Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) διαθέτουν υψηλή ικανότητα όγκου κίνηση και έχουν αναφερθεί να είναι ανθεκτικά σε θεραπευτικά μέσα. Αντίστροφα, η θεραπεία-ανθεκτική καρκινικά κύτταρα φαίνεται να εκδηλωθεί CSC φαινοτύπους και ιδιότητες. Έχει γενικά υποτεθεί ότι ανθεκτικά στα φάρμακα καρκινικά κύτταρα μπορούν να είναι όλα τα ΚΕΠ αν και η γενικότητα αυτής της υπόθεσης είναι άγνωστη. Εδώ, σε χρόνια θεραπεία Du145 κυττάρων καρκίνου του προστάτη με ετοποσίδη, πακλιταξέλη και ορισμένα πειραματικά φάρμακα (δηλαδή, σταυροσπορίνη και 2 πακλιταξέλη αναλόγων), η οποία οδήγησε σε πληθυσμούς κυττάρων φάρμακο με ανοχή (DTC). Παραδόξως, αυτές οι κωδικοί DTC, όταν εμφυτεύονται υποδόρια ή ορθοτοπικώς σε NOD ποντίκια /SCID, παρουσίασαν πολύ μειωμένη ογκογενετικότητας ή ήταν ακόμη και μη-ογκογόνο. Drug-ανεκτικές DLD1 κόλον καρκινικά κύτταρα επιλέγονται από ένα παρόμοιο πρωτόκολλο χρόνιας επιλογή εμφανίζεται επίσης μειωμένη ογκογονικότητα ενώ UC14 καρκίνο της ουροδόχου κύστης φάρμακο κύτταρα ανεκτικά αποδεικνύεται είτε αυξημένη ή μειωμένη ικανότητα όγκου-αναγέννησης. Φάρμακο-ανεκτική κυττάρων Du145 έδειξε χαμηλή πολλαπλασιαστική και κλωνογονική ικανότητα και ήταν ουσιαστικά άνευ CD44

+ κύτταρα. Υποψήφιοι νοκ ντάουν του CD44 στα κύτταρα Du145 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αναγέννηση του όγκου, ενώ η αποκατάσταση της έκφρασης CD44 σε κύτταρα Du145 ναρκωτικά ανεκτική αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μερικώς αυξημένη ογκογονικότητα. Είναι ενδιαφέρον, τα ναρκωτικά ανεκτική κυττάρων Du145 έδειξε και τις δύο αυξήσεις και μειώσεις σε πολλά γονίδια «βλαστική ικανότητα». Τέλος, αποδείχθηκε ότι η χρόνια έκθεση στο φάρμακο που παράγεται κωδικούς DTC μέσω επιγενετικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν μόρια όπως CD44 και KDM5A. έτσι τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι 1) δεν είναι όλοι οι κωδικοί DTC είναι απαραίτητα ΚΕΠ? 2) τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως η ταξόλη και ετοποσίδη μπορεί να στοχεύσει απευθείας CD44

+ καρκινικά κύτταρα-κίνηση? και 3) Οι κωδικοί DTC που παράγεται μέσω της χρόνιας επιλογής φαρμάκου περιλαμβάνει επιγενετικών μηχανισμών

Παράθεση:. Yan H, Chen X, Zhang Q, Qin J, Li H, Liu C, et al. Κύτταρα (2011) Drug-ανεκτικές Καρκίνος εμφανίσουν μειωμένη ογκογενή Χωρητικότητα: Μείωση των CD44

+ κύτταρα και αποδεικτικών στοιχείων για επιγενετική. PLoS ONE 6 (9): e24397. doi: 10.1371 /journal.pone.0024397

Επιμέλεια: Amit Singh, Πανεπιστήμιο του Dayton, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Ιούλη 2011? Αποδεκτές: 8, Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 15η Σεπτεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) R01-ES015888, ΝΙΗ 1R21CA 150009, Υπουργείο άμυνας, W81XWH-08-1-0472, Υπουργείο άμυνας, W81XWH-11-1-0331, Elsa Ίδρυμα Pardee, MDACC Κέντρο για τον Καρκίνο επιγενετική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος βλαστοκυττάρων (CSC) έννοια, ότι οι όγκοι περιέχουν βλαστικά-όπως τα καρκινικά κύτταρα, προτάθηκε πριν από δεκαετίες και πρόσφατα αναβίωσε να εξηγήσει την κυτταρική ετερογένεια στον όγκο. Ένα από τα πιο σημαντικά κριτήρια για τον καθορισμό ΚΕΠ ενισχύεται η ικανότητά τους να αναγεννούν μεταμοσχεύσιμων όγκων που ανακεφαλαιώνουν ιστολογικά τη φαινοτυπική ετερογένεια του πατρικού όγκου [1]. Ως εκ τούτου, ΚΕΠ καλούνται συχνά τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση. ΚΕΠ εντοπίστηκαν για πρώτη φορά στη λευχαιμία και, από το 2003, έχουν αναφερθεί για πολλούς ανθρώπινους στερεούς όγκους περιλαμβανομένων γλοιώματος [2], το σάρκωμα [3], και καρκίνους του Ewing του στήθους [4], [5], του παχέος εντέρου [6] – [ ,,,0],12], πάγκρεας [13], [14], το ήπαρ [15] – [17], το στομάχι [18], του πνεύμονα [19], [20], το κεφάλι και το λαιμό [21], των νεφρών [22], και των ωοθηκών [ ,,,0],23], [24].

