Αφηρημένο

Ιστορικό

Αν και πολυτροπικότητα θεραπεία μπορεί να προκαλέσει υψηλό ποσοστό της ύφεσης σε πολλές υποκατηγορίες του λεμφώματος μη-Hodgkin λέμφωμα (NHL), σημαντικό ποσοστό των ασθενών που υποτροπιάζουν με ανίατη ασθένεια. Η επίδραση του ανθρώπινου μυελού των οστών (ΒΜ) μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSC) σχετικά με την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων είναι αμφιλεγόμενη, και δεν είναι διαθέσιμες ειδικές πληροφορίες για την επίδραση του BM-MSC στο NHL.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Η επίδραση της BM-MSC αναλύθηκε σε δύο

in vivo

μοντέλα διαδίδονται μη-Hodgkin λεμφώματα με μια νωχελικός (EBV

– Burkitt τύπου BJAB, μέση επιβίωση = 46 ημέρες) και ένας επιθετικός (EBV

+ Β λεμφοβλαστοειδή SKW6.4, μέση επιβίωση = 27 ημέρες) συμπεριφορά σε nude-SCID ποντίκια. Ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) ένεση του MSC (4 ημέρες μετά την ένεση ίρ των κυττάρων του λεμφώματος) αύξησε σημαντικά τη συνολική επιβίωση σε μια βέλτιστη αναλογία MSC:lymphoma 1:10 και στα δύο μοντέλα ξενομοσχεύματος (BJAB + MSC, μέση επιβίωση = 58,5 ημέρες? SKW6.4 + MSC, μέση επιβίωση = 40 ημέρες). Μετά την ένεση MSC, ε.π. μάζες όγκου που αναπτύχθηκε πιο αργά και, ιστοπαθολογική παρατήρηση, παρουσίασαν μαζική διήθηση στρωματικά συζευγμένο με εκτεταμένη νέκρωση ενδο-όγκου. Στις

in vitro

πειράματα, βρήκαμε ότι: i) MSC /λεμφώματος συν-καλλιέργειες συγκρατημένα επηρεαστεί επιβίωση λεμφώματος κυττάρων και χαρακτηρίζονται από αυξημένη απελευθέρωση των προ-αγγειογενετική κυτοκινών σε σχέση με την MSC, ή λέμφωμα, καλλιέργειες? ii) MSC επάγει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε επικοινωνούντα δοκιμασίες, αλλά προωθείται απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε άμεση συν-καλλιέργειες MSC /ενδοθηλιακών κυττάρων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι BM-MSC εμφανίζουν αντι-λεμφώματος σε δύο διακριτές ξενομοσχεύματος SCID μοντέλα ποντικών της διαδίδονται NHL

Παράθεση:. Secchiero P, Zorzet S, Τρίποδο C, Corallini F, ΜβΙΙοηί Ε, Caruso L, et al. (2010) ανθρώπινου μυελού των οστών μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα Προβολή Αντικαρκινική Δραστηριότητα σε ποντίκια SCID Λαμβάνοντας Λέμφωμα Ξενομοσχεύματα Διάχυτη μη-Hodgkin. PLoS ONE 5 (6): e11140. doi: 10.1371 /journal.pone.0011140

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 23 Φεβρουαρίου, 2010? Αποδεκτές: 24η Μαΐου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 16 του Ιουνίου 2010

Copyright: © 2010 Secchiero et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Associazione Italiana per la Ricerca contro il Cancro (AIRC) επιχορήγηση και από CariFe Ιδρύματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά το γεγονός ότι η θεραπεία πολυτροπικότητα, συμπεριλαμβανομένων συνδυασμένη χημειοθεραπεία, ακτινοβολία, και μονοκλωνικά αντισώματα ειδικού στόχου, όπως rituximab, μπορεί να προκαλέσει υψηλό ποσοστό της ύφεσης σε πολλές υποκατηγορίες του λεμφώματος μη-Hodgkin λέμφωμα (NHL), σημαντικές αναλογίες των ασθενών υποτροπιάζουν με ανίατη ασθένεια. Έτσι, αποτελεσματικές θεραπείες για NHL παραμένει μια σοβαρή ιατρική ανάγκη, λαμβάνοντας επίσης υπόψη ότι η συχνότητα του NHL συνεχίζει να αυξάνεται [1]. Οι πιο διαδεδομένες μορφές NHL είναι κακοηθειών Β-κυττάρων, των οποίων οζώδες λέμφωμα (FL) και διάχυτο μεγάλων λέμφωμα Β-κυττάρων (DLBCL) περιλαμβάνουν την πλειοψηφία [2]. Λέμφωμα Burkitt είναι μια λιγότερο διαδεδομένη μορφή NHL χαρακτηρίζεται από μετατόπιση του c-myc ογκογονιδίου με την περιοχή προαγωγέα /ενισχυτή βαριάς αλυσίδας Ig [3]. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν δείξει ότι, ομοίως με συμπαγείς όγκους, η συνιστώσα στρωματικών κυττάρων σε NHL δεν σχηματίζεται από αθώους περαστικούς στη νεοπλαστική διαδικασία, αλλά αποτελείται από τύπους κυττάρων που θα μπορούσαν να ενεργά επιρροή και προάγουν την ανάπτυξη των παρακείμενων μετασχηματισμένων κυττάρων [4 ] – [9]. Ωστόσο, η επίδραση του ανθρώπινου μυελού των οστών (ΒΜ) μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSC), τα οποία θεωρούνται τα βλαστοκύτταρα στρωματικά προγονικά εντός του ΒΜ, σχετικά με την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων είναι αμφιλεγόμενη.

