Αφηρημένο

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) κύτταρα, εκφράζουν ανοσοσφαιρίνες (IGS). Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι η έκφραση της πρωτεΐνης κάπα ελαφράς αλύσου σε κύτταρα NPC μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω από την πρωτεΐνη λανθάνουσα μεμβράνη EBV-κωδικοποιημένα 1 (LMP1). Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές NPC ως πρότυπα και διαπίστωσε ότι LMP1-επαυξημένης παραγωγής κάπα αντιστοιχεί με αυξήσεις στην φωσφορυλίωση των ERKs. PD98059 εξασθενεί LMP1 επαγόμενη φωσφορυλίωση ERKs αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση της ελαφράς αλύσου κ. ERK-ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο RNA αμβλύνει LMP1 που προκαλείται

κάπα ελαφριά έκφραση του γονιδίου αλυσίδας

. Λουσιφεράσης δημοσιογράφος αποδείξει ότι ανοσοσφαιρίνη

κ

3 ‘ενισχυτή (3’Ε

κ) δραστηριοποιείται στην Ιακ-κύτταρα που εκφράζουν NPC και LMP1 ρυθμίζει προς τα πάνω την δραστηριότητα της 3’Ε

κ στα κύτταρα NPC. Επιπλέον, η ανάλυση μετάλλαξης της θέσης σύνδεσης PU σε 3’Ε

κ και αναστολή της οδού ΜΕΚ /ΕΚΚ από PD98059 δείχνουν ότι ο χώρος PU είναι λειτουργική και LMP1 ενισχυμένη 3’Ε

δραστικότητα κ ρυθμίζεται εν μέρει από αυτό το μέρος. θεραπεία PD98059 οδηγεί επίσης σε μια εξαρτώμενη από την συγκέντρωση αναστολή της επαγόμενης LMP1 Ets-1 έκφραση και η φωσφορυλίωση, η οποία αντιστοιχεί με εξαρτώμενο από τη δόση εξασθένιση της ERK φωσφορυλίωσης LMP1 επαγόμενη έκφραση και κάπα ελαφράς αλύσου. Η καταστολή της ενδογενούς

Ets-1 από

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA συνοδεύεται από μία μείωση της έκφρασης ελαφριάς αλυσίδας Ig κάππα. δοκιμασίες μετατόπισης πηκτής χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων NPC δείχνουν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-1 στρατολογείται από LMP1 στο μοτίβο PU μέσα 3’Ε

κ

in vitro

. δοκιμασίες ChIP καταδεικνύουν περαιτέρω Ets-1 σύνδεση με το μοτίβο PU της 3’Ε

κ στα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι LMP1 απορυθμίζει 3’Ε

δραστικότητα κ και

κάππα

έκφραση γονιδίων με την ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής Ets-1 μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης ERKs. Οι μελέτες μας παρέχουν αποδείξεις για ένα νέο ρυθμιστικό μηχανισμό της έκφρασης κάπα, με την οποία οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από ιό ενεργοποιούν το

κάππα

βελτιωτή 3 ‘μέσω ενεργοποίησης παραγόντων μεταγραφής σε μη-Β επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα.

Citation : Liu H, Duan Ζ, Zheng Η, Χου D, Λι Μ, Tao Y, et al. (2012) EBV-κωδικοποιημένο LMP1 ρυθμίζει προς τα πάνω Ig

κ

3’Enhancer Δραστηριότητα και Ig

κ

έκφραση στα κύτταρα του καρκίνου ρινοφαρυγγικής με την ενεργοποίηση του Ets-1 μέσω ERKs Σηματοδοσίας. PLoS ONE 7 (3): e32624. doi: 10.1371 /journal.pone.0032624

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27, Ιουλίου του 2011? Αποδεκτές: 1η Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 1 Μαρτίου, 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Δημόσιο Κλειδί σχέδιο Βασική Έρευνα και την Ανάπτυξη (973) του Υπουργείου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (Αρ 2004CB518703), Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και του Προγράμματος Ανάπτυξης (863) της Κίνας (Αρ 2006AA 02A 404) και το Εθνικό Ίδρυμα φύση Επιστημών της Κίνας (Νο 30471968, Αρ 30973399). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο περιορισμός της ανοσοσφαιρίνης (Ig) έκφραση σε κύτταρα της Β-κυτταρικής γραμμής είναι καλά εδραιωμένη. Ωστόσο, βρήκαμε Ig κάππα ελαφριάς αλυσίδας «απροσδόκητα» εκφράζεται σε επιθηλιακά καρκινικές κυτταρικές γραμμές και επιθηλιακών ιστών [1], [2], [3]. Η έκφραση του Ig κάπα ελαφράς αλύσου σε μη αιμοποιητικά καρκινικές κυτταρικές σειρές ήταν επίσης αναφέρθηκε από άλλα εργαστήρια [4], [5], [6], [7].