Τοποθέτηση στοιχεία δείχνουν ότι ΚΕΠ μπορεί να είναι πιο ανθεκτικά σε θεραπευτικά αντικαρκινικά, όπως φαίνεται στο λευχαιμικά [25] και του πολλαπλού μυελώματος [26] βλαστικά κύτταρα. CD133

+ ΚΕΠ αύξηση μετά από ακτινοβολία και συμβάλλουν στη γλοιοβλάστωμα ραδιοαντοχή μέσω προτιμησιακών ενεργοποίηση της απόκρισης σημείου ελέγχου βλάβης του DNA και την αύξηση της παραγωγικής ικανότητας επιδιόρθωση του DNA [27]. Το CD44

+ CD24

lo /- Τα μαστού ΚΕΠ εμπλουτισμένα σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού που έχουν λάβει επικουρική χημειοθεραπεία [28] και πιο ανθεκτικά σε ορισμένα χημειοθεραπευτικά φάρμακα [29]. Σε μοντέλα ποντικού μαστικών όγκων, ΚΕΠ έχουν επίσης αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικοί στην θεραπεία της σισπλατίνης [30]. Επιπλέον, στη χημειοθεραπεία του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν CSC φαινοτύπους [31] και CD133

+ ηπατική ΚΕΠ είναι στη χημειοθεραπεία λόγω της προνομιακής ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt [32]. Αυτά τα νέα ευρήματα τονίζουν πιθανή εμπλοκή των ΚΕΠ στην αντίσταση θεραπεία και σε υποτροπή της νόσου. Έχει υποτεθεί ότι ανθεκτικά στα φάρμακα καρκινικά κύτταρα μπορούν όλα να εμπλουτιστεί σε ΚΕΠ αν και η γενική εφαρμοσιμότητα αυτής της υπόθεσης παραμένει μη δοκιμασμένη.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση [33], [34], κλωνογενείς δοκιμασίες [35], [36 ], καθώς επίσης και πειράματα μεταμόσχευση του όγκου [37] – [41] έχουν παράσχει αποδείξεις ότι ο καρκίνος του ανθρώπινου προστάτη (PCA) περιλαμβάνει επίσης βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν. συστηματικές μελέτες μας σε μοντέλα ξενομοσχεύματος δείχνουν ότι τα κύτταρα του προστάτη είναι ετερογενείς όσον αφορά την ικανότητα των όγκων-κίνηση τους με το CD44

+ κυτταρικό πληθυσμό που φιλοξενούν τόσο ήρεμα ΚΕΠ και προγονικών κυττάρων του όγκου γρήγορα πολλαπλασιαζόμενων [38], [42]. Ένα κλάσμα του CD44

+ κύτταρα του προστάτη είναι αργή ποδηλασία, μπορεί προφανώς να υφίστανται αυτο-ανανέωση, κατά προτίμηση εκφράζουν γονίδια «βλαστική ικανότητα», και κατέχουν υψηλή ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό. ΚΕΠ μπορούν να εμπλουτιστούν περαιτέρω χρησιμοποιώντας CD44

+ α2β1

hi προφίλ δείκτη [39] και holoclones κυττάρων του προστάτη, στην οποία τα περισσότερα κύτταρα είναι CD44

+ α2β1

hi, περιέχουν αυτο-ανανέωση των κυττάρων του όγκου, την έναρξη [41]. πρόσφατη εργασία μας δείχνει ότι Nanog, απαραίτητη για την αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία των κυττάρων ES, εμπλουτίζεται το CD44

κυτταρικό πληθυσμό + προστάτη και λειτουργικά απαιτούνται για την ανάπτυξη του όγκου [43]. Στην πραγματικότητα, επαγώγιμη έκφραση Nanog είναι επαρκής για να αποκτήσει CSC φαινοτυπικές και λειτουργικές ιδιότητες και για την προώθηση της ευνουχισμό ανθεκτικά ανάπτυξη προστάτη [44]. Ένα βασικό αναπάντητο ερώτημα είναι κατά πόσο τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με προστάτη μπορεί να συμπεριφέρεται όπως μερικά άλλα ΚΕΠ είναι ανθεκτικά στην θεραπευτική ή, εναλλακτικά, αν φαρμακευτική αγωγή θα εμπλουτίσει PCA-κύτταρα έναρξης. Εδώ αναφέρουμε τα μη αναμενόμενα ευρήματα που κάποιοι ναρκωτικά ανεκτική καρκινικά κύτταρα είναι πολύ λιγότερο ογκογόνο ή ακόμη και μη-ογκογόνο. Παραδόξως, τα ναρκωτικά ανεκτική καλλιέργειες κυττάρων Du145 προστάτη στερούνται CD44

+ κύτταρα, τα οποία, εν μέρει τουλάχιστον, ευθύνονται για τη μειωμένη ογκογονικότητα τους.

Υλικά και Μέθοδοι

των ζώων που σχετίζονται με μελέτες έχουν εγκριθεί από το MD Anderson Cancer Center επιτροπή Θεσμικών IACUC (ACUF 08-05-08132). Όλες οι άλλες μελέτες που παρουσιάζονται εδώ ήταν ο ερευνητής-ξεκίνησε και δεν απαιτούν έγκριση από άλλους ρυθμιστικούς φορείς.

Cells, αντιδραστήρια, και τα ζώα

Du145, PC3 και UC14 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε RPMI που περιέχει 7% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 200 ​​U /ml πενικιλίνη (Gibco). κύτταρα DLD1 ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 7% FBS με αντιβιοτικά. Etoposide (VP16) και πακλιταξέλη αγοράστηκαν από την Sigma. Η δοξορουβικίνη (Dox) και σταυροσπορίνη (STS) αγοράστηκαν από την Biomol. WP1102 και WP1103 οι δύο νεοσυντιθέμενες ανάλογα paclitaxel με υποκαταστάσεις στο 2′-ΟΗ (από την ομάδα Πριέμπε? Λεπτομέρειες που πρέπει να δημοσιευθεί και αλλού). Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη περιλαμβάνονται: mAb κουνέλι να CD44 (Abcam) για κηλίδωση Western (1:1,000), mAb ποντικού για CD44 (BD Pharmingen) για ανοσοχρώση (1:500), mAb ποντικού για ABCG2 (Abcam? 1: 500), pAb κουνέλι με Bcl-2 (Santa Cruz? 1:500), μονοκλωνικά αντισώματα ποντικιού για να ρ21 και ρ27 (Santa Cruz? 1:1,1000 και για τα δύο), pAb κουνέλι να hTERT (Santa Cruz? 1:100), mAb κουνέλι να GAPDH (Cell Signaling? 1:2,000) και mAb σε β-ακτίνη (Cell Signaling? 1:1,000). Δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την GE Healthcare και ECL Plus αντιδραστήρια ήταν από την PerkinElmer Inc. NOD ποντίκια /SCID αρχικά αγοράστηκε από την Jackson Laboratories (Bar Harbor, ΜΕ) και τις αποικίες αναπαραγωγής εγκατεστημένος στην εγκατάσταση των ζώων μας και να διατηρούνται σε κανονικές συνθήκες σύμφωνα με το κατευθυντήριες οδηγίες των ιδρυμάτων.