MSC συνήθως απομονώνονται από η προσκολλημένη μονοπύρηνο κλάσμα του BM αναρροφήσεις, μπορούν να πολλαπλασιάζονται για πολλά περάσματα στον πολιτισμό και έχει πολλές ιδιότητες που τους μια ελκυστική επιλογή ως θεραπευτικοί παράγοντες των κυττάρων κάνουν. Στην πραγματικότητα, είναι σχετικά μη ανοσογόνος, αν και ο μηχανισμός της ανοσολογικής προνόμιο τους δεν είναι καλά κατανοητός και αποτελεί αντικείμενο έντονης μελέτης [10] – [12]. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, MSC εμφανίζουν σημαντικές θεραπευτικές δυνατότητες σε εκφυλιστικές ασθένειες [13], [14]. Από την άλλη πλευρά, όσον αφορά την πιθανή θεραπευτική χρήση τους σε νεοπλασματικές ασθένειες, μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι θετώς μεταφερθεί MSC θα μπορούσε να ευνοήσει εμφύτευση και την εξέλιξη του όγκου

in vivo

[9], [12], [15]. Τα επιβλαβή αποτελέσματα θα μπορούσαν να προέρχονται από διαφορετικά χαρακτηριστικά MSC. Πράγματι, MSC μεταναστεύουν ειδικά προς θέσεις ενεργούς ογκογένεσης, όπου θα μπορούσαν να ενσωματώσουν την εξειδικευμένη θέση του όγκου, να συμβάλει στην ανάπτυξη των ινοβλαστών και μυοϊνοβλαστών που σχετίζονται με όγκους [16] – [18], διεγείρουν την αγγειογένεση [18] – [20], και την προώθηση της ανάπτυξης και της αντίστασης στα φάρμακα και των δύο συμπαγών όγκων και αιματολογικών κακοηθειών [18], [21] – [26]

σε αυτές τις βάσεις, στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε την επίδραση της BM-προερχόμενα χορήγηση MSC. σε δύο μοντέλα διαδίδονται NHL, που ιδρύθηκε από ενδο-περιτοναϊκή (ip) ένεση σε γυμνά-SCID ποντίκια του EBV

– Burkitt τύπου BJAB και EBV

+ Β λεμφοβλαστοειδή SKW6.4 κυτταρικές σειρές, που χαρακτηρίζεται από μια νωχελικός ( BJAB) και ένας επιθετικός (SKW6.4) συμπεριφορά. Αντίθετα με τις προσδοκίες μας, διαπιστώσαμε ότι BM-MSC παρέτεινε σημαντικά την επιβίωση του λεμφώματος που φέρουν ξενομοσχεύματα.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός των μοντέλων ξενομοσχεύματος BJAB και SKW6.4

SCID ποντίκια ήταν ip ένεση με ένα προκαθορισμένο βέλτιστο αριθμό (2 × 10

6) του λεμφώματος (BJAB ή SKW6.4) κύτταρα. BJAB ξενομοσχεύματα χαρακτηρίζεται από την περιτοναϊκή όγκους, η οποία άρχισε να γίνεται ψηλαφητή και μετρήσιμη από την εξωτερική παρατήρηση σε 18-20 ημέρες μετά την ένεση και σταθερά προχώρησε μέχρι ποντίκια θάνατο (Εικόνα 1Α). Από την άλλη πλευρά, σε ξενομοσχεύματα SKW6.4, μια κυτταρική μάζα όγκου ήταν σχεδόν ψηλαφητή σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο που εξετάστηκαν. Ιστοπαθολογική εξέταση των περιτοναϊκών μαζών έδειξαν ότι τόσο BJAB- και όγκων SKW6.4 προερχόμενο έχουν μια σταθερή πορεία του ρυθμού αύξησης του CD20

+ λεμφοβλαστοειδή κύτταρα (Σχήμα 1Α). Μεταβλητή διάδοση των CD20

+ λεμφοβλαστοειδή κύτταρα παρατηρήθηκε σε λεμφαδένες και σπλήνα, ενώ του μυελού των οστών και των νεφρών ήταν συνήθως ανεπηρέαστα (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, οι δύο ξενομοσχεύματα λεμφώματος που φέρουν, και ιδίως ξενομοσχεύματα SKW6.4, συχνά εκτίθενται απομονωμένο ή μαζική διήθηση του CD20

+ λεμφοβλαστοειδή κύτταρα στο ήπαρ (Εικόνα 1Β).

SCID ποντίκια ήταν i.p. ένεση με BJAB ή κύτταρα SKW6.4 (2 × 10

6). Α, BJAB αλλά δεν SKW6.4 ξενομοσχεύματα χαρακτηρίζεται από την περιτοναϊκή όγκους μετρήσιμη από την εξωτερική παρατήρηση. Βέλος δείχνει τα εξωτερικά σύνορα της μάζας του όγκου. Στα ένθετα, μακροσκοπική εμφάνιση της περιτοναϊκής μαζών και ιστολογική Η &? Ε και CD20 χρώσεις (αρχική μεγέθυνση, 20 ×) δείχνονται. Β, ιστοπαθολογική εξέταση τμημάτων necroptic ιστού που ελήφθη από SKW6.4 ξενομοσχεύματος δείχνει απών (νεφρού και μυελού των οστών), που απομονώνονται (βέλη? Σπλήνα και ήπαρ) ή μαζική (λεμφαδένας και του ήπατος) διήθηση του CD20

+ ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Αρχική μεγέθυνση, 20 ×. C, ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier των μοντέλων ξενομοσχεύματος NHL. Το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών που ενέθηκαν με BJAB (n = 15) ή SKW6.4 (n = 15) των κυττάρων μετρήθηκε από την ημέρα της ένεσης λεμφώματος κυττάρων μέχρι την ημέρα του θανάτου. Asterisk,

σ

& lt?. 0.01

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρά τις μεγαλύτερες περιτοναϊκή μάζες σε BJAB σε σχέση με SKW6.4 ξενομόσχευμα ποντικούς, η μέση επιβίωση των SKW6.4 ξενομοσχεύματα ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,01) μικρότερη (27 ημέρες) σε σύγκριση με εκείνη του BJAB ξενομοσχευμάτων (47 ημέρες? Σχήμα 1C).