Ανοσοσφαιρίνη

κάππα ελαφριάς αλυσίδας

γονιδιακή έκφραση είναι υπό τον έλεγχο των διακριτών cis-ρυθμιστικά στοιχεία, συμπεριλαμβανομένων των υποκινητών και ενισχυτές. Δύο σημαντικές

ενισχυτές κάπα

: η εσονικές ενισχυτή (δηλαδή

κ), το οποίο βρίσκεται μεταξύ του J

κ-C

κ περιοχής, και το βελτιωτή 3 ‘(3’Ε

κ), το οποίο βρίσκεται κατάντη του C

κ περιοχής, έχουν ταυτοποιηθεί [8], [9], [10]. Αμφότεροι οι ενισχυτές είναι αδρανείς στα στάδια προ-Β και προ-Β κυττάρων και ενεργός στα Ιακ εκφράζουν ώριμων Β κυττάρων και των κυττάρων του πλάσματος στάδια [10], [11]. Η δράση αυτών των ενισχυτών είναι γενικά μεταγραφικώς σιωπηλό σε άλλα κύτταρα τα οποία δεν μπορούν να παράγουν την αλυσίδα κάππα, όπως Τ-λεμφοειδή κύτταρα (Jurkat) [10], επιθηλιακά κύτταρα (HeLa) [10] και ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες [12]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, η ενεργοποίηση αυτών των ρυθμιστικών στοιχείων γενικά πιστεύεται ότι απαιτείται για

κάππα ανοσοσφαιρίνης γονιδιακή έκφραση

και είναι ένα κύτταρο Β γράμμωσης-περιορισμένο περίπτωση [10]. Περιέργως, έχουμε βρει ότι τα ανθρώπινα π.χ.

κ είναι ενεργή σε Ιακ εκφράζουν ρινοφαρυγγικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (NPC), η οποία είναι σημαντική για την έκφραση της αλυσίδας κάππα φωτός σε αυτά τα κύτταρα [13]. Ωστόσο, αν οι άλλες

κάπα

ενισχυτή, 3’Ε

κ, είναι λειτουργική σε Ιακ εκφράζουν επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα παραμένει άγνωστος.

Πρωτεΐνες δέσμευσης

Η λειτουργία των ενισχυτών διαμεσολαβείται από το DNA που είναι προσλαμβάνονται στα ρυθμιστικά στοιχεία των ενισχυτών. Αρκετές θετικά ρυθμιστικά στοιχεία έχουν ταυτοποιηθεί σε 3’Ε

κ, συμπεριλαμβανομένης μιας συναίνεσης PU μοτίβο (TTTGGGGAA) για τον παράγοντα μεταγραφής Ets σχετίζονται πρωτεΐνες [10]. Η οικογένεια Ets περιλαμβάνει διάφορα υπο-οικογένειες, συμπεριλαμβανομένων ETS (ETS-1, Ets-2), TCF (Elk-1, Sap-1, κλπ), και SPI (PU.1, Spi-Β, SPI-C κ.λ.π.) . Τα μέλη της οικογένειας έχουν ταυτοποιηθεί με βάση των δομικών τους σύνθεση και τις ομοιότητες τους στις εξελικτικά διατηρημένες περιοχές Ets που μεσολαβούν στη δέσμευση σε αλληλουχίες DNA είναι πλούσιες σε πουρίνες με έναν κεντρικό GGAA /πυρήνα συναίνεση T [14], [15]. οικογένεια πρωτεϊνών Ets είναι πυρηνικές πρωτεΐνες και φωσφορυλίωση είναι ένας σημαντικός μετα-μεταφραστική τροποποίηση των πολλών μελών της οικογένειας Ets, η οποία μπορεί να επηρεάσει τις δραστηριότητες τους μεταγραφικές και δραστηριότητες δέσμευσης DNA [15]. Στο Β κύτταρα, η δέσμευση της πρωτεΐνης PU.1 να βελτιωτή κάπα 3 ‘διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην 3’Ε

λειτουργία κ [16]. Η φωσφορυλίωση του PU.1 σε Ser148 απαιτείται για την αλληλεπίδραση των PU.1 με Pip στο DNA και αυτή η φωσφορυλίωση μπορεί να ρυθμίσει τη μεταγραφική δραστηριότητα των PU.1 [17]. Ωστόσο, η πρωτεΐνη PU.1 εκφράζεται αποκλειστικά στα αιμοποιητικά κύτταρα [15], [18] και είναι απίθανο να εκτελέσει ρυθμιστική λειτουργία σε Ιακ εκφράζουν επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Πρόσφατη μελέτη με τη χρήση ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης σε συνδυασμό με μικροσυστοιχίες υποκινητή γονιδίωμα-ευρεία ερώτημα για την πληρότητα των τριών πρωτεϊνών ETS σε ένα ανθρώπινο Τ-κυτταρική γραμμή, αποκάλυψε ότι απολύονται πληρότητα ήταν συχνά ανιχνεύεται, ενώ οι ειδικές πληρότητα ήταν λιγότερο πιθανό [19]. Έτσι, μπορούμε να υποθέσουμε ότι, εάν 3’Ε

κ είναι πράγματι λειτουργικό σε Ιακ εκφράζουν επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας Ets είναι πιο πιθανό να παίζουν ρόλο στην 3’Ε

κ δραστηριότητα από PU.1 . Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να διερευνήσει περαιτέρω αυτό που παράγοντα (ες) της μεταγραφής συνδέεται με την θέση πρόσδεσης PU της 3’Ε

κ και αν η δέσμευση είναι σημαντική για 3’Ε

κ λειτουργική ενεργοποίηση Ig κάπα εκφράζουν επιθηλιακά τα καρκινικά κύτταρα.