Δημιουργία κυττάρων ναρκωτικά ανεκτική (DTC) και καθορισμός της IC

50 τιμές

Du145, κύτταρα DLD1 και UC14 αρχικά εκτεθεί σε διάφορα φάρμακα, σε τετραπλά φρεάτια , σε μία κλίμακα συγκεντρώσεων, δηλαδή, 0, 0,1 ηΜ, 1 ηΜ, 10 ηΜ, 50 ηΜ, 0,1 μΜ, 0,5 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ, 4 μΜ και 10 μΜ. Τα φάρμακα αναπληρώνονται κάθε 3 ημέρες και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία συνεχώς για 2 εβδομάδες. Η επιβίωση των κυττάρων και του θανάτου ήταν παρακολουθείται στενά κάτω από μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης-αντίθεσης. Στο τέλος της θεραπείας 2-εβδομάδων «βέλτιστη» συγκεντρώσεις του φαρμάκου προσδιορίστηκαν με βάση το κριτήριο που φαρμάκων έδειξαν σημαντική ανασταλτικές επιδράσεις στην επέκταση των κυττάρων, αλλά δεν σκοτώνουν τελείως το σύνολο του πληθυσμού (περίπου 90% θανάτωση κυττάρων). Το σύνολο πείραμα επαναλήφθηκε μία φορά. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στον προσδιορισμό της βέλτιστης συγκεντρώσεις (αναφέρεται στο κείμενο). Στη συνέχεια, τα καρκινικά κύτταρα ήταν συνεχώς καλλιεργήθηκαν στο μέσο που περιέχει την βέλτιστη συγκέντρωση των φαρμάκων για τουλάχιστον 3 μήνες για να καθοριστεί το DTC, που χαρακτηρίσθηκαν ως κύτταρα Du145-VP16, κύτταρα Du145-Paclitaxel, ούτω καθεξής και ούτω καθεξής. Οι κωδικοί DTC ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε μέσο το οποίο περιέχει τις βέλτιστες συγκεντρώσεις των μεμονωμένων φαρμάκων.

Για τον προσδιορισμό των ημι-μέγιστες συγκεντρώσεις αναστολής (δηλαδή, IC

50) των γονικών καρκινικών κυττάρων και των DTC, 2.5- 3,0 × 10

5 κύτταρα επιστρώθηκαν εις τετραπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του αρχικού φαρμάκου επιλογή ή μη επιλογή φαρμάκων (για την εξέταση πιθανών αντίσταση σταυρό) για 24-48 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας trypan blue προσδιορισμούς και το πρίσμα 5,0 λογισμικό GraphPad χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων και τον υπολογισμό του IC

50 τιμές.

Κλωνικές και ενσωμάτωσης BrdU προσδιορισμούς, ανοσοφθορισμού, και ανοσοστύπωση

Βασικές διαδικασίες για αυτά τα πειράματα έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [37] – [39], [43] – [45]. Για τον προσδιορισμό των συνολικών αριθμών κυττάρων, 5000 κύτταρα τοποθετήθηκαν εις τριπλούν ή τετραπλούν σε πλάκες 12 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες, με φρέσκο ​​μέσο που τροφοδοτείται κάθε 3 ημέρες. Στο τέλος, οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας trypan blue. Για τις δοκιμασίες BrdU, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε γυάλινες καλυπτρίδες (10.000 κύτταρα /καλυπτρίδα) όλη τη νύχτα και στη συνέχεια δονήθηκαν με 10 μΜ BrdU για 4 ώρες. Στο τέλος, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη που περιείχε 5% σακχαρόζη επί 10 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 20 λεπτά σε 1% Triton-100 και στη συνέχεια μετουσιώνεται, εξουδετερώθηκε, μπλοκάρει, και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BrdU (1:100) για 1 ώρα στους 37 ° C που ακολουθείται από κατσίκα αντι-ποντικού IgG-Alexa Fluor 594 (30 λεπτά στους 37 ° C). Ένα σύνολο 500-1000 κύτταρα μετρήθηκαν ανά καλυπτρίδα και δύο καλυπτρίδες μετρήθηκαν για κάθε κυτταρικό τύπο για να προσδιοριστεί το ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων (δηλαδή, BrdU

+) κύτταρα.

Για κλωνική ανάλυση, 100 κύτταρα ήταν επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες με φρέσκο ​​μέσο που τροφοδοτείται κάθε 3 ημέρες. Στο τέλος, οι δύο holoclones και meroclones [41] απαριθμήθηκαν και τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως η αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης. Paraclones περιείχαν μεγάλες και γηρασμένα κύτταρα [41] και γενικά είχε & lt? 20 κύτταρα και ως εκ τούτου δεν είχαν προσδιοριστεί ποσοτικά. χρώση ανοσοφθορισμού των CD44 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [38], [45]. Για κηλίδωση Western. γονική Du145 και διάφορα ναρκωτικά ανεκτική κύτταρα Du145 συλλέχθηκαν για την παρασκευή προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου σε κηλίδωση Western ανάλυση των μορίων που αναφέρονται στα πάνελ σχήματος. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα Du145-VP16 πρώτα σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις τριχοστατίνη Α (TSA) ή 5′-αζα-δεοξυκυτιδίνη (Αζα) για 72 ώρες.

Καθιέρωση GFP-tagged κύτταρα DU145 φάρμακο ανεκτικός

Εν συντομία, τα κύτταρα συσκευασίας 293FT [43] επιμολύνονται με pLL3.7-GFP φορέα λεντοϊού [43] μαζί με τα πλασμίδια συσκευασία χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη. μέσον Virus περιέχει συλλέχθηκε 48-72 ώρες αργότερα, φυγοκεντρούνται στις 3000 rpm, πέρασε μέσω ενός φίλτρου 0,45 μm για την απομάκρυνση συντριμμάτων και τελικά υποβλήθηκε σε υπερφυγοκέντρηση (20.000 rpm × 2 ώρες στους 4 ° C). κύτταρα DU145 Drug-ανεκτικές στη συνέχεια μολύνθηκαν με τον ιό σε ΜΟΙ (πολλαπλότητα μόλυνσης) 20-25.