ένεση του ΒΜ προερχόμενων MSC παρατείνει σημαντικά την επιβίωση των δύο BJAB και SKW6.4 ξενομοσχεύματα

για να προσδιορισθεί η επίδραση της ανθρώπινης BM-MSC για την επιβίωση ξενομοσχευμάτων λεμφώματος, ομάδες ποντικών SCID ήταν ip ένεση είτε με BJAB ή κύτταρα SKW6.4 και, μετά από 4 ημέρες, με την MSC σε αναλογία lymphoma:MSC του 10:01. Μία ομάδα ποντικών εγχύθηκε με MSC και μόνο, ως έλεγχος. Ξενομοσχεύματος ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με BJAB + MSC και SKW6.4 + MSC έδειξε σημαντική (ρ & lt? 0,01) αύξηση στην επιβίωση σε σύγκριση με την αντίστοιχη BJAB (Σχήμα 2Α) ή SKW6.4 (Σχήμα 2Β) ξενομοσχεύματα. Αξίζει να σημειωθεί, αυξάνοντας την ποσότητα του εγχυόμενου MSC σε αναλογία lymphoma:MSC του 2:01 δεν βελτίωσε την συνολική επιβίωση του BJAB ξενομοσχευμάτων (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, στο μοντέλο ξενομοσχεύματος BJAB, η οποία επέτρεψε την ακριβή μέτρηση της μάζας του όγκου με την εξωτερική επιθεώρηση, διαπιστώσαμε ότι η βελτίωση στην επιβίωση παράλληλα με μια σημαντική (ρ & lt? 0,05) καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με BJAB + MSC με σεβασμό σε ποντικούς ένεση με BJAB μόνο του (Σχήμα 2C).

SCID ποντίκια ήταν ip ένεση είτε με BJAB (n = 10) ή SKW6.4 (n = 10) και κύτταρα, μετά από 4 ημέρες, με την MSC σε αναλογία lymphoma:MSC του 10:01. Ως έλεγχος, μια ομάδα ποντικών (η = 10) εγχύθηκε με MSC μόνο. Κατά Kaplan-Meier ανάλυση των μοντέλων ξενομοσχεύματος NHL, συγκρίνοντας την επιβίωση των ποντικών που ενέθηκαν με BJAB ± MSC (Α) ή SKW6.4 ± MSC (Β). Σε BJAB ξενομόσχευμα ποντικούς, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε μία ομάδα ποντικών (η = 10) εγχύθηκε με MSC σε αναλογία lymphoma:MSC από 2:01 φαίνονται επίσης (Α). Το ποσοστό επιβίωσης μετρήθηκε από την ημέρα της ένεσης λεμφώματος κυττάρων μέχρι την ημέρα του θανάτου. Asterisk,

σ

& lt? 0,05 σε σχέση με BJAB ή SKW ποντίκια. C, η περιτοναϊκή όγκοι μετρήθηκαν κάθε εβδομάδα, μέχρι το θάνατο των ζώων, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι section.Results είναι μέσοι ± SD. Asterisk,

σ

& lt?. 0.05

Η

Η ιστοπαθολογική εξέταση των καρκινικών ιστών από την ξένου μοσχεύματος SCID ποντίκια έδειξαν εντυπωσιακά διακριτά χαρακτηριστικά μεταξύ περιτοναϊκή μαζών που αναπτύχθηκε κατά την έγχυση είτε με λέμφωμα κύτταρα ή κύτταρα λεμφώματος + MSC. Αυτές οι αναλύσεις εκτελέστηκαν κυρίως στο μοντέλο ξενομοσχεύματος BJAB, λόγω του μεγαλύτερου μεγέθους των μαζών, αλλά παρόμοια ιστοπαθολογική χαρακτηριστικά παρατηρήθηκαν επίσης στα ξενομοσχεύματα SKW6.4. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, BJAB όγκοι εμφάνισαν ένα στερεό πρότυπο ανάπτυξης με μια δυσδιάκριτη πλέγματος στρωματικά, επιβεβαιώθηκε με τρίχρωμη χρώση Masson, καθώς και μερικά σκάφη ενδοογκική, όπως ανιχνεύεται με CD31 ανοσοϊστοχημική χρώση, μια ιστοπαθολογική κατάσταση θυμίζει αυτή που παρατηρείται στην πλειονότητα της ανθρώπινης NHL [27]. Από την άλλη πλευρά, καρκινικών μαζών που αναπτύχθηκε σε ποντικούς συν-ένεση με BJAB και τα κύτταρα MSC παρουσίασαν μια εντελώς διαφορετική άποψη, που χαρακτηρίζεται από: περιοχές που περιέχουν στρωματικά γέφυρες αναμιγνύεται με φύλλα κυττάρων BJAB, όπως τεκμηριώνεται σαφώς τόσο από Η &? Ε και trichromic χρώσεις του Masson, και ενδο-ογκικές αστεροειδή μεσεγχυματικά κύτταρα συχνά χαρακτηρίζεται από θετικότητα προς α-SMA (Σχήμα 3Β). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον ήταν η διαπίστωση ότι τα ποντίκια συν-ένεση με BJAB + MSC έδειξε αρκετές ενδονεοπλαστική εστίες νέκρωσης (Εικόνα 3Β), και τα φύλλα των κυττάρων BJAB με εστίες νέκρωσης ήταν συχνά συμπίπτει με τις περιοχές που περιέχουν α-SMA