προηγούμενο μελέτη μας έδειξε ότι η

γονίδιο κάππα ελαφριάς αλυσίδας

εκφράστηκε σε NPC και άλλα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Πιο ενδιαφέρον είναι, βρήκαμε ότι τα επίπεδα της ελαφριάς αλυσίδας κάπα ήταν σημαντικά υψηλότερη στην LMP1-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με LMP1-αρνητικά κύτταρα [2]. Λόγω της μεταμόρφωσης της και ογκογόνων δραστηριότητες, LMP1 θεωρείται ότι είναι μια σημαντική ογκογόνο πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από EBV. LMP1 μεσολαβεί μία ποικιλία οδών κυτταρικής σηματοδότησης περιλαμβανομένων ΝΡ-κΒ, c-Jun-ΝΗ

2-τερματικό κινασών (JNKs), p38 /ΜΑΡΚ, ΡΙ3Κ /Akt και JAK /STAT και προκαλεί μεταγραφική αυξορρύθμιση διαφόρων κυτταρικών γονιδίων, όπως ως

IL-6, IL-8, bcl-2, CD23, Α20

και

EGFR

[20], [21], [22]. LMP1 μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει τον /ERK /MAPK μονοπατιού σηματοδότησης Ras [23], και το Ras /MAPK κινάσες σηματοδότησης, Raf, ΜΕΚ και ΕΚΚ, ενεργοποιούνται σε ρινοφαρυγγικής επιθηλιακά κύτταρα LMP1 εκφράζουν [24]. Επιπλέον, Κιμ [25] ανέφερε ότι η σταθερή επιμόλυνση του

LMP1

γονιδίου σε κύτταρα MDCK που επάγεται η έκφραση του ETS-1, γεγονός που υποδηλώνει ότι

Ets

θα μπορούσε να είναι ένα γονίδιο στόχος της LMP1. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, Ets-1 και Ets-2 είναι υπο-οικογένεια μέλη του ETS-σχετικών πρωτεϊνών. Και οι δύο είναι πυρηνικής στόχοι της Ras οδού και φωσφορυλίωση διατηρημένων θρεονίνης, Thr38 και Thr72-σηματοδότησης, είναι ένα αναγκαίο μοριακό γεγονός για Ras-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση αυτών των μεταγραφικών παραγόντων [26]. Σωρευτικά, ένα LMP1 /ERK /ETS /κάπα καταρράκτη σηματοδότησης μπορεί να υπάρχουν με την οποία LMP1 απορυθμίζει την έκφραση της ελαφριάς αλυσίδας κάπα στα κύτταρα NPC.

Στην παρούσα μελέτη, ο αναστολέας ΜΕΚ, PD98059, χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει το ρόλο της η οδός ΕΚΚ στο LMP1-ενισχυμένη κάπα παραγωγή ελαφριάς αλυσίδας σε κύτταρα NPC. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι LMP1-επαυξημένης παραγωγής κάπα αντιστοιχεί με αυξήσεις στην φωσφορυλίωση των ERKs. PD98059 αναστέλλει LMP1 επαγόμενη φωσφορυλίωση ERKs αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση της ελαφράς αλύσου κ. ERK-ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο RNA αμβλύνει LMP1 που προκαλείται

κάπα ελαφριά έκφραση του γονιδίου αλυσίδας

. Λουσιφεράσης δημοσιογράφος αποδείξει ότι 3’Ε

κ δραστηριοποιείται στο Ιακ-κύτταρα που εκφράζουν NPC και σταθερή έκφραση LMP1 ρυθμίζει προς τα πάνω την δραστηριότητα της 3’Ε

κ στα κύτταρα NPC. Οι μεταλλάξεις της θέσης δέσμευσης PU για 3’Ε

Κ μειώσει σημαντικά LMP1-ενισχυμένη 3’Ε

κ δραστηριότητα. LMP1 επαγόμενη 3’Ε

δραστικότητα κ δραματικά αναστέλλεται από τον αναστολέα κινάσης ανάντη ERKs, PD98059. Θεραπεία της PD98059 οδηγεί επίσης σε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της LMP1 επαγόμενης Ets-1 έκφραση και η φωσφορυλίωση, η οποία αντιστοιχεί με εξαρτώμενο από τη δόση εξασθένιση της ERK φωσφορυλίωσης LMP1 επαγόμενη έκφραση και κάπα ελαφράς αλύσου. Η knockdown του ενδογενούς

Ets-1 από

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA συνοδεύεται από μία μείωση της έκφρασης ελαφριάς αλυσίδας Ig κάππα. δοκιμασίες μετατόπισης πηκτώματος με τη χρήση πυρηνικών εκχυλισμάτων που παρασκευάζονται από διάφορες κυτταρικές σειρές NPC επιβεβαιώνουν ότι ο παράγοντας μεταγραφής Ets-1 στρατολογείται από LMP1 στο μοτίβο PU του ανθρώπινου

κάππα ελαφριάς αλυσίδας

γονίδιο. δοκιμασίες ChIP αποδεικνύουν επίσης ότι Ets-1 συνδέεται άμεσα με το μοτίβο PU της 3’Ε

κ στα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι LMP1 απορυθμίζει 3’Ε

δραστικότητα κ και

κάππα ελαφριάς αλυσίδας

γονιδιακή έκφραση με την ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής Ets-1 μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης ERKs.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές και κυτταρικής καλλιέργειας

HNE2 είναι ένα EBV-LMP1-αρνητική ανθρώπινη κυτταρική σειρά NPC. HNE2-LMP1 είναι μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει συστατικά LMP1 μετά την εισαγωγή της πλήρους μήκους

LMP1

cDNA σε HNE2 κύτταρα [27]. Η ανθρώπινη κυτταρικές γραμμές μυελώματος, XG6, η οποία εκφράζει την κυτταροπλασματική φως λ αλυσίδα, και XG7 που εκφράζει την κυτταροπλασματική φως κ αλυσίδα [28], χρησιμοποιήθηκαν ως κάππα αλυσίδα αρνητικός και θετικός έλεγχος, αντίστοιχα. Raji είναι ένα Β-κύτταρο ανθρώπινου λεμφώματος κυτταρική γραμμή Burkitt. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI1640 (GIBCO, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS (GIBCO, USA), 1% γλουταμίνη, και 1% αντιβιοτικά σε 37 ° C υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Για τα κύτταρα XG6 και XG7, 1 ng /ml rIL-6 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκε σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο όπως περιγράφεται παραπάνω [28]. Κύτταρα σε φάση λογαριθμικής ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα.