υποδόρια (SC) και ορθοτοπική πειράματα όγκου

Βασικές διαδικασίες είχαν περιγραφεί προηγουμένως [37 ] – [39], [41], [43], [46]. Εν συντομία, η γονική και φάρμακο-ανεκτική Du145 (και άλλες) κύτταρα σε διαφορετικούς αριθμούς εγχύθηκαν σε 50% Matrigel s.c στα πλευρά του NOD /SCID ποντίκια. Όταν ο μεγαλύτερος όγκος (ες) σε κάθε ομάδα πρέπει να τερματιστεί από κανονισμούς IACUC ή τα ζώα που φέρουν όγκο έγινε ετοιμοθάνατα, όλα τα ζώα σε αυτή την ομάδα θυσιάστηκαν και οι όγκοι συγκομιδή. Για ορθοτοπική εμφύτευση, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν και τα κύτταρα εγχύθηκαν σε 20-μΙ μίγματος μέσου-Matrigel (1:01) εντός της ραχιαίας προστάτη. Όταν φορτίο του όγκου έγινε φανερό (με ψηλάφηση), το πείραμα τερματίστηκε, τα ζώα θυσιάστηκαν, και πρωτογενείς όγκοι μαζί με διάφορα όργανα (π.χ. πνεύμονα, ήπαρ, σπλήνα, πάγκρεας, νεφρό, κλπ) αποκόπηκαν και εξετάστηκαν για τις πολύ μικρές και macrometastasis (δηλαδή, GFP

+ εστίες) κάτω από μια Nikon επιφθορισμού μικροδιατομής μικροσκόπιο.

CD44 νοκ ντάουν πειράματα

shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν διεξήχθη όπως περιγράφηκε πρόσφατα [43], [46]. Εν συντομία, 293FT κύτταρα συσκευασίας μετήχθησαν είτε με pGIPz CD44-shRNA φορέα λεντοϊού ή φορέα ελέγχου pGIPz-NS. Ο ιός που περιέχει μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση στις 3.000 rpm, διηθείται μέσω ενός φίλτρου μm-σύριγγα 0.45, και τελικά υποβλήθηκε σε υπερφυγοκέντρηση (20.000 rpm × 2 ώρες στους 4 ° C). Το ιικό ίζημα ανασυστάθηκε στο μέσο ΟΡΤΙ-ΜΕΜ και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα ΗΤ1080 ινοσαρκώματος για τον προσδιορισμό του ιικού τίτλου. Στη συνέχεια, Du145 κύτταρα μολύνθηκαν με τους ιούς pGIPz-NS ή pGIPz-CD44shRNA σε ΜΟΙ 20 και, 24-48 ώρες αργότερα, χρησιμοποιήθηκαν είτε in vitro χαρακτηρισμούς ή σε πειράματα όγκου vivo.

CD44 υπερέκφραση πειράματα

Η βασική διαδικασία ρετροϊικό περιγράφηκε προηγουμένως [45]. Εν συντομία, ρετροϊικούς φορείς, συμπεριλαμβανομένων φορέα αναφοράς pBabe-GFP και pBabe-CD44 (Addgene, Cambridge, ΜΑ) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα τα Ampho-Φοίνιξ 293 (ATCC). 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση, ο ιός που περιέχει μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε, φυγοκεντρήθηκε στις 3000 στροφές ανά λεπτό, διηθείται μέσω ενός φίλτρου μm-σύριγγα 0.45, και τελικά υποβλήθηκε σε υπερφυγοκέντρηση (22.000 rpm × 2 ώρες στους 4 ° C). Το ιικό ίζημα ανασυστάθηκε στο μέσο ΟΡΤΙ-ΜΕΜ και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν τα ναρκωτικά ανεκτική κύτταρα Du145 για 24-48 h, η οποία στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σε in vitro και in vivo πειράματα.

Η θεραπευτική αγωγή της ορθοτοπική PC3 όγκους με πακλιταξέλη

Η βασική διαδικασία για θεραπευτικούς πειράματα περιγράφηκε πρόσφατα [46]. Εν συντομία, τα κύτταρα PC3-GFP εμφυτεύθηκαν στο ραχιαίο προστάτη (DP) των αρσενικών NOD /SCID ποντίκια (500.000 κύτταρα /DP? N = 10). Τρεις εβδομάδες αργότερα, 5 ζώα ανά ομάδα ενέθηκαν ενδοφλεβίως, με 15 mg /kg σωματικού βάρους του paclitaxel ή του οχήματος μάρτυρα (PBS). Οι ενέσεις επαναλήφθηκαν κάθε εβδομάδα για δύο ακόμη εβδομάδες (δηλαδή, ένα σύνολο 3 ενέσεις) τερματίστηκαν και τα ζώα 49 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Οι όγκοι DP αποκόπηκαν, απεικόνιση, και ζυγίστηκαν ενώ διάφορα όργανα, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του παγκρέατος, των λεμφαδένων, του ήπατος, και του εγκεφάλου, εξετάστηκαν για μετάσταση σε ένα ανατομικό μικροσκόπιο επιφθορισμού [46].

Ανάλυση «βλαστική ικανότητα» προφίλ γονιδιακής έκφρασης με ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης – αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR)

Η βασική διαδικασία για την ανάλυση qPCR περιγράφηκε πρόσφατα [44], [46]. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα Du145 και Du145-VP16 χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy RNA-καθαρισμού (Qiagen, Valencia, CA). Το ΑΒΙ υψηλής χωρητικότητας cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) και τυχαία εξαμερή χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA. qPCR διεξήχθη από το Core Βιολογίας Διευκόλυνση M.D. Anderson Επιστημονικό Πάρκο-Μοριακή χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7900HT (Applied Biosystems). Αρχείο Builder 3.1 λογισμικό (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό PCR εκκινητές και ανιχνευτές. ζεύγη εκκινητών Human ειδική γονιδιακή χρησιμοποιήθηκαν για προφίλ έκφρασης με την μέθοδο SYBR® Green. Η πειραματική Ct (κατώφλι κύκλου) βαθμολογείται έναντι εκείνη του ελέγχου του προϊόντος 18S. Όλες οι ενισχύσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Η μέθοδος DDCt χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ποσότητα του προϊόντος γονιδίου σε σχέση με εκείνη που εκφράζεται σε γονικά κύτταρα Du145 (1-φορές, 100%).