+ στρωματικά κύτταρα (Σχήμα 3Β)

τμήματα της περιτοναϊκής μαζών από BJAB (Α) και BJAB + MSC (Β) ξενομοσχεύματος ποντίκια αναλύθηκαν μετά Η &?. Ε και trichromic χρώσεις του Masson, και immunophenotypical αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα αντι-CD31 ή αντι-αSMA, όπως υποδεικνύεται. Σε Η &? Ε τμήματα χρώση, αστερίσκοι υποδεικνύουν μικρές εστίες νέκρωσης εντός καρκινικών μαζών (Β). Σε trichromic χρωματισμένο τμήματα του Masson, οι ίνες κολλαγόνου χρωματισμένο με μπλε χρώμα (βέλη) και αποδείξεις μια λεπτή και δυσδιάκριτη πλέγμα των στρωματικών μεταξύ συμπαγή μορφή του όγκου σε Α, ή μια πιο διάχυτη και παχιά αρχιτεκτονική στρωματικά στο Β CD31

+ ενδοθηλιακά τα κύτταρα και α-SMA μυοϊνοβλάστη κύτταρα που μοιάζουν με χρωματιστό σε καφέ (βέλη στο Α και Β). Αρχική μεγέθυνση 20 ×.

Η

Η

in vitro

συγκαλλιέργεια με την MSC επηρεάζει οριακά την επιβίωση του λεμφώματος κυττάρων /πολλαπλασιασμό, ενώ προάγει την απελευθέρωση των αγγειογενετικών κυτταροκινών

Για να εξακριβωθεί αν η δραστηριότητα αντι-λέμφωμα του MSC παρατηρείται

in vivo

οφείλεται σε μια άμεση ανασταλτική επίδραση της MSC στα κύτταρα του λεμφώματος, έχουμε δοκιμαστεί εάν MSC θα μπορούσαν να διαμορφώσουν την επιβίωση /ανάπτυξη των BJAB και τα κύτταρα SKW6.4 σε μια

in vitro

σύστημα συγκαλλιέργειας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων BJAB καλλιεργειών έδειξε μια μέτρια αλλά σημαντική μείωση (μέση τιμή ± SD: 20 ± 6%, ρ & lt? 0,05), συζευγμένο με επαγωγή απόπτωσης, όταν BJAB συν-καλλιεργούνται παρουσία κυττάρων MSC, σε αναλογία lymphoma:MSC του 10:01 (Σχήμα 4Α). Από την άλλη πλευρά επίπεδα, κυτταρικής βιωσιμότητας και την απόπτωση των SKW6.4 καλλιέργειες, ήταν εντελώς ανεπηρέαστη από την παρουσία του MSC (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, για να συγκριθεί η απελευθέρωση των προ-αγγειογενετική κυτοκίνες (Πίνακας S1), εκτελέσαμε ανάλυση της σειράς πρωτεΐνης που βασίζονται σε αντίσωμα της υπερκείμενα καλλιέργειας: i) κύτταρα SKW6.4 λέμφωμα, ii) MSC, iii) SKW6.4 /MSC συν-καλλιεργούνται σε άμεση επαφή? iv) SKW6.4 /MSC συν-καλλιεργήθηκαν σε πλάκες transwell. Όπως ήταν αναμενόμενο, η MSC παρήγαγαν σημαντικά επίπεδα αρκετών προ-αγγειογενετική κυτοκίνες, μερικές από τις οποίες (αγγειογενίνη, IL-8, CCL2 και VEGF) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα από την ταυτόχρονη παρουσία κυττάρων SKW6.4 (Σχήμα 4Β). Τόσο άμεσων όσο και μεταξύ φρεατίων λέμφωμα /MSC συν-καλλιέργειες ήταν εξίσου αποτελεσματικά στην προώθηση της απελευθέρωσης κυτοκινών. Οι ποσότητες των IL-8 και VEGF μετρήθηκαν περαιτέρω με ELISA (Σχήμα 4C) και τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με εκείνα της ανάλυσης δέσμης πρωτεΐνης (Σχήμα 4Β). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι ένα σημαντικό (ρ & lt? 0,05) αύξηση της απελευθέρωσης της IL-8 και VEGF, σε σχέση με το MSC μόνο, παρατηρήθηκε τόσο στην MSC /SKW6.4 καθώς και στο MSC /BJAB συν-καλλιέργειες.

BJAB και SKW6.4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία MSC, σε αναλογία lymphoma:MSC του 10:01. Α, Μετά από 96 ώρες καλλιέργειας, λέμφωμα κυττάρων απόπτωση αναλύθηκε με χρώση διπλό αννεξίνη V /PI. Β, υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν από: κύτταρα SKW6.4 λεμφώματος και μόνο, MSC και μόνο, SKW6.4 /MSC άμεση συνεργασία των πολιτισμών και SKW6.4 /MSC φρεατίων συν-καλλιέργειες. Η απελευθέρωση των προ-αγγειογενετική κυτοκίνες εκτιμήθηκε στα υπερκείμενα καλλιέργειας με τη χρήση ενός πρωτεώματος Profiler συστοιχία ανθρώπινη αγγειογένεση. Οι κύκλοι στις μεμβράνες τονίζουν τέσσερα κυτοκίνες (αγγειογενίνη, IL-8, CCL2 και VEGF) που απελευθερώνονται από MSC, η οποία είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα από την ταυτόχρονη παρουσία κυττάρων SKW6.4. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και τα αποτελέσματα από ένα από αυτά εμφανίζονται. Το γράφημα ράβδων αναφέρει τα αποτελέσματα των πυκνομετρικές αναλύσεις των μεμβρανών. Οι συντομογραφίες των αναλύονται κυτοκινών που ορίζονται στον πίνακα S1. Asterisk, σ & lt? 0,05. C, επίπεδα IL-8 και VEGF μετρήθηκαν στα υπερκείμενα καλλιέργειας των υποδεικνυόμενων καλλιεργειών με ELISA. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν. Asterisk, σ & lt?. 0.01