Χημικά και κύτταρα θεραπείες

Ο ανάντη αναστολέα ΜΕΚ κινάσης ERKs, PD98059 (Cell Signaling, USA), παρασκευάζεται όπως και ένα απόθεμα διαλύματος 20 mM σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma). Υποσυρρέοντα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ένωση σε διάφορες συγκεντρώσεις για διαφορετικούς χρόνους. Οι λεπτομερείς διαδικασίες επεξεργασίας που περιγράφονται στο Σχήμα Legends. Η τελική συγκέντρωση του DMSO στο μέσο καλλιέργειας διατηρήθηκε σε λιγότερο από 0,1%, η οποία δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων. χειριστήρια του οχήματος ήταν προετοιμασμένοι για όλες τις θεραπείες.

πλασμίδια

Το ανθρώπινο

β-σφαιρίνης

υποστηρικτής ήταν 128 bp ελάχιστο υποκινητή πανομοιότυπη με εκείνη που χρησιμοποιείται στο παρελθόν [29]. Ο υποκινητής ελήφθη με ενίσχυση από ανθρώπινο HNE2 κυτταρικό γενωμικού DNA με τους ακόλουθους εκκινητές: αίσθηση, 5 ‘-

GAGCTC

acggctgtcatcacttagacctcac-3′, το οποίο περιέχει το

Sac Ι του

κλωνοποίησης site? αντίθετης φοράς, 5 ‘-

AAGCTT

taagcaatagatggctctgccctgac-3′, το οποίο περιέχει το

Hind III Ιστοσελίδα. Το θραύσμα εισήχθη εντός του

Sac I /Hind III

θέσεις του

pGL3-Basic

φορέα (Promega, Madison, WI) και το πλασμίδιο ορίστηκε ως

pGL3-β

.

Ένα τμήμα 313 bp που περιέχει το ανθρώπινο 3’Ε

πυρήνα ενισχυτή κ και 90 bp ανοδικά από τις βασικές ενισχυτή ακολουθίες [10], [30], [31] κλωνοποιήθηκε. Η 3’Ε

θραύσμα ενισχυτή κ ενισχύθηκε από HNE2 κυτταρικό γονιδιωματικό DNA με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές από τον ανθρώπινο

γονίδιο Ig κάππα

(GenBank αριθμός πρόσβασης Νο NG_000834.): Με νόημα, 5 ‘-

GGATCC

cctcttggtaccccagcata-3 ‘, το οποίο περιέχει μια τεχνητή

ΒθπίΗΙ ιστοσελίδα? αντίθετης φοράς, 5′-

GTCGAC

ctgaaagggtgtggagtgct-3 ‘, το οποίο περιέχει μια τεχνητή

Sal Ι Ιστοσελίδα. Τα ενισχυμένα με PCR θραύσματα στη συνέχεια υπέστησαν πέψη με

BamH I /Sal Ι

και εισάγεται στις αντίστοιχες θέσεις περιορισμού του

pGL3-β

πλασμίδιο που περιγράφεται παραπάνω για την παραγωγή

Ρβ-3 ‘ E

κwt

. Τα προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν με το μέγεθος τους, όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση και με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Το μοτίβο μεταλλαγμένο PU (ορίζεται ως

Ρβ-3’Ε

κmt

) από

Ρβ-3’Ε

κwt

παρήχθη με PCR βασίζεται σε μια τεχνική επέκτασης επικάλυψης [ ,,,0],32]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή μεταλλάξεων ήταν: προς τα εμπρός, 5′-accctttgggcccctgaaaacagaacc-3 ‘? αντίστροφη, 5’-ttttcaggggcccaaagggtcttctcc-3 ‘. Τα ενισχυμένα με PCR θραύσματα που φέρουν τις επιθυμητές μεταλλάξεις στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν εντός του

BamH I /Sal Ι

θέσεις του

pGL3-β

πλασμίδιο. Οι αναμενόμενες μεταλλάξεις και η ακεραιότητα του ενισχυτή επιβεβαιώθηκε με αυτοματοποιημένη αλληλούχιση χρησιμοποιώντας ένα sequencer Applied Biosystems και του λογισμικού (Foster City, CA).

Κύτταρα

παρεμβολή RNA

HNE2-LMP1 αναπτύχθηκαν σε 6 -Καλά πλάκες και επιμολυσμένα με ERK-ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο ολιγονουκλεοτιδίων RNA (si-ΕΚΚ? Cat όχι: # 6560? 100 pmol? Cell Signaling) ή ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια (si-ομελέτα? Cat όχι: # 6568? 100 pmol? Cell Signaling )? Ένα σύστημα ETS-1-ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο ολιγονουκλεοτιδίων RNA (si-Ets-1? Cat no: SC-29309? 150 pmol? Santa Cruz) ή ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια (si-ομελέτα? Cat no: SC-37007? 150 pmol? Σάντα Κρουζ ) χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA) για 72 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να επιβεβαιώσετε ERK ή Ets-1 νοκ ντάουν, κύτταρα επιμολυσμένα με si-ERK, si-Ets-1, ή ομελέτα ολιγονουκλεοτιδίων συλλέχθηκαν για εκχύλιση πρωτεϊνών και ανοσοαποτύπωση.