Στατιστικές αναλύσεις

GraphPad Prism 5.0 λογισμικό και F- δοκιμή χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθεί η IC

50 αξίες. Αζευγάρωτη

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν οι διαφορές στους αριθμούς των κυττάρων, BrdU

+% των κυττάρων, της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης, CD44

+% των κυττάρων, και τα βάρη των όγκων. Ακριβής δοκιμασία Fisher χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνετε συχνότητα εμφάνισης και λανθάνουσα κατάσταση.

Αποτελέσματα

Η χρόνια σχεδόν θανατηφόρες φαρμακευτική αγωγή οδήγησε σε φάρμακα καρκινικών κυττάρων ανεκτική

Κλινικά, πολλοί ασθενείς με καρκίνο συχνά αντιμετωπίζονται χρόνια με θεραπευτικά αντικαρκινικά. Το καλύτερο παράδειγμα είναι ίσως CML (χρόνια μυελογενής λευχαιμία) ασθενείς, οι οποίοι πρέπει να λαμβάνουν imatinib (Gleevec) συνεχώς για χρόνια [47]. Επιπλέον, μετρονομική χημειοθεραπεία – μια μορφή χορήγησης χημειοθεραπείας χαρακτηρίζεται από συχνές, συχνά καθημερινή, επεκτάθηκε χορήγηση μικρών δόσεων των συμβατικών chemodrugs χωρίς μεγάλες διακοπές [48], αναδύεται ως μια τυπική θεραπευτική αγωγή για πολλούς καρκίνους. Με βάση τις παραδοχές που ΚΕΠ μπορεί να έχει ένα ειδικό πλεονέκτημα επιβίωσης θεραπευτικών και είναι πιθανό τα κύτταρα που διαμεσολαβούν την αντίσταση των ναρκωτικών, ελέγξαμε εάν τα καρκινικά κύτταρα που έχουν επιζήσει ΧΡΟΝΙΑ φαρμακευτική αγωγή μπορεί όλοι να έχουν τις ιδιότητες CSC. Εμείς αντιμετωπίζονται πρώτα κύτταρα Du145 καρκίνου του προστάτη (PCA) με δύο κλινικές φάρμακα, δηλαδή, ετοποσίδη (VP16) και πακλιταξέλη (Ταχοί), καθώς και τρία πειραματικά φάρμακα, σταυροσπορίνη (STS), ένα promiscuous αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης, και δύο πρόσφατα παρασκευασμένα ανάλογα paclitaxel ονομάζονται WP1102 και WP1103 (λεπτομέρειες που θα παρουσιαστεί αλλού). Όπως περιγράφεται στις Μεθόδους, υποβάλλαμε σε αγωγή πρώτα κύτταρα Du145 με αυτές τις πέντε φάρμακα σε ένα εύρος 10 συγκεντρώσεις για 2 εβδομάδες για τον προσδιορισμό των «βέλτιστη» συγκεντρώσεις υποθανατηφόρες στις οποίες τα φάρμακα ανέστειλε σημαντικά την επέκταση των καρκινικών κυττάρων, αλλά δεν σκοτώνουν το σύνολο του πληθυσμού. Χρησιμοποιώντας αυτό το χρόνιο πρωτόκολλο θεραπείας ότι μετρονομική μεταχείριση »μιμείται» στην κλινική, προσδιορίσαμε τις βέλτιστες συγκεντρώσεις, σε κύτταρα Du145, της VP16, πακλιταξέλη, STS, WP1102 και WP1103 στα 1,25 μΜ, 50 ηΜ, 7 ηΜ, 5 ηΜ, και 25 ηΜ, αντίστοιχα. Du145 κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν, συνεχώς, στο μέσο που περιέχει τα βέλτιστες συγκεντρώσεις των φαρμάκων για ~ 3 μήνες. Οι γραμμές (DTC) που προκύπτει φάρμακο-ανεκτική κυττάρων ορίστηκαν ως κύτταρα Du145-VP16, Du145-πακλιταξέλη, Du145-STS, Du145-WP1102 και WP1103 Du145-αντίστοιχα.

Για να προσδιορίσετε αν το φάρμακο-ανεκτική Du145 κύτταρα ήταν πραγματικά ανεκτικοί των αρχικών φαρμάκων επιλογής, υποβάλλαμε σε αγωγή γονικών και φάρμακο-ανεκτική κύτταρα Du145 side-by-side με τα αντίστοιχα πέντε φάρμακα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, φάρμακο-ανεκτική κύτταρα Du145 ήταν γενικά πιο ανθεκτικά από τα γονικά κύτταρα Du145 στα φάρμακα επιλογής. Έτσι, τα κύτταρα Du145-VP16 ήταν & gt? 10 φορές πιο ανθεκτικά από τα κύτταρα Du145 να Ρ16 (IC

50 τιμές είναι 0,78 μΜ για Du145 και 9,17 μΜ για τα κύτταρα Du145-Ρ16). κύτταρα Du145-πακλιταξέλη ~ 7 φορές πιο ανθεκτικά στο paclitaxel από κύτταρα Du145 (Σχ. 1, Α και C). Παρομοίως, κύτταρα Du145-WP1103 ήταν σχεδόν 30 φορές πιο ανθεκτικό σε σχέση με τα κύτταρα WP1103 Du145 (Σχ. 1Β-C). Τέλος, Du145-STS και τα κύτταρα Du145-WP1102 ήταν περίπου 1,5 και 3 φορές πιο ανθεκτικά στο STS και WP1102, αντίστοιχα, από μη επιλεγμένα κύτταρα Du145 (Σχ. 1Β-C). Ως εκ τούτου, η αντίσταση διαφορικό ναρκωτικών από τους καθιερωμένους κωδικούς DTC κατατάσσεται Du145-WP1103 & gt? Du145-Ρ16 & gt? Du145-πακλιταξέλη & gt?. Du145-STS≈Du145-WP1102