Η

MSC επάγει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και την προώθηση απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων μετά από άμεση MSC /ενδοθηλιακών

επαφή κυττάρων

Από MSC απελευθερώνουν ένα κοκτέιλ ισχυρών προ-αγγειογενετική παράγοντες [28] – [30], εξετάσαμε την επόμενη την ικανότητα των MSC να οδηγεί τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, οι καλλιέργειες MSC ασκείται ένας ισχυρός (ρ & lt? 0,01) προ-μεταναστευτική δραστηριότητα στα ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως αξιολογείται σε επικοινωνούντα δοκιμασίες. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, στην τελευταία ομάδα των πειραμάτων ερευνήσαμε την επίδραση μιας άμεσης αλληλεπίδρασης μεταξύ MSC και ενδοθηλιακών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, συρρέοντα HUVEC σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, και την επόμενη ημέρα, MSC προστέθηκαν σε μία αναλογία ενδοθηλιακά cell:MSC του 5:01. Σε μια σειρά πειραμάτων, πριν από την προσθήκη του MSC, HUVEC φορτώθηκαν με τις καρβοκυανίνη fluorichrome με Dil [31], λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι έχει περιγραφεί μεταφορά της Dil από διαφορετικούς τύπους κυττάρων. MSC /HUVEC o-καλλιέργειες ήταν τότε παρακολουθείται καθημερινά από μορφολογική εξέταση (κάτω από μια ανεστραμμένη αντίθεσης φάσης και μικροσκόπιο φθορισμού) και ποσοτικοποίηση της συνολικής φθορισμού σε σύγκριση με καλλιέργειες μόνο HUVEC (Σχήμα 5Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, την ημέρα 1, φθορισμός περιορίζεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ MSC ήταν τελείως αρνητική. Με τον καιρό παρατηρήσαμε γεγονότα της χρώσης φθορισμού διάχυτης να MSC, υποδεικνύοντας ότι η MSC είχε συγχωνευθεί με το δίκτυο των ενδοθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 5Β). Παράλληλα, στην εγκύκλιο MSC /HUVEC συν-καλλιέργειες, έχουμε τεκμηριωμένα μια προοδευτική κατάρρευση του ενδοθηλιακών κυττάρων μονοστοιβάδας, με την επικράτηση των νεκρών ενδοθηλιακών κυττάρων κοντά στο MSC και σημαντική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων, ποσοτικά με αννεξίνη-V /διπλή χρώση ΡΙ ( Σχήμα 5Β-Γ). Δυστυχώς, σε αυτές τις ομάδες πειραμάτων ήμασταν σε θέση να διεξάγουν πειράματα τριμερή με την προσθήκη επίσης των κυττάρων του λεμφώματος, για τεχνικά προβλήματα, κυρίως λόγω των διαφορών στις απαιτήσεις μέσα καλλιέργειας.

Α, HUVEC μετανάστευση αξιολογήθηκε σε πλάκες transwell προς την MSC, σπέρνεται (72 ώρες πριν) στον κάτω θάλαμο των πλακών transwell, έναντι μέσου ελέγχου. Τα μεγέθυνση 10x φωτογραφίες του εκπροσώπου χρωματισμένο φίλτρα δείξει? σκοτεινότερες περιοχές είναι λόγω της υψηλότερης πυκνότητας κυττάρου. Ο μέσος αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων ανά πεδίο εκτιμήθηκε μετρώντας τουλάχιστον τέσσερα υψηλής ισχύος τυχαία πεδία ανά ηθμό. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SD από τρία πειράματα το καθένα εκτελέστηκαν εις διπλούν. Στην Β και C, ταπήτιο HUVEC σπάρθηκαν σε απουσία ή παρουσία του MSC (ενδοθηλιακά αναλογία cell:MSC του 5:01). Εικόνες με φθορισμό και μικροσκοπία αντίθεσης φάσης δείχνουν τη σημαντική μείωση των ενδοθηλιακών πυκνότητα κυττάρων κατά την προσθήκη του MSC στις καλλιέργειες. Β, Εκπρόσωπος εικόνες που δείχνει κόκκινο με Dil-σημασμένο ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως εμφανίζονται στο HUVEC καλλιέργειες (ένθετο), και MSC, η οποία αποκτά τη χρώση μετά από 4 ημέρες συν-καλλιέργειες με την ένδειξη HUVEC. Αρχική μεγέθυνση 20 ×. Συνολικά φθορισμού πολιτισμό των HUVEC και HUVEC + MSC ήταν ποσοτικά με έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού. C, Η παρουσία νεκρών κυττάρων σε αντιπροσωπευτικές εικόνες με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης δεικνύεται με αστερίσκους. Αρχική μεγέθυνση 20 ×. Συνολικά απόπτωση των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση Αηηβχίη V /PI. Τα δεδομένα σε Β και Γ είναι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν. Asterisck,

σ

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Προηγούμενο

in vivo

μελέτες έχουν αξιολογήσει την επίδραση της MSC σε ζωικά μοντέλα αιματολογικών κακοήθειες περιορίζεται σε συσκευές γέλη υποδόρια [14], [15], [32]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η πλειοψηφία των NHL εξελίσσεται κυρίως ως συστημική κακοήθεια, σε αυτή τη μελέτη έχουμε αναπτύξει και περιγράφονται δύο ζωικά μοντέλα τα οποία μας επέτρεψε τη διερεύνηση της δραστηριότητας των MSC έναντι NHL σε ξενομοσχεύματα φέρουν διαδίδονται όγκους. Πράγματι, μετά από ε.π. ένεση, κακοήθη BJAB και SKW6.4 λεμφώματος κυττάρων που σχηματίζονται μάζες όγκου, με συχνές διάδοση στο ήπαρ και τους κοιλιακούς λεμφαδένες.