δοκιμασίες λουσιφεράσης δημοσιογράφος

Το

pGL3-β, Ρβ-3’Ε

κwt

και

Ρβ-3’Ε

κmt

λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλασμίδια ανταποκριτές που περιγράφεται ανωτέρω χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με τον έλεγχο

pGL3-Basic

φορέα (Promega) και το πλασμίδιο εσωτερικού ελέγχου

pRL-SV40

(Promega). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 ανά φρεάτιο νύχτα και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με τον ενδεικνυόμενο πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε διαμόλυνσης περιείχε 800 ng /φρεάτιο του πυγολαμπίδας πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης και 80 ng /πηγάδι του εσωτερικού ελέγχου

pRL-SV40

πλασμίδιο. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 50 μΜ PD98059 ή 0,1% DMSO για 12 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 36 ώρες μετά την επιμόλυνση και τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για πυγολαμπίδας και

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter Assay Kit (Promega) με ένα φωτόμετρο GloMax 20/20 (Promega) . Οι λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές συν-επιμολύνθηκαν με το

pRL-SV40

φορέα για τη διόρθωση για μεταβολές στην αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επαγωγή φορές σε σύγκριση με το

pGL3-Basic

φορέα. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν εις τριπλούν για κάθε πειραματικό κατασκεύασμα.

αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Υποσυρρέουσες HNE2 και HNE2-LMP1 κύτταρα κατεργάστηκαν ή όχι επεξεργασία με 50 μΜ PD98059 για 12 hr. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων XG6, XG7 ή κυτταρικές γραμμές Raji ως μάρτυρες, χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA διαλύθηκε σε 20 μΙ επεξεργασμένου με DEPC ύδατος και ποσοτικοποιείται στα 260 nm. Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε αντίστροφα με SuperScript ™ IIRT (Invitrogen) στους 42 ° C για 50 λεπτά, και το προκύπτον cDNA υποβλήθηκε σε PCR. Για

κάππα ελαφριάς αλυσίδας

RT-PCR, προκειμένου να προσδιοριστεί ο βέλτιστος αριθμός κύκλου PCR, μια σταθερή ποσότητα cDNA εισόδου χρησιμοποιήθηκε σε αντιδράσεις PCR, ο αριθμός κύκλος κυμαινόταν μεταξύ 25 και 40 (25, 28, 32, 36, 38, 40) και το προϊόν της PCR του 36 κύκλους έδειξε μια καλή ανιχνεύσιμο σήμα και ήταν στην γραμμική περιοχή. Οι συνθήκες των κύκλων για το

ανθρώπινη κάππα ελαφριάς αλυσίδας

(GenBank αριθμός πρόσβασης Νο AJ010442.) Ή για

ακτίνη

: 94 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 36 κύκλους των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 50 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση για 10 λεπτά στους 72 ° C. θερμοκυκλικές συνθήκες PCR για τα μέλη της οικογένειας Ets, LMP1 και GAPDH είναι 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 32 κύκλους των 95 ° C για 30 sec, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 40 δευτερόλεπτα, και επέκταση για 10 λεπτά στους 72 ° C. Για ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR), iTaq SYBR Green Supermix με Rox χρησιμοποιήθηκε με τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων (Cat ηο 172 έως 5850, Bio-Rad..): 95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από 60 ° C για 1 λεπτό σε ένα ΑΒΙ Prism 7500 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο συγκριτικής CT (ΔΔCT) μετά την κανονικοποίηση προς την έκφραση GAPDH. Οι αλληλουχίες εκκινητών για την ενίσχυση του Ig κάππα ελαφριάς αλυσίδας, τα μέλη της οικογένειας Ets [33], LMP1 [34] και των εσωτερικών ελέγχων παρατίθενται στον Πίνακα S1. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 1,5-2% και οπτικοποιήθηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο.

Protein

εκχύλιση

λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν ουσιαστικά σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [2]. Για τις αναλύσεις μετατόπισης κινητικότητας ηλεκτροφόρησης (EMSAs), πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Extraction Kit (Cat. Νο. 78833, Pierce, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Δοκιμής το BCA (Cat. Νο. 23228, Pierce).

Western ανάλυση κηλίδος

Πρωτεΐνες (50 έως 100 μg) υπέστησαν ζέση σε ρυθμιστικό δείγματος SDS για 5 λεπτά , διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Millipore, USA). Η μη ειδική αντιδραστικότητα μπλοκαρίστηκε με επώαση της μεμβράνης επί 30 λεπτά σε ένα ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween-20 και 10% άπαχο γάλα σε σκόνη. Η μεμβράνη επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με διάφορες πρωτογενή αντισώματα, και ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου ποντικού ή κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (Santa Cruz, USA), και στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές για 10 λεπτά κάθε με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween-20. Οι πρωτεΐνες αντισώματος-δεσμευμένο ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Cat. Νο. 34075, Pierce) ακολουθείται από έκθεση σε φιλμ αυτοραδιογραφίας. Μετά σχολαστικά για φωσφορυλιωμένο ERKs ή φωσφορυλιωμένη Ets-1 για να εξετάσει ERKs κατάσταση ενεργοποίησης ή το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης Ets-1, οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν με επώαση στους 50 ° C για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό απογύμνωσης (100 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 2% (κ.β. /νοί) δωδεκυλοθειικό νάτριο και 62.5 mM Tris-HCl ρΗ 6.8) και ξαναϊχνηθετούνται με αντι-ERK ή αντι-Ets-1. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για κηλίδωση Western: αντι-LMP1 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (CS.1-4, ϋΑΚΟ, Denmark), αντι-ανθρώπινη αλυσίδα αντισώματος κάπα ελαφράς κουνελιού (A0191, ϋΑΚΟ), Ets-1 (sc-350), φωσφορυλιωμένη θρεονίνης (sc-5267), ERK (sc-93), φωσφορυλιωμένη ERK (sc-7383), και α-τουμπουλίνης (sc-5286) (όλα από Santa Cruz).