Α-Β. Η γονική φάρμακο-ανεκτικές κυτταρικές γραμμές Du145 και Du145 επιλέγονται με δύο κλινικές φάρμακα (Α) ή τρία πειραματικά φάρμακα (Β) εκτέθηκαν, side-by-side, με τις αντίστοιχες φάρμακα επιλογής (π.χ., κύτταρα Du145-VP16 να VP16 και Du145- Η πακλιταξέλη κύτταρα σε πακλιταξέλη) στις συγκεντρώσεις (μετατραπεί σε λογάριθμος) που υποδεικνύεται. Υ-άξονας αντιπροσωπεύει την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (%). Γ πινακοποιημένη παρουσιάσεις IC

50 τιμές (βλέπε Υλικά & amp? Μέθοδοι) και το αντίστοιχο 95% CI (διάστημα εμπιστοσύνης) των κυττάρων Du145 και ναρκωτικά ανεκτική κυττάρων Du145 ως απάντηση στα πέντε φάρμακα που αναφέρονται. Τιμές υπολογίστηκαν από τα δεδομένα που λαμβάνονται στην Α και Β

Η

Στη συνέχεια, εκθέσαμε τα κύτταρα Du145-VP16 με τρεις μη-επιλογή φαρμάκων, δηλαδή, η πακλιταξέλη, STS, και δοξορουβικίνη (Dox). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, τα κύτταρα Du145-VP16 ήταν πιο ανθεκτικά (από μητρικά κύτταρα Du145) στην πακλιταξέλη (~ 4 φορές), STS (1,5 φορές), και Dox (13 φορές), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι κωδικοί DTC ήταν επίσης διασταυρούμενη αντοχή με άλλα μη-επιλογή φάρμακα

κύτταρα

Du145-VP16 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πακλιταξέλη (Α), STS (Β), και δοξορουβικίνη (Dox? C). στις συγκεντρώσεις [log] υποδεικνύεται. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως% αναστολή και IC

50 (D) προσδιορίστηκαν όπως στο σχήμα 1.

Η

Χρησιμοποιώντας παρόμοιες στρατηγικές, ιδρύσαμε και ναρκωτικά ανεκτική DLD1 του παχέος εντέρου (Εικ. 3) και UC14 κύστη (δεν φαίνεται) τα καρκινικά κύτταρα. Σε κύτταρα DLD1, οι βέλτιστες συγκεντρώσεις για VP16, πακλιταξέλη, WP1102 και WP1003 προσδιορίστηκαν να είναι στα 2,5 μΜ, 100 ηΜ, 120 ηΜ, και 100 ηΜ, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, οι καθιερωμένες DLD1-VP16, DLD1-πακλιταξέλη, DLD1-WP1102 και WP1103 DLD1-κύτταρα ήταν ανθεκτικά στα αντίστοιχα φάρμακα επιλογή. Περαιτέρω, τα κύτταρα DLD1-VP16 έδειξε επίσης διασταυρούμενη αντίσταση σε πακλιταξέλη και Dox (Σχ. 3Β). UC14 κύτταρα Drug-ανεκτικές ήταν παρομοίως πιο ανθεκτικά στα φάρμακα επιλογής (δηλαδή, πακλιταξέλη, STS, VP16, Dox, WP1102 και WP1103), από ό, τι τα γονικά κύτταρα UC14 (δεν φαίνεται).

Γονική και ναρκωτικά ανεκτικές κυτταρικές γραμμές DLD1 επιλέγονται με βέλτιστες συγκεντρώσεις (βλέπε κείμενο) του VP16, πακλιταξέλη, WP1102 και WP1103, εκτέθηκαν, side-by-side, στις αντίστοιχες φάρμακα επιλογής στις συγκεντρώσεις (μετατραπεί σε λογάριθμος) έδειξε (Α). Υ-άξονας αντιπροσωπεύει την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (%). Β πινακοποιημένη παρουσιάσεις IC

50 αξίες και τα αντίστοιχα 95% CI (εμπιστοσύνη των διαστημάτων) των γονικών κυττάρων DLD1 και ναρκωτικά ανεκτική γραμμές DLD1 σε απάντηση τόσο την επιλογή και μη επιλογή φαρμάκων.

Η

Drug-ανεκτική κυττάρων Du145 ήταν εκπληκτικά λιγότερο ογκογόνο από τα γονικά κύτταρα Du145

Υποθέσαμε ότι ο ΚΒΔΕ μπορεί να διαθέτουν ιδιότητες CSC και να είναι πιο ογκογόνο in vivo. Προς μεγάλη έκπληξή μας, όλα τα κύτταρα Du145 φάρμακο με ανοχή υποδορίως (sc) με ένεση μέσα στο NOD /SCID ποντικοί έδειξαν πολύ μειωμένη ογκογενή ικανότητα σε σύγκριση με τον ίδιο αριθμό γονικών κυττάρων Du145, η οποία έδειξε μια συχνότητα ογκογενή (TIF) του ~ 1/175 (Πίνακας 1). Ένεση αύξηση του αριθμού των γονικών κυττάρων Du145, ήταν αναμενόμενο, οδήγησε σε μείωση της λανθάνουσας κατάστασης (Πίνακας 1). Σε αντίθεση, τα κύτταρα Du145-VP16 έδειξε TIF του ~ 1 /62.000 και, στα 100.000 κύτταρα εγχέονται, η λανθάνουσα κατάσταση του όγκου ήταν περισσότερο από δύο φορές όσο για τον ίδιο αριθμό κυττάρων Du145 (Πίνακας 1). Στην πραγματικότητα, και οι δύο Du145-paclitaxel και Du145-WP1103 κύτταρα ήταν μη-ογκογόνα έως 10000 (για Du145-WP1103) και 100000 (για Du145-paclitaxel) κύτταρα εμφυτεύονται (Πίνακας 1). Ακόμη και για Du145-STS και Du145-WP1102 κυττάρων, η οποία έδειξε τα χαμηλότερα IC

50 διαφορές (Εικ. 1 Β-C), μειωμένη συχνότητα εμφάνισης όγκου με TIF του 1/971 και 1 /45.787, αντίστοιχα, και μικρότερους όγκους ήταν επίσης παρατηρούμενες (Πίνακας 1).