Το κύριο εύρημα της παρούσας μελέτης είναι ότι μία μόνο ένεση MSC, σε αναλογία MSC:tumor κυττάρων τόσο χαμηλά όσο 1:10, παρέτεινε σημαντικά την επιβίωση των ζώων με νωχελικός (BJAB) και επιθετική (SKW6.4) λεμφώματα. Αυτή η παρατήρηση ήταν ιδιαίτερα ενθαρρυντική, δεδομένου ότι ελήφθη σε διαδίδονται NHL φέρουν ξενομοσχεύματα, ότι, κατά τη γνώμη μας, έχουν μεγαλύτερη σημασία από τα υποδόρια μοντέλα NHL απασχολούνται σε προηγούμενες μελέτες [14], [15], [32]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυξάνοντας τον αριθμό των MSC, μέχρι αναλογία MSC:tumor κυττάρων 1:02 για, δεν οδήγησε σε σημαντική βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας του MSC. Η ένεση του MSC καθυστέρησε την ανάπτυξη των όγκων περιτοναϊκής μάζες των ξενομοσχευμάτων NHL, και στη Νεκροσκοπική ανάλυση, τα δείγματα όγκων που αναπτύσσονται στην απουσία ή παρουσία MSC έδειξε σημαντικές ιστολογικές διαφορές, οι οποίες μπορούν να ανακεφαλαιωθούν ως εξής: ενώ BJAB- ή /και SKW6.4 προερχόμενο περιτοναϊκή μάζες έδειξε την τυπική τριχοειδές δίκτυο αχνό περιγράφονται επίσης στο ανθρώπινο NHL [27], η παρουσία του MSC προώθησε μια διάχυτη αύξηση α-SMA

+ ενσωμάτωση κύτταρο σε όλη την στρωματικό διαμέρισμα στο διακύμανση της πενιχρή SMA

+ περιαγγειακή μοτίβο παρατηρείται κυρίως στην απουσία της MSC. Επιπλέον, η μαζική περιοχές ενδονεοπλαστική νέκρωσης προτίμηση παρατηρήθηκαν σε λέμφωμα + MSC εγχυθεί ζώα και πιθανόν υπόψη για τους μειωμένες μάζες όγκου που χαρακτηρίζουν αυτά τα ποντίκια σε σχέση με τα ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα λεμφώματος και μόνο. ​​

Στην προσπάθεια να διαφωτίσει ο μηχανισμός (ες) με την οποία MSC ασκούν δραστηριότητα αντι-λέμφωμα

in vivo

, έχουμε πραγματοποιήσει μια σειρά από

in vitro

πειράματα σε συστήματα συγκαλλιέργειας. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από αυτά τα πειράματα τείνουν να αποκλείσουν μια σημαντική άμεση κυτταροτοξική δράση της MSC στα κύτταρα του λεμφώματος, αφού MSC ανέστειλε μετρίως τη βιωσιμότητα των BJAB, αλλά δεν παρουσιάζουν κανένα αισθητό αποτέλεσμα στην SKW6.4 κυτταρική επιβίωση /ανάπτυξη. Ενδιαφέρον, η ικανότητα των MSC καλλιέργειες που εκκρίνουν υψηλά επίπεδα αγγειογενετικών κυτταροκινών, όπως ο VEGF, IL-8, αγγειογενίνη και CCL2, ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,01) ενισχύεται από την ταυτόχρονη παρουσία των κυττάρων του λεμφώματος. Σταθερά με την ικανότητά τους απελευθέρωσης αρκετών προ-αγγειογενετική κυτοκινών, MSC προωθείται ισχυρά τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε επικοινωνούντα δοκιμασίες. Ωστόσο, όταν το MSC ήταν άμεσα συν-καλλιεργημένα με ενδοθηλιακά κύτταρα, παρατηρήσαμε μια σημαντική επαγωγή απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Από την άποψη αυτή, η τρέχουσα ευρήματά μας είναι σε συμφωνία με εκείνα άλλων συγγραφέων που έχουν αποδείξει ότι MSC υπό ορισμένες συνθήκες θα μπορούσε να ασκήσει αντι-αγγειογενετική δραστικότητα σε άκρως vascularized σαρκώματα Kaposi [33], καθώς και σε καλλιέργειες κανονικών ενδοθηλιακών κυττάρων

στο vitro

[34]. Έτσι, αν και ήμασταν σε θέση να τεκμηριώσει τη σημασία αυτών των

in vitro

δεδομένων σε ζωικά μοντέλα μας, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν την ύπαρξη μιας πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ MSC, τα κύτταρα του λεμφώματος και ενδοθηλιακά κύτταρα, που χαρακτηρίζεται από: i) σημαντική απελευθέρωση των προ-αγγειογενετική /προμεταναστευτικές κυτοκινών από το MSC, η οποία ενισχύεται από την παρουσία των κυττάρων του λεμφώματος? ii) ισχυρή χημειοτακτική δραστηριότητα των MSC επί ενδοθηλιακών κυττάρων, που ακολουθείται από μια κυτταροτοξική δράση του MSC σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία απαιτείται η /επαφή ενδοθηλιακών κυττάρων MSC.