ανοσοκατακρήμνισης

λύματα ολόκληρων κυττάρων (200 μα) αναμίχθηκαν με σφαιρίδια πρωτεΐνης A-Sepharose (Sigma), επωάζονται στους 4 ° C για 2 ώρες, και φυγοκεντρήθηκε για 2 λεπτά στις 2000 rpm για προδιαύγαση. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο κλάσμα επωάστηκε στους 4 ° C όλη τη νύκτα με 4 μα ενός Ets-1 σφαιρίδια αντίσωμα και πρωτεΐνη Α-Sepharose, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στις 12.000 rpm. Τα ανοσοϊζήματα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμιστικό ΡΑΡΙ (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, που περιέχει 1% ΝΡ-40, 0,05% SDS, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, και αναστολείς πρωτεάσης). Τα ιζήματα εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-Sepharose με βρασμό για 5 λεπτά και τελικά υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα για την ανίχνευση φωσφορυλίωσης θρεονίνης.

δοκιμασίες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας

μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας δοκιμασίες (EMSAs) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την LightShift ™ χημιφωταύγειας EMSA Kit (Cat. Νο. 20148, Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης σε πυρηνικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την BCA αντιδραστηρίου ανάλυσης πρωτεΐνης (Cat. Νο 23228, Pierce) και EMSAs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας δείγματα που περιέχουν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης. Τα μίγματα αντίδρασης (20 μΐ) που περιέχει πυρηνικά εκχυλίσματα (8 μg) επωάστηκαν με βιοτίνη σημασμένο δίκλωνο ανιχνευτές ολιγονουκλεοτιδίου (2 ηΜ) σε ρυθμιστικό αντίδρασης (Pierce) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αντιδράσεις υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 5% σε 0.5 χ Τρις-βορικού-αιθυλενοδιαμίνη τετρα-οξικό οξύ (ΤΒΕ) ρυθμιστικό διάλυμα που ακολουθείται από ηλεκτροκηλίδωση πάνω σε Biodyne ™ Β νάυλον μεμβράνες (Cat. Νο. 77016, Pierce) και υν εγκάρσια σύνδεση . Βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια στη συνέχεια ανιχνεύονται με ανίχνευση με στρεπταβιδίνη συζευγμένη σε HRP και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL και αυτοραδιογραφία. Για τις αναλύσεις ανταγωνισμού, 100-πλάσια περίσσεια του αντίστοιχου μη επισημασμένου ολιγο άγριου τύπου ή του μεταλλαγμένου ολίγο είχε συμπεριληφθεί στην αντίδραση σύνδεσης. Για πειράματα υπερμετατόπισης αντισώματος, τα μείγματα αντίδρασης προεπωάστηκαν με 2 μα ενός αντισώματος Ets-1 (SC-350Χ, Santa Cruz) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές ή ανταγωνιστές είναι ως ακολούθως: το αγρίου τύπου ανθρώπινο κPU ολιγονουκλεοτίδια, 5′-gaagaccctttggggaactgaaaacaga-3 ‘και 5′-tctgttttcagttccccaaagggtcttc-3’, που προέρχεται από την αλληλουχία της θέσης PU μέσα στο ανθρώπινο 3’Ε

κ. Οι μεταλλαγμένες ολιγονουκλεοτίδια κPU (ορίζεται ως mutPU) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-gaagaccctttgggcccctgaaaacaga-3 ‘και 5′-tctgttttcaggggcccaaagggtcttc-3’. Οι μη-ειδικές ανταγωνιστικών ιχνηλατών ήταν 5′-ccagagggggatttccaagaggcca-3 ‘και 5′-tggcctcttggaaatccccctctgg-3’, οι οποίες προήλθαν από την αλληλουχία της θέσης ΝΡ-κΒ μέσα στο ανθρώπινο π.χ.

