις εμφανώς μειωμένη, αλλά η τάση παρέμεινε η ίδια (Σχ. 5D), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την εμπλοκή ICAD σε γονιδιωματική ακεραιότητα.

χρωμοσωμικό DNA απομονώθηκε από τις διάφορες πειραματικές ομάδες εκτιμήθηκε για γενική χρωμοσωμικών ανωμαλιών με χρήση ολιγο βάσει μικροδιάταξης CGH με τσιπ που περιέχει γονιδιωματικό ανιχνευτές 105.000 ποντικού.