Γνωρίζουμε επίσης ότι παρέκταση ενός δεδομένου ζωικό μοντέλο για κλινικά σχετικές καταστάσεις θα πρέπει να εξετάζεται με ιδιαίτερη προσοχή. Ειδικότερα, θα πρέπει να θυμόμαστε ότι ένας σημαντικός περιορισμός της μελέτης μας αντιπροσωπεύεται από το γεγονός ότι το αντι-όγκων ανοσολογική απόκριση δεν είναι πολύτιμη στο μοντέλο SCID μας, αλλά πιθανόν είναι σημαντικό στη συνολική επίδραση της MSC στην ανάπτυξη του όγκου. Στην πραγματικότητα, έχει δειχθεί ότι η ανοσοκατασταλτική επίδραση του MSC θα μπορούσε να ευνοήσει την ανάπτυξη του όγκου σε αλλογενή ζώα [12]. Αν και μερικοί αμφιλεγόμενα δεδομένα υπάρχουν για το ρόλο της MSC σε ανάπτυξη ή /και τη θεραπεία [35] καρκίνου, [36], διάφορα νέα συμπεράσματα μπορούν να συνοψιστούν από τη μελέτη μας: i) το

in vitro

αλληλεπίδραση του ΒΜ προερχόμενο MSC και τα κύτταρα λεμφώματος προβλέπει κακώς η

in vivo

επίδραση του MSC στην επιβίωση των ζώων που φέρουν ξενομόσχευμα? ii) MSC ρυθμίζει σημαντικά το δίκτυο στρωματικά λεμφωμάτων

in vivo

, με την αύξηση του αριθμού των α-SMA-θετικών κυττάρων και να επάγουν την αύξηση του εντός του όγκου νέκρωση? iii) MSC προωθούν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων

in vitro

που ακολουθείται από θάνατο ενδοθηλιακών κυττάρων μετά την MSC /ενδοθηλιακών άμεση επαφή των κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

κυτταρικές σειρές SKW6.4 και BJAB ελήφθησαν από DSMZ (Deutsche Sammlung νοη Mikroorganismen ιιηά Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Γερμανία) ή αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Gibco BRL, Gaithersbrg, MD). Ανθρώπινη BM-προερχόμενα MSC και τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) αγοράστηκαν από την Lonza (Walkersville, MD). BM-MSC ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε MSC-Μέσο Ανάπτυξης (MSC-GM, Lonza). HUVEC αναπτύχθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας επικαλυμμένες με ζελατίνη 0,2% σε μέσο Μ199 ενδοθηλιακής ανάπτυξης συμπληρωμένο με 20% FBS, 10 mg /ml ηπαρίνης και 50 mg /ml ECGF (όλα από την Lonza) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Σε όλα τα πειράματα, η MSC και HUVEC χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ του 3

ου και 6

ου πέρασμα

in vitro.

Η

NHL μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού

Γυναίκα CB -17 SCID ποντίκια (4 εβδομάδες ηλικίας) λήφθηκαν από Charles River Laboratories (Hollister, CA) και διατηρήθηκαν σύμφωνα με τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε κλουβιά μικρο-απομονωτή με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα και τη φροντίδα τους διεξήχθησαν σύμφωνα με το National Institutes of Οδηγός Υγείας για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care στο Πανεπιστήμιο της Τεργέστης (αριθμός έγκρισης του Υπουργείου Υγείας 191 ιταλικών /2008-D). Συγκεκριμένα, τέθηκε κάθε προσπάθεια για να αποφευχθεί περιττό πόνο των ζώων. SKW6.4 ή BJAB (2 χ 10

6) τα κύτταρα συλλέχθηκαν, αιωρήθηκαν σε PBS, και ε.π. εγχέεται 6 εβδομάδων ποντικούς. Μετά από 4 ημέρες, τα ποντίκια λέμφωμα ξενομόσχευμα τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες (τουλάχιστον 10 ποντίκια για κάθε ομάδα), και χορηγήθηκε ε.π. με όχημα (PBS) ή MSC (2 × 10

5 ή 1 × 10

6, που αντιστοιχεί σε αναλογία lymphoma:MSC των 10:01 και 2:01 αντίστοιχα). Σε μια ομάδα ποντικών SKW6.4 (n = 10), MSC ενέθηκαν 12 ημέρες μετά την έγχυση SKW6.4.

Τα ζώα παρακολουθήθηκαν ημερησίως για αλλαγές στο βάρος, παρενέργειες της θεραπείας ή σημάδια οποιασδήποτε ασθένεια. Η ανάπτυξη του όγκου προσδιορίστηκε με μετρήσεις δαγκάνα δύο ορθογώνιους άξονες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο: (π /6) χ

ένα

2 ×

b

, όπου

ένα

είναι η μικρότερη και

β

είναι η πλέον άξονα? η πυκνότητα όγκου θεωρείται ότι είναι ίση με ένα. Η επιβίωση υπολογίστηκε ως η διάρκεια της διάρκειας ζωής του ζώου από τον εμβολιασμό των κυττάρων του λεμφώματος μέχρι το θάνατο. Νεκροψία διεξήχθη για να προσδιοριστεί μακροσκοπική έκταση και ιστολογικά χαρακτηριστικά της περιτοναϊκής μαζών. Επιπλέον, τα κύρια όργανα συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς, των νεφρών, του μηριαίου οστού (για το μυελό των οστών), συκώτι, σπλήνα, οι κόμβοι συλλέχθηκαν για μικροσκοπική εξέταση και να αξιολογήσουν το μοτίβο της διάδοσης της μεταμόσχευσης.