κ. Οι δεσμευτικές περιοχές είναι υπογραμμισμένες και οι μεταλλάξεις φαίνονται με έντονους χαρακτήρες. Οι μεταλλαγμένες ανιχνευτές ολίγο έναντι της θέσης πρόσδεσης κPU για EMSAs είναι πανομοιότυπες με εκείνες των μεταλλαγμένων αλληλουχιών στα κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

ανάλυση ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα τσιπ Assay kit (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, ένα διάλυμα φορμαλδεΰδης προστέθηκε απευθείας στα κύτταρα HNE2-LMP1 σε μια τελική συγκέντρωση 1% και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εξουδετερώθηκαν για 5 λεπτά με γλυκίνη σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε δύο φορές με 1 χ αναστολείς πρωτεάσης αλατούχο διάλυμα που περιέχει παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Τα κύτταρα διασπάστηκαν χρησιμοποιώντας SDS ρυθμιστικό λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Χρωματίνης στο προϊόν λύσης (350 μΙ) ψαλιδισμένα σε μέσο μήκος των -500 bp με επεξεργασία με υπερήχους με ένα Branson Sonifier διάρρηξης κυττάρων Β15 (έλεγχος εξόδου 4, κύκλος 40%), με 14 κύκλους παλμών 20 δευτερολέπτων στους 20 sec χρονικά διαστήματα. Το εναιώρημα προκαταρκτική διαύγαση σε DNA σπέρματος σολομού πρωτεΐνη Α /αγαρόζη-50% πολτού /για 1 ώρα στους 4 ° C. Αφού η χρωματίνη ήταν «προδιαυγασθέντος», ένα μικρό κλάσμα (10 μΐ) φυλάχθηκε ως «DNA εισόδου» για την ανάλυση PCR αργότερα. Τα υπόλοιπα δείγματα (100 μΐ καθένα) από κουρεύεται σταυροδεσμούς χρωματίνης επωάστηκαν όλη τη νύκτα με 2 μg Ets-1 (sc-350Χ), IgG κουνελιού (SC-2027) (Santa Cruz), ή χωρίς αντίσωμα στους 4 ° C με ήπια κλονισμός. Τα ανοσοσύμπλοκα επωάστηκαν για 2 ώρες στους 4 ° C σε ένα DNA σπέρματος σολωμού /πρωτεΐνη Α /αγαρόζη-50% πολτό με ήπια ανακίνηση, πλύθηκε και εκλούστηκε. Cross-linking αντιστράφηκε χρησιμοποιώντας 5 Μ NaCl. Μετά πέψη με πρωτεϊνάση Κ, το DNA στα δείγματα εκχυλίζεται με φαινόλη, καταβυθίζεται με αιθανόλη, και επαναιωρήθηκε σε 50 μΙ DDH

2O. Το διάλυμα DNA (2 μΙ) χρησιμοποιήθηκε για 36 κύκλους ενίσχυσης PCR. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμασίες Chip:. Ανθρώπινη 3’Ε

ενισχυτή κ συμπεριλαμβανομένης της περιοχής PU-δέσμευσης, 5′- ccagggaccaagatagcaac -3 ‘και 5′-ctgaaagggtgtggagtgct -3’ (158 bp)

η στατιστική ανάλυση

Όλοι οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS (v. 12.0) στατιστικό πρόγραμμα λογισμικού. Οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων ομάδων αξιολογήθηκαν από

t

test του Student. Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική όταν

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

LMP1 ενισχύει την έκφραση ελαφριάς αλυσίδας κάπα μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης ΕΚΚ στα ανθρώπινα κύτταρα NPC

LMP1 να ενεργοποιήσετε την /ERK /MAPK μονοπατιού σηματοδότησης Ras [23] και η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι LMP1 απορυθμίζει την έκφραση ελαφριάς αλυσίδας κάπα σε κυτταρικές σειρές NPC [2]. Για να επιβεβαιώσει εάν ERKs οδός είναι συμμετέχουν στην έκφραση ελαφριάς αλυσίδας κάπα LMP1-επαυξημένη, PD98059 χρησιμοποιήθηκε για να χειραγωγήσουν την ενεργοποίηση ERKs και προς τα πάνω ρύθμιση κάπα αλυσίδας που προκαλείται από LMP1. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ERK ήταν υψηλότερη σε κύτταρα HNE2-LMP1 παρά σε κύτταρα HNE2, η οποία κατέδειξε ότι LMP1 ενεργοποιεί πράγματι το μονοπάτι ERK σε κύτταρα NPC (Σχήμα 1Α). Θεραπεία της HNE2-LMP1 κυττάρων με PD98059 οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη καταστολή της επαγόμενης LMP1 κάππα ελαφριάς αλυσίδας (Εικόνα 1Β), οι οποίες αντιστοιχούσαν με εξαρτώμενο από τη δόση εξασθένιση της φωσφορυλίωσης ERK που επάγεται από LMP1 (Σχήμα 1Α). PD98059 (50 μΜ) έδειξαν σαφώς μια ανασταλτική δράση επί των κυττάρων HNE2-LMP1, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί των κυττάρων HNE2 (Σχήμα 1 C). Για να προσδιοριστεί εάν η αναστολή της έκφρασης kappa Ig δια κατεργασίας PD98059 παρουσιάζεται στο μεταγραφικό επίπεδο, HNE2 και HNE2-LMP1 κύτταρα διατηρήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες και τα επίπεδα του

κάππα ελαφριάς αλυσίδας

mRNA εξετάστηκαν με RT -PCR. Η θεραπεία με PD98059 (50 μΜ) προκάλεσε μια αξιοσημείωτη μείωση στο

κάπα

έκφραση του mRNA LMP1 που προκαλείται, αλλά το

κάπα

επίπεδο mRNA σε HNE2 παρέμεινε ουσιαστικά αμετάβλητη (Σχήμα 1D), η οποία συμφωνεί με το αποτελέσματα ανοσοστύπωσης. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η οδός ΕΚΚ παίζει ρόλο στην LMP1 που προκαλείται

γονιδιακής έκφρασης ελαφριάς αλυσίδας κάπα

, εμείς γκρέμισε

ERK

έκφραση με παρεμβολή RNA. Ότι επιμόλυνση των κυττάρων HNE2-LMP1 με ένα κωδικοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο δεν επηρέασε LMP1 επαγόμενη

έκφραση κάππα

γονιδίου,

si-ΕΚΚ

αμβλύνθηκε την επίδραση της LMP1 (Σχήμα 1 Ε), υποδεικνύοντας ότι η ERK μονοπάτι εμπλέκεται σε αυτή την εκδήλωση. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την ιδέα ότι προς τα πάνω ρύθμιση του κάπα ελαφριάς αλυσίδας με LMP1 συμβαίνει μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ERK /σηματοδότησης ΜΑΡΚ.