η

για να προσδιορίσετε αν το site εμφύτευση του όγκου θα μπορούσε να έχει συνέπειες για το διαφορικό ογκογενετικότητας παρατηρείται, ιδρύσαμε GFP-tagged Du145 γονικής και ναρκωτικά ανεκτική κυττάρων Du145 και εμφυτεύεται ίσο αριθμό (δηλαδή , 500,000) κυττάρων ορθοτοπικά στο ραχιαίο προστάτη (DP) των αρσενικών ποντικών NOD /SCID. Όταν το πείραμα τερματίστηκε 75 ημέρες μετά τις ενέσεις των καρκινικών κυττάρων, παρατηρήσαμε ότι Du145-STS κύτταρα Du145-VP16 και δημιουργείται μικρότερους όγκους από ό, τι τα γονικά κύτταρα Du145 (Σχ. 4Α). Στην πραγματικότητα, και οι δύο Du145-paclitaxel και Du145-WP1103 κύτταρα ήταν μη ογκογόνων στο μοντέλο αναγέννησης όγκου DP (Σχ. 4Α). Σημαντικά, γονικά κύτταρα Du145 μετάσταση σε πολλαπλά όργανα, συμπεριλαμβανομένων των λεμφαδένων, του νεφρού, του παγκρέατος, του ήπατος, του πνεύμονα, και σπλήνας ενώ φάρμακο ανεκτική κυττάρων Du145 έλειπε προφανή μετάσταση σε οποιοδήποτε από τα όργανα αυτά (Εικόνα 4Β-C?. Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)

Α. GFP-tagged γονικής ή φάρμακο-ανεκτικές κύτταρα Du145 εμφυτεύθηκαν (500.000 κύτταρα /ένεση), σε 50% Matrigel, στην ΑΣ του NOD ποντίκια /SCID. τερματίστηκαν Όλα τα ζώα 75 ημέρες μετά την εμφύτευση. Εμφανίζονται είναι συχνότητα εμφάνισης όγκου και τα βάρη του όγκου (μέσος όρος ± Τ.Α? Στατιστικές δεν εφαρμόζεται λόγω του σχετικά μικρού αριθμού των ζώων). Π.Χ. Αντιπροσωπευτικά όγκου και όργανο εικόνες από μια ζώο που φέρει τον όγκο στην ομάδα Du145 (Β) και Du145-VP16 (C), αντίστοιχα. Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon microdissecting επιφθορισμού μικροσκόπιο σε 0,75 × και η εγκιβωτισμένη περιοχή Β (η εικόνα του πνεύμονα GFP) αντιπροσωπεύει μια διεύρυνση που δείχνει GFP

+ κηλίδες στον πνεύμονα.

Η

ναρκωτικά ανεκτική κύτταρα DLD1 παρουσίασαν επίσης μειωμένη ογκογονικότητα ενώ UC14 κύτταρα φάρμακο-ανεκτική αποδειχθεί ναρκωτικών μεταβολές που εξαρτώνται από τον όγκο έναρξη ικανότητα

για να καθοριστεί αν η μειωμένη ογκογονικότητα συνδέεται με κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο περιορίζεται μόνο στα κύτταρα Du145, έχουμε παρόμοια ένεση, sc, αύξηση του αριθμού των γονικών DLD1 και τέσσερα ναρκωτικά ανεκτική κυτταρικές σειρές DLD1 στα ποντίκια NOD /SCID. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S1, το φάρμακο-ανεκτική κύτταρα DLD1, αν και εμφανίζει παρόμοια συχνότητα εμφάνισης όγκων, αναγεννημένη σημαντικά μικρότερους όγκους συγκριτικά με γονικά κύτταρα DLD1 στους ίδιους αριθμούς κυττάρων.

Πραγματοποιήσαμε παρόμοια πειράματα όγκου περιοριστική αραίωση σε 6 κύτταρα UC14 φάρμακο που επιλέγεται (Πίνακας S2). Σε αντίθεση με Du145 και DLD1 φάρμακο κύτταρα ανεκτική, η οποία απέδειξε ομοιόμορφα μειωμένο ογκογόνο δυναμικό, 4 από τα 6 UC14 φάρμακο κύτταρα ανεκτικά (Πίνακας S2? Σκιάζεται καστανό) έδειξαν ενισχυμένη ικανότητα όγκου-αναγέννησης σε σύγκριση με τον ίδιο αριθμό γονικών κυττάρων UC14. Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο φάρμακο-ανεκτικές UC14 κυτταρικές σειρές αναγεννηθεί επίσης πολύ μικρότερους όγκους από ό, τι ο ίδιος αριθμός γονικών κυττάρων UC14 (Πίνακας S2? Σκιασμένο ροζ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι UC14 φάρμακο κύτταρα ανεκτικά είναι είτε περισσότερο ή λιγότερο ογκογόνο από τα γονικά κύτταρα, ανάλογα με τις αρχικές φάρμακα επιλογής.

Drug-ανεκτικές κύτταρα Du145 ήταν λιγότερο πολλαπλασιαστική και έδειξε χαμηλή αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης

Δεδομένου ότι ήταν αρκετά απροσδόκητο ότι ορισμένα ναρκωτικά ανεκτική καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη ικανότητα όγκου-αναγέννησης, μπορούμε στη συνέχεια επικεντρώθηκε σε κύτταρα Du145 ναρκωτικά ανεκτική στην προσπάθεια να αποκαλύψουν πιθανούς μηχανισμούς. Παρατηρήσαμε με συνέπεια ότι τα περισσότερα ναρκωτικά ανεκτική κυττάρων Du145 φάνηκε να πολλαπλασιαστούν πιο αργά σε σύγκριση με τα κύτταρα Du145. Πράγματι, σε μια προοπτική πείραμα 10 ημερών μέτρησης ζωντανά αριθμούς κυττάρων, παρατηρήσαμε ότι όλα τα ναρκωτικά ανεκτική κύτταρα Du145, εκτός κύτταρα Du145-WP1102, έδειξε αριθμούς πολύ χαμηλότερο τελικό σημείο ζωντανών κυττάρων (Εικ. 5Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι DTCs ήταν λιγότερο πολλαπλασιαστική ή /και πιο επιρρεπείς σε κυτταρικό θάνατο. Στη συνέχεια διεξάγονται πειράματα ενσωμάτωσης BrdU για να μετρηθεί άμεσα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, φάρμακο-ανεκτική κυττάρων Du145 εμφάνισαν χαμηλότερες πολλαπλασιαστικές δείκτες (δηλαδή,% BrdU

+ κύτταρα). Είναι ενδιαφέρον, ακόμη και Du145-WP1102 κύτταρα απέδειξαν χαμηλότερα πολλαπλασιασμού δείκτη (Εικ. 5Β), αν και αυτές οι καλλιέργειες έδειξαν παρόμοια συνολικό αριθμό ζωντανών κυττάρων σε γονικά κύτταρα Du145 (Εικ. 5Α). Να θυμάστε ότι τα κύτταρα Du145-WP1102 εμφανίζονται επίσης σχετικά μικρότερη μείωση της παραγωγικής ικανότητας ογκογενή σε σύγκριση με άλλα κύτταρα Du145 φάρμακο-ανεκτική (Πίνακας 1). Είναι πιθανό ότι τα κύτταρα Du145-WP1102 πολλαπλασιάστηκαν λιγότερο, αλλά είχε επίσης λιγότερο αυθόρμητες κυτταρικό θάνατο, με αποτέλεσμα παρόμοια τελικού σημείου αριθμούς ζωντανών κυττάρων (Εικ. 5Α) και λιγότερο έντονη μειώσεις στην ογκογονικότητα (Πίνακας 1). Πράγματι, παρατηρήσαμε με συνέπεια ότι τα κύτταρα Du145-WP1102, χρονίως επιλέγονται χρησιμοποιώντας 5 ηΜ WP1102 ένωση, έδειξε λιγότερο επίπλευσης και αποπτωτικών κυττάρων στις φιάλες καλλιέργειας σε σύγκριση με κύτταρα Du145-WP1103 (δεν φαίνεται), που χρονίως επιλέγεται χρησιμοποιώντας 25 ηΜ WP1103 ένωσης. Τέλος, παρατηρήσαμε ότι όλα τα κύτταρα Du145 φάρμακο ανεκτική έδειξε χαμηλότερη αποδοτικότητα κλωνοποίησης από τα γονικά κύτταρα Du145 (Εικ. 5C).

A. Ποσοτικοποίηση των αριθμών των βιώσιμων κυττάρων. Γονείς και φάρμακο-ανεκτική κύτταρα Du145 απλώθηκαν, εις τετραπλούν, σε πλάκες 12 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τη χρήση ανιχνεύσεως αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης 10 ημέρες μετά επιμετάλλωσης. Β Ποσοτικοποίηση% + κυττάρων BrdU

(βλέπε Υλικά & amp? Μέθοδοι). C. Προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης. Γονείς και φάρμακο-ανεκτική κύτταρα Du145 απλώθηκαν, εις τετραπλούν, εντός πλακών 6 φρεατίων (100 κύτταρα /φρεάτιο) με φρέσκο ​​μέσο αναπληρώνονται κάθε 3 ημέρες. Οι αριθμοί των holoclones και meroclones προσδιορίστηκαν 10 ημέρες μετά την επιμετάλλωση. Σε όλα τα δεδομένα, ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD και στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Φοιτητής

t-test

(*, Ρ & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01)

Η

. Συνεπής με μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τα ναρκωτικά ανεκτική κυττάρων Du145 έδειξαν αυξημένα επίπεδα δύο αναστολέων κινάσης κυκλίνη-εξαρτώμενες, ρ21 και ρ27, ειδικά σε Du145-πακλιταξέλη και τα κύτταρα Du145-WP1103 (Εικ. 6Α), δύο κυτταρικές σειρές που στερούνταν εντελώς ογκογονικότητας (Τραπέζι 1). Τα επίπεδα ρ27 ήταν επίσης αυξημένα σε όλες τις τρεις άλλες κυτταρικές σειρές φάρμακο-ανεκτική Du145 (Σχ. 6Α). Περιέργως, η σημαντικά αυξημένη πρωτεϊνική ζώνη ρ27 σε Du145-πακλιταξέλη και τα κύτταρα Du145-WP1103 μετανάστευσε ελαφρώς γρηγορότερα από την πρωτεΐνη σε άλλες κυτταρικές σειρές (Σχ. 6Α). Μελλοντικές μελέτες θα ξεκαθαρίσει αυτό το δυνητικά ενδιαφέρουσα παρατήρηση. Σε αντίθεση με ρ21 και ρ27, Bcl-2, αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, έδειξαν λιγότερο, αν και δραματικό μειώσεις, και πάλι, στις δύο μη ογκογόνα γραμμές Du145, δηλαδή, Du145-paclitaxel και Du145-WP1103 (Σχ. 6Α).

Α. Ολόκληρο κυτταρολύματος από τους κυτταρικούς τύπους που αναφέρονται χρησιμοποιήθηκε σε κηλίδωση Western της ρ21, ρ27, Bcl-2, και hTERT και η κηλίδωση επανελέγχθηκε για β-ακτίνη. NS, μη ειδική. B. κηλίδωση Western των CD44 και ABCG2. Η κηλίδωση επανελέγχθηκε για β-ακτίνη και GAPDH. CD. Du145 και φάρμακο-ανεκτική κύτταρα Du145 απλώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και χρωματίστηκαν για CD44 χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα. Που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά εικόνες (C) και η ποσοτικοποίηση των CD44

+ κύτταρα (D? Μέσος όρος ± SD, *, P & lt? 0,01).

Η

Drug-ανεκτική Du145 κουλτούρες επέδειξαν μειωμένη αριθμούς, ή στερούνται, CD44

+ κύτταρα

Αρκετά αποδεικτικά στοιχεία υποδηλώνουν ότι μειωμένη ικανότητα όγκου-αναγέννησης σε ναρκωτικά ανεκτική κύτταρα Du145 μπορεί να περιλαμβάνει, εκτός από την σε κίνδυνο πολλαπλασιαστικού δυναμικού ίσως προκαλούνται από αυξημένη ρ21 και ρ27, φάρμακο που προκαλείται από ανωμαλίες στα κύτταρα του όγκου-κίνηση.