Η ιστοπαθολογική και immunophenotypical ανάλυση

δείγματα ζώων σταθεροποιήθηκαν σε 10% διάλυμα ρυθμισμένο-φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Για μορφολογική ανάλυση, 4-μm πάχους τομές κόπηκαν από τους κύβους παραφίνης και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με τα μέσα του συμπλόκου μεθόδου στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα πρωτογενή mAbs για: CD20, α-SMA και CD31 (Dako, Glostrup, Δανία). 3-3’diaminobenzidine χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε κολλαγόνο, οι τομές βάφτηκαν με τριχρωματική του Masson. Μετά τις χρώσεις, οι διαφάνειες εξετάστηκαν κάτω από ένα Leica DM2000 οπτικό μικροσκόπιο και ελήφθησαν μικροφωτογραφίες χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Leica DFC320.

Πειράματα

Συν-καλλιέργεια

Για το λέμφωμα /MSC συγκαλλιέργειας

in vitro

πειράματα, MSC σπάρθηκαν σε 6 φρεατίων και την επόμενη ημέρα, είτε BJAB ή κύτταρα SKW6.4 προστέθηκαν στις καλλιέργειες MSC σε αναλογία lymphoma:MSC του 10:01. Συν-καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν για μέχρι 96 ώρες, σε μέσο λέμφωμα κυττάρων. Σε μερικά πειράματα, συν-καλλιέργειες διεξήχθησαν με τη χρήση 24-Transwell πλάκες (3.0 μm, μέγεθος πόρων? Corning Costar, Cambridge, ΜΑ), με την MSC σπάρθηκαν στο κάτω διαμέρισμα και λεμφώματος κύτταρα προστίθενται στο άνω διαμέρισμα

Για ενδοθηλιακών /MSC συν-καλλιέργειες, HUVEC σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και την επόμενη ημέρα, MSC προστέθηκαν σε μια αναλογία HUVEC:MSC του 5:01. Συν-καλλιέργειες διεξήχθησαν για μέχρι 5 ημέρες σε μέσο HUVEC. Σε μερικά πειράματα, πριν από την προσθήκη του MSC, HUVEC φορτώθηκαν με τις καρβοκυανίνη φθοριοχρώμιο με Dil (1,1’dioctadecyl-3,3,3 ‘, 3’tetramethylindocarbocyanine υπερχλωρικό? Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Βέλγιο). Με Dil είναι ένα λιπόφιλο μόριο το οποίο ενσωματώνει στην κυτταρική μεμβράνη, και έχει τα ακόλουθα φασματικά χαρακτηριστικά: μέγιστη απορρόφηση στα 549 nm και μέγιστο εκπομπής στα 565 nm. Για το σκοπό αυτό, HUVEC επωάστηκαν με 50 μg με Dil /ml για 2 ώρες πριν από την εκτέλεση MSC: ενδοθηλιακών κυττάρων συν-καλλιέργειες. Μορφολογία των καλλιεργειών HUVEC και HUVEC /MSC συν-καλλιέργειες παρατηρήθηκε περιοδικά την πάροδο του χρόνου υπό την αντίθεση και φθορισμού μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης και η συνολική φθορισμός ποσοτικοποιήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού.

δοκιμασία απόπτωσης

για την ανάλυση της απόπτωσης, τα κύτταρα διπλό χρωματίστηκαν με αννεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (Alexis Biochemicals, Lausen, Switzerland) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη (Becton-Dickinson , San Jose, CA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Για να αποφευχθεί η μη-ειδική φθορισμός από τα νεκρά κύτταρα, ζώντα κύτταρα με περίφραξη στενά με χρήση των εμπρός και πλευρικής σκέδασης. Ειδικότερα, για HUVEC και καλλιέργειες MSC /HUVEC, την ανάλυση του βαθμού απόπτωσης σε ολόκληρο τον πληθυσμό κυττάρων, τα κύτταρα υπόστρωμα εγγεγραμμένων συλλέχθηκαν με κατεργασία τρυψίνης και συγκεντρώθηκαν με επιπλέοντα κύτταρα για την χρώση.

συστοιχία Proteome Profiler και προσδιορισμούς ενζυμο-συνδεδεμένες ανοσορροφητικές

τα υπερκείμενα καλλιέργειας αναλύθηκαν με τη χρήση του πρωτεώματος Profiler ανθρώπινο συστοιχία αγγειογένεση (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ίσες ποσότητες υπερκειμένων καλλιέργειας αραιώθηκαν και αναμίχθηκαν με ένα κοκτέιλ από βιοτινυλιωμένα αντισώματα αγγειογένεση ανίχνευση και επωάστηκαν με το (σύλληψη) μεμβράνες αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση του μη συνδεδεμένου υλικού, οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP στρεπταβιδίνη. Χημειοφωταύγεια χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του σήματος. Χρώση ένταση των στιγμών προσδιορίσθηκαν με λογισμικό ImageQuant (Molecular Dynamics) και εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες.

Enzyme-ανοσορροφητικές δοκιμασίες (ELISA) για την IL-8 και VEGF αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμο κιτ ELISA (R & ? D Systems). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν και σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα αναγνώστηκαν σε οπτική πυκνότητα 450 nm χρησιμοποιώντας Anthos 2010 αναγνώστη ELISA (Anthos Labtec Instruments, Wals Salzburg, Austria).

μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε 24 πλάκες φρεατίων Transwell (8.0 μm, μέγεθος πόρων) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. MSC σπάρθηκαν σε μέσο καλλιέργειας HUVEC εντός του κατώτερου θαλάμου πλακών transwell και, μετά από 72 ώρες, 0,25 × 10

5 HUVEC ανά φρεάτιο προστέθηκαν στα κορυφαία θαλάμους σε 100 μΙ μέσου.