(Α) κύτταρα HNE2-LMP1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις PD98059 ή 0,1 % DMSO για 2 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και συνολικά και φωσφορυλιωμένων επίπεδα ERKs προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. (Β) κύτταρα HNE2-LMP1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις PD98059 ή 0,1% DMSO για 12 ώρες. Kappa έκφρασης ελαφριάς αλυσίδας σε κύτταρα NPC εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα. (C) και τα κύτταρα HNE2 HNE2-LMP1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 50 μΜ PD98059 ή 0,1% DMSO για 12 ώρες και κηλίδωση Western Διεξήχθη για την ανίχνευση έκφρασης ελαφριάς αλυσίδας κάππα. (D) HNE2 και HNE2-LMP1 κύτταρα επωάστηκαν με θρεπτικό μέσο που περιείχε την ενδεικνυόμενη συγκέντρωση PD98059 ή 0,1% DMSO για 12 ώρες. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε RT-PCR, χρησιμοποιώντας ειδικούς εναρκτήρες σχεδιάζονται για να ενισχύσουν

ελαφριάς αλυσίδας κάπα

και

ακτίνης

mRNAs. (Ε) κύτταρα HNE2-LMP1 επιμολύνονται με

si-ΕΚΚ

ή ομελέτα ολιγονουκλεοτιδίων. ERK και Ig κάππα επίπεδα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η φωσφορυλίωση ή συνολικό επίπεδο έκφρασης για κάθε πρωτεΐνη, καθώς και mRNA εκτιμήθηκε με πυκνομετρία και παρουσιάζονται ως μια αναλογία με την αντίστοιχη ελέγχου φόρτωσης (δεξιά πάνελ). Οι XG7 και XG6 κύτταρα εμφανίζονται ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα, για την κάπα ελαφριά αλυσίδα.

Η

Η θέση πρόσδεσης PU εμπλέκεται στην LMP1-ενισχυμένη δραστηριότητα 3’Eκ μέσω της ERK μονοπάτι

Η ενεργοποίηση του 3’Ε

κ απαιτείται για

κάπα ανοσοσφαιρίνης έκφραση

γονιδίου. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον 3’Ε

κ θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί λειτουργικά στα κύτταρα NPC, εμείς συνδέονται ένα 3’Ε

θραύσμα 313 bp ανθρώπινο ενισχυτή κ, το οποίο περιέχει τον πυρήνα ενισχυτή και 90 bp ανοδικά από τις βασικές ενισχυτή ακολουθίες ότι είναι απαραίτητη για την μέγιστη δραστικότητα ενισχυτή όταν ο πυρήνας ενισχυτής δεν είναι σε άμεση γειτνίαση με τον υποκινητή [31], με την ανθρώπινη

β-σφαιρίνης

προαγωγέα για να οδηγήσει την έκφραση του γονιδίου της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας και αναλύθηκε αυτό το κατασκεύασμα ανταποκριτή με παροδική μορφομετατροπή κυτταρικών γραμμών NPC (Σχήμα 2Α, Β). Το ανθρώπινο

β-σφαιρίνης

υποστηρικτής επιλέχθηκε επειδή έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για αρκετές μελέτες των ενισχυτών ανοσοσφαιρίνης [35], [36], [37], αλλά και επειδή βρήκαμε να επηρεάζεται ελάχιστα από LMP1 στα πειράματά μας (Σχήμα 2C και στο Σχήμα 3). Τα κατασκευάσματα εισήχθησαν εντός HNE2 και τα κύτταρα HNE2-LMP1 να δοκιμαστεί η δραστικότητα του 3’Ε

κ. Η επιμόλυνση του

Ρβ-3’Ε

κwt

παράγεται υψηλότερη δραστικότητα λουσιφεράσης από επιμόλυνση του

pGL3-β

κατασκεύασμα (χωρίς ενισχυτή), ανεξάρτητα από το αν LMP1-αρνητικά (

σ

& lt? 0,05) ή LMP1-θετικό (

σ

& lt? 0,01) κύτταρα NPC εξετάστηκαν. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 3’Ε

κ είναι ενεργή σε κύτταρα NPC που εξέφραζαν την κάπα ελαφριά αλυσίδα Ig. Επιπλέον, η δραστηριότητα του 3’Ε

κ στα κύτταρα HNE2-LMP1 ήταν περίπου 3 φορές υψηλότερη από εκείνη σε κύτταρα HNE2 (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 2C), που συμφώνησε με την κάπα πρότυπα έκφρασης αλυσίδα αυτών των δύο κυτταρικών σειρών [2]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η λουσιφεράσης δραστηριότητα

pGL3-β

και στα δύο κύτταρα HNE2 και HNE2-LMP1 ήταν ουσιαστικά ισοδύναμο, το οποίο πρότεινε ότι η διαφορά στην 3’Ε

δραστηριότητας κ μεταξύ HNE2 και HNE2-LMP1 κυττάρων ήταν